يعيش التصوير خلية خلال الإمتداد الميكانيكية

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Rápalo, G., Herwig, J. D., Hewitt, R., Wilhelm, K. R., Waters, C. M., Roan, E. Live Cell Imaging during Mechanical Stretch. J. Vis. Exp. (102), e52737, doi:10.3791/52737 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

تتعرض الخلايا لالأحمال الميكانيكية في العديد من الأنسجة، ولقد ثبت هذا التحفيز الميكانيكي لتعزيز التغييرات في أنماط التعبير الجيني، وإطلاق سراح من عوامل النمو، السيتوكينات، أو إعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية والهيكل الخلوي 1-4. الإشارات بين الخلايا transduced من هذه المحفزات الميكانيكية تحدث من خلال عملية mechanotransduction 5-7. في الجهاز التنفسي، نتيجة واحدة من mechanotransduction هي زيادة في أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) 8،9 والسيتوكينات الموالية للالتهابات 10 في الخلايا الظهارية الرئوي في وجود دوري سلالة الشد. أدلة قوية تشير أيضا إلى أن الإفراط في الضغط الشد يؤدي إلى ضرر مباشر على ظهارة السنخية، بالإضافة إلى ردود البيوكيميائية للخلايا 11-14. على الرغم من أن التركيز هنا ينصب بالدرجة الأولى على استجابة خلايا الرئة إلى تشويه الميكانيكية، ومسارات الناجمة عن mechanotransduction تلعب دورا رئيسيا في BASجيم ظيفة العديد من الأنسجة في جسم الإنسان، بما في ذلك تنظيم الأوعية الدموية لهجة 15 ووضع لوحة النمو 16.

وقد أدى الاهتمام المتزايد في mechanotransduction في تطوير العديد من الأجهزة لتطبيق الأحمال الميكانيكية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية للخلايا المستزرعة والأنسجة. على وجه الخصوص، وأجهزة تطبيق إجهاد الشد، وهو شكل شائع من تحميل الميكانيكية التي يعاني منها الأنسجة، وتحظى بشعبية 11،17-19. ومع ذلك، فإن العديد من الأجهزة المتوفرة مصممة إما مفاعل حيوي لتطبيقات هندسة الأنسجة أو لا تفضي إلى التصوير في الوقت الحقيقي مع التمدد. على هذا النحو، هناك حاجة إلى تطوير الأدوات والأساليب التي يمكن تصور الخلايا والأنسجة في التوتر لتسهيل التحقيق في ممرات mechanotransduction.

هنا، تم تصميم جهاز تمتد في الطائرة الميكانيكية وتم تطوير بروتوكولات لتطبيق مأشكال ultiple من سلالة إلى الأنسجة والخلايا في حين يسمح التصوير من الاستجابات الكيميائية الحيوية والميكانيكية في الوقت الحقيقي (الشكل 1A-D). ويستخدم الجهاز ستة المشابك متباعدة بشكل متساو ترتيب محيطي لفهم غشاء مرن وتطبيق في الطائرة، وانتفاخ شعاعي تصل إلى ما يقرب من 20٪ (الشكل 1B). يمكن وضعها الجهاز المشغلات في حاضنة الثقافة خلية لفترة طويلة من الزمن، في حين يتم وضع المحرك (الشكل 1C) خارج الحاضنة والتي تسيطر عليها البرمجيات الاحتكارية التي يقدمها المورد المحرك. ويرتبط المحرك للسائق الخطي، والتي تدور على كام الداخلية، والقيادة المشابك نقالة ستة موحد في التوتر والاسترخاء.

بالإضافة إلى جهاز ميكانيكي، تم إنشاء أغشية مرنة مخصصة من المتاحة تجاريا ثقافة الخلية أغشية جاهزة لاستخدامها في نظام ميكانيكي. الجدران ثم دائرية (التي يبلغ قطرها حوالي28 ملم) وقدمت ويعلق على لغشاء مرن بحيث يمكن زرع خلايا فقط في هذه المنطقة من موصوفة وصفا جيدا الشخصي سلالة. من أجل تحديد ما إذا كان وضع هذه الأغشية داخل الجهاز المشغلات من شأنه أن يوفر سلالة موحد وموحد الخواص في وسط الغشاء مرنا، أجري تحليل العناصر المحدودة باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا (الشكل 1E-F). وعلى غرار غشاء مرن مع شروط الحدود المتماثلة والاستفادة من جميع العناصر الرباعية للشبكة. حلقات متحدة المركز ينظر في المؤامرة كفاف من أقصى سلالة الرئيسي هو مبين في الشكل 1F تشير إلى توزيع الخواص من سلالة.

وقد تم قياس الإجهاد التي يعاني منها الغشاء عن طريق تسجيل الصور من علامات عن طريق التحميل (الشكل 2). ويبين الشكل 2D أن متوسط ​​سلالة غشاء تقاس شعاعي ومحوري الاتجاهات وكان ما يقرب من الخطيةفيما يتعلق المحرك تطبيقها تعول ما يصل الى سلالة خطي الحد الأقصى من 20٪. لم يكن هناك فرق كبير بين مستويات الإجهاد خلال قياس انتفاخ مقارنة مع تلك التي تقاس خلال التراجع مرة أخرى إلى موقف يستريح. بعد ذلك، تم قياس تشريد الخلايا البشرية القصبية الظهارية (16HBE) والنواة مثقف على الغشاء مخصصة مرونة. تم تصوير fluorescently المسمى (دابي) نوى الخلايا 16HBE باستخدام الهدف 20X تحت المجهر متحد البؤر، في حين تم قياس النزوح خلية كاملة مع الصور الطوري سجلت مع المجهر الرقمي. كما رأينا في الشكل (3)، وكان من سلالة تقاس تشريد النوى مماثلة لتلك التي تقاس تشريد علامات على الغشاء، وتصل إلى 20٪ ~ سلالة الخطي. هذا يؤكد أن سلالة تطبيقها على الأغشية وأحيلت إلى الخلايا الملتصقة. البروتوكولات واصفا استخدام الجهاز مخصص على المجهر التقليدي وmicroscop القوة الذريةيتم توفير البريد في الخطوات التالية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. بناء الغشاء مع الجدران حسنا لاستبقاء خلية الإعلام الثقافة (انظر الشكل 1D للمنتج النهائي)

  1. باستخدام polydimethylsiloxane (PDMS) ورقة المغلفة مع الكولاجين الأول، قطع الخطوط العريضة للغشاء مرن مع مشرط أو يموت.
  2. وضع كل الغشاء في 60 مم طبق بتري للتخزين.
  3. إنشاء الجدران:
    1. مزيج PDMS في 10: 1 نسبة الوزن من المطاط الصناعي A إلى B المطاط الصناعي (وكيل علاج).
    2. صب 5 مل من PDMS المختلطة بالكامل في 50 مل أنابيب.
    3. وضع 50 مل الأنابيب مع PDMS غير مخمر أفقيا في فرن التهجين.
    4. استخدام وظيفة الدوار لطلاء الجدران الداخلية للأنابيب في 8 دورة في الدقيقة خلال فترة المعالجة. في RT، وPDMS سوف يشفى تماما في 2 يوما.
    5. إزالة PDMS من الأنبوب في الثقافة العقيمة خلية غطاء محرك السيارة.
    6. باستخدام شفرة حلاقة جديدة، تقسيم الاسطوانة من PDMS إلى أقسام 4 مم في الارتفاع.
    7. وضع المقاطع، والتي سوف تكون بمثابة وا الغشاءLLS، في وعاء طبق بتري دون السماح للالجدران لتصبح مجعدة.
  4. اختيار ومركز جدار واحد من PDMS على غشاء واحد مع الحفاظ على اثنين في طبق بيتري.
  5. وضع بلطف PDMS غير مخمر (10: 1 نسبة) على محيط الخارجي للجدار لاستخدامها الغراء. منع تشكيل الفجوات بين الجدار والغشاء لأنه لا يوجد في الاحتفاظ السائل.
  6. وضع كل طبق بتري تحتوي على غشاء المنجزة والمشمولة في فرن عند 70 درجة مئوية لمدة 24 ساعة لعلاج.

2. الربط بين دوران المحرك مع المشبك النزوح أو شعاعي النمو لمعايرة (الشكل 2)

  1. بدء برنامج التحكم في المحرك.
  2. تهجير المشابك الجهاز باستخدام الإعداد اليدوي في البرامج الحركية.
  3. قياس المسافة وتسجيل موقف عدد السيارات بين معارضة المشابك في كل من النزوح الحد الأدنى والحد الأقصى من المشابك.
  4. حساب التغير في المئة في دistance بين المشابك بوصفها وظيفة من عدد السيارات (~ 0-75k التهم). وهذا يشير إلى الحد الأقصى للسلالة المحتملة التي تحققت على الغشاء.

3. تطبيق تمتد على الرئة ماوس الظهارية الخط الخليوي (MLE12)

  1. البذور MLE12 الخلايا عند 2.5 مليون خلية على غشاء مرن (الخطوة 1) لكل بئر إلى أن متكدسة في غضون يومين. قد تختلف كثافة البذر لأنواع مختلفة من الخلايا.
  2. تأكد من أن المحرك الميكانيكي في وضع مريح تماما.
    1. إزالة الخلايا سائل الإعلام والثقافة.
    2. باستخدام 1.5 ملم اللكمات الخزعة، لكمة اثنين من الثقوب في كل من المشبك ستة (انظر الشكل 1D) علامات التبويب من الغشاء. وضع شعاعي من الثقوب يحدد مقدار ما قبل التوتر تجارب غشاء البداية. لكمة ثقوب في دائرة نصف قطرها 20،5 ملم على علامات التبويب غشاء إذا كان المطلوب لا قبل التوتر.
    3. وضع غشاء على نقالة مع ثقبا يصطفون مع دبابيس داخل المشابك.أعلى مكان المشابك في المكان. تضييق الخناق في وقت واحد بالتناوب الجانبين.
    4. إضافة 1 مل سائل الإعلام ثقافة الخلية.
  3. وضع الجهاز على المسرح المجهر تركز وسط الغشاء مع مسار الضوء.
  4. استخدام الشريط أو مغناطيس (إن أمكن) لإصلاح الجهاز إلى المرحلة. مرة واحدة ثابتة، والسيطرة على في الطائرة (موازية للغشاء) والرأسي (ض الاتجاه) من جهاز ميكانيكي مع وحدة تحكم مرحلة من مراحل المجهر.
  5. تطبيق تمتد مع البرامج المقدمة من قبل الشركة المصنعة عن طريق التحكم في الموقف وسرعة دوران المحرك 20 يدويا.

4. قياس الميتوكوندريا أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS)

  1. بمجرد متموجة الخلايا، إضافة 1-2 مل من RT DMEM مع مؤشر الفائق الميتوكوندريا (5 ميكرومتر تركيز النهائي) مباشرة على الخلايا.
  2. احتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 ° C.
  3. غسل الخلايا بلطف ثلاث مرات مع العازلة تحسنت في حمام مائي ل37 ° C.
  4. المكان على الفور غشاء مرن على نقالة (الخطوة 2.2) بالفعل في مكان تحت المجهر متحد البؤر تستقيم.
  5. إضافة 1 مل من DMEM مع الفينول الحمراء المتوسطة مجانا و 25 ملم من HEPES.
  6. تعيين المرشحات الإثارة / الانبعاثات 510/580 نانومتر.
  7. صورة حقول متعددة كل 15 دقيقة لخلق مسار الوقت المطلوب لإنتاج الفائق الميتوكوندريا.
  8. من الصور التي تم التقاطها، رسوم بيانية كثافة سجل مضان في كل فترة زمنية باستخدام برمجيات قادرة على قياس كثافة مضان.

5. تطبيق تمدد وقوة الذرية المجهر (AFM)

ملاحظة: يتم توفير هذه الخطوات لAFM محددة والجمع بين المجهر الضوئي (الشكل 4 و قائمة المواد).

  1. إعداد AFM للتجربة.
    1. زيادة ارتفاع الرأس AFM إلى موقف الأقصى في ض الاتجاه.
    2. وضع تمديدات على الساقين من AFM لرفع الطائرة التي AFM الاتصالات ناتئ العينة. العينة ورئيس AFM لا بد من رفع لاستيعاب ارتفاع جهاز ميكانيكي.
  2. إعداد المجهر الضوئي (إن وجد).
    1. إزالة لوحة AFM الماسح الضوئي. إزالة الهدف المنشود.
    2. إضافة فاصل إلى الهدف. إن ذروة هل تعتمد على الهدف وAFM المحددة المتابعة، ولكن من الضروري إذا كانت هناك رغبة التصوير الضوئي منذ طائرة المراقبة سيكون تحولا في الاتجاه التصاعدي مبلغ يساوي نقالة وارتفاع محول (الشكل 5A). لاحظ أن AFM تقدم عادة منخفضة التصوير التكبير من مسار بصري فوق الجهاز.
    3. يعلو ظهر الهدف المنشود في موقعه. ضع الماسح الضوئي مرة أخرى إلى AFM.
    4. بدء تشغيل البرنامج AFM. تبدأ كل مصادر الضوء اللازمة بما في ذلك مصدر الضوء لقياس مضان.
    5. جبل رقاقة مع شعاع ناتئ أنغير مناسبة القياسات المطلوبة. ويفضل 200 السندات الإذنية / نانومتر أو أقل صلابة عند قياس معامل مرونة الخلايا الحية.
    6. محاذاة الليزر ومعايرة صلابة ناتئ وفقا لاقتراحات الشركة المصنعة على ساترة الزجاج التي شنت على الجهاز.
  3. إعداد الغشاء كما في الخطوة 1، ولكن مع التعديلات التالية.
    1. مباشرة قبل تركيب الغشاء إلى جهاز تمتد، وقطع الجدران إلى حوالي 1 ملم في الطول. هذا يمنع تدخل من ذوي الخبرة بين الجدران غشاء الخلية والحمل.
    2. تركيب غشاء على الجهاز الميكانيكي كما هو موضح 3.2.1-3.2.3.
    3. إزالة وسائل الإعلام ثقافة الخلية لمنع الأضرار التي لحقت الماسح الضوئي AFM في حالة وجود تسرب.
    4. زوجين الجهاز مع محول (الشكل 5A). وضع جهاز ميكانيكي مع محول على الماسح الضوئي.
    5. تمتد الغشاء إلى مستوى سلالة الشد المطلوب.
  4. إضافة محدود (<0.5 مل) حجم وسائل الاعلام على الخلايا لتجنب الماسح الضوئي AFM أو الضرر المجهر بسبب وجود تسرب.
  5. إشراك شعاع ناتئ مع الغشاء.
  6. متابعة بروتوكول للجهاز AFM خاص لمسح المناطق المثيرة للاهتمام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أنواع الاكسجين التفاعلية والتشوه

وقد أظهرت الدراسات السابقة زيادة في أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) في الشعب الهوائية والخلايا الظهارية السنخية ردا على امتداد دوري 21. وتشمل أنواع الاكسجين التفاعلية جزيئات والجذور الحرة المستمدة من الأكسجين الجزيئي مع تفاعل عالية لنسبة الدهون والبروتينات والسكريات والأحماض النووية 22-24. ROS بمثابة إشارة المشتركة بين الخلايا لتنظيم وظيفة القناة الايونية، بروتين كيناز / تفعيل الفوسفاتيز، والتعبير الجيني، ولكن الإنتاج المفرط أو غير المنظم يمكن أن تسهم في أفكارك وموت الخلايا الميتة، التنكس العصبي، وتصلب الشرايين، والسكري، والسرطان 24،25. الفائق، وهو ما قبل المؤشر لأشكال أخرى من ROS، يمكن أن تنتج كناتج ثانوي لتنفس الميتوكوندريا عندما تسرب الالكترونات من سلسلة نقل الإلكترون. وأشارت الدراسات السابقة التي تمتد الميكانيكية دوري حفز إنتاج السوبر أكسيد من خلال الجمع بين النظام NADPH أوكسيديز (نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد الفوسفات أوكسيديز) وسلسلة نقل الإلكترون الميتوكوندريا (I معقدة وIII). وقد اقترح أن هذا التحفيز يرجع إلى تشويه المباشر من الميتوكوندريا 21 ربما بسبب الصلات إلى الهيكل الخلوي الخلية. من أجل اختبار هذه الفرضية، وقد وضعت الخلية تمتد الجهاز بحيث نستطيع صورة التغييرات في إنتاج ROS في الخلايا الحية ردا على امتداد الميكانيكية. هنا، تم قياس ROS الميتوكوندريا التي تنتجها الخلايا الظهارية الشعب الهوائية بسبب تمدد باستخدام جهاز مخصص والبروتوكول. في غياب تمتد الميكانيكية، لم إنتاج ROS لن تزيد بشكل ملحوظ على مدى 60 دقيقة (الشكل 4). عندما تم تطبيق واحد 17٪ وتمتد المحافظة، كانت هناك زيادة في الميتوكوندريا ROS التي استمرت لمدة 60 دقيقة أخرى.

مباشر الظهارية أحادي الطبقة الأضرار الناجمة عن الإمتداد

الصورة = "jove_content"> آليات غير المباشرة التي تمتد المفرط في ظهارة الرئة يضر وقد نوقشت الرئتين في العمق في مكان آخر (2). وتشير العديد من الدراسات أن تمتد الميكانيكية المفرط للخلايا الظهارية الرئة يمكن أن يسبب الإصابة المباشرة التي تنطوي على تلف خلايا 11،13،26،27. هذا النوع من الضرر من الصعب التقاط دون التصوير في الوقت الحقيقي أثناء انتفاخ الميكانيكية. على هذا النحو، وذلك باستخدام جهاز مخصص والنقيض من المرحلة المجهري صور متتالية من الخلايا التي تم امتدت ميكانيكيا تم تسجيلها قبل وبعد العلاج مع خلوى الموالية للالتهابات (50 نانوغرام / مل TNF-α لمدة 6 ساعة) (الشكل 5). تم القبض على الصور من نفس مجال الخلايا في زيادة مستويات التوتر. تظهر الصور تشكيل فجوة عندما امتدت الخلايا بين السلالة 10 و 15٪ كما يتبين من السهام الحمراء. من المهم أن نلاحظ أن هذه الصور تم تسجيلها في القريب في الوقت الحقيقي، <10 ثانية من التأخر بين نهاية تمتد لفيلم ح والتصوير، بينما امتدت الخلايا. في دراسات سابقة من التصوير خلية من خلايا تمدد، وقد تم الحصول على الصور قبل وبعد امتداد يقارن إلا صورا من الخلايا ليس في حالة امتدت 11،13،28.

AFM نانو المسافة البادئة على الخلايا امتدت

وضعت جهاز ميكانيكي في AFM مع استخدام لوحة محول (انظر الشكل 6A). باستخدام أساليب نشرت سابقا 13 والخرائط معامل المرونة (E-خرائط) من MLE12 الخلايا قبل وبعد 10٪ سلالة الشد تم الحصول عليها (الشكل 6D-E). على الرغم من أن صورة النقيض من المرحلة بنسبة 10٪ سلالة (الشكل 6D) تم الحصول عليها في غضون 10 ثانية من امتداد، وخرائط E هو مبين في الشكل 6D-E تستهلك حوالي 22 دقيقة مع 300 الفردية منحنيات قوة انحراف سجلت أكثر من 40 ميكرون X 40 ميكرون المنطقة مع / ثانية سرعة 2.5 ميكرون من طرف في ض الاتجاه.OM / ملفات / ftp_upload / 52737 / 52737fig1highres.jpg "الهدف =" _ فارغة "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 1
الشكل 1. الجهاز مصمم خصيصا لزراعة الخلايا وتمتد. (A) رسم ولدت الحاسوب من التصميم الميكانيكي للجهاز، (B) صورة من الجهاز الانتهاء، (C) صورة من جهاز متصل المحرك والسائق الخطي، والذي يحول دوران المحرك إلى الحركة 1-الأبعاد التي تسيطر على امتداد ذو محورين المشبك من (D) سيليكون الغشاء المطاطي. الركيزة يحتوي على اثنين من الثقوب على كل علامة تبويب المشبك لتوضع على المشاركات على كل المشبك. (E) نموذج الهيئة الاتحادية للبيئة الأبعاد للغشاء مرن هو 1/4 من الهيكل كله بسبب استخدام شروط الحدود متماثل. ( ويرد ترونج> F) سلالة الرئيسي أقصى في الغشاء الكامل تصور تشكيل حلقات إرشادية مجال السلالة الخواص. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. (A) هو مبين الجهاز دعم غشاء مرن مع علامات تطبيقها لقياس الضغط التطبيقية. عن قرب صور من علامات، من قبل (B) وبعد (C) وتمتد، وصفت مع سهم لتشير بوضوح إلى تشريد علامات على الغشاء. (D) سلالة غشاء بوصفها وظيفة من المحرك التهم خلال نهج وتراجع. كان سلالة غشاء مماثل في كل من نهج وتراجع مع تراجع انتاج سلالات أعلى قليلا. أ href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52737/52737fig2highres.jpg" الهدف = "_ فارغة"> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. غشاء سلالة إحالته إلى الخلايا. (A - B) صور المرحلة النقيض من الخلايا البشرية القصبية الظهارية (16HBE) على غشاء مرن باستخدام الهدف 10X، قبل (A) وبعد (B) 20٪ التوتر. (C - D) تم تصوير Fluorescently المسمى (دابي) نوى الخلايا 16HBE باستخدام الهدف 20X تحت المجهر متحد البؤر، قبل (C) وبعد (D) 20٪ التوتر. (E) سلالة غشاء الخلايا التي يعاني منها كان الخطي ومتجانسة. ر = "_ فارغة"> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. لوحظ تأثير شريط واحد على إنتاج ROS من 16HBE الخلايا باستخدام التراكمي جهاز استشعار الفائق الميتوكوندريا باستخدام الهدف 20X تحت المجهر متحد البؤر (A - C). قطات من الوقت بالطبع (0، 60 دقيقة، و ~ 65 دقيقة) من إنتاج الفائق خلال تمتد في نفس المجال من الخلايا. (D) كثافة مضان النسبية لل16HBE الخلايا مع مرور الوقت مما يدل على زيادة بنسبة 50٪ في كثافة مضان من انتاج أساسي الفائق في غضون الساعة الأولى (A إلى B). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

r.within صفحة = "دائما"> الرقم 5
الرقم 5. صور المرحلة النقيض من الخلايا الظهارية السنخية (MLE12) استجابة أحادي الطبقة في زيادة تمتد (A - D). كانت كلها سجلت باستخدام مجهر رقمي مع الهدف 20X. الأسهم تشير إلى المواقع التي وقعت فصل خلية الى خلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الرقم 6. (A) جهاز ميكانيكي هو مبين في AFM للنانو المسافة البادئة من الخلايا مع التمدد. يجب إزالة الماسح الضوئي لوضع الموسع موضوعي. وترد ثلاث تمديدات الساق لجميع الساقين ثلاثة من رئيس AFM للسماح للجهازالتنسيب. ويستخدم لوحة محول لتركيب نقالة إلى الماسح الضوئي AFM (لوحة سوداء). يمسح شعاع ناتئ في اتجاه السهم هو مبين في مرحلة تمتد تسبق النقيض من الصورة خلية MLE12 (B). الساحات الحمراء في قبل (B) وبعد (C) وصور امتداد تصور المنطقة التي تم التقاطها خلال النانو المسافة البادئة (الهدف 40X). خرائط معامل مرونة، قبل (D) وبعد (E) وتمتد، ويتم الحصول على مع تقنيات تحليل المنشورة سابقا (13). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد تم تطوير جهاز فريد من نوعه لتصوير الخلايا الحية خلال تمتد الميكانيكية. وهذا الجهاز كان يستخدم في البروتوكول لدراسة الظهارية الرئة ذي الخلية mechanobiology. في الدراسات الأولية، تبين أن شريط واحد عقد حفز إنتاج الفائق الميتوكوندريا في الخلايا الظهارية القصبية. بالإضافة إلى ذلك، وقد تبين أن زيادة مستويات عالية من الضغط الميكانيكي تسبب الضرر المباشر لسلامة أحادي الطبقة من الخلايا الظهارية السنخية.

لإجراء هذه التجارب الأولية، ومعايرة لأول مرة الجهاز، ثم تبين أن سلالة غشاء وأحيلت إلى خلايا (الشكلان 2-3). عموما الجهاز أداء جيدا، كما يدل على ذلك الارتباط الوثيق بين سلالة غشاء (تقاس علامات على الغشاء) وسلالة الخلية (التي تقاس المسافات بين نوى) هو مبين في الشكل 3E. ومع ذلك، كانت هناك بعض الاختلافات الطفيفة الملحوظة بين سترافي قياسها على الأغشية خلال نهج ومنحنيات العائد من العلامات، كما هو مبين في الشكل 2D. ويعزى ذلك على الأرجح لهزة ارتدادية في الجهاز ويكون مرتبطا تجتاح القضايا. وبالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة إلى آلية عالمية متصاعدة للجهاز بحيث يمكن استخدامها بكفاءة على المجاهر مع تكوينات مختلفة. هذا من شأنه أن يقلل من الوقت الذي يقضيه بين المواقع من اكتساب الجهاز والصورة مع الحفاظ على اتصال قوي لالمجهر. واستخدمت ثقبا في الأغشية لتطبيق طفيفة قبل سلالة لغشاء لمنع تشكيل دولة ضاغطة الأولية بسبب تحامل من مادة مرنة. يقود دولة ضاغطة أيضا إلى تخفيض الحد الأقصى سلالة المعمول به.

وقد صمم الجهاز خصيصا لتناسب في اللجوء MFP3D مجهر القوة الذري للسماح النانو المسافة البادئة من الخلايا الحية خلال تمتد الميكانيكية. نحن لسنا على علم بأي جهاز آخر غير قادرة على فيducing دولة الإجهاد الخواص في الطائرة التصوير التي يمكن أن تعمل في إطار AFM. وقد تم تصميم الجهاز أيضا للاستخدام المستمر في حاضنة لزراعة الخلايا (أبقى عند 37 درجة مئوية في بيئة معقمة الرطبة مع 5٪ CO 2). القدرة على العمل ضمن حاضنة تسمح للدراسة الخلايا التي تمر نظم تمتد على المدى الطويل.

هناك العديد من القيود على نهج المقدمة. أولا، فيما يمتد الغشاء، ومجال التركيز ينتقل من الطائرة، على الرغم من أن الحد الأدنى (~ 100 ميكرون). يصبح هذا القيد عند تتبع حقل من الخلايا من خلال نظام تمتد، لأن مجال الرؤية يتغير على مدى وانتفاخ الغشاء. على الرغم من الغشاء داخل 22 مم الخبرات 0،23-0،25 الضغط، والمناطق خارج هذه التجربة قطرها الداخلي حقل سلالة أكثر تقلبا. على الرغم من أن الدراسات التصويرية محدودة بسهولة إلى هذه المنطقة المركزية، فمن الممكن أن الخلايا تستجيب لمستويات أعلى من سلالةفي المناطق الخارجية يمكن أن تؤثر على استجابة الخلايا داخل المنطقة المركزية. ويمكن تحقيق توزيع سلالة موحدة على مساحة أكبر من المصالح مع تحسينات في تصميم الغشاء. غشاء PDMS هو لصناعة السيارات في فلوري في موجات تستخدم عادة لمؤشرات الفلورسنت، وهذا يحد من القدرة على التصوير مضان في الخلايا من تحت الغشاء. لهذا السبب تم استخدام المجهر تستقيم مع أهداف مياه الغمر في دراساتنا الإنتاج ROS المذكورة أعلاه. هذا يمكن أن يكون القيد للدراسات التي يتم الجمع بين AFM والتصوير مضان.

الجهاز التجاري الأكثر شيوعا (FlexCell FX 5000 نظام التوتر) لتطبيق إجهاد ميكانيكي لخلايا يشتمل على نظام فراغ يمكن السيطرة عليها تطبيق إجهاد الشد على غشاء حين يدخلون ويخرجون من الطائرة البصرية. تصميم الغشاء والمشبك الواردة في هذه الوثيقة إنشاء حقل سلالة ثنائية المحوري حيث السلالة الخواص ويبقى في allowin الطائرةز في الوقت الحقيقي التصوير. مع تعديلات طفيفة على تصميم الغشاء، يمكن أن تنتج وسائط نقالة تمتد ذو محورين كذلك. إذا المصنف الخلايا أولا على غشاء منفوخ، في الطائرة الأحمال ضغطي يمكن أن تطبق أيضا. الجهاز قادر على الوصول المستويين الفسيولوجية والمرضية للسلالة. باختصار، وقد وضعت جهاز والبروتوكولات الجديدة التي يمكن استخدامها لتطبيق إجهاد ميكانيكي إلى الخلايا التي يمكن تصويرها باستخدام المجهر مضان وAFM النانو المسافة البادئة العيش.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر معهد فيديكس للتكنولوجيا في جامعة ممفيس لدعمهم. فإن الكتاب أن نعترف طلاب المجموعة مشروع تصميم العليا في قسم الهندسة الميكانيكية في جامعة ممفيس (ديفيد باتلر، جاكي كارتر، دومينيك كليفلاند، يعقوب شافير)، دانيال كوهن من قسم جامعة ممفيس للهندسة والتكنولوجيا التحكم في المحركات ، والدكتور عمر بن تنغ والسيدة Charlean Luellen لمساعدتهم في زراعة الخلايا. وأيد هذا العمل من قبل K01 HL120912 (ER) وR01 HL123540 (CMW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SmartMotor NEMA 34: 3400 Series MOOG Animatics SM3416D Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus
Flexcell Membrane (Collagen I coated) Flexcell International Corp SM2-1010C 3.5" x 5.25" x 0.020"
Sylgard 184 Dow Corning Corporation 10:1
Hoechst 33342  Sigma-Aldrich H1399 DAPI stain
MitoSOX Sigma-Aldrich M36008
Tiron Sigma-Aldrich D7389  mitochondrial superoxide label
DMEM superoxide inhibitor
FBS
HEPES
50 ml tubes Fisher Scientific 06-443-19 Any centriguge tube can be used to create an area for imaging.
Hybridization oven Bellco Glass
MLE12 Cells ATCC CRL-2110 Mouse Lung Epithelial Cells 
16HBE cells ATCC CRL-2741 Human Bronchial Epithelial Cells
AFM Indentation Experiments
Cantilever Beams for Nano-indentation Budget Sensors Si-Ni30
AFM  Asylum Research MFP3D
Olympus microscope Olympus IX-71 Inverted microscope with 20X and 40X objectives.
AFM Leg Extenders Asylum Research Not available AFM microscope
Finite Element Analyses
ABAQUS Simulia 6.12
Software
ImageJ NIH
Microscopes
Digital microscope Life Technologies EVOS XL Core Initially a self standing company, now owned by Life Technologies.
Confocal microscope Zeiss LSM 710 2-photon upright microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tschumperlin, D. J., Boudreault, F., Liu, F. Recent advances and new opportunities in lung mechanobiology. J Biomech. 43, 99-107 (2010).
  2. Waters, C. M., Roan, E., Navajas, D. Comprehensive Physiology. John Wiley, & Sons, Inc. (2011).
  3. Majkut, S., Dingal, P. C. D. P., Discher, D. E. Stress Sensitivity and Mechanotransduction during Heart Development. Current Biology. 24, R495-R501 (2014).
  4. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475, 316-323 (2011).
  5. Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. Mechanotransduction across the cell-surface and through the cytoskeleton. Science. 260, 1124-1127 (1993).
  6. Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).
  7. Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
  8. Waters, C. M. Reactive oxygen species in mechanotransduction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L484-L485 (2004).
  9. Chapman, K. E., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
  10. Chu, E. K., Whitehead, T., Slutsky, A. S. Effects of cyclic opening and closing at low- and high-volume ventilation on bronchoalveolar lavage cytokines. Crit Car Med. 32, 168-174 (2004).
  11. Tschumperlin, D., Margulies, S. Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro. Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).
  12. Vlahakis, N. E., Hubmayr, R. D. Cellular stress failure in ventilator-injured lungs. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1328-1342 (2005).
  13. Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L1235-L1241 (2012).
  14. Gamerdinger, K., et al. Mechanical load and mechanical integrity of lung cells - Experimental mechanostimulation of epithelial cell- and fibroblast-monolayers. J Mech Behav Biomed Mater. 4, 201-209 (2014).
  15. Hayashi, K., Naiki, T. Adaptation and remodeling of vascular wall; biomechanical response to hypertension. J Mech Behav Biomed Mater. 2, 3-19 (2009).
  16. Villemure, I., Stokes, I. Growth plate mechanics and mechanobiology. A survey of present understanding. J Biomech. 42, 1793-1803 (2009).
  17. Waters, C. M., et al. A system to impose prescribed homogenous strains on cultured cells. J Appl Physiol (1985). 91, 1600-1610 (2001).
  18. Gerstmair, A., Fois, G., Innerbichler, S., Dietl, P., Felder, E. A device for simultaneous live cell imaging during uni-axial mechanical strain or compression. J Appl Physiol (1985). 107, 613-620 (1985).
  19. Dassow, C., et al. A method to measure mechanical properties of pulmonary epithelial cell layers. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 101, 1164-1171 (2013).
  20. SmartMotor User's Guide v523. Animatics Corporation. Available from: http://www.animatics.com/download/publication/UsersGuide%20v523.pdf (2011).
  21. Chapman, K., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
  22. Birukov, K. G. Cyclic stretch, reactive oxygen species, and vascular remodeling. Antioxid Redox Signal. 11, 1651-1667 (2009).
  23. Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, 335-344 (2003).
  24. Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
  25. Pouvreau, S. Superoxide flashes in mouse skeletal muscle are produced by discrete arrays of active mitochondria operating coherently. PLoS One. 5, (2010).
  26. Yalcin, H. C., et al. Influence of cytoskeletal structure and mechanics on epithelial cell injury during cyclic airway reopening. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297, L881-L891 (2009).
  27. Jacob, A. M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and claudin 4. J Appl Physiol. 113, 1377-1387 (2012).
  28. DiPaolo, B. C., Lenormand, G., Fredberg, J. J., Margulies, S. S. Stretch magnitude and frequency-dependent actin cytoskeleton remodeling in alveolar epithelia. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C345-C353 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics