यांत्रिक खंड के दौरान लाइव सेल इमेजिंग

Bioengineering

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Rápalo, G., Herwig, J. D., Hewitt, R., Wilhelm, K. R., Waters, C. M., Roan, E. Live Cell Imaging during Mechanical Stretch. J. Vis. Exp. (102), e52737, doi:10.3791/52737 (2015).

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Abstract

Introduction

कोशिकाओं कई ऊतकों में यांत्रिक लोड के अधीन हैं, और इस यांत्रिक उत्तेजना जीन अभिव्यक्ति, विकास कारकों, साइटोकिन्स, या बाह्य मैट्रिक्स के पुनर्गठन की रिहाई के पैटर्न में बदलाव को बढ़ावा देने और 1-4 cytoskeleton दिखाया गया है। ऐसी यांत्रिक उत्तेजनाओं से transduced इंट्रासेल्युलर संकेतों mechanotransduction 5-7 की प्रक्रिया के माध्यम से होते हैं। श्वसन प्रणाली में, mechanotransduction का एक परिणाम प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) चक्रीय तन्यता तनाव की उपस्थिति में फेफड़े के उपकला कोशिकाओं में 8,9 और समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स 10 में वृद्धि हुई है। पुख्ता सबूत भी अत्यधिक तन्यता तनाव कोशिकाओं 11-14 के जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं के अलावा, वायुकोशीय उपकला को चोट निर्देशित करने के लिए ले जाता है कि पता चलता है। फोकस यहां यांत्रिक विरूपण करने के लिए फेफड़ों की कोशिकाओं की प्रतिक्रिया पर मुख्य रूप से है, mechanotransduction द्वारा प्रेरित रास्ते बस में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैंसंवहनी स्वर 15 के नियमन और विकास की थाली 16 के विकास सहित मानव शरीर में कई ऊतकों के आईसी समारोह।

mechanotransduction में बढ़ती रुचि संवर्धित कोशिकाओं और ऊतकों को physiologically प्रासंगिक यांत्रिक लोड के आवेदन के लिए कई उपकरणों के विकास में हुई है। विशेष रूप से, ऊतक द्वारा अनुभवी मैकेनिकल लोडिंग के एक आम रूप है, जो एक तन्यता तनाव, लागू करने, उपकरणों 11,17-19 लोकप्रिय हैं। हालांकि, उपलब्ध उपकरणों से कई या तो ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए एक बायोरिएक्टर के रूप में बनाया गया है या खिंचाव के साथ वास्तविक समय इमेजिंग के लिए अनुकूल नहीं हैं। जैसे, mechanotransduction के रास्ते की जांच की सुविधा के लिए तनाव में कोशिकाओं और ऊतकों कल्पना कर सकते हैं कि उपकरणों और तरीकों को विकसित करने की आवश्यकता है।

इस के साथ साथ, एक में विमान यांत्रिक खींच डिवाइस तैयार किया गया था और प्रोटोकॉल एम लागू करने के लिए विकसित किए गएएकाधिक ऊतकों को तनाव के रूपों और कोशिकाओं वास्तविक समय (चित्रा 1 ए डी) में जैव रासायनिक और यांत्रिक प्रतिक्रियाओं की इमेजिंग की इजाजत दी। इस उपकरण में एक लचीला झिल्ली समझ और लगभग 20% (चित्रा 1 बी) के लिए एक में विमान, रेडियल फैलावट ऊपर लागू करने के लिए circumferentially व्यवस्था की छह समान स्थान clamps के इस्तेमाल करता है। मोटर (चित्रा 1C) इनक्यूबेटर के बाहर तैनात है और मोटर सप्लायर द्वारा प्रदान मालिकाना सॉफ्टवेयर के द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जबकि actuating डिवाइस, समय की एक विस्तारित अवधि के लिए एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखा जा सकता है। मोटर तनाव और तनाव कम करने में समान रूप से छह स्ट्रेचर clamps के ड्राइविंग, एक आंतरिक कैम घूमता है जो एक रेखीय ड्राइवर, से जुड़ा है।

यांत्रिक उपकरण के अलावा, अनुकूलित लचीला झिल्ली यांत्रिक प्रणाली में इस्तेमाल किया जा करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल संस्कृति तैयार झिल्ली से बनाए गए थे। लगभग की एक व्यास के साथ फिर परिपत्र दीवारों (28 मिमी) बना दिया है और कोशिकाओं को ही अच्छी तरह से वर्णित तनाव प्रोफ़ाइल के इस क्षेत्र में संवर्धित किया जा सकता है कि इतना लचीला झिल्ली पर जुड़े थे। Actuating डिवाइस के भीतर इन झिल्लियों की नियुक्ति लचीला झिल्ली के केंद्र में वर्दी और isotropic तनाव प्रदान करेगा कि क्या यह निर्धारित करने के लिए, परिमित तत्व विश्लेषण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर (चित्रा 1E-एफ) का उपयोग किया गया था। लचीला झिल्ली सममित सीमा की स्थिति और जाल के लिए सभी चतुर्भुज तत्वों के उपयोग के साथ मॉडलिंग की थी। चित्रा 1F में दिखाया अधिकतम प्रिंसिपल तनाव के समोच्च साजिश में देखा गाढ़ा छल्ले तनाव की isotropic वितरण संकेत मिलता है।

झिल्ली द्वारा अनुभवी तनाव लोड हो रहा है (चित्रा 2) के माध्यम से चिह्नों की छवियों की रिकॉर्डिंग के द्वारा मापा गया था। चित्रा 2 डी रेडियल और अक्षीय दिशा-निर्देश में मापा औसत झिल्ली तनाव लगभग रैखिक था कि पता चलता हैलागू की मोटर के संबंध में 20% की एक अधिकतम रैखिक तनाव अप करने के लिए मायने रखता है। वापस आराम की स्थिति को त्याग के दौरान मापा उन के साथ तुलना फैलावट दौरान मापा तनाव के स्तर के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। अगला, कस्टम लचीला झिल्ली पर सुसंस्कृत मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं (16HBE) और उनके नाभिक के विस्थापन मापा गया। पूरे सेल विस्थापन एक डिजिटल माइक्रोस्कोप के साथ दर्ज चरण विपरीत छवियों के साथ मापा गया था जबकि 16HBE कोशिकाओं fluorescently लेबल (DAPI) नाभिक, एक confocal खुर्दबीन के नीचे एक 20x उद्देश्य का उपयोग imaged थे। चित्रा 3 में देखा, नाभिक के विस्थापन से मापा जाता है तनाव, अप करने के लिए ~ 20% रैखिक तनाव झिल्ली पर चिह्नों के विस्थापन से मापा जाता है कि इसी तरह की थी। यह झिल्ली के लिए लागू तनाव पक्षपाती कोशिकाओं को प्रेषित किया गया है कि पुष्टि करता है। एक पारंपरिक माइक्रोस्कोप पर कस्टम उपकरण के उपयोग का वर्णन प्रोटोकॉल और एक परमाणु शक्ति microscopई निम्न चरणों में प्रदान की जाती हैं।

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Protocol

रिटेंशन सेल की संस्कृति मीडिया के लिए अच्छी तरह से दीवारों (अंतिम उत्पाद के लिए चित्रा -1 देखें) के साथ झिल्ली 1. निर्माण

  1. कोलेजन मैं लेपित के साथ polydimethylsiloxane (PDMS) शीट का उपयोग करना, एक स्केलपेल या एक मरने के साथ लचीला झिल्ली की रूपरेखा काटा।
  2. भंडारण के लिए एक 60 मिमी पेट्री डिश में प्रत्येक झिल्ली रखें।
  3. दीवारों का निर्माण:
    1. बी (इलाज एजेंट) elastomer के लिए इलास्टोमेर एक के 1 वजन अनुपात: एक 10 पर PDMS मिलाएं।
    2. 50 मिलीलीटर ट्यूबों में पूरी तरह से मिश्रित PDMS की 5 मिलीलीटर डालो।
    3. क्षैतिज एक संकरण ओवन में uncured PDMS के साथ 50 मिलीलीटर ट्यूब रखें।
    4. इलाज समय के दौरान 8 rpm पर कोट करने के लिए ट्यूब के भीतर की दीवारों रोटर समारोह का उपयोग करें। आरटी पर, PDMS पूरी तरह से 2 दिनों में ठीक हो जाएगा।
    5. एक बाँझ सेल संस्कृति हुड में ट्यूब से PDMS निकालें।
    6. एक नई धार का प्रयोग, वर्गों ऊंचाई में 4 मिमी में PDMS के सिलेंडर विभाजन।
    7. झिल्ली वा रूप में काम करेगा जो वर्गों, रखेंLLS, की अनुमति के बिना एक पेट्री डिश कंटेनर में दीवारों बढ़ गई बनने के लिए।
  4. पेट्री डिश में दो को बनाए रखते हुए एक झिल्ली पर PDMS की एक दीवार का चयन करें और केंद्र।
  5. गोंद के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए दीवार के बाहर परिधि पर: (1 अनुपात 10) धीरे uncured PDMS जगह है। यह तरल बनाए रखने के लिए के बाद से वहाँ दीवार और झिल्ली के बीच अंतराल के गठन को रोकने।
  6. प्रत्येक पेट्री डिश पूरा झिल्ली युक्त और इलाज करने के लिए 24 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में कवर रखें।

अंशांकन के लिए दबाना विस्थापन या रेडियल ग्रोथ (चित्रा 2) के साथ मोटर घुमाव 2. सहसंबंध

  1. मोटर को नियंत्रित करने सॉफ्टवेयर शुरू करो।
  2. मोटर सॉफ्टवेयर में मार्गदर्शन सेटिंग का उपयोग कर डिवाइस के clamps के विस्थापित।
  3. दूरी को मापने और clamps के न्यूनतम और अधिकतम विस्थापन दोनों पर clamps के विरोध करने के बीच मोटर गिनती स्थिति रिकॉर्ड।
  4. विकास में प्रतिशत परिवर्तन की गणनामोटर गिनती (~ 0-75k मायने रखता है) के एक समारोह के रूप में clamps के बीच istance। यह झिल्ली पर हासिल की अधिकतम संभावित तनाव का संकेत होगा।

माउस फेफड़ों उपकला सेल लाइन पर खिंचाव की 3. आवेदन (MLE12)

  1. अच्छी तरह से प्रति लचीला झिल्ली पर 25 लाख कोशिकाओं (चरण 1) में बीज MLE12 कोशिकाओं दो दिनों के भीतर मिला हुआ होना करने के लिए। बोने घनत्व विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के लिए भिन्न हो सकते हैं।
  2. यांत्रिक actuator एक पूरी तरह से आराम की स्थिति में है सुनिश्चित करें।
    1. सेल संस्कृति मीडिया निकालें।
    2. छह दबाना में से प्रत्येक में दो छेद पंच, 1.5 मिमी बायोप्सी घूंसे का प्रयोग झिल्ली के टैब (चित्रा -1 देखें)। छेद के रेडियल नियुक्ति झिल्ली अनुभवों को शुरू में पूर्व तनाव की राशि निर्धारित करता है। कोई पूर्व तनाव वांछित है अगर झिल्ली टैब पर 20.5 मिमी के दायरे में छेद पंच।
    3. छिद्रित छेद clamps के भीतर पिन के साथ ऊपर की परत के साथ स्ट्रेचर पर झिल्ली स्थिति।जगह में शीर्ष clamps के रखें। शिकंजा एक समय बारी पक्ष में एक मजबूत करनी होगी।
    4. 1 मिलीलीटर सेल संस्कृति मीडिया जोड़ें।
  3. प्रकाश पथ के साथ झिल्ली के बीच केंद्रित खुर्दबीन मंच पर डिवाइस रखें।
  4. मंच के लिए इस उपकरण को ठीक करने के लिए टेप या मैग्नेट (यदि संभव हो) का प्रयोग करें। एक बार तय हो, माइक्रोस्कोप के मंच नियंत्रक के साथ यांत्रिक उपकरण की में विमान (झिल्ली के समानांतर) और ऊर्ध्वाधर (Z-दिशा) नियंत्रित करते हैं।
  5. मैन्युअल रूप से मोटर रोटेशन 20 की स्थिति और गति को नियंत्रित करने से निर्माता द्वारा प्रदान की सॉफ्टवेयर के साथ खिंचाव लागू करें।

Mitochondrial प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की 4. मापन (आरओएस)

  1. कोशिकाओं मिला हुआ हैं एक बार, सीधे कोशिकाओं पर माइटोकॉन्ड्रियल सुपरऑक्साइड सूचक (5 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता) के साथ आर टी DMEM के 1-2 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. धो कोशिकाओं धीरे बफर के साथ तीन बार करने के लिए एक पानी के स्नान में गरम37 डिग्री सेल्सियस।
  4. इसके तत्काल बाद एक ईमानदार confocal खुर्दबीन के तहत पहले से ही जगह में स्ट्रेचर (2.2 कदम) पर लचीला झिल्ली जगह है।
  5. फिनोल लाल मुक्त मध्यम और HEPES के 25 मिमी के साथ DMEM के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  6. 510/580 एनएम / उत्तेजना उत्सर्जन फिल्टर सेट करें।
  7. छवि कई क्षेत्रों में हर 15 मिनट माइटोकॉन्ड्रियल सुपरऑक्साइड उत्पादन के वांछित समय के पाठ्यक्रम बनाने के लिए।
  8. पर कब्जा कर लिया छवियों से, रिकॉर्ड प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रतिदीप्ति तीव्रता बढ़ाता करने में सक्षम सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रत्येक समय अंतराल पर histograms।

मांसपेशियों और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी 5. आवेदन (AFM)

नोट: ये कदम एक विशिष्ट AFM और ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप संयोजन (चित्रा 4 और सामग्री की सूची) के लिए प्रदान की जाती हैं।

  1. प्रयोग के लिए है AFM तैयार करें।
    1. Z-दिशा में इसकी अधिकतम स्थिति के लिए AFM के सिर की ऊंचाई बढ़ाने के।
    2. AFM की पैर पर extenders रखोविमान लिफ्ट जो AFM के ब्रैकट संपर्कों नमूना पर। नमूना और AFM सिर यांत्रिक उपकरण की ऊंचाई को समायोजित करने के लिए उठाया जा करने की जरूरत है।
  2. (यदि उपलब्ध हो) ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप तैयार करें।
    1. AFM के स्कैनर थाली निकालें। वांछित उद्देश्य निकालें।
    2. उद्देश्य के लिए एक स्पेसर जोड़ें। स्पेसर की ऊंचाई उद्देश्य और विशिष्ट AFM के सेट-अप पर निर्भर करेगा, लेकिन अवलोकन विमान स्ट्रेचर और अनुकूलक ऊंचाई (चित्रा के बराबर राशि से Z-दिशा में शिफ्ट हो जाएगा के बाद से ऑप्टिकल इमेजिंग वांछित है अगर यह आवश्यक है 5A)। AFM के आमतौर पर डिवाइस के ऊपर एक ऑप्टिकल पथ से कम बढ़ाई इमेजिंग प्रदान करता है कि ध्यान दें।
    3. अपने स्थान में वांछित उद्देश्य वापस माउंट। AFM के लिए पीठ पर स्कैनर रखें।
    4. AFM के सॉफ्टवेयर को शुरू करें। प्रतिदीप्ति माप के लिए प्रकाश स्रोत सहित सभी आवश्यक प्रकाश स्रोतों की शुरुआत करें।
    5. एक ब्रैकट किरण के साथ एक चिप माउंटवांछित मापन के लिए उपयुक्त है। जीवित कोशिकाओं के लोचदार मापांक जब मापने 200 PN / एनएम या उससे कम कठोरता पसंद किया जाता है।
    6. लेजर संरेखित करें और डिवाइस पर घुड़सवार एक गिलास coverslip पर निर्माता के सुझाव के अनुसार ब्रैकट कठोरता जांचना।
  3. चरण 1 में के रूप में एक झिल्ली को तैयार है, लेकिन निम्नलिखित संशोधनों के साथ।
    1. इसके तत्काल बाद खींच डिवाइस के लिए पर झिल्ली बढ़ते से पहले, ऊंचाई में लगभग 1 मिमी करने के लिए दीवारों में कटौती। यह झिल्ली दीवारों और लोड सेल के बीच अनुभवी हस्तक्षेप से बचाता है।
    2. 3.2.1-3.2.3 वर्णित के रूप में यांत्रिक उपकरण पर झिल्ली माउंट।
    3. एक फैल के मामले में AFM के स्कैनर को होने वाले नुकसान को रोकने के लिए सेल संस्कृति मीडिया निकालें।
    4. युगल एक एडाप्टर (चित्रा 5 ए) के साथ डिवाइस। स्कैनर पर अनुकूलक के साथ यांत्रिक उपकरण रखें।
    5. वांछित तन्यता तनाव के स्तर तक झिल्ली स्ट्रेच।
  4. कारण एक गिर करने के लिए AFM के स्कैनर या माइक्रोस्कोप क्षति से बचने के लिए कोशिकाओं पर मीडिया के एक सीमित (<0.5 एमएल) मात्रा में शामिल करें।
  5. झिल्ली के साथ ब्रैकट बीम व्यस्त हैं।
  6. हित के क्षेत्रों को स्कैन करने के लिए विशेष रूप से AFM के डिवाइस के प्रोटोकॉल का पालन करें।

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Representative Results

प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों और विरूपण

पिछले अध्ययनों चक्रीय खिंचाव 21 के जवाब में airway और वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) में वृद्धि से पता चला है। रिएक्टिव ऑक्सीजन प्रजातियों अणुओं और लिपिड, प्रोटीन, polysaccharides, और न्यूक्लिक एसिड 22-24 के लिए उच्च जेट के साथ आणविक ऑक्सीजन से व्युत्पन्न मुक्त कण में शामिल हैं। आरओएस एक आम इंट्रासेल्युलर आयन चैनल समारोह को विनियमित करने के संकेत, प्रोटीन काइनेज / फॉस्फेट सक्रियण, और जीन की अभिव्यक्ति के रूप में सेवा है, लेकिन जरूरत से ज्यादा या अनियमित उत्पादन apoptotic और परिगलित कोशिका मृत्यु, neurodegeneration, atherosclerosis, मधुमेह और कैंसर 24,25 करने के लिए योगदान कर सकते हैं। इलेक्ट्रॉनों इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण श्रृंखला से रिसाव जब Superoxide, आरओएस के अन्य रूपों के लिए एक पूर्व कर्सर, माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन की एक उप-उत्पाद के रूप में उत्पादन किया जा सकता है। पिछले अध्ययनों चक्रीय यांत्रिक खिंचाव सुपर के उत्पादन को प्रेरित सुझाव दिया है किएनएडीपीएच ओक्सीडेस प्रणाली (निकोटिनामाइड एडिनाइन डाईन्यूक्लियोटाइड फॉस्फेट ओक्सीडेस) और mitochondrial इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (जटिल मैं और तृतीय) का एक संयोजन के माध्यम से ऑक्साइड। यह इस उत्तेजना की वजह से सेल cytoskeleton के लिए कनेक्शन की वजह से संभवतः माइटोकॉन्ड्रिया 21 का एक सीधा विरूपण करने के लिए किया गया है कि प्रस्तावित किया गया है। इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, डिवाइस खींच सेल विकसित किया गया था हम कर सकते थे कि इतना यांत्रिक खिंचाव के जवाब में जीवित कोशिकाओं में आरओएस उत्पादन में छवि बदल जाता है। इधर, खिंचाव के कारण ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं द्वारा उत्पादित माइटोकॉन्ड्रियल आरओएस कस्टम डिवाइस और प्रोटोकॉल का उपयोग मापा गया था। यांत्रिक खिंचाव के अभाव में आरओएस उत्पादन काफी 60 मिनट (चित्रा 4) से अधिक वृद्धि नहीं था। एक भी 17% खिंचाव आवेदन किया है और बनाए रखा गया था, एक और 60 मिनट के लिए बनी है कि माइटोकॉन्ड्रियल आरओएस में वृद्धि हुई थी।

कारण फैलाने के लिए सीधी उपकला Monolayer नुकसान

2 गहराई में चर्चा की गई है हानि पहुँचाता है जिसके द्वारा अप्रत्यक्ष तंत्र। कई अध्ययनों से फेफड़ों के उपकला कोशिकाओं के अत्यधिक यांत्रिक खिंचाव कोशिकाओं 11,13,26,27 को होने वाले नुकसान को शामिल प्रत्यक्ष चोट पैदा कर सकता है कि सुझाव। नुकसान के इस प्रकार यांत्रिक फैलावट के दौरान वास्तविक समय इमेजिंग के बिना कब्जा करने के लिए मुश्किल है। जैसे, कस्टम डिवाइस और चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी यंत्रवत् से पहले दर्ज किए गए थे बढ़ाकर कि कोशिकाओं की और एक समर्थक भड़काऊ साइटोकाइन (6 घंटे के लिए 50 एनजी / एमएल TNF-α) (चित्रा 5) के साथ उपचार के बाद लगातार छवियों का उपयोग। कोशिकाओं के एक ही क्षेत्र की छवियाँ बढ़ रही तनाव स्तरों पर कब्जा कर लिया गया। छवियों लाल तीर द्वारा संकेत के रूप में कोशिकाओं 10 और 15% के बीच तनाव फैला रहे थे जब एक अंतराल के गठन दिखा। यह stretc के अंत के बीच <, इन छवियों के पास वास्तविक समय में दर्ज किया गया है कि अंतराल के 10 सेकंड के नोट करना महत्वपूर्ण है एच और इमेजिंग, कोशिकाओं को बढ़ाया गया है। फैला कोशिकाओं के सेल इमेजिंग के पिछले अध्ययनों में, छवियों से पहले और खिंचाव नहीं बढ़ाया हालत 11,13,28 में कोशिकाओं का ही छवियों की तुलना के बाद प्राप्त किया गया।

फैला कोशिकाओं पर AFM के नैनो खरोज

यांत्रिक उपकरण (चित्रा 6A देखें) एक एडाप्टर थाली के उपयोग के साथ है AFM में रखा गया था। पहले प्रकाशित विधियों 13, लोचदार मापांक नक्शे से पहले MLE12 कोशिकाओं (ई-नक्शे) और 10% के बाद तन्यता तनाव का उपयोग (चित्रा 6D-ई) प्राप्त किया गया। 10% तनाव (चित्रा 6D) में चरण विपरीत छवि को फैलाने के 10 सेकंड के भीतर प्राप्त किया गया था हालांकि, चित्रा 6D-ई में दिखाया गया ई-नक्शे एक 40 माइक्रोन x 40 माइक्रोन से अधिक दर्ज की गई 300 व्यक्ति बल नीचे को झुकाव घटता के साथ लगभग 22 मिनट का सेवन Z-दिशा में टिप के एक 2.5 माइक्रोन / एस वेग के साथ क्षेत्र।ओम / फ़ाइलें / ftp_upload / 52,737 / 52737fig1highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 1
चित्रा 1. सेल संस्कृति और खींच लिए कस्टम डिजाइन डिवाइस। (ए) डिवाइस के यांत्रिक डिजाइन के कम्प्यूटर जनित ड्राइंग, (बी) पूरा डिवाइस, (सी) 1-आयामी गति में मोटर रोटेशन धर्मान्तरित जो मोटर और रैखिक ड्राइवर, से जुड़ा डिवाइस की तस्वीर की तस्वीर जो (डी) सिलिकॉन रबर की झिल्ली दबाना द्विअक्षीय खिंचाव नियंत्रित करता है। सब्सट्रेट प्रत्येक दबाना पर पदों पर रखा जा करने के लिए प्रत्येक दबाना टैब पर दो छेद होते हैं। कारण सममित सीमा की स्थिति का उपयोग करने के लिए पूरे ढांचे के 1/4 है कि लचीला झिल्ली (ई) dimensioned FEA मॉडल। ( टुनिशिया> एफ) अधिकतम प्रिंसिपल तनाव isotropic तनाव क्षेत्र का संकेत के छल्ले के गठन का चित्रण पूर्ण झिल्ली में दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 (ए) एप्लाइड तनाव को मापने के लिए आवेदन किया है चिह्नों के साथ एक लचीला झिल्ली का समर्थन डिवाइस दिखाया गया है। बंद हुआ (बी) के पहले चिह्नों की छवियों, और बाद में (सी) खिंचाव, झिल्ली पर चिह्नों के विस्थापन का संकेत स्पष्ट रूप से करने के लिए एक तीर के साथ लेबल रहे थे। मोटर के एक समारोह के रूप में (डी) झिल्ली तनाव दृष्टिकोण और त्याग के दौरान गिना जाता है। झिल्ली तनाव त्याग से थोड़ा अधिक उपभेदों के उत्पादन के साथ दोनों दृष्टिकोण और त्याग में इसी तरह की थी। = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52737/52737fig2highres.jpg" लक्ष्य = "_blank" href> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. झिल्ली तनाव कोशिकाओं को संचरण। (ए - बी) (ए) से पहले एक 10x उद्देश्य का उपयोग कर, लचीला झिल्ली पर मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं (16HBE) के चरण विपरीत छवियों और (बी) 20% तनाव के बाद। (सी - डी) 16HBE कोशिकाओं fluorescently लेबल (DAPI) नाभिक (सी) से पहले और (डी) 20% तनाव के बाद, एक confocal खुर्दबीन के नीचे एक 20x उद्देश्य का उपयोग imaged थे। (ई) कोशिकाओं द्वारा अनुभवी झिल्ली तनाव रैखिक और समरूप था।टी = "_blank"> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. 16HBE कोशिकाओं के आरओएस उत्पादन पर एक भी खिंचाव के प्रभाव का एक confocal खुर्दबीन के नीचे एक 20x उद्देश्य का उपयोग कर एक संचयी माइटोकॉन्ड्रियल सुपरऑक्साइड सेंसर का उपयोग कर मनाया गया (एक - सी)। फोटो समय के पाठ्यक्रम (0, 60 मिनट, और ~ कोशिकाओं के एक ही क्षेत्र में खिंचाव के दौरान सुपर उत्पादन का 65 मिनट)। (डी) पहले घंटे के भीतर सुपरऑक्साइड की आधारभूत उत्पादन से प्रतिदीप्ति तीव्रता में 50% की वृद्धि (बी करने के लिए ए) का संकेत है कि समय के साथ 16HBE कोशिकाओं के रिश्तेदार प्रतिदीप्ति तीव्रता। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा बढ़ रही खिंचाव के लिए एक वायुकोशीय उपकला (MLE12) monolayer की प्रतिक्रिया 5. चरण विपरीत छवियों (ए - डी)। सभी एक 20x उद्देश्य के साथ एक डिजिटल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर दर्ज किया गया। तीर सेल के लिए सेल जुदाई हुआ स्थानों जहां से संकेत मिलता है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
खिंचाव के साथ कोशिकाओं की नैनो खरोज के लिए है AFM में दिखाया चित्रा 6 (ए) यांत्रिक उपकरण। स्कैनर उद्देश्य बढ़ाने की नियुक्ति के लिए हटा दिया जाना चाहिए। तीन पैर extenders के डिवाइस के लिए अनुमति देने के लिए AFM के सिर के सभी तीन पैरों से जुड़े होते हैंनियुक्ति। एक अनुकूलक प्लेट AFM के स्कैनर (काले रंग की थाली) पर स्ट्रेचर माउंट करने के लिए उपयोग किया जाता है। पहले खंड के चरण विपरीत छवि एक MLE12 सेल (बी) में दिखाया गया है तीर की दिशा में ब्रैकट बीम स्कैन। पहले (बी) और (सी) खिंचाव छवियों के बाद लाल वर्गों नैनो खरोज (40x उद्देश्य) के दौरान कब्जा कर लिया था कि क्षेत्र को दर्शाती है। लोचदार मापांक नक्शे, (डी) पहले और बाद में (ई) खिंचाव, पहले प्रकाशित विश्लेषण तकनीक 13 के साथ प्राप्त कर रहे हैं। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यांत्रिक खंड के दौरान जीवित कोशिका इमेजिंग के लिए एक अद्वितीय उपकरण विकसित किया गया था; और इस डिवाइस फेफड़ों के उपकला कोशिका mechanobiology अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया था। प्रारंभिक अध्ययन में, यह एक भी आयोजित खिंचाव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं में mitochondrial सुपरऑक्साइड के उत्पादन को प्रेरित है कि पाया गया था। इसके अलावा, यह यांत्रिक तनाव के स्तर में वृद्धि वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं की एक monolayer की अखंडता के लिए प्रत्यक्ष क्षति के कारण होता है कि प्रदर्शन किया गया।

इन प्रारंभिक प्रयोगों का संचालन करने के लिए, डिवाइस पहले से calibrated किया गया था, और फिर यह झिल्ली तनाव कोशिकाओं (आंकड़े 2-3) को प्रेषित किया गया है कि दिखाया गया था। चित्रा 3E में दिखाया गया है (झिल्ली पर निशान से मापा) झिल्ली तनाव और (नाभिक के बीच दूरी से मापा) सेल तनाव के बीच करीबी संबंध द्वारा संकेत के रूप में कुल मिलाकर डिवाइस है, अच्छा प्रदर्शन किया। हालांकि, रणनीति के बीच मनाया कुछ मामूली मतभेद थेचित्रा 2 डी में दिखाया गया के रूप में, दृष्टिकोण के दौरान झिल्ली और मार्कर की वापसी से घटता पर मापा जाता है। इस डिवाइस में प्रतिक्रिया करने की संभावना की वजह से और मुद्दों को उत्साहित करने के लिए संभवतः संबंधित था। यह कुशलता से अलग विन्यास के साथ सूक्ष्मदर्शी पर इस्तेमाल किया जा सकता है, ताकि इसके अलावा, इस उपकरण के लिए एक सार्वभौमिक बढ़ते तंत्र की जरूरत है। इस खुर्दबीन के लिए एक मजबूत कनेक्शन को बनाए रखते हुए डिवाइस और छवि अधिग्रहण की स्थिति के बीच बिताए समय को कम करेगा। झिल्ली में छिद्रित छेद की वजह से एक लोचदार सामग्री की clamping के लिए एक प्रारंभिक दबाने राज्य के गठन को रोकने के लिए झिल्ली को एक नाबालिग पूर्व तनाव लागू करने के लिए इस्तेमाल किया गया। दबाने राज्य भी अधिकतम लागू तनाव की कमी आती है।

कस्टम डिवाइस यांत्रिक खंड के दौरान जीवित कोशिकाओं की नैनो खरोज अनुमति देने के लिए एक शरण MFP3D परमाणु सेना माइक्रोस्कोप में फिट करने के लिए डिजाइन किया गया था। हम में सक्षम है कि किसी भी अन्य डिवाइस के बारे में पता नहीं कर रहे हैंएक AFM के भीतर कार्य कर सकते हैं कि इमेजिंग विमान में एक isotropic तनाव राज्य ducing। इस उपकरण में भी एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में निरंतर उपयोग के लिए डिजाइन किया गया था (5% सीओ 2 के साथ एक नम, बाँझ वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा)। एक मशीन के भीतर कार्य करने की क्षमता लंबी अवधि के खिंचाव परहेजों के दौर से गुजर कोशिकाओं के अध्ययन की अनुमति देता है।

प्रस्तुत दृष्टिकोण करने के लिए कई सीमाएं हैं। सबसे पहले, झिल्ली हिस्सों के रूप में, ध्यान के क्षेत्र हालांकि न्यूनतम रूप से, हवाई जहाज से बाहर ले जाता है (~ 100 माइक्रोन)। देखने के क्षेत्र झिल्ली फैलावट के पाठ्यक्रम पर बदलता है, क्योंकि एक खिंचाव आहार के माध्यम से कोशिकाओं के एक क्षेत्र पर नज़र रखने के लिए जब यह एक सीमा हो जाता है। 22 मिमी व्यास के भीतर झिल्ली 0.23-0.25 तनाव का अनुभव करता है हालांकि, इस भीतरी व्यास अनुभव एक और अधिक चर तनाव मैदान के बाहर के क्षेत्रों में। इमेजिंग अध्ययन आसानी से इस मध्य क्षेत्र तक ही सीमित कर रहे हैं, यह कोशिकाओं तनाव का उच्च स्तर का जवाब देने संभव है किबाहरी क्षेत्रों में मध्य क्षेत्र के भीतर कोशिकाओं की प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं। ब्याज की एक बड़े क्षेत्र पर एक वर्दी तनाव वितरण झिल्ली डिजाइन में सुधार के साथ प्राप्त किया जा सकता है। PDMS झिल्ली सामान्यतः फ्लोरोसेंट संकेतक के लिए इस्तेमाल तरंग दैर्ध्य में ऑटो फ्लोरोसेंट है, और इस झिल्ली के नीचे से कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए क्षमता की सीमा। इस कारण एक ईमानदार माइक्रोस्कोप ऊपर वर्णित आरओएस उत्पादन के हमारे अध्ययन में पानी विसर्जन उद्देश्यों के साथ उपयोग किया गया था। इस AFM और प्रतिदीप्ति इमेजिंग संयुक्त कर रहे हैं, जिसमें अध्ययन के लिए एक सीमा हो सकती है।

कोशिकाओं को यांत्रिक तनाव को लागू करने के लिए सबसे आम वाणिज्यिक डिवाइस (Flexcell FX 5000 तनाव सिस्टम) में और ऑप्टिकल विमान से बाहर जाने, जबकि एक झिल्ली पर तन्यता तनाव को लागू करने के लिए एक चलाया हुआ निर्वात प्रणाली को शामिल किया गया। तनाव isotropic है और विमान allowin में रहता है, जहां इस के साथ साथ प्रस्तुत झिल्ली और दबाना डिजाइन एक द्वि-अक्षीय तनाव क्षेत्र बनानेजी वास्तविक समय इमेजिंग। झिल्ली डिजाइन करने के लिए मामूली संशोधनों के साथ, स्ट्रेचर के रूप में अच्छी तरह से एक अक्षीय खिंचाव मोड उत्पादन कर सकते हैं। कोशिकाओं पहले एक distended झिल्ली पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, में विमान compressive भार भी लागू किया जा सकता है। डिवाइस तनाव के दोनों शारीरिक और रोग के स्तर तक पहुंचने के लिए सक्षम है। सारांश में, एक नई डिवाइस और प्रोटोकॉल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और AFM नैनो खरोज का उपयोग imaged किया जा सकता है कि कोशिकाओं को जीने के लिए यांत्रिक तनाव लागू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि विकसित किए गए।

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।

Acknowledgments

लेखकों के उनके समर्थन के लिए मेम्फिस के विश्वविद्यालय में प्रौद्योगिकी के फेडेक्स संस्थान को धन्यवाद कि चाहते हैं। लेखकों मेम्फिस (डेविड बटलर, जैकी कार्टर, डोमिनिक क्लीवलैंड, याकूब शैफर) विश्वविद्यालय में मैकेनिकल इंजीनियरिंग विभाग में वरिष्ठ डिजाइन परियोजना के समूह के छात्रों को स्वीकार करना चाहते हैं, मोटर नियंत्रण के लिए विश्वविद्यालय मेम्फिस के इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकी विभाग की ओर से डेनियल कोह्न सेल संस्कृति में उनकी मदद के लिए, और डॉ बिन टेंग और सुश्री Charlean Luellen। इस काम K01 HL120912 (ईआर) और R01 HL123540 (CMW) द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SmartMotor NEMA 34: 3400 Series MOOG Animatics SM3416D Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus
Flexcell Membrane (Collagen I coated) Flexcell International Corp SM2-1010C 3.5" x 5.25" x 0.020"
Sylgard 184 Dow Corning Corporation 10:1
Hoechst 33342  Sigma-Aldrich H1399 DAPI stain
MitoSOX Sigma-Aldrich M36008
Tiron Sigma-Aldrich D7389  mitochondrial superoxide label
DMEM superoxide inhibitor
FBS
HEPES
50 ml tubes Fisher Scientific 06-443-19 Any centriguge tube can be used to create an area for imaging.
Hybridization oven Bellco Glass
MLE12 Cells ATCC CRL-2110 Mouse Lung Epithelial Cells 
16HBE cells ATCC CRL-2741 Human Bronchial Epithelial Cells
AFM Indentation Experiments
Cantilever Beams for Nano-indentation Budget Sensors Si-Ni30
AFM  Asylum Research MFP3D
Olympus microscope Olympus IX-71 Inverted microscope with 20X and 40X objectives.
AFM Leg Extenders Asylum Research Not available AFM microscope
Finite Element Analyses
ABAQUS Simulia 6.12
Software
ImageJ NIH
Microscopes
Digital microscope Life Technologies EVOS XL Core Initially a self standing company, now owned by Life Technologies.
Confocal microscope Zeiss LSM 710 2-photon upright microscope

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References

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