Imaging Live Cell durante meccanica Stretch

Bioengineering

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Rápalo, G., Herwig, J. D., Hewitt, R., Wilhelm, K. R., Waters, C. M., Roan, E. Live Cell Imaging during Mechanical Stretch. J. Vis. Exp. (102), e52737, doi:10.3791/52737 (2015).

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Abstract

Introduction

Le cellule sono sottoposte a sollecitazioni meccaniche in molti tessuti, e questa stimolazione meccanica ha dimostrato di promuovere cambiamenti nei modelli di espressione genica, il rilascio di fattori di crescita, citochine, o rimodellamento della matrice extracellulare e citoscheletro 1-4. I segnali intracellulari trasdotte da tali stimoli meccanici avvengono attraverso il processo di meccanotrasduzione 5-7. Nel sistema respiratorio, un risultato di mechanotransduction è l'aumento delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) 8,9 e citochine pro-infiammatorie 10 in cellule epiteliali polmonari in presenza di deformazione a trazione ciclica. Forte evidenza suggerisce anche che un'eccessiva deformazione a trazione porta a dirigere ferita all'epitelio alveolare, oltre alle risposte biochimiche delle cellule 11-14. Anche se il fuoco qui è soprattutto sulla risposta delle cellule polmonari a deformazione meccanica, percorsi indotte da meccanotrasduzione svolgono un ruolo chiave nei basic funzione di molti tessuti del corpo umano, compresa la regolazione del tono vascolare 15 e lo sviluppo della piastra di crescita 16.

Il crescente interesse meccanotrasduzione ha portato allo sviluppo di numerosi dispositivi per l'applicazione di fisiologicamente rilevanti sollecitazioni meccaniche alle cellule in coltura e tessuti. In particolare, i dispositivi che applicano lo sforzo a trazione, che è una forma comune di carico meccanico sperimentato da tessuto, sono popolari 11,17-19. Tuttavia, molti dei dispositivi disponibili sono sia concepita come un bioreattore per applicazioni di ingegneria tissutale o non sono favorevoli a delle immagini in tempo reale con la stirata. In quanto tale, vi è la necessità di sviluppare strumenti e metodi in grado di visualizzare le cellule e tessuti in tensione per facilitare la ricerca di percorsi di meccanotrasduzione.

Qui, un dispositivo che si estende in piano meccanico è stato progettato e sono stati sviluppati protocolli per applicare mforme ultiple di tensione ai tessuti e cellule pur consentendo l'imaging delle risposte biochimiche e meccaniche in tempo reale (Figura 1A-D). Il dispositivo utilizza sei morsetti equidistanti disposte circonferenzialmente ad afferrare una membrana flessibile e applicare una in piano, radiale distensione fino a circa il 20% (Figura 1B). Il dispositivo di azionamento può essere collocato in un incubatore di coltura cellulare per un periodo di tempo prolungato, mentre il motore (Figura 1C) è posizionato all'esterno dell'incubatrice e controllato da software proprietario fornito dal fornitore del motore. Il motore è collegato ad un driver lineare, che fa ruotare una camma interna, guidando i sei morsetti barella uniformemente in tensione e rilassamento.

Oltre al dispositivo meccanico, membrane flessibili personalizzati sono stati creati da commercialmente disponibili coltura cellulare membrane pronti per essere utilizzati nel sistema meccanico. Poi pareti circolari (con un diametro di circa28 mm) sono state fatte e attaccato alla membrana flessibile in modo che le cellule possono essere coltivate solo in questa regione del profilo ceppo ben descritto. Al fine di determinare se il posizionamento di queste membrane all'interno del dispositivo di azionamento fornirebbe una sollecitazione uniforme e isotropo nel centro della membrana flessibile, analisi agli elementi finiti è stata condotta utilizzando software disponibile in commercio (Figura 1E-F). La membrana flessibile è stato modellato con condizioni al contorno simmetriche e utilizzando tutti gli elementi quadrangolari per la maglia. Gli anelli concentrici visto nella trama di contorno di massima deformazione principale mostrato nella Figura 1F indicano la distribuzione isotropa del ceppo.

Il ceppo sperimentato dalla membrana è stata misurata registrando immagini marcature attraverso carico (Figura 2). Figura 2D mostra che la deformazione media membrana misurata in direzioni radiali e assiali era approssimativamente linearerispetto al motore applicata conta fino a un ceppo lineare massima di 20%. Non c'era alcuna differenza significativa tra i livelli di deformazione misurati durante distensione rispetto a quelli misurati durante la retrazione nella posizione di riposo. Successivamente, lo spostamento di cellule umane bronchiali epiteliali (16HBE) e loro nuclei coltivate sulla membrana flessibile personalizzato sono stati misurati. Fluorescente (DAPI) nuclei delle cellule 16HBE sono stati ripresi utilizzando un obiettivo 20X al microscopio confocale, mentre lo spostamento a cellula intera è stata misurata con le immagini registrate contrasto di fase con un microscopio digitale. Come si vede in figura 3, la deformazione misurato dallo spostamento dei nuclei era simile a quello misurato per spostamento di marcature sulla membrana, fino a ~ 20% di deformazione lineare. Ciò conferma che il ceppo applicato alle membrane è stata trasmessa alle cellule aderenti. I protocolli che descrivono l'uso del dispositivo personalizzato su un microscopio tradizionale e una forza microscop atomicae sono previste nei seguenti passi.

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Protocol

1. Costruzione di membrana con Well Mura per la conservazione di cellule di coltura (vedi Figura 1D per il prodotto finale)

  1. Utilizzando polidimetilsilossano (PDMS) fogli rivestiti con collagene I, tagliare il contorno della membrana flessibile con un bisturi o un dado.
  2. Posizionare ogni membrana in una piastra di Petri di 60 mm per immagazzinaggio.
  3. Creazione di pareti:
    1. Mescolare PDMS in un rapporto di 10: 1 in peso di elastomero A a elastomero B (induritore).
    2. Versare 5 ml di PDMS completamente misti in provette da 50 ml.
    3. Mettere 50 ml tubi con PDMS TDS orizzontalmente in un fornetto.
    4. Utilizzare la funzione del rotore per rivestire le pareti interne dei tubi a 8 rpm durante il tempo di polimerizzazione. A RT, i PDMS saranno perfettamente polimerizzato in 2 giorni.
    5. Rimuovere il PDMS dal tubo in una cappa sterile coltura cellulare.
    6. Utilizzando una nuova lama di rasoio, partizionare il cilindro di PDMS in sezioni 4 millimetri di altezza.
    7. Posizionare le sezioni, che servirà come il wa membranalls, in un contenitore piatto Petri senza consentire alle pareti diventino creased.
  4. Selezionare e centrare una parete di PDMS su una membrana, mantenendo i due nella scatola di Petri.
  5. Posizionare delicatamente PDMS TDS (10: 1 ratio) sul perimetro esterno della parete da utilizzare come collante. Evitare la formazione di spazi vuoti tra la parete e la membrana essendo lì per trattenere liquidi.
  6. Inserire ogni piatto Petri contenente la membrana completato e coperto in stufa a 70 ° C per 24 ore per curare.

2. Correlazione di giri del motore con morsetto Spostamento o crescita radiale per la calibrazione (Figura 2)

  1. Avviare il software di controllo del motore.
  2. Spostare i morsetti del dispositivo utilizzando l'impostazione manuale del software del motore.
  3. Misurare la distanza e registrare la posizione di conteggio del motore tra opposte morsetti sia cilindrata minima e massima delle pinze.
  4. Calcolare la variazione percentuale distance fra le ganasce in funzione del conteggio motore (~ 0-75k conteggi). Ciò indica la deformazione massima potenziale raggiunto sulla membrana.

3. Applicazione di Stretch su Cell Line polmone mouse epiteliale (MLE12)

  1. Seed MLE12 cellule a 2,5 milioni di cellule sulla membrana flessibile (Fase 1) per pozzetto da confluenti entro due giorni. La densità di semina può variare per diversi tipi di cellule.
  2. Assicurarsi che l'attuatore meccanico è in una posizione completamente rilassato.
    1. Rimuovere cellule di coltura.
    2. Utilizzando 1,5 millimetri punzoni biopsia, perforare due fori in ciascuna delle sei morsetto (vedi Figura 1D) linguette della membrana. Il posizionamento radiale dei fori determina la quantità di pre-tensionamento esperienze membrana inizialmente. Perforare i fori ad un raggio di 20,5 mm sulle linguette membrana se non pretensionamento è desiderato.
    3. Posizionare la membrana sulla barella con i fori punzonati allineando i perni nei morsetti.Primo posto morsetti a posto. Serrare le viti una alla volta alternando i lati.
    4. Aggiungere 1 ml terreni di coltura delle cellule.
  3. Posizionare il dispositivo sul palco microscopio centraggio mezzo della membrana con il percorso ottico.
  4. Utilizzare nastro o magneti (se possibile) per fissare il dispositivo alla fase. Una volta fissato, il controllo in-plane (parallela alla membrana) e verticale (direzione z) del dispositivo meccanico con il controllore del microscopio.
  5. Applicare stirata con il software fornito dal produttore controllando manualmente la posizione e la velocità di rotazione del motore 20.

4. Misura di mitocondriali specie reattive dell'ossigeno (ROS)

  1. Una volta che le cellule sono confluenti, aggiungere 1-2 ml di RT DMEM con indicatore superossido mitocondriale (5 mM concentrazione finale) direttamente sulle cellule.
  2. Incubare per 10 minuti a 37 ° C.
  3. Lavare le cellule delicatamente per tre volte con tampone riscaldato a bagnomaria per37 ° C.
  4. Porre immediatamente la membrana flessibile sulla barella (Step 2.2) già in atto con un microscopio confocale in posizione verticale.
  5. Aggiungere 1 ml di DMEM con terreno privo di fenolo-rosso e 25 mm di HEPES.
  6. Impostare filtri di eccitazione / emissione di 510/580 nm.
  7. Immagine più campi ogni 15 minuti per creare il decorso temporale desiderato di produzione di superossido mitocondriale.
  8. Dalle immagini catturate, intensità della fluorescenza registrare istogrammi ad ogni intervallo di tempo utilizzando il software in grado di quantificare l'intensità di fluorescenza.

5. Applicazione di Stretch e microscopia a forza atomica (AFM)

NOTA: Questi passaggi sono previsti per un AFM combinazione specifica microscopio ottico (figura 4 e Materiali List).

  1. Preparare la AFM per l'esperimento.
    1. Aumentare l'altezza della testa AFM alla sua posizione massima nella direzione z.
    2. Mettere estensori sulle gambe della AFM persollevare il piano a cui sbalzo contatti AFM il campione. Il campione e la testa AFM deve essere sollevato per ospitare l'altezza del dispositivo meccanico.
  2. Preparare il microscopio ottico (se disponibile).
    1. Rimuovere la piastra di scansione AFM. Rimuovere l'obiettivo desiderato.
    2. Aggiungi un distanziatore all'obiettivo. L'altezza del distanziatore dipenderebbe l'obiettivo e l'AFM specifico set-up, ma è necessario se imaging ottico è desiderata dal piano di osservazione sarà spostamento nella direzione z di una quantità pari alla barella e altezza adattatore (Figura 5A). Si noti che la AFM fornisce solitamente basso ingrandimento delle immagini da un percorso ottico sul dispositivo.
    3. Montare la parte posteriore obiettivo desiderato nella sua posizione. Posizionare lo scanner al AFM.
    4. Avviare il software AFM. Avviare tutte le sorgenti luminose necessari tra cui la sorgente luminosa per misure di fluorescenza.
    5. Montare un chip con una trave a sbalzo cheè opportuno che le misure desiderate. 200 pN / rigidità nm o inferiore è preferibile quando si misura il modulo elastico di cellule vive.
    6. Allineare il laser e calibrare la rigidità sbalzo secondo le indicazioni del fabbricante su un vetrino di vetro montato sul dispositivo.
  3. Preparare una membrana, come nella fase 1, ma con le seguenti modifiche.
    1. Immediatamente prima di montare la membrana al dispositivo tenditore, tagliare le pareti di circa 1 mm di altezza. Questo impedisce l'interferenza sperimentato tra le pareti della membrana e la cella di carico.
    2. Montare la membrana sul dispositivo meccanico come descritto 3.2.1-3.2.3.
    3. Rimuovere terreni di coltura cellulare per evitare danni allo scanner AFM in caso di fuoriuscita.
    4. Coppia il dispositivo con un adattatore (Figura 5A). Posizionare il dispositivo meccanico con l'adattatore sullo scanner.
    5. Allungare la membrana per il livello di deformazione a trazione desiderato.
  4. Aggiungere un numero limitato (<0,5 ml) il volume dei media sulle cellule per evitare scanner AFM o danni microscopio a causa di una caduta.
  5. Engage trave a sbalzo con la membrana.
  6. Seguire il protocollo del particolare dispositivo AFM per acquisire aree di interesse.

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Representative Results

Specie reattive dell'ossigeno e Deformazione

Precedenti studi hanno mostrato un aumento delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) nelle vie respiratorie e cellule epiteliali alveolari in risposta al tratto ciclica 21. Le specie reattive dell'ossigeno includono molecole e radicali liberi derivati ​​da ossigeno molecolare con alta reattività di lipidi, proteine, polisaccaridi e acidi nucleici 22-24. ROS servire come un segnale comune intracellulare di regolare funzione del canale ionico, proteina chinasi / attivazione fosfatasi, e l'espressione genica, ma la produzione eccessiva o non regolamentato può contribuire alla apoptosi e morte cellulare necrotica, neurodegenerazione, aterosclerosi, diabete e cancro 24,25. Superossido, un pre-cursore per altre forme di ROS, può essere prodotto come un sottoprodotto della respirazione mitocondriale quando gli elettroni perdite dalla catena di trasferimento di elettroni. Studi precedenti hanno suggerito che ciclico tratto meccanico ha stimolato la produzione di superossido attraverso una combinazione di sistema NADPH ossidasi (nicotinamide adenina dinucleotide fosfato-ossidasi) e la catena di trasporto degli elettroni mitocondriale (I e III complesso). E 'stato proposto che questa stimolazione era dovuto a una distorsione diretta dei mitocondri 21 possibilmente dovuto connessioni al citoscheletro. Per verificare questa ipotesi, la cellula dispositivo allungamento è stato sviluppato in modo che potessimo immagine cambia in produzione di ROS in cellule vive, in risposta a stiramento meccanico. Qui, i ROS mitocondriali prodotti dalle cellule epiteliali bronchiali dovute ad allungare è stata misurata con il dispositivo personalizzato e il protocollo. In assenza di stiramento meccanico, produzione di ROS non aumentava significativamente durante 60 min (Figura 4). Quando un singolo il 17% tratto è stata applicata e mantenuta, c'è stato un aumento di mitocondriale di ROS che persiste per altri 60 min.

Diretta danno epiteliale monostrato causa Stretch

2. Diversi studi suggeriscono che l'eccessiva tratto meccanica delle cellule epiteliali del polmone può causare lesioni diretto di danni alle cellule 11,13,26,27. Questo tipo di danno è difficile cogliere senza imaging in tempo reale durante la distensione meccanica. Come tale, utilizzando il dispositivo personalizzato e microscopia a contrasto di fase immagini consecutive di cellule che sono stati allungati meccanicamente stati registrati prima e dopo il trattamento con una citochina pro-infiammatoria (50 ng / ml TNF-α per 6 hr) (Figura 5). Immagini dello stesso campo di cellule sono state catturate a crescenti livelli di deformazione. Le immagini mostrano la formazione di un vuoto quando le cellule sono state tese tra il 10 e il 15% ceppo indicato dalle frecce rosse. È importante notare che queste immagini sono state registrate in tempo quasi reale, <10 sec di ritardo tra la fine del stretc h e di imaging, mentre le cellule sono state tese. In studi precedenti di imaging cellulare di cellule allungate, le immagini sono state ottenute prima e dopo il tratto confrontando solo le immagini delle cellule non in condizione tesa 11,13,28.

AFM Nano-indentazione sulle cellule allungate

Il dispositivo meccanico è stata collocata nella AFM con l'uso di una piastra di adattamento (vedi Figura 6A). Utilizzando metodi precedentemente pubblicati 13, mappe Modulo Elastico (E-mappe) di MLE12 cellule prima e dopo il 10% di deformazione alla trazione sono stati ottenuti (Figura 6D-E). Anche se l'immagine a contrasto di fase al 10% di deformazione (Figura 6D) è stato ottenuto entro 10 secondi del tratto, gli E-mappe mostrato nella Figura 6D-E consumati circa 22 min con 300 singole curve forza-deformazione registrati nel corso di un 40 micron x 40 micron zona con un 2,5 micron / s velocità della punta nella direzione z.om / files / ftp_upload / 52737 / 52737fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 1
Figura 1. Il dispositivo progettato su misura per la coltura cellulare e stretching. (A) disegno generato da calcolatore della progettazione meccanica del dispositivo, (B) fotografia del dispositivo completata, (C) fotografia di dispositivo collegato al motore e il driver lineare, che converte la rotazione del motore in un movimento 1-dimensionale che controlla il tratto biassiale morsetto della membrana di gomma (D) silicone. Il substrato contiene due fori su ciascuna scheda morsetto per essere immessi in messaggi su ciascun morsetto. (E) il modello FEA quotato della membrana flessibile che è un quarto di tutta la struttura a causa di uso di condizioni al contorno simmetriche. ( trong> F) deformazione massima principale è mostrato nel pieno membrana raffigurante la formazione di anelli indicativi di campo di deformazione isotropa. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. (A) è mostrato il dispositivo di supporto di una membrana flessibile con le marcature applicate per misurare la deformazione applicata. Close-up immagini delle marcature, prima (B) e dopo (C) tratto, sono stati etichettati con una freccia che indica chiaramente lo spostamento delle marcature sulla membrana. (D) ceppo membrana in funzione del motore conta fase di avvicinamento e distacco. Ceppo membrana è stata simile in entrambi e allo svincolo con retrazione ceppi produttori leggermente superiori. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52737/52737fig2highres.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Membrana trasmissione ceppo alle cellule. (A - B) immagini fase di contrasto cellule umane bronchiali epiteliali (16HBE) sulla membrana flessibile utilizzando un obiettivo 10X, prima (A) e dopo (B) 20% di deformazione. (C - D) fluorescente (DAPI) nuclei delle cellule 16HBE sono stati ripresi utilizzando un obiettivo 20X al microscopio confocale, prima (C) e dopo (D) 20% di deformazione. (E) Il ceppo membrana vissuta da cellule era lineare e omogeneo.t = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. L'impatto di un singolo tratto sulla produzione di ROS 16HBE cellule è stata osservata mediante un sensore superossido mitocondriale complessivo utilizzando un obiettivo 20X al microscopio confocale (A - C). Istantanee del tempo naturalmente (0, 60 min, e ~ 65 min) della produzione di superossido durante tratto nello stesso campo delle cellule. (D) relativa intensità di fluorescenza di 16HBE cellule nel tempo indica un aumento del 50% di intensità di fluorescenza dalla produzione basale di superossido entro la prima ora (da A a B). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.


Figura 5. immagini a contrasto di fase di un epiteliale alveolare (MLE12) risposta monostrato all'aumento tratto (A - D). Sono stati tutti registrati utilizzando un microscopio digitale con un obiettivo 20X. Le frecce indicano i luoghi in cui si è verificata la separazione cella-a-cella. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6. (A) Dispositivo meccanico mostrato in AFM per nano-indentazione di cellule con tratto. Lo scanner deve essere rimosso per il collocamento di estensione oggettiva. Tre estensori delle gambe sono collegati a tutti e tre gambe della testa AFM per consentire dispositivoposizionamento. Una piastra adattatore viene utilizzato per montare l'barella allo scanner AFM (nero piatto). Le scansioni trave a sbalzo nella direzione della freccia mostrata l'immagine prima fase di stiramento contrasto una cella MLE12 (B) in. I quadrati rossi nella prima (B) e dopo (C) immagini tratto raffigurano l'area che è stato catturato durante la nano-indentazione (obiettivo 40X). Le mappe elastiche modulo, prima (D) e dopo (E) tratto, si ottengono con tecniche di analisi precedentemente pubblicati 13. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Un dispositivo unico per l'imaging cellulare dal vivo durante allungamento meccanico è stato sviluppato; e questo dispositivo è stato utilizzato in un protocollo per studiare epiteliali polmonari mechanobiology cellule. In studi preliminari, si è constatato che un singolo tratto tenuta stimolato la produzione di superossido mitocondriale nelle cellule epiteliali bronchiali. Inoltre, è stato dimostrato che un aumento dei livelli di sollecitazioni meccaniche causate danno diretto per l'integrità di un monostrato di cellule epiteliali alveolari.

Per condurre questi esperimenti preliminari, il dispositivo è stato calibrato, e poi è stato dimostrato che il ceppo membrana è stata trasmessa alle cellule (Figure 2-3). Nel complesso il dispositivo buoni risultati, come indicato dalla stretta correlazione tra la deformazione della membrana (misurata da segni sulla membrana) e il ceppo cellulare (misurata per distanze tra nuclei) mostrato in Figura 3E. Tuttavia, vi sono state alcune piccole differenze osservate tra strain misurata sulle membrane durante l'avvicinamento e le curve di ritorno dei marcatori, come mostrato nella figura 2D. Questo è probabilmente dovuto al contraccolpo nel dispositivo e forse in relazione alla presa problemi. Inoltre, è necessario un meccanismo di montaggio universale per il dispositivo in modo che possa essere utilizzato in modo efficiente sul microscopi con differenti configurazioni. Questo riduce il tempo trascorso tra il posizionamento del dispositivo di acquisizione delle immagini e mantenendo un collegamento robusto per microscopio. Fori nelle membrane sono stati usati per applicare una minore pre-deformazione alla membrana per prevenire la formazione di uno stato di compressione iniziale a causa di serraggio di un materiale elastico. Lo stato di compressione comporta anche una riduzione della deformazione massima applicabile.

Il dispositivo personalizzato è stato progettato per adattarsi in un asilo MFP3D microscopio a forza atomica per consentire nano-indentazione di cellule vive durante allungamento meccanico. Non siamo a conoscenza di qualsiasi altro dispositivo che è in grado didurre uno stato di stress isotropo nel piano di imaging che può funzionare in un AFM. Il dispositivo è stato progettato anche per uso continuo in un incubatore di coltura cellulare (mantenuto a 37 ° C in un ambiente sterile umido con 2 5% CO). La capacità di funzionare all'interno di un incubatore permette lo studio di cellule in fase di regimi tratto a lungo termine.

Esistono diverse limitazioni l'approccio illustrato. In primo luogo, come i tratti di membrana, il campo di attenzione si sposta fuori piano, anche se in minima (~ 100 micron). Questo diventa una limitazione quando il monitoraggio di un campo di cellule attraverso un regime tratto, perché il campo di vista cambia nel corso della distensione membrana. Anche se la membrana all'interno del diametro 22 millimetri sperimenta 0,23-0,25 ceppo, le regioni al di fuori di questa esperienza interiore diametro di un campo di deformazione più variabile. Sebbene studi di imaging sono facilmente limitati a questa regione centrale, è possibile che le cellule di rispondere a livelli più elevati di deformazionea regioni esterne possono influenzare la risposta delle cellule all'interno della regione centrale. Una distribuzione uniforme su ceppo una più grande area di interesse può essere ottenuto con miglioramenti nella progettazione membrana. La membrana PDMS è auto-fluorescente a lunghezze d'onda comunemente utilizzati per gli indicatori fluorescenti, e questo limita la capacità di imaging di fluorescenza nelle cellule da sotto la membrana. Per questo motivo un microscopio in posizione verticale è stato utilizzato con obiettivi immersione acqua nei nostri studi di produzione di ROS sopra descritte. Questo può essere una limitazione per gli studi in cui AFM e fluorescenza sono combinati.

Il dispositivo commerciale più comune (FlexCell FX 5000 Tension System) per l'applicazione di sollecitazioni meccaniche alle cellule incorpora un sistema di vuoto controllabile applicando sforzo a trazione su una membrana mentre si muove dentro e fuori del piano ottico. Il design della membrana e morsetto presentato qui a creare un campo di deformazione biassiale dove deformazione è isotropo e rimane nel piano allowing immagini in tempo reale. Con piccole modifiche al design della membrana, la barella in grado di produrre i modi tratto monoassiali pure. Se le cellule vengono prima seminate su una membrana disteso, in piano possono essere applicate anche carichi di compressione. Il dispositivo è in grado di raggiungere entrambi i livelli fisiologici e patologici del ceppo. In sintesi, un nuovo dispositivo e protocolli sono stati sviluppati che può essere utilizzato per applicare sforzo meccanico a vivere cellule che possono essere ripreso usando la microscopia a fluorescenza e AFM nano-indentazione.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare che Fedex Institute of Technology presso l'Università di Memphis per il loro sostegno. Gli autori desiderano ringraziare gli studenti del gruppo di progetto di design di alto livello presso il Dipartimento di Ingegneria Meccanica presso l'Università di Memphis (David Butler, Jackie Carter, Dominick Cleveland, Jacob Shaffer), Daniel Kohn del dipartimento Università di Memphis Engineering Technology per il controllo motore , e il dottor Bin Teng e la signora Charlean Luellen per il loro aiuto in coltura cellulare. Questo lavoro è stato sostenuto da K01 HL120912 (ER) e R01 HL123540 (CMW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SmartMotor NEMA 34: 3400 Series MOOG Animatics SM3416D Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus
Flexcell Membrane (Collagen I coated) Flexcell International Corp SM2-1010C 3.5" x 5.25" x 0.020"
Sylgard 184 Dow Corning Corporation 10:1
Hoechst 33342  Sigma-Aldrich H1399 DAPI stain
MitoSOX Sigma-Aldrich M36008
Tiron Sigma-Aldrich D7389  mitochondrial superoxide label
DMEM superoxide inhibitor
FBS
HEPES
50 ml tubes Fisher Scientific 06-443-19 Any centriguge tube can be used to create an area for imaging.
Hybridization oven Bellco Glass
MLE12 Cells ATCC CRL-2110 Mouse Lung Epithelial Cells 
16HBE cells ATCC CRL-2741 Human Bronchial Epithelial Cells
AFM Indentation Experiments
Cantilever Beams for Nano-indentation Budget Sensors Si-Ni30
AFM  Asylum Research MFP3D
Olympus microscope Olympus IX-71 Inverted microscope with 20X and 40X objectives.
AFM Leg Extenders Asylum Research Not available AFM microscope
Finite Element Analyses
ABAQUS Simulia 6.12
Software
ImageJ NIH
Microscopes
Digital microscope Life Technologies EVOS XL Core Initially a self standing company, now owned by Life Technologies.
Confocal microscope Zeiss LSM 710 2-photon upright microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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