Imágenes de células vivas durante el estiramiento mecánico

Bioengineering

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Rápalo, G., Herwig, J. D., Hewitt, R., Wilhelm, K. R., Waters, C. M., Roan, E. Live Cell Imaging during Mechanical Stretch. J. Vis. Exp. (102), e52737, doi:10.3791/52737 (2015).

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Abstract

Introduction

Las células se someten a cargas mecánicas en muchos tejidos, y esta estimulación mecánica se ha demostrado para promover cambios en los patrones de la expresión génica, la liberación de factores de crecimiento, citoquinas, o remodelación de la matriz extracelular y el citoesqueleto 1-4. Las señales intracelulares transducidas a partir de tales estímulos mecánicos se producen a través del proceso de mechanotransduction 5-7. En el sistema respiratorio, uno de los resultados de mechanotransduction es el aumento de especies reactivas de oxígeno (ROS) 8,9 y citoquinas pro-inflamatorias 10 en las células epiteliales pulmonares en la presencia de deformación por tracción cíclica. Una fuerte evidencia también sugiere que la deformación por tracción excesiva conduce a dirigir lesión en el epitelio alveolar, además de las respuestas bioquímicas de las células 11-14. Aunque el enfoque aquí es principalmente sobre la respuesta de las células pulmonares a la deformación mecánica, las vías inducidas por mechanotransduction juegan un papel clave en los basic función de muchos tejidos en el cuerpo humano, incluyendo la regulación del tono vascular 15 y el desarrollo de la placa de crecimiento 16.

El creciente interés en mechanotransduction se ha traducido en el desarrollo de numerosos dispositivos para la aplicación de cargas mecánicas fisiológicamente relevantes a las células cultivadas y el tejido. En particular, los dispositivos que aplican una tensión de tracción, que es una forma común de la carga mecánica experimentada por el tejido, son populares 11,17-19. Sin embargo, muchos de los dispositivos disponibles están diseñados ya sea como un biorreactor para aplicaciones de ingeniería de tejidos o no son propicias para la formación de imágenes en tiempo real con estiramiento. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar herramientas y métodos que se pueden visualizar las células y tejidos en tensión para facilitar la investigación de las vías de mecanotransducción.

En este documento, un dispositivo de estiramiento mecánico en el plano fue diseñado y protocolos fueron desarrollados para aplicar mformas ultiple de la cepa a los tejidos y células, mientras que permiten imágenes de las respuestas bioquímicas y mecánicas en tiempo real (Figura 1A-D). El dispositivo utiliza seis pinzas uniformemente espaciadas dispuestas circunferencialmente para captar una membrana flexible y aplicar una, distensión radial en el plano a aproximadamente 20% (Figura 1B). El dispositivo de accionamiento puede ser colocado en una incubadora de cultivo celular durante un período prolongado de tiempo, mientras que el motor (Figura 1C) se coloca fuera de la incubadora y controlado por software propietario proporcionada por el proveedor del motor. El motor está conectado a un conductor lineal, que gira una leva interna, conduciendo las seis abrazaderas de camilla de manera uniforme en la tensión y la relajación.

Además del dispositivo mecánico, membranas flexibles personalizados se crean a partir de cultivo de células de las membranas disponibles comercialmente listos para ser utilizado en el sistema mecánico. Entonces paredes circulares (con un diámetro de aproximadamente28 mm) se hicieron y se une a la membrana flexible para que las células podrían ser cultivadas sólo en esta región del perfil de deformación bien descrito. Con el fin de determinar si la colocación de estas membranas dentro del dispositivo de accionamiento proporcionaría cepa uniforme e isotrópico en el centro de la membrana flexible, se realizó análisis de elementos finitos utilizando el software disponible comercialmente (Figura 1E-F). La membrana flexible se modeló con condiciones de contorno simétricas y utilizando todos los elementos cuadriláteros para la malla. Los anillos concéntricos visto en el gráfico de contorno de máxima deformación principal se muestra en la Figura 1F indican la distribución isotrópica de la cepa.

La tensión experimentada por la membrana se midió mediante la grabación de imágenes de marcas a través de la carga (Figura 2). La figura 2D muestra que la cepa promedio membrana medido en direcciones radiales y axiales era aproximadamente linealcon respecto al motor aplicado cuenta hasta una deformación máxima lineal de 20%. No hubo diferencia significativa entre los niveles de deformación medidos durante la distensión en comparación con los medidos durante la retracción de nuevo a la posición de reposo. A continuación, se midió el desplazamiento de las células humanas bronquiales epiteliales (16HBE) y sus núcleos cultivadas sobre la membrana de encargo flexible. Marcados con fluorescencia (DAPI) núcleos de las células 16HBE se obtuvieron imágenes utilizando un objetivo 20X en un microscopio confocal, mientras que el desplazamiento de célula entera se midió con imágenes de contraste de fase grabadas con un microscopio digital. Como se ve en la Figura 3, la cepa medido por el desplazamiento de los núcleos fue similar al medido por el desplazamiento de las marcas en la membrana, hasta ~ 20% de deformación lineal. Esto confirma que la deformación aplicada a las membranas se transmite a las células adherentes. Los protocolos que describen el uso del dispositivo de encargo en un microscopio tradicional y una fuerza atómica microscópicase se proporcionan en los siguientes pasos.

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Protocol

1. Construcción de membrana con paredes bien para Retención de Cultivo Celular Medios (ver Figura 1D para el producto final)

  1. El uso de polidimetilsiloxano (PDMS) láminas revestidas con colágeno I, cortar el contorno de la membrana flexible con un bisturí o un troquel.
  2. Coloque cada membrana en una placa de Petri de 60 mm para el almacenamiento.
  3. Creación de paredes:
    1. Mezclar PDMS en una proporción de 10: 1 en peso de elastómero de A a elastómero B (endurecedor).
    2. Vierta 5 ml de PDMS completamente mezclados en tubos de 50 ml.
    3. Colocar 50 ml tubos con PDMS sin curar horizontalmente en un horno de hibridación.
    4. Utilice la función de rotor para revestir las paredes interiores de los tubos a 8 rpm durante el tiempo de curado. A TA, la PDMS se curarán completamente en 2 días.
    5. Retire los PDMS de tubo en una campana de cultivo celular estéril.
    6. Usando una nueva hoja de afeitar, particionar el cilindro de PDMS en secciones de 4 mm de altura.
    7. Coloque las secciones, las cuales servirán de wa membranaLLS, en un recipiente placa de Petri sin permitir que las paredes se conviertan arrugado.
  4. Seleccionar y el centro de una pared de PDMS en una membrana, mientras que el mantenimiento de los dos en la placa de Petri.
  5. Colocar suavemente PDMS sin curar (10: 1 ratio) en el perímetro exterior de la pared para ser utilizados como pegamento. Evitar la formación de huecos entre la pared y la membrana, ya que es allí para retener líquido.
  6. Coloque cada placa de Petri que contiene la membrana completado y cubierto en un horno a 70 ° C durante 24 horas para curar.

2. Correlación de Rotaciones de motor con abrazadera Desplazamiento o Crecimiento radial de calibración (Figura 2)

  1. Inicie el software de control del motor.
  2. Plegar las abrazaderas del dispositivo utilizando la configuración manual en el software del motor.
  3. Medir la distancia y registrar la posición de conteo del motor entre las abrazaderas opuestas tanto en el desplazamiento mínimo y máximo de las abrazaderas.
  4. Calcular el porcentaje de cambio en el dIstance entre las abrazaderas como una función del recuento de motor (~ 0-75k recuentos). Esto indicará la cepa potencial máximo alcanzado en la membrana.

3. Aplicación de estiramiento en la línea celular epitelial de pulmón de ratón (MLE12)

  1. Semilla MLE12 células en 2,5 millones de células en la membrana flexible (Paso 1) por pocillo a confluentes en dos días. La densidad de siembra puede variar para diferentes tipos de células.
  2. Asegúrese de que el accionador mecánico está en una posición completamente relajada.
    1. Retire el medio de cultivo celular.
    2. El uso de 1,5 mm golpes de biopsia, sacador dos agujeros en cada uno de los seis abrazadera (véase la Figura 1D) lengüetas de la membrana. La colocación radial de los orificios determina la cantidad de pre-tensión las experiencias de membrana inicialmente. Perforar los agujeros en un radio de 20,5 mm en las fichas de membrana si no se desea pre-tensión.
    3. Coloque la membrana en la camilla con los agujeros perforados alineando con los pasadores dentro de las abrazaderas.Coloca los mejores abrazaderas en su lugar. Apriete los tornillos de uno a la vez alternando los lados.
    4. Añadir 1 ml de medio de cultivo celular.
  3. Coloque el dispositivo en la platina del microscopio de centrado el centro de la membrana con la trayectoria de la luz.
  4. Use cinta adhesiva o imanes (si es posible) para fijar el dispositivo a la etapa. Una vez fijo, controlar el en el plano (paralelo a la membrana) y vertical (dirección z) del dispositivo mecánico con el controlador de platina del microscopio.
  5. Aplicar tramo con el software proporcionado por el fabricante por controlar manualmente la posición y la velocidad de rotación del motor 20.

4. Medición de la mitocondriales especies reactivas del oxígeno (ROS)

  1. Una vez que las células son confluentes, añadir 1-2 ml de DMEM RT con indicador de superóxido mitocondrial (5 mM concentración final) directamente sobre las células.
  2. Incubar durante 10 minutos a 37 ° C.
  3. Lavar las células suavemente tres veces con tampón calentado en un baño de agua para37 ° C.
  4. Coloque inmediatamente la membrana flexible en la camilla (Paso 2.2) ya en el lugar con un microscopio confocal vertical.
  5. Añadir 1 ml de DMEM con medio libre de rojo de fenol y 25 mM de HEPES.
  6. Establecer filtros de excitación / emisión de 510/580 nm.
  7. Imagen de varios campos de cada 15 min para crear el curso de tiempo deseado de la producción de superóxido mitocondrial.
  8. A partir de las imágenes capturadas, la intensidad de fluorescencia registro histogramas en cada intervalo de tiempo utilizando un software capaz de cuantificar la intensidad de fluorescencia.

5. Aplicación de Estiramiento y Fuerza Atómica Microscopía (AFM)

NOTA: Estos pasos se proporcionan para un AFM específica y la combinación de microscopio óptico (Figura 4 y Lista de Materiales).

  1. Preparar el AFM para el experimento.
    1. Aumentar la altura de la cabeza AFM a su posición máxima en la dirección z.
    2. Ponga extensores en las patas de la AFM alevantar el plano en el que AFM en voladizo en contacto con la muestra. El espécimen y la cabeza AFM necesita ser levantado para dar cabida a la altura del dispositivo mecánico.
  2. Preparar el microscopio óptico (si está disponible).
    1. Retire la placa de escáner AFM. Retire el objetivo deseado.
    2. Añadir un espaciador para el objetivo. La altura del espaciador dependería de lo objetivo y lo AFM específica puesta a punto, pero es necesario si se desea imágenes ópticas desde plano de observación será cambio en la dirección z en una cantidad igual a la camilla y la altura del adaptador (Figura 5A). Tenga en cuenta que la AFM por lo general proporciona imágenes bajo aumento de un camino óptico por encima del dispositivo.
    3. Montar la parte trasera objetivo deseado en su ubicación. Coloque el escáner de nuevo en el AFM.
    4. Inicie el software de AFM. Iniciar todas las fuentes luminosas necesarias, como la fuente de luz para mediciones de fluorescencia.
    5. Montar un chip con una viga en voladizo quees apropiado para las mediciones deseadas. Se prefiere 200 pN / rigidez nm o menos cuando se mide el módulo de elasticidad de células vivas.
    6. Alinear el láser y calibrar la rigidez en voladizo de acuerdo con las sugerencias del fabricante sobre un cubreobjetos de vidrio montado en el dispositivo.
  3. Preparar una membrana como en el Paso 1, pero con las siguientes modificaciones.
    1. Inmediatamente antes de montar la membrana en el dispositivo de estiramiento, cortar las paredes a aproximadamente 1 mm de altura. Esto evita la interferencia experimentada entre las paredes de la membrana y la célula de carga.
    2. Montar la membrana en el dispositivo mecánico tal como se describe 3.2.1-3.2.3.
    3. Retire el medio de cultivo de células para evitar daños en el escáner AFM en caso de un derrame.
    4. Pareja el dispositivo con un adaptador (Figura 5A). Coloque el dispositivo mecánico con el adaptador en el escáner.
    5. Estire la membrana al nivel de deformación a la tracción deseada.
  4. Añadir un (<0,5 ml) Volumen limitado de los medios en las células para evitar escáner AFM o daños microscopio debido a un derrame.
  5. Involucrar a la viga en voladizo con la membrana.
  6. Siga el protocolo del dispositivo de AFM en particular a analizar áreas de interés.

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Representative Results

Especies reactivas del oxígeno y Deformación

Estudios anteriores han demostrado aumentos en especies reactivas de oxígeno (ROS) en las vías respiratorias y las células epiteliales alveolares en respuesta al estiramiento cíclico 21. Especies reactivas de oxígeno incluyen moléculas y radicales libres derivados del oxígeno molecular con alta reactividad a los lípidos, proteínas, polisacáridos, y ácidos nucleicos 22-24. ROS servir como una señal intracelular común para regular la función del canal de iones, la proteína quinasa / activación de la fosfatasa, y la expresión génica, pero la producción excesiva o no regulada puede contribuir a apoptóticas y la muerte celular necrótica, la neurodegeneración, la aterosclerosis, la diabetes y el cáncer 24,25. Superóxido, un pre-cursor para otras formas de ROS, puede ser producido como un subproducto de la respiración mitocondrial cuando los electrones se escapan de la cadena de transferencia de electrones. Estudios previos sugirieron que estiramiento mecánico cíclico estimula la producción de súperóxido a través de una combinación del sistema de NADPH oxidasa (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato-oxidasa) y la cadena de transporte de electrones mitocondrial (complejo I y III). Se ha propuesto que esta estimulación se debió a una distorsión directa de la mitocondria 21 posiblemente debido a las conexiones con el citoesqueleto de la célula. Con el fin de probar esta hipótesis, se desarrolló la célula dispositivo de estiramiento para que pudiéramos imagen cambia en la producción de ROS en células vivas en respuesta al estiramiento mecánico. Aquí, los ROS mitocondriales producidas por las células epiteliales bronquiales debido al estiramiento se midió utilizando el dispositivo y protocolo personalizado. En ausencia de estiramiento mecánico, la producción de ROS no aumentó significativamente en 60 min (Figura 4). Cuando se aplicó y se mantiene un solo 17% de estiramiento, hubo un aumento en ROS mitocondrial que persistió durante otros 60 min.

Directo Daño epitelial monocapa Debido al estiramiento

2. Varios estudios sugieren que el exceso de estiramiento mecánico de las células epiteliales del pulmón puede causar daño directo que implica daño a las células 11,13,26,27. Este tipo de daño es difícil de capturar sin imágenes en tiempo real durante la distensión mecánica. Como tal, utilizando el dispositivo de la costumbre y la microscopía de contraste de fase de imágenes consecutivas de células que se estiran mecánicamente se registraron antes y después del tratamiento con una citoquina proinflamatoria (50 ml de TNF-α / ng durante 6 horas) (Figura 5). Las imágenes del mismo campo de células fueron capturados en el aumento de los niveles de tensión. Las imágenes muestran la formación de una brecha cuando las células se estiraron entre 10 y 15% de deformación como se indica por las flechas rojas. Es importante señalar que estas imágenes se registraron en tiempo casi real, <10 seg de retardo entre el final de stretch h y de formación de imágenes, mientras que las células se estiran. En estudios previos de imágenes de células de las células estiradas, las imágenes se obtuvieron antes y después de estiramiento comparando sólo las imágenes de células no en condición estirada 11,13,28.

AFM Nano-muesca en células estiradas

El dispositivo mecánico se colocó en el AFM con el uso de una placa de adaptador (véase la Figura 6A). El uso de métodos previamente publicados 13, mapas módulo elástico (E-mapas) de MLE12 células antes y después del 10% de deformación a la tracción se obtuvieron (Figura 6D-E). Aunque la imagen de contraste de fase a 10% de deformación (Figura 6D) se obtuvo en 10 s de la recta final, los E-mapas que se muestran en la figura 6D-E consumen aproximadamente 22 minutos con 300 curvas de esfuerzo-deformación individuales registrados en un 40 micras x 40 micras área con una / s velocidad de 2,5 m de la punta en la dirección z.om / archivos / ftp_upload / 52737 / 52737fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 1
Figura 1. El dispositivo diseñado a medida para el cultivo celular y estiramiento. (A) Dibujo generada por ordenador de diseño mecánico del dispositivo, (B) fotografía del dispositivo completo, (C) fotografía de dispositivo conectado al motor y el controlador lineal, que convierte la rotación del motor en un movimiento de 1-dimensional que controla el estiramiento biaxial de sujeción de la membrana de goma (D) de silicona. El sustrato contiene dos agujeros en cada pestaña de sujeción para ser colocados en los postes de cada abrazadera. (E) modelo FEA de dimensiones de la membrana flexible que es un cuarto de toda la estructura debido al uso de condiciones de contorno simétricas. ( trong> F) deformación principal máxima se muestra en la membrana completa que representa la formación de anillos indicativos del campo de deformación isótropa. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. (A) El dispositivo de soporte una membrana flexible con marcas aplicadas para medir la tensión aplicada se muestra. Close-up imágenes de las marcas, antes de (B) y después (C) estiramiento, fueron marcadas con una flecha para indicar claramente el desplazamiento de las marcas de la membrana. (D) la cepa de membrana como una función del motor cuenta durante la aproximación y retracción. Cepa membrana fue similar en ambos aproximación y retirada con retracción cepas productoras ligeramente superiores. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52737/52737fig2highres.jpg" target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Membrana de transmisión de la cepa a las células. (A - B) Las imágenes de contraste de fase de células humanas bronquiales epiteliales (16HBE) sobre la membrana flexible usando un objetivo 10X, antes (A) y después (B) 20% de deformación. (C - D) marcadas fluorescentemente (DAPI) núcleos de las células 16HBE se obtuvieron imágenes utilizando un objetivo 20X en un microscopio confocal, antes de (C) y después (D) 20% de deformación. (E) La cepa membrana experimentado por las células fue lineal y homogéneo.t = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Se observó el impacto de un solo tramo en la producción de ROS de 16HBE células utilizando un sensor de superóxido mitocondrial acumulativo utilizando un objetivo 20X en un microscopio confocal (A - C). Instantáneas del tiempo del curso (0, 60 min, y ~ 65 min) de la producción de superóxido durante el estiramiento en el mismo campo de células. (D) la intensidad de fluorescencia relativa de 16HBE células con el tiempo lo que indica un aumento del 50% en la intensidad de fluorescencia de la producción de la línea de base de superóxido en la primera hora (A a B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


Figura 5. imágenes de contraste de fase de un epitelio alveolar (MLE12) monocapa respuesta al aumento de estiramiento (A - D). Fueron todos registró usando un microscopio digital con un objetivo 20X. Las flechas indican los lugares donde se produjo la separación de célula a célula. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. (A) Dispositivo mecánico mostrado en el AFM para la nano-indentación de células con estiramiento. El escáner se debe quitar para la colocación de extensor de objetivo. Tres extensores de las piernas se unen a las tres patas de la cabeza AFM para permitir el dispositivocolocación. Una placa de adaptador se utiliza para montar la camilla en que el escáner AFM (placa de negro). Las exploraciones de viga en voladizo en la dirección de la flecha mostrada en la imagen antes de contraste de fase de estiramiento una célula MLE12 (B). Los cuadrados rojos en la anterior (B) y después (C) imágenes estrías representan el área que fue capturado en nano-indentación (objetivo 40X). Los mapas de módulo elástico, antes de (D) y después (E) de estiramiento, se obtienen con técnicas de análisis publicados previamente 13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Un dispositivo único para imágenes de células vivas durante el estiramiento mecánico fue desarrollado; y este dispositivo se utilizó en un protocolo para estudiar mecanobiología células epiteliales de pulmón. En estudios preliminares, se encontró que un solo tramo celebrada estimuló la producción de superóxido mitocondrial en las células epiteliales bronquiales. Además, se demostró que el aumento de los niveles de tensión mecánica causaron daño directo a la integridad de una monocapa de células epiteliales alveolares.

Para llevar a cabo estos experimentos preliminares, el dispositivo se calibró primero, y luego se demostró que la cepa membrana se transmite a las células (Figuras 2-3). En general, el dispositivo realiza bien, como se indica por la estrecha correlación entre la cepa de membrana (medida por las marcas en la membrana) y la cepa de células (medido por distancias entre núcleos) que se muestra en la Figura 3E. Sin embargo, hubo algunas pequeñas diferencias observadas entre straen medida en las membranas durante la aproximación y las curvas de retorno de los marcadores, como se muestra en la Figura 2D. Esto era probablemente debido a la holgura en el dispositivo y posiblemente relacionados con temas de agarre. Además, se necesita un mecanismo de montaje universal para el dispositivo de modo que de manera eficiente se puede utilizar en los microscopios con diferentes configuraciones. Esto reduciría el tiempo transcurrido entre la adquisición de posicionamiento de dispositivo y la imagen mientras se mantiene una conexión robusta como para el microscopio. Los agujeros perforados en las membranas se utilizan para aplicar una pre-deformación menor a la membrana para evitar la formación de un estado de compresión inicial debido a la sujeción de un material elástico. El estado de compresión también conduce a una reducción de la deformación máxima aplicable.

El dispositivo personalizado fue diseñado para caber en una Fuerza Atómica Asilo MFP3D Microscopio para permitir nano-indentación de células vivas durante el estiramiento mecánico. No tenemos conocimiento de cualquier otro dispositivo que es capaz de enducing un estado de tensión isótropa en el plano de la imagen que puede funcionar dentro de un AFM. El dispositivo también fue diseñado para el uso continuo en una incubadora de cultivo celular (mantuvo a 37 ° C en un ambiente húmedo, estéril con 5% de CO 2). La capacidad de funcionar dentro de una incubadora permite el estudio de las células sometidas a regímenes de estiramiento a largo plazo.

Existen varias limitaciones para el enfoque presentado. En primer lugar, como los tramos de membrana, el campo de foco se mueve fuera del plano, aunque mínimamente (~ 100 micras). Esto se convierte en una limitación cuando el seguimiento de un campo de células a través de un régimen de estiramiento, debido a que el campo de visión cambia en el transcurso de la distensión de la membrana. A pesar de que la membrana dentro del diámetro 22 mm 0,23 a 0,25 experimenta tensión, las regiones fuera de esta experiencia diámetro interior de un campo de deformación más variable. Aunque los estudios de imagen se limitan fácilmente a esta región central, es posible que las células que responden a niveles más altos de la cepaen regiones externas puede afectar la respuesta de las células dentro de la región central. Una distribución de la tensión uniforme sobre un área mayor de interés se puede lograr con mejoras en el diseño de la membrana. La membrana de PDMS es auto-fluorescente en longitudes de onda usadas comúnmente para indicadores fluorescentes, y esto limita la capacidad para obtener imágenes de fluorescencia en las células de debajo de la membrana. Por esta razón un microscopio vertical se utilizó con objetivos de inmersión en agua en nuestros estudios de la producción de ROS descritos anteriormente. Esto puede ser una limitación para estudios en los que se combinan AFM y de imágenes de fluorescencia.

El dispositivo comercial más común (FlexCell Sistema de tensión FX 5000) para aplicar tensión mecánica a las células incorpora un sistema de vacío controlable la aplicación de la deformación por tracción en una membrana mientras se mueve dentro y fuera del plano óptico. El diseño de la membrana y la abrazadera se presenta en este documento a crear un campo de deformación biaxial donde cepa es isótropo y permanece en el plano allowing imágenes en tiempo real. Con modificaciones menores en el diseño de la membrana, la camilla puede producir modos de estiramiento uniaxial también. Si las células se sembraron primero en una membrana distendido, en el plano cargas de compresión pueden también ser aplicadas. El dispositivo es capaz de llegar tanto a los niveles fisiológicos y patológicos de la cepa. En resumen, un nuevo dispositivo y se desarrollaron protocolos que se puede utilizar para aplicar la tensión mecánica a las células vivas que se pueden obtener imágenes mediante microscopía de fluorescencia y AFM nano-indentación.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Los autores desean que gracias Fedex Instituto de Tecnología de la Universidad de Memphis por su apoyo. Los autores desean agradecer a los estudiantes del grupo de proyecto de diseño de alto nivel en el Departamento de Ingeniería Mecánica de la Universidad de Memphis (David Butler, Jackie Carter, Dominick Cleveland, Jacob Shaffer), Daniel Kohn desde el departamento de la Universidad de Memphis Tecnología de Ingeniería para el control del motor y el Dr. Bin Teng y la Sra Charlean Luellen por su ayuda en el cultivo celular. Este trabajo fue apoyado por K01 HL120912 (ER) y R01 HL123540 (CMW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SmartMotor NEMA 34: 3400 Series MOOG Animatics SM3416D Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus
Flexcell Membrane (Collagen I coated) Flexcell International Corp SM2-1010C 3.5" x 5.25" x 0.020"
Sylgard 184 Dow Corning Corporation 10:1
Hoechst 33342  Sigma-Aldrich H1399 DAPI stain
MitoSOX Sigma-Aldrich M36008
Tiron Sigma-Aldrich D7389  mitochondrial superoxide label
DMEM superoxide inhibitor
FBS
HEPES
50 ml tubes Fisher Scientific 06-443-19 Any centriguge tube can be used to create an area for imaging.
Hybridization oven Bellco Glass
MLE12 Cells ATCC CRL-2110 Mouse Lung Epithelial Cells 
16HBE cells ATCC CRL-2741 Human Bronchial Epithelial Cells
AFM Indentation Experiments
Cantilever Beams for Nano-indentation Budget Sensors Si-Ni30
AFM  Asylum Research MFP3D
Olympus microscope Olympus IX-71 Inverted microscope with 20X and 40X objectives.
AFM Leg Extenders Asylum Research Not available AFM microscope
Finite Element Analyses
ABAQUS Simulia 6.12
Software
ImageJ NIH
Microscopes
Digital microscope Life Technologies EVOS XL Core Initially a self standing company, now owned by Life Technologies.
Confocal microscope Zeiss LSM 710 2-photon upright microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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