Live-Cell Imaging under Mechanical Stretch

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rápalo, G., Herwig, J. D., Hewitt, R., Wilhelm, K. R., Waters, C. M., Roan, E. Live Cell Imaging during Mechanical Stretch. J. Vis. Exp. (102), e52737, doi:10.3791/52737 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Celler udsættes for mekaniske belastninger i mange væv, og dette mekanisk stimulering har vist sig at fremme ændringer i mønstre af genekspression, frigivelse af vækstfaktorer, cytokiner eller ombygning af den ekstracellulære matrix og cytoskelet 1-4. De intracellulære signaler transduceret fra sådanne mekaniske stimuli opstår gennem processen med mechanotransduction 5-7. I luftvejene, en resultat af mechanotransduction er stigningen i reaktive oxygenarter (ROS) 8,9 og proinflammatoriske cytokiner 10 i pulmonale epitelceller i nærvær af cyklisk trækbelastning. Stærke beviser antyder også, at overdreven trækbelastning fører til direkte skade på det alveolære epithel, udover de biokemiske reaktioner af celler 11-14. Selvom fokus her er primært på respons lungeceller til mekanisk deformation, veje induceret af mechanotransduction spille en central rolle i basic funktion af mange væv i det menneskelige legeme, herunder regulering af vaskulær tonus 15 og udviklingen af væksten pladen 16.

Den stigende interesse for mechanotransduction har resulteret i udviklingen af ​​mange enheder for anvendelsen af ​​fysiologisk relevante mekaniske belastninger til dyrkede celler og væv. Især indretninger anvender en trækbelastning, som er en almindelig form for mekanisk belastning opleves af væv, er populære 11,17-19. Imidlertid er mange af de tilgængelige enheder enten udformet som en bioreaktor for vævsdyrkningsapplikationer eller ikke befordrende for tidstro billeddannelse med stretch. Som sådan er der et behov for at udvikle værktøjer og metoder, der kan visualisere celler og væv i spænding for at lette efterforskningen af ​​veje for mechanotransduction.

Heri blev en in-plane mekaniske stretching anordning designet og protokoller blev udviklet til at anvende multiple former for stamme til væv og celler, mens tillader billeddannelse af de biokemiske og mekaniske reaktioner i realtid (Figur 1A-D). Mekanismen anvender seks jævnt fordelte klemmer anbragt periferisk at gribe en fleksibel membran og anvende en i planet, radial udspilning op til ca. 20% (figur 1B). Aktiveringsindretningen kan placeres i en cellekultur inkubator i en længere periode, mens motoren (Figur 1C) er placeret uden for inkubatoren og kontrolleret af proprietær software tilvejebragt af leverandøren motor. Motoren er forbundet til en lineær driver, som roterer en intern cam, køre de seks båre klemmer ensartet i spænding og afspænding.

Ud over den mekaniske indretning, blev tilpassede fleksible membraner skabt fra kommercielt tilgængelige cellekultur klar membraner til anvendelse i det mekaniske system. Så cirkulære vægge (med en diameter på ca.28 mm) blev fremstillet og fastgjort til den fleksible membran, således at celler kunne dyrkes kun i denne region i velbeskrevet stamme profil. For at afgøre, om placeringen af disse membraner inden betjeningsindretningen ville tilvejebringe ensartede og isotrope stamme i centrum af den fleksible membran blev finite element analyse udført under anvendelse af kommercielt tilgængeligt software (Figur 1E-F). Den fleksible membran blev modelleret med symmetriske randbetingelser og udnytte alle firkantede elementer til masken. De koncentriske ringe set i kontur plot af maksimal principal stamme er vist i figur 1F angiver isotrope fordeling af stammen.

Den deformation, som membranen blev målt ved at registrere billeder af markeringer gennem loading (Figur 2). Figur 2D viser, at den gennemsnitlige membran stamme målt i radiale og aksiale retninger var tilnærmelsesvis lineærmed hensyn til den anvendte motor tæller op til en maksimal lineær belastning på 20%. Der var ingen signifikant forskel mellem de deformationsniveauer målt under udspilning i forhold til dem, der måles under tilbagetrækning tilbage til hvilestilling. Derefter blev fortrængningen af ​​humane bronchiale epithelceller (16HBE) og deres kerner dyrket på den brugerdefinerede fleksibel membran målt. Fluorescensmærkede (DAPI) kerner af 16HBE cellerne blev filmede med en 20X målsætning under et konfokal mikroskop, mens hele celle forskydning blev målt med fase kontrast billeder optaget med en digital mikroskop. Som det ses i figur 3, stammen målt ved forskydning af kerner var svarende til den, målt ved forskydning af markeringer på membranen, indtil ~ 20% lineær belastning. Dette bekræfter, at stammen anvendt til membranerne blev fremsendt til de adhærente celler. Protokollerne beskriver brugen af ​​den brugerdefinerede enhed på et traditionelt mikroskop og en atomic force mikroskopete findes i de følgende trin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Konstruktion af membranen med Well Walls for Bevarelse af celledyrkningsmedier (se figur 1D for det endelige produkt)

  1. Anvendelse af polydimethylsiloxan (PDMS) ark overtrukket med kollagen I, skåret omridset af den fleksible membran med en skalpel eller en matrice.
  2. Placer hver membran i en 60 mm petriskål til opbevaring.
  3. Oprettelse af vægge:
    1. Bland PDMS ved et 10: 1 vægtforhold mellem elastomer A til elastomer B (hærder).
    2. Hæld 5 ml fuldt blandede PDMS i 50 ml rør.
    3. Placer 50 ml rør med uhærdede PDMS vandret i en hybridiseringsovn.
    4. Brug rotoren funktion at coate de indre vægge af rørene ved 8 rpm under hærdningen tid. Ved stuetemperatur, vil de PDMS være fuldt hærdet i 2 dage.
    5. Fjern PDMS fra røret i en steril cellekultur hætte.
    6. Ved hjælp af en ny barberblad, opdele cylinderen af ​​PDMS i sektioner 4 mm i højden.
    7. Placer de afsnit, som vil tjene som membranen waLLS, i en petriskål beholder uden at tillade væggene at blive krøllet.
  4. Vælge og centrere den ene væg i PDMS på én membran under opretholdelse af to i petriskålen.
  5. Blidt uhærdede PDMS (10: 1 ratio) på den ydre omkreds af væggen, der skal anvendes som lim. Forebyg dannelsen af ​​huller mellem væggen og membranen, da det er der for at tilbageholde væske.
  6. Placer hver petriskål indeholdende den færdige membran og dækket i en ovn ved 70 ° C i 24 timer for at hærde.

2. Korrelation af Motor Rotationer med Clamp Displacement eller Radial Vækst for kalibrering (figur 2)

  1. Start softwaren styre motoren.
  2. Fortrænge klemmerne af enheden ved hjælp af manuel indstilling i motoren software.
  3. Mål afstanden og registrere motorens tælle position mellem modstående klemmer på både minimale og maksimale forskydning af klemmerne.
  4. Beregne den procentvise ændring i distance mellem klemmerne som en funktion af motorens count (~ 0-75k tællinger). Angiver dette den maksimale potentielle stamme opnået på membranen.

3. Anvendelse af Stretch om Mouse Lung epitelcellelinie (MLE12)

  1. Frø MLE12 celler ved 2,5 millioner celler på den fleksible membran (trin 1) per brønd skal sammenflydende inden to dage. Den podningsdensitet kan variere for forskellige celletyper.
  2. Sørg for, at aktuator er i en helt afslappet stilling.
    1. Fjern cellekulturmedier.
    2. Af 1,5 mm biopsi slag, punch to huller i hver af de seks klemmen (se figur 1D) flige af membranen. Den radiale placering af hullerne bestemmer mængden af ​​forspænding membranen oplevelser oprindeligt. Punch huller i en radius på 20,5 mm på membranen fanerne hvis der ønskes ikke forspænding.
    3. Placer membran på båren med udstansede huller foring op med benene inden klemmerne.Placer øverste klemmer på plads. Spænd skruerne én ad gangen skiftevis sider.
    4. Tilsæt 1 ml celledyrkningsmedier.
  3. Placere enheden på mikroskopbordet centrering midt på membranen med lysbanen.
  4. Brug tape eller magneter (hvis muligt) til at fastgøre enheden til scenen. Når fast, kontrollere i plan (parallelt med membran) og lodret (z-retningen) af den mekaniske indretning med den fase controller af mikroskopet.
  5. Påfør strækning med den software fra producenten ved manuelt at styre positionen og hastigheden af motorens rotation 20.

4. Måling af Mitochondrial Reaktive Oxygen Species (ROS)

  1. Når cellerne er sammenflydende, tilsættes 1-2 ml RT DMEM med mitokondrie superoxid indikator (5 uM slutkoncentration) direkte på cellerne.
  2. Der inkuberes i 10 minutter ved 37 ° C.
  3. Vask cellerne forsigtigt tre gange med puffer opvarmet i et vandbad til37 ° C.
  4. Umiddelbart placere den fleksible membran på blændrammen (trin 2.2), der eksisterer i en opretstående konfokal mikroskop.
  5. Der tilsættes 1 ml DMEM med phenol-rød frit medium og 25 mM HEPES.
  6. Indstil excitation / emission filtrene til 510/580 nm.
  7. Billede flere felter hver 15 min at skabe det ønskede tidsforløbet af mitokondrie superoxid-produktion.
  8. Fra optagne billeder, optage fluorescensintensitet histogrammer i hvert tidsinterval ved hjælp af software i stand til at kvantificere fluorescens intensitet.

5. Anvendelse af Stretch og Atomic force mikroskopi (AFM)

BEMÆRK: Disse trin er beregnet til en bestemt AFM og optisk mikroskop kombination (figur 4 og Materialer List).

  1. Forbered AFM til eksperimentet.
    1. Øge højden af ​​AFM hovedet til sin maksimale position i z-retningen.
    2. Sætte strækkemidler på benene af AFM tilløfte flyet, hvor AFM cantilever kontakter prøven. Prøven og AFM hoved skal løftes til at rumme højden af ​​den mekaniske indretning.
  2. Forbered den optiske mikroskop (hvis tilgængelig).
    1. Fjern AFM scanner pladen. Fjern det ønskede mål.
    2. Tilføj et afstandsstykke til målet. Højden af spacer ville afhænge af formålet og den specifikke AFM set-up, men det er nødvendigt, hvis optisk billeddannelse ønskes, da observation flyet vil være skift i z-retningen med et beløb svarende til båren og adapter højde (figur 5A). Bemærk, at AFM giver normalt lav forstørrelse billeddannelse fra en optisk vej over indretningen.
    3. Monter det ønskede mål tilbage i sin placering. Placer scanneren tilbage på AFM.
    4. Start AFM software. Start alle nødvendige lyskilder herunder lyskilde til fluorescens målinger.
    5. Montere en chip med en udliggerbjælke, derer passende for de ønskede målinger. 200 pN / nm eller mindre stivhed foretrækkes, når måling af den elastiske modulus af levende celler.
    6. Juster laseren og kalibrere cantilever stivhed i henhold til producentens forslag om et dækglas monteret på enheden.
  3. Forberede en membran som i trin 1, men med følgende modifikationer.
    1. Umiddelbart før montering af membranen på den strækker enhed, klippe væggene til ca. 1 mm i højden. Dette forhindrer interferens opleves mellem membranvæggene og vejecellen.
    2. Monter membran på den mekaniske enhed som beskrevet 3.2.1-3.2.3.
    3. Fjern celledyrkningsmedier at forhindre beskadigelse AFM scanneren i tilfælde af et udslip.
    4. Par enheden med en adapter (figur 5A). Anbring den mekaniske indretning med adapteren på scanneren.
    5. Strække membranen til det ønskede trækbelastning niveau.
  4. Tilføj en begrænset (<0,5 ml) volumen af ​​medier på cellerne for at undgå AFM scanner eller mikroskop skader på grund af et udslip.
  5. Engagere udliggerbjælke med membranen.
  6. Følg protokollen for den særlige AFM-enhed til at scanne områder af interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Reaktive Oxygen Species og Deformation

Tidligere undersøgelser har vist stigninger i reaktive oxygenarter (ROS) i luftveje og alveolære epitelceller i respons på cyklisk strækning 21. Reaktive oxygenarter indbefatter molekyler og frie radikaler afledt af molekylært oxygen med høj reaktivitet til lipider, proteiner, polysaccharider og nucleinsyrer 22-24. ROS tjene som fælles intracellulært signal til at regulere ionkanalfunktion, protein kinase / phosphatase-aktivering, og genekspression, men overdreven eller ureguleret produktion kan bidrage til apoptotiske og nekrotisk celledød, neurodegeneration, aterosklerose, diabetes og cancer 24,25. Superoxid, en pre-cursor for andre former for ROS, kan produceres som et biprodukt af mitokondriel respiration når elektroner lække fra elektronoverførsel kæden. Tidligere undersøgelser antydet, at cyklisk mekanisk stræk stimulerede produktionen af ​​superoxid gennem en kombination af NADPH-oxidase-systemet (nicotinamidadenindinucleotidphosphat-oxidase) og mitokondrie elektron transportkæden (kompleks I og III). Det er blevet foreslået, at denne stimulering skyldtes en direkte fordrejning af mitokondrierne 21 muligvis på grund af forbindelser til cellecytoskelettet. For at teste denne hypotese blev cellen strækker enhed udviklet, så vi kunne ændres billedet i ROS-produktion i levende celler som respons på mekanisk strækning. Her blev mitokondrielle ROS produceres af bronkiale epitelceller grund strække målt ved anvendelse af tilpassede indretning og protokol. I fravær af mekanisk stræk, havde ROS produktionen ikke stige betydeligt i løbet af 60 min (figur 4). Når en enkelt 17% stræk blev anvendt og vedligeholdt, var der en stigning i mitokondrie ROS der varede i en anden 60 min.

Direkte Epithelial Monolayer Skader Grundet Stretch

2. Flere undersøgelser tyder på, at overdreven mekanisk strækning af lunge epiteliale celler kan forårsage direkte skade involverer beskadigelse celler 11,13,26,27. Denne type skade er vanskelig at fange uden tidstro billeddannelse under mekanisk udspilning. Som sådan, benytter det brugerdefinerede enhed og fasekontrastmikroskopi hinanden følgende billeder af celler, som blev mekanisk strakt blev registreret før og efter behandling med en pro-inflammatorisk cytokin (50 ng / ml TNF-α i 6 timer) (figur 5). Billeder af det samme felt af celler blev fanget ved stigende deformationsniveauer. Billederne viser dannelsen af ​​et hul, når cellerne blev udspændt mellem 10 og 15% belastning som angivet ved de røde pile. Det er vigtigt at bemærke, at disse billeder blev optaget i nær realtid, <10 sek af forsinkelse mellem slutningen af ​​stræ h og billeddannelse, medens cellerne blev strakt. I tidligere studier af cell imaging af strakte celler, blev billeder opnået før og efter strækning kun en sammenligning af billeder af celler ikke strakt tilstand 11,13,28.

AFM Nano-indrykning på strakte celler

Den mekaniske indretning blev placeret i AFM med anvendelse af en adapterplade (se figur 6A). Ved hjælp af tidligere offentliggjorte metoder 13, elasticitetsmodul kort (E-Kort) af MLE12 celler før og efter 10% trækstyrke stamme blev opnået (figur 6D-E). Selvom fase kontrast billede ved 10% belastning (Figur 6D) blev opnået inden for 10 sekunder af strækningen, e-kort, der er vist i figur 6D-E forbruges ca. 22 min med 300 individuelle kraftafledende kurver er konstateret i en 40 um x 40 um område med en 2,5 um / s hastighed af spidsen i z-retningen.about / filer / ftp_upload / 52737 / 52737fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 1
Figur 1. Den specialdesignet enhed til cellekultur og udspænding. (A) Computer-generated tegning af den mekaniske konstruktion af indretningen, (B) fotografi af den færdige indretning, (C) fotografi af anordning forbundet til motoren og lineær driver, som omdanner motorens rotation i en 1-dimensional bevægelse, som styrer klemmen biaksiale strækning af (D) silikonegummi membran. Underlaget indeholder to huller på hver fane klemme skal placeres på stillinger på hver klemme. (E) dimensioneret FEA model af den fleksible membran, der er 1/4 i hele strukturen på grund af anvendelse af symmetriske randbetingelser. ( Trong> F) Maksimal vigtigste stammen er vist i den fulde membran skildrer dannelsen af ringe indikerer isotrop stamme felt. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. (A) Den enhed, der understøtter en fleksibel membran med markeringer anvendes til at måle påførte belastning er vist. Close-up billeder af markeringerne, før (B) og efter (C) strækning, blev mærket med en pil til klart at angive forskydningen af markeringerne på membranen. (D) Membran stamme som en funktion af motorens tæller under tilgang og tilbagetrækning. Membran stammen var ens i både tilgang og tilbagetrækning med tilbagetrækning producerer lidt højere stammer. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52737/52737fig2highres.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Membran stamme transmission til cellerne. (A - B) Fase kontrast billeder af humane bronchiale epithelceller (16HBE) på den fleksible membran ved anvendelse af et 10X objektiv, før (A) og efter (B) 20% belastning. (C - D) Fluorescensmærkede (DAPI) kernerne i 16HBE celler blev afbildet ved anvendelse af et 20X objektiv under et konfokalt mikroskop, før (C) og efter (D) 20% belastning. (E) Membranen deformation, som cellerne var lineær og homogen.t = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Virkningen af en enkelt strækning på ROS produktion af 16HBE celler blev observeret under anvendelse af en kumulativ mitokondrie superoxid sensor ved anvendelse af et 20X objektiv under et konfokalt mikroskop (A - C). Snapshots af tidsforløbet (0, 60 min, og ~ 65 min) af superoxid produktion i stræk i det samme felt af celler. (D) Relativ fluorescensintensitet af 16HBE celler over tid indikerer en stigning på 50% i fluorescensintensitet fra baseline produktion af superoxid inden for den første time (A til B). Klik her for at se en større version af dette tal.


Figur 5. Fase kontrast billeder af en alveolær epitelial (MLE12) monolag reaktion på stigende strækning (A - D). Blev alle optaget med en digital mikroskop med en 20X målsætning. Pilene angiver de steder, hvor celle-til-celle adskillelse fandt sted. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. (A) Mekanisk anordning vist i flyvehåndbogen for nano-indrykning af celler med stretch. Scanneren skal fjernes for placering af objektive extender. Tre ben extendere er knyttet til alle tre ben af ​​AFM hovedet for at tillade enhedenplacering. En adapterplade anvendes til at montere båren på AFM scanneren (sort plade). De udliggerbjælke scanninger i retning af pilen vist i den før strækning fase kontrast billede en MLE12 celle (B). De røde firkanter i før (B) og efter (C) stretch billeder skildrer det område, der blev fanget under nano-indrykning (40X mål). De elastiske modulus kort, før (D) og efter (E) stræk, opnås med tidligere publicerede analyseteknikker 13. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En unik indretning til levende celler under den mekaniske strækning blev udviklet; og denne enhed blev brugt i en protokol til at studere lunge epitel celle mechanobiology. I indledende undersøgelser blev det konstateret, at en enkelt holdt strækning stimulerede produktionen af ​​mitokondrie superoxid i bronkiale epitelceller. Desuden blev det påvist, at forøgede niveauer af mekanisk belastning forårsaget direkte skade på integriteten af ​​et monolag af alveolære epitelceller.

At gennemføre disse indledende forsøg blev enheden først kalibreret, og derefter blev det vist, at membranen stamme blev fremsendt til celler (figur 2-3). Samlet indretningen klaret sig godt, som angivet ved den tætte sammenhæng mellem membranen stamme (målt ved mærker på membranen) og cellen stamme (målt ved afstande mellem kerner) vist i figur 3E. Men der var nogle mindre forskelle observeret mellem strai målt på membranerne under tilgang og tilbagevenden kurver af markørerne, som vist i figur 2D. Dette var sandsynligvis på grund af spillerum i enheden og muligvis relateret til gribende emner. Derudover er der behov for en universel montering mekanisme for enheden, således at den effektivt kan anvendes på mikroskoper med forskellige konfigurationer. Dette vil reducere den tid, der går mellem positionering af enheden og billedoptagelse den samtidig opretholde en robust forbindelse til mikroskopet. Huller trykt i membranerne blev anvendt til at anvende en mindre pre-stamme til membranen for at forhindre dannelse af en indledende kompressionskraft tilstand på grund af klemning af et elastisk materiale. Den kompressionskraft tilstand fører også til en reduktion af den maksimale anvendelse stamme.

Den brugerdefinerede enhed er designet til at passe i et Asyl MFP3D atomic force mikroskop til at tillade nano-indrykning af levende celler under mekanisk stræk. Vi er ikke bekendt med nogen anden enhed, der er i stand til iducere en isotropisk stress tilstand i imaging fly, der kan fungere i en AFM. Indretningen blev også designet til kontinuerlig anvendelse i en celle-kultur inkubator (holdt ved 37 ° C i et fugtigt, sterilt miljø med 5% CO2). Evnen til at fungere inden for en inkubator tillader studiet af celler, der undergår langsigtede stretch regimer.

Der er adskillige begrænsninger for præsenterede fremgangsmåde. Først da de strækninger membran, inden for fokus bevæger sig ud af flyet, selv om minimalt (~ 100 um). Dette bliver en begrænsning, når sporing af et felt af celler gennem en strækning regime, fordi synsfeltet ændrer i løbet af membranen udspilning. Selvom membran inden diameter 22 mm oplever 0,23-0,25 stammen, regionerne uden for dette indre diameter opleve en mere variabel belastning felt. Selvom billeddannelse undersøgelser let er begrænset til denne centrale region, er det muligt, at cellerne reagerer på højere niveauer af stammeved ydre områder kan påvirke responset af celler i den centrale region. En ensartet stamme fordeling over et større område af interesse kan opnås med forbedringer i membran design. PDMS membranen er auto-fluorescerende ved bølgelængder, der almindeligvis anvendes til fluorescerende indikatorer, og dette begrænser evnen til billeddannelse fluorescens i celler fra under membranen. Af denne grund en opretstående mikroskop blev udnyttet med vand nedsænkning mål i vores studier af ROS produktion er beskrevet ovenfor. Dette kan være en begrænsning for undersøgelser, hvor AFM og fluorescens billeddannelse kombineres.

Den mest almindelige kommercielle enhed (FlexCell FX 5000 Tension System) til påføring af mekanisk belastning til celler inkorporerer en kontrollerbar vakuumsystem anvende trækbelastning på en membran under bevægelse ind og ud af den optiske plan. Membranen og clamp design præsenteret heri skabe en bi-aksial belastning felt, hvor stammen er isotropisk og forbliver i flyet allowing imaging i realtid. Med mindre ændringer membran design, kan båren producere enaksede stretch tilstande som godt. Hvis cellerne først er podet på en udspilet membran, i planet trykbelastninger kan også anvendes. Indretningen er i stand til at nå både fysiologiske og patologiske niveauer af stamme. Sammenfattende blev en ny enhed og protokoller udviklet, der kan anvendes til at påføre mekanisk belastning for at leve celler, som kan afbildes ved hjælp af fluorescensmikroskopi og AFM nano-indrykning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne at takke Fedex Institute of Technology på University of Memphis for deres støtte. Forfatterne vil gerne anerkende studerende på senior design projekt gruppe i Mekanik Institut ved University of Memphis (David Butler, Jackie Carter, Dominick Cleveland, Jacob Shaffer), Daniel Kohn fra University of Memphis Engineering Technology afdeling for motorstyring og Dr. Bin Teng og Ms. Charlean Luellen for deres hjælp i cellekultur. Dette arbejde blev støttet af K01 HL120912 (ER) og R01 HL123540 (CMW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SmartMotor NEMA 34: 3400 Series MOOG Animatics SM3416D Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus
Flexcell Membrane (Collagen I coated) Flexcell International Corp SM2-1010C 3.5" x 5.25" x 0.020"
Sylgard 184 Dow Corning Corporation 10:1
Hoechst 33342  Sigma-Aldrich H1399 DAPI stain
MitoSOX Sigma-Aldrich M36008
Tiron Sigma-Aldrich D7389  mitochondrial superoxide label
DMEM superoxide inhibitor
FBS
HEPES
50 ml tubes Fisher Scientific 06-443-19 Any centriguge tube can be used to create an area for imaging.
Hybridization oven Bellco Glass
MLE12 Cells ATCC CRL-2110 Mouse Lung Epithelial Cells 
16HBE cells ATCC CRL-2741 Human Bronchial Epithelial Cells
AFM Indentation Experiments
Cantilever Beams for Nano-indentation Budget Sensors Si-Ni30
AFM  Asylum Research MFP3D
Olympus microscope Olympus IX-71 Inverted microscope with 20X and 40X objectives.
AFM Leg Extenders Asylum Research Not available AFM microscope
Finite Element Analyses
ABAQUS Simulia 6.12
Software
ImageJ NIH
Microscopes
Digital microscope Life Technologies EVOS XL Core Initially a self standing company, now owned by Life Technologies.
Confocal microscope Zeiss LSM 710 2-photon upright microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tschumperlin, D. J., Boudreault, F., Liu, F. Recent advances and new opportunities in lung mechanobiology. J Biomech. 43, 99-107 (2010).
  2. Waters, C. M., Roan, E., Navajas, D. Comprehensive Physiology. John Wiley, & Sons, Inc. (2011).
  3. Majkut, S., Dingal, P. C. D. P., Discher, D. E. Stress Sensitivity and Mechanotransduction during Heart Development. Current Biology. 24, R495-R501 (2014).
  4. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475, 316-323 (2011).
  5. Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. Mechanotransduction across the cell-surface and through the cytoskeleton. Science. 260, 1124-1127 (1993).
  6. Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).
  7. Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
  8. Waters, C. M. Reactive oxygen species in mechanotransduction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L484-L485 (2004).
  9. Chapman, K. E., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
  10. Chu, E. K., Whitehead, T., Slutsky, A. S. Effects of cyclic opening and closing at low- and high-volume ventilation on bronchoalveolar lavage cytokines. Crit Car Med. 32, 168-174 (2004).
  11. Tschumperlin, D., Margulies, S. Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro. Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).
  12. Vlahakis, N. E., Hubmayr, R. D. Cellular stress failure in ventilator-injured lungs. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1328-1342 (2005).
  13. Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L1235-L1241 (2012).
  14. Gamerdinger, K., et al. Mechanical load and mechanical integrity of lung cells - Experimental mechanostimulation of epithelial cell- and fibroblast-monolayers. J Mech Behav Biomed Mater. 4, 201-209 (2014).
  15. Hayashi, K., Naiki, T. Adaptation and remodeling of vascular wall; biomechanical response to hypertension. J Mech Behav Biomed Mater. 2, 3-19 (2009).
  16. Villemure, I., Stokes, I. Growth plate mechanics and mechanobiology. A survey of present understanding. J Biomech. 42, 1793-1803 (2009).
  17. Waters, C. M., et al. A system to impose prescribed homogenous strains on cultured cells. J Appl Physiol (1985). 91, 1600-1610 (2001).
  18. Gerstmair, A., Fois, G., Innerbichler, S., Dietl, P., Felder, E. A device for simultaneous live cell imaging during uni-axial mechanical strain or compression. J Appl Physiol (1985). 107, 613-620 (1985).
  19. Dassow, C., et al. A method to measure mechanical properties of pulmonary epithelial cell layers. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 101, 1164-1171 (2013).
  20. SmartMotor User's Guide v523. Animatics Corporation. Available from: http://www.animatics.com/download/publication/UsersGuide%20v523.pdf (2011).
  21. Chapman, K., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
  22. Birukov, K. G. Cyclic stretch, reactive oxygen species, and vascular remodeling. Antioxid Redox Signal. 11, 1651-1667 (2009).
  23. Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, 335-344 (2003).
  24. Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
  25. Pouvreau, S. Superoxide flashes in mouse skeletal muscle are produced by discrete arrays of active mitochondria operating coherently. PLoS One. 5, (2010).
  26. Yalcin, H. C., et al. Influence of cytoskeletal structure and mechanics on epithelial cell injury during cyclic airway reopening. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297, L881-L891 (2009).
  27. Jacob, A. M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and claudin 4. J Appl Physiol. 113, 1377-1387 (2012).
  28. DiPaolo, B. C., Lenormand, G., Fredberg, J. J., Margulies, S. S. Stretch magnitude and frequency-dependent actin cytoskeleton remodeling in alveolar epithelia. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C345-C353 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics