Mekanik Stretch sırasında Canlı Hücre Görüntüleme

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rápalo, G., Herwig, J. D., Hewitt, R., Wilhelm, K. R., Waters, C. M., Roan, E. Live Cell Imaging during Mechanical Stretch. J. Vis. Exp. (102), e52737, doi:10.3791/52737 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Hücreler, bir çok dokuda mekanik yüklere maruz kalır ve bu, mekanik uyarma gen ekspresyonu, büyüme faktörleri, sitokinler, ya da hücre dışı matrisin yeniden verildiği şekillerindeki değişiklikleri teşvik etmek ve 1-4 hücre iskeletinin gösterilmiştir. Bu tür mekanik uyarıcılara karşı hücre içi sinyallere mechanotransduction 5-7 işleminde meydana gelir. Solunum sisteminde, mechanotransduction bir sonucu, reaktif oksijen türlerinin (ROS), siklik bir çekme gücü mevcudiyetinde pulmoner epitel hücrelerinde 8,9 ve pro-inflamatuar sitokinlerin 10 artıştır. Güçlü kanıtlar ayrıca aşırı gerilim soyu hücrelerinin 11-14 biyokimyasal yanıtların yanı sıra, alveol epiteline yaralanması doğrudan yol açtığını göstermektedir. Odak Burada mekanik deformasyon akciğer hücrelerinin yanıtı esas olmasına rağmen, mechanotransduction neden yollar bas önemli bir rol oynardamar tonusu 15 düzenlenmesinde ve büyüme plağının 16 geliştirilmesi dahil olmak üzere insan vücudunda birçok dokuda, bir ic fonksiyonu.

mechanotransduction artan ilgi kültürlenmiş hücreler ve doku için fizyolojik olarak ilgili mekanik yüklerin uygulanması için çok sayıda cihazı geliştirilmesi ile sonuçlanmıştır. Özel olarak, doku tarafından yaşanan mekanik yüklenme ortak bir biçimi olan bir çekme gücü, uygulama tertibatının 11,17-19 popülerdir. Ancak, mevcut cihazların çoğu ya doku mühendisliği uygulamaları için biyoreaktör olarak tasarımlanmış veya streç ile gerçek zamanlı görüntüleme için elverişli değildir. Bu nedenle, mechanotransduction arasında yolların araştırılmasını kolaylaştırmak için gerilim hücre ve dokuları görselleştirmek araçları ve yöntemlerinin geliştirilmesi için bir ihtiyaç vardır.

Burada, bir düzlem mekanik germe cihazı tasarlanmıştır ve protokoller m uygulamak için geliştirilmiştirultiple dokulara soyunun formları ve hücreler, gerçek zaman (Şekil 1A-D), biyokimyasal ve mekanik yanıtların görüntüleme imkan verir. Cihaz, esnek bir membran kavramak ve yaklaşık% 20 (Şekil 1B) bir düzlemsel radyal distansiyon yukarı uygulamak için çevresel olarak yerleştirilmiş olan eşit aralıklı kelepçeler kullanılmaktadır. Motor (Şekil 1C) inkübatör dışına yerleştirilmiş ve motor satıcı tarafından sunulan özel yazılım tarafından kontrol edilir ise çalıştırma tertibatı, uzun bir zaman süresi için bir hücre kültürü inkübatöründe yerleştirilebilir. kas gerginliği ve gevşeme eşit altı sedye kelepçeler sürüş bir iç cam döner lineer sürücü bağlanır.

Mekanik cihaz ek olarak, özel esnek zarların mekanik bir sistemde kullanılmak üzere ticari olarak temin edilebilen hücre kültürü hazır zarlarından oluşturulmuştur. Yaklaşık bir çapı olan, dairesel sonra duvar (28 mm) yapılmıştır ve hücreler, sadece iyi tarif edilen suş profili bu bölgede kültürlenebilir böylece esnek bir zar üzerine bağlanmıştır. Harekete geçirme cihazı içinde bu membranların yerleştirilmesi, esnek bir zarın merkezinde tek tip ve izotropik streynini sağlayabilir olup olmadığını belirlemek için, sonlu eleman analizi, ticari olarak temin edilebilen yazılımı (Şekil 1E-F) kullanılarak yapıldı. Esnek zar simetrik sınır koşulları ve örgü için tüm dörtgen elemanlar kullanan ile modellenmiştir. Şekil 1F gösterilen maksimum asal zorlanma kontur arsa görülen eş halkalar zorlanma izotropik dağılımını göstermektedir.

membran tarafından hissedilen gerginlik yükleme (Şekil 2) vasıtasıyla işaretler görüntüleri kaydedilerek sürekli olarak ölçüldü. Şekil 2B, radyal ve eksenel yönde ölçülen ortalama membran soyu yaklaşık doğrusal olduğunu göstermektediruygulanan motoru ile ilgili olarak% 20 oranında bir maksimum doğrusal suşu kadar sayar. Geri dinlenme pozisyonuna geri çekilmesi sırasında ölçülen kıyasla distansiyon sırasında ölçülen gerilme düzeyleri arasında anlamlı bir fark yoktu. Daha sonra, özel bir esnek zar üzerinde kültürlenmiş insan bronşiyal epitel hücreleri (16HBE) ve bunların çekirdeklerinin değiştirme ölçüldü. Bütün hücre yer değiştirmesi, bir dijital mikroskop ile kaydedilen faz kontrast görüntüleri ile ölçüldü ise 16HBE hücrelerinin floresan etiketli (DAPI) çekirdekler, konfokal mikroskop altında bir 20x objektif kullanılarak görüntülendi. Şekil 3'te görüldüğü gibi, çekirdek yer değiştirmesi ile ölçülen gerilme, up ~% 20 lineer streyn zar üzerinde işaretlerin yer değiştirmesi ile ölçülen benzer olmuştur. Bu membranların uygulanan gerilme yapışık hücrelere iletilen olduğunu doğrulamaktadır. Geleneksel mikroskop özel cihazın kullanımını anlatan protokolleri ve atomik kuvvet mikroskopE, aşağıdaki adımlarda verilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tutma Hücre Kültürü Medya Kuyu Walls (nihai ürün için Şekil 1D bakınız) Membran 1. İnşaat

  1. Kollajen I ile kaplanmış polidimetilsiloksan (PDMS) yaprak kullanarak, neşter veya bir kalıp esnek membran hatlarını kesti.
  2. Depolanması için bir 60 mm Petri kabı, her membran yerleştirin.
  3. Duvarların Oluşturma:
    1. B (sertleştirici) elastomer elastomer A: 1 ağırlık oranında, bir 10 PDMS karıştırın.
    2. 50 ml tüpler içine tam olarak karıştırılır PDMS 5 ml dökün.
    3. Yatay bir hibridizasyon fırında sertleşmemiş PDMS ile 50 ml'lik tüpler yerleştirin.
    4. Kür süresinde 8 rpm'de kaplamak için tüplerin iç duvarları rotor işlevini kullanın. Oda sıcaklığında, PDMS tam 2 gün içinde tedavi edilecek.
    5. Steril hücre kültürü kaputu tüpten PDMS çıkarın.
    6. Yeni bir jilet kullanarak, bölümlerde yüksekliği 4 mm içine PDMS silindir bölümlemek.
    7. Membran wa olarak görev yapacak bölümleri, koyunlls, izin vermeden bir Petri kabı kabına duvarları buruşuk olmak.
  4. Petri kabındaki iki korurken, bir zar üzerinde PDMS bir duvar seçin ve merkezi.
  5. Tutkal olarak kullanılmak üzere, duvarın dış çevre üzerinde (1 oranında 10) hafifçe sertleşmemiş PDMS yerleştirin. Bu sıvı tutmak için olmadığı duvar ve zar arasındaki boşluk oluşmasını önler.
  6. Her petri çanağı tamamlanmış membran içeren ve tedavi etmek için 24 saat boyunca 70 ° C'de bir fırın içinde kapalı bir yer.

Kalibrasyon için Kelepçe Yerinden veya Radyal Büyüme (Şekil 2) Motorlu Münavebesindeki 2. Korelasyon

  1. Motorun kontrol yazılımını başlatın.
  2. Motor yazılımı manuel ayarını kullanarak cihazın kelepçeleri yerinden.
  3. Mesafeyi ölçün ve kelepçeler minimum ve maksimum deplasman hem de kelepçeler karşıt arasındaki motor sayısı konumunu kaydedin.
  4. D yüzde değişim hesaplayınMotor sayımı (~ 0-75k sayımları) 'in bir fonksiyonu olarak kelepçeler arasında istance. Bu membran üzerinde elde edilen maksimum potansiyel gerginlik gösterecektir.

Fare Akciğer Epitel Hücre Hattı Stretch 3. Uygulama (MLE12)

  1. Oyuk başına esnek bir zar üzerinde 2.500.000 hücreleri (Aşama 1) Tohum MLE12 hücreler iki gün içinde birleşmiş olması. tohum yoğunluğu farklı hücre tipleri için farklı olabilir.
  2. Mekanik aktüatör tamamen rahat bir konumda olduğundan emin olun.
    1. Hücre kültürü ortamı çıkarın.
    2. Altı kelepçenin her iki delikler, 1.5 mm biyopsi kalıplar kullanılarak membran çıkıntıları (Şekil 1D bakınız). deliklerin radyal yerleştirme membran deneyimleri başlangıçta ön gerilim miktarını belirler. Hiçbir ön gerilim isteniyorsa membran sekmelerde 20.5 mm yarıçapında delikler.
    3. Delikli delik kelepçeler içinde iğne ile sıraya ile sedye üzerinde membran yerleştirin.Yerde üst kelepçeleri yerleştirin. Vidaları zaman alternatif tarafta bir tane sıkın.
    4. 1 ml hücre kültür ortamı ekleyin.
  3. Işık yolu ile membran orta merkezleme mikroskop sahnede cihazı yerleştirin.
  4. Sahneye cihazı sabitlemek için bant veya mıknatısları (mümkünse) kullanın. Bir kez, sabit, mikroskop aşamasında kontrol ünitesi ile mekanik bir cihazın düzlem (zara paralel) ve dikey (z-yönü) kontrol eder.
  5. Manuel motor dönüş 20 konumunu ve hızını kontrol ederek üretici tarafından sağlanan yazılım ile streç uygulayın.

Mitokondriyal reaktif oksijen türlerinin 4. Ölçüm (ROS)

  1. Hücreler birleştiklerinde, sonra, doğrudan hücrelerde mitokondriyal süperoksit göstergesi (5 uM nihai konsantrasyon) ile RT DMEM 1-2 ml ekleyin.
  2. 37 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edin.
  3. Yıkama Hücreler nazikçe tampon maddesi ile üç defa bir su banyosu içinde ısıtılmıştır37 ° C.
  4. Hemen dik konfokal mikroskop altında zaten yerinde sedyeye (Adım 2.2) esnek membran yerleştirin.
  5. Fenol-kırmızı içermeyen ortamda ve HEPES 25 mM DMEM 1 ml ilave edilir.
  6. 510/580 nm uyarım / emisyon filtreleri ayarlayın.
  7. Görüntü birden alanlar her 15 dk mitokondriyal süperoksit üretiminin istenilen zaman ders oluşturmak için.
  8. Çekilen görüntülerin itibaren, rekor floresan yoğunluğu floresan yoğunluğu miktarının yeteneğine sahip yazılımı kullanarak her zaman aralığında histogramlar.

Streç ve Atomik Kuvvet Mikroskobu 5. Uygulama (AFM)

Not: Bu adımlarda, belirli bir AFM ve optik mikroskop kombinasyonu (Şekil 4 ve Malzeme Listesi) için verilmiştir.

  1. Deney için AFM hazırlayın.
    1. Z-doğrultusunda maksimum pozisyona AFM baş yüksekliğini artırın.
    2. AFM ayakları üzerine genişleticiler koyUçağı kaldırmak hangi AFM konsol temas örnek de. Numune ve AFM kafası mekanik bir cihaz yüksekliğine uyacak kaldırılması gerekir.
  2. (Varsa) optik mikroskop hazırlayın.
    1. AFM tarayıcı plakasını sökün. İstenilen hedefe çıkarın.
    2. Amaç için bir ayırıcı ekleyin. aralama yüksekliği objektif ve belirli AFM set-up bağlı olacaktır, ancak gözlem uçağı sedye ve adaptör yüksekliği (Şekil eşit miktarda z-yönünde kayma olacağından optik görüntüleme isteniyorsa gerekli olduğunu 5A). AFM genellikle cihazın üzerinde bir optik yolundan düşük büyütme görüntüleme sağladığını unutmayın.
    3. Konumu istenen amaç geri monte edin. AFM geri tarayıcıyı yerleştirin.
    4. AFM yazılımını başlatın. Floresan ölçümleri için ışık kaynağı dahil gerekli bütün ışık kaynakları başlatın.
    5. Bir konsol kiriş ile bir çip monte olduğunuarzu edilen ölçümler için uygundur. Canlı hücrelerin elastik modülü ölçerken 200 pN / nm ya da daha az sertlik tercih edilmektedir.
    6. Lazer hizalama ve cihaz üzerine monte edilmiş bir cam lamel üzerinde üreticinin önerilerine göre konsol sertliği kalibre.
  3. Aşama 1 'de olduğu gibi bir zar hazırlama, ancak şu değişiklikler yapılmıştır.
    1. Hemen germe aygıtının için membran takmadan önce, yüksekliği yaklaşık 1 mm duvar kesti. Bu membran duvar ve yük hücresi arasında yaşanan girişimi önler.
    2. 3.2.1-3.2.3 tarif edildiği gibi mekanik bir cihaz ile ilgili membran monte edin.
    3. Bir dökülme durumunda AFM tarayıcı zarar görmesini önlemek için hücre kültürü ortamı çıkarın.
    4. Çift bir adaptör (Şekil 5A) ile bir cihaz. Tarayıcının adaptörle mekanik cihaz yerleştirin.
    5. İstenen gerilme gerinim seviyesine membran gerin.
  4. Nedeniyle dökülme için AFM tarayıcı veya mikroskop zarar görmesini önlemek için hücreler üzerinde medya sınırlı (<0.5 ml) hacmi ekleyin.
  5. Membran ile konsol kiriş Engage.
  6. Ilgi alanları taramak için belirli AFM cihazının protokolünü izleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Reaktif Oksijen Türleri ve Deformasyon

Daha önce yapılan çalışmalar, siklik streç 21 tepki olarak hava yolu ve alveolar epitel hücrelerinin, reaktif oksijen türlerinin (ROS) artış göstermiştir. Reaktif oksijen türleri, molekülleri ve lipitler, proteinler, polisakkaritler, nükleik asitler, 22-24, yüksek reaktiviteye sahip moleküler oksijenden türemiş serbest radikalleri içerir. ROS, ortak bir hücre içi iyon kanalı fonksiyonu düzenleyen bir sinyal, protein kinaz / fosfataz aktivasyonu ve gen ifadesi olarak hizmet, ancak aşırı veya düzensiz üretiminin, apoptotik ve nekrotik hücre ölümü, sinir dejenerasyonu, ateroskleroz, diyabet ve kanser 24,25 katkıda bulunabilir. Elektronlar elektron transfer zincirinden sızıntı olduğunda süperoksit, ROS diğer formları için bir ön imleç, mitokondriyal solunumun bir yan ürün olarak imal edilebilir. Önceki çalışmalar halkalı mekanik streç süper üretimini stimüle önerdiNADPH oksidaz sistemi (nikotinamid adenin dinükleotit fosfat oksidaz) ve mitokondriyal elektron taşıma zinciri (karmaşık I ve III) bir kombinasyonu ile oksittir. Bu stimülasyon nedeniyle hücre iskeletinin bağlantıları nedeniyle muhtemelen mitokondri 21 doğrudan bir bozulma olduğu önerilmiştir. Bu hipotezi test etmek için, germe aygıtının hücre geliştirildi biz olabilir, böylece mekanik germe yanıt olarak, canlı hücreleri ROS üretiminin görüntü değişir. Burada, esneme bağlı bronşiyal epitel hücreleri tarafından üretilen mitokondriyal ROS özel cihaz ve protokol kullanılarak ölçülmüştür. Mekanik streç yokluğunda, ROS üretimi önemli ölçüde 60 dakika (Şekil 4) üzerinde artmamıştır. Tek bir% 17 germe uygulanır ve tutulan zaman, başka bir 60 dakika boyunca devam mitokondriyal ROS bir artış oldu.

Due Stretch Doğrudan Epitel Monolayer Hasar

2 derinlemesine tartışılmıştır zarar hangi Dolaylı mekanizmalar. Çeşitli çalışmalar, akciğer epitel hücrelerinin aşırı mekanik streç hücrelerine 11,13,26,27 zarar içeren doğrudan yaralanmalara neden olabilir düşündürmektedir. Bu tür bir hasar mekanik distansiyon sırasında gerçek zamanlı görüntüleme olmadan yakalamak zordur. Bu nedenle, özel bir cihaz ve faz kontrast mikroskopisi mekanik önce kaydedildi gergin hücre ve pro-enflamatuar sitokin (6 saat süre ile 50 ng / ml TNF-α) (Şekil 5) ile muamele edildikten sonra ardışık görüntü kullanılması. Hücrelerin aynı alanda görüntüleri artan gerilme seviyelerinde ele geçirildi. Fotoğraflar, kırmızı oklarla gösterildiği gibi hücre 10 ve% 15 suşu arasında gergin bir boşluk oluşumunu göstermektedir. Bu Streç sonu arasındaki <bu görüntüler neredeyse gerçek zamanlı olarak kaydedildi olduğu gecikme 10 saniye dikkat etmek önemlidir H ve görüntüleme, hücreler uzatılır ise. Gergin hücrelerin hücre görüntüleme önceki çalışmalarda, görüntüler önce ve streç değil gerilmiş durumda 11,13,28 de hücrelerin sadece görüntüleri karşılaştırarak sonra elde edildi.

Gergin hücreleri üzerinde AFM Nano-girinti

mekanik cihaz (Şekil 6A), bir adaptör plakasının kullanımı ile AFM yerleştirilmiştir. Daha önce yayınlanmış yöntemlerin 13, elastik modül haritaları önce MLE12 hücrelerinin (E-harita) ve% 10 ettikten sonra germe soyu kullanılarak (Şekil 6D-D) elde edilmiştir. % 10 suşu (Şekil 6D) faz kontrast görüntü streç 10 saniye içinde elde olmasına rağmen, Şekil 6D-E'de gösterilen e-haritalar 40 mikron X 40 mikron üzerinde kaydedilen 300 bireysel kuvvet-sapma eğrileri ile yaklaşık 22 dakika tüketilen z-yönünde bir uç kısmı 2.5 um / s hız ile alan.om / files / ftp_upload / 52737 / 52737fig1highres.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Figür 1
Şekil 1. Hücre kültürü ve germe için özel olarak tasarlanmış bir cihaz. (A) cihazın mekanik tasarım Bilgisayar oluşturulan çizim, (B) tamamlanmış cihazın, (C) 1 boyutlu hareket içine Motor dönüşünü dönüştüren motor ve lineer sürücü bağlı cihazın fotoğraf fotoğrafını hangi (D) silikon kauçuk membran kelepçe çift eksenli streç kontrol eder. Alt tabaka, her kelepçe ile ilgili mesajların yerleştirilmek üzere her kelepçe sekmesinde iki delik içerir. Nedeniyle, simetrik sınır koşulları kullanılmasına bütün yapının 1/4 olan esnek bir membran (E) Boyutlu FEA modeli. ( trong> F) Maksimum anapara yamulma izotropik yamulma alanının gösterge halkaları oluşumunu gösteren tam zarında gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2. (A) uygulanan gerginlik ölçmek için uygulanan işaretleri ile esnek bir membran destek cihazı gösterilmektedir. Close-up (B) önce işaretler görüntüleri ve sonra (C) streç, membran üzerinde işaretlerin deplasman işaret açıkça bir ok ile işaretlenmiştir. Motorun bir fonksiyonu olarak (D) Membran suşu yaklaşımı ve geri çekme sırasında sayar. Membran suşu retraksiyonu biraz daha yüksek suşlar üreten hem yaklaşım ve geri çekme benzerdi. = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52737/52737fig2highres.jpg" target = "_ blank" href> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. Membran soyu hücrelerine iletimi. (A - B), (A) önce 10X objektif kullanılarak esnek bir zar üzerinde insan bronşiyal epitel hücreleri (16HBE) arasında Faz kontrast görüntüleri ve (B)% 20 gerilim sonrası. (Cı - D) 16HBE hücrelerinin Floresan etiketli (DAPI) çekirdek (C) önce, ve (d)% 20 gerildikten sonra, konfokal mikroskop altında bir 20x objektif kullanılarak görüntülendi. (E) hücreleri tarafından deneyimli membran zorlanma doğrusal ve homojen oldu.t = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4. 16HBE hücre ROS üretiminin tek bir esneme etkisi konfokal mikroskop altında bir 20x objektif kullanarak bir kümülatif mitokondriyal süperoksit sensörü kullanılarak gözlendi (A - C). Anlık zaman programı (0, 60 dakika, ve ~ hücrelerin aynı alanda germe sırasında süperoksit üretimi 65 dakika). (D) ilk bir saat içinde süperoksit temel üretim floresan% 50'lik bir artış (B A) gösteren zamanla 16HBE hücrelerinin Bağıl floresan yoğunluğu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.


Şekil artan germek için, bir alveolar epitel (MLE12) tek tabaka tepkisinin 5. Faz kontrast görüntüleri (A - D). Tüm bir 20x objektif ile bir sayısal mikroskop kullanılarak kaydedildi. oklar, hücre-hücre ayırma meydana konumları gösteriyor. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Streç hücrelerin nano girinti için AFM gösterilen Şekil 6 (A), mekanik bir cihaz. Tarayıcı amacı genişletici yerleştirilmesi için kaldırılmalıdır. Üç bacak uzatma kabloları cihaz için izin AFM başın her üç ayaklı bağlıdırlaryerleştirme. Bir adaptör plakası AFM tarayıcı (siyah plaka) üzerine sedyeyi monte etmek için kullanılır. önce streç faz kontrast görüntü bir MLE12 hücresi (B) gösterilen ok yönünde konsol kiriş tarar. önce (B) ve (C) streç görüntüleri sonrasında kırmızı kareler nano girinti (40X objektif) sırasında yakalandı alanı betimliyor. elastik modülü haritaları, (D) önce ve sonra (E) streç, önceden yayınlanmış analiz tekniklerinin 13 ile elde edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mekanik streç sırasında canlı hücre görüntüleme için benzersiz bir cihaz geliştirildi; ve bu cihaz, akciğer epitelyal hücre mechanobiology incelemek için bir protokol kullanılmıştır. Ön çalışmalarda, tek tutulan streç bronşiyal epitel hücrelerde mitokondrial süperoksid üretimini uyardığı tespit edildi. Buna ek olarak, mekanik zorlanma artmış seviyeleri alveolar epitel hücrelerinin bir tek tabaka bütünlüğü doğrudan bozukluklara sebep olduğu gösterilmiştir.

Bu ön deneyler için, aygıt önce kalibre edildi ve daha sonra zar soyu hücreleri (Şekil 2-3) iletilir olduğu gösterilmiştir. Şekil 3E gösterilen (membran üzerinde işaretleri ile ölçülen) membran zorlanma ve (çekirdekleri arasındaki mesafeler ile ölçülen) hücre suşu arasındaki yakın korelasyon gösterdiği gibi genel aygıt, iyi bir performans. Ancak, stra arasında gözlemlenen bazı küçük farklılıklar vardıŞekil 2B gösterildiği gibi de, yaklaşma sırasında membranların ve belirteçlerinin dönüş eğrileri üzerinde ölçtü. Bu cihazda geri adım atılmak muhtemel nedeni ve sorunları kavrama muhtemelen ilgili oldu. Etkin bir şekilde farklı konfigürasyonlara sahip mikroskoplar kullanılabilir ve böylece ek olarak, cihaz için evrensel bir montaj mekanizması gereklidir. Bu mikroskop sağlam bir bağlantı korurken cihaz ve görüntü alımı konumlandırma arasında harcanan zamanı azaltacaktır. Zarlarda delinmiş delikler nedeniyle elastik bir malzemeden sıkıştırma için bir ilk sıkıştırıcı durum oluşumunu önlemek için zar için küçük bir ön gerilme uygulamak için kullanıldı. sıkıştırılma durumu aynı zamanda maksimum geçerli soyun bir azalmaya yol açar.

özel aygıt mekanik streç sırasında canlı hücrelerin nano-girinti izin vermek için Sığınma MFP3D Atomik Kuvvet Mikroskobu sığacak şekilde tasarlanmıştır. Biz yeteneğine sahip herhangi bir başka aygıt farkında değildirBir AFM içinde işlev görebilir görüntüleme düzleminde izotropik stres durumu ducing. Aygıt, aynı zamanda bir hücre kültürü inkübatöründe sürekli kullanım için tasarlanmıştır (% 5 CO2 ile nemli, steril bir ortamda 37 ° C'de tutulur). bir kuluçka içinde çalışması yeteneği, uzun vadeli streç rejimleri geçiren hücrelerin çalışma sağlar.

Sunulan yaklaşımın bazı sınırlamalar vardır. Birincisi, zar uzanıyor olarak, odak alan olmasına rağmen minimal, düzlemin dışına taşır (~ 100 mikron). Görüş alanı membran distansiyon boyunca değişir, çünkü bir streç rejimi ile bir hücre alanını takip Bu bir sınırlama olur. 22 mm çapında olan membran 0,23-0,25 gerginlik yaşar olsa da, bu iç çap deneyimi daha değişken gerilme alanının dışında kalan bölgeler. Görüntüleme çalışmaları kolayca merkezi bölge ile sınırlı olmasına rağmen, bu hücreler, suşun yüksek düzeyde yanıt olanaklıdırDış bölgelerin merkezi bölge içinde hücrelerinin tepkisini etkileyebilir. Ilgi daha geniş bir alana düzgün bir gerilme dağılımı membran tasarımı gelişmeler ile elde edilebilir. PDMS membran sıklıkla flüoresan göstergeler için kullanılan dalga boyunda otomatik fluoresan ve bu zarın altındaki hücrelerde fluoresans görüntüsü için yeteneği sınırlar. Bu nedenle dik mikroskop yukarıda açıklanan ROS üretimi bizim çalışmalarda suya daldırma hedefleri ile kullanılmıştır. Bu AFM ve floresan görüntüleme kombine edildiği çalışmalar için bir sınırlama olabilir.

hücrelere mekanik zorlanma uygulamak için en yaygın ticari cihaz (FlexCell FX 5000 Germe Sistemi) ve optik uçaktan dışarı taşırken bir zar üzerinde gerilme yorgunluğunu uygulayan bir kontrol vakum sistemine sahiptir. suşu izotropik ve uçak allowin kalır nerede burada sunulan membran ve kelepçe tasarımı bi-eksenli gerilme alanı oluşturmakg gerçek zamanlı görüntüleme. Membran tasarımı küçük değişikliklerle, sedye de tek eksenli streç modları üretebilir. Hücreler ilk önce şişmiş zar üzerinde ekilmiş ise, düzlem-içi sıkıştırma yükleri de uygulanabilir. Cihaz zorlanma hem fizyolojik ve patolojik düzeylere ulaşması mümkün. Özet olarak, yeni bir cihaz ve protokoller, flüoresans mikroskopisi ve AFM nano girinti kullanılarak görüntülenebilir hücreleri canlı mekanik gerilime uygulamak için kullanılabileceğini geliştirilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

Acknowledgments

Yazarlar, desteklerinden dolayı Memphis Üniversitesi'nde Teknoloji Fedex Enstitüsü'ne teşekkür isterim. Yazarlar Memphis (David Butler, Jackie Carter, Dominick Cleveland, Jacob Shaffer) Üniversitesi Makine Mühendisliği Bölümü'nde kıdemli tasarım proje grubunun öğrencileri kabul etmek istiyorum, motor kontrolü için University of Memphis Mühendislik Teknolojisi bölümünden Daniel Kohn Hücre kültüründe yardım ettikleri için, Dr. Bin Teng ve Bayan Charlean Luellen. Bu eser K01 HL120912 (ER) ve R01 HL123540 (CMW) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SmartMotor NEMA 34: 3400 Series MOOG Animatics SM3416D Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus
Flexcell Membrane (Collagen I coated) Flexcell International Corp SM2-1010C 3.5" x 5.25" x 0.020"
Sylgard 184 Dow Corning Corporation 10:1
Hoechst 33342  Sigma-Aldrich H1399 DAPI stain
MitoSOX Sigma-Aldrich M36008
Tiron Sigma-Aldrich D7389  mitochondrial superoxide label
DMEM superoxide inhibitor
FBS
HEPES
50 ml tubes Fisher Scientific 06-443-19 Any centriguge tube can be used to create an area for imaging.
Hybridization oven Bellco Glass
MLE12 Cells ATCC CRL-2110 Mouse Lung Epithelial Cells 
16HBE cells ATCC CRL-2741 Human Bronchial Epithelial Cells
AFM Indentation Experiments
Cantilever Beams for Nano-indentation Budget Sensors Si-Ni30
AFM  Asylum Research MFP3D
Olympus microscope Olympus IX-71 Inverted microscope with 20X and 40X objectives.
AFM Leg Extenders Asylum Research Not available AFM microscope
Finite Element Analyses
ABAQUS Simulia 6.12
Software
ImageJ NIH
Microscopes
Digital microscope Life Technologies EVOS XL Core Initially a self standing company, now owned by Life Technologies.
Confocal microscope Zeiss LSM 710 2-photon upright microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tschumperlin, D. J., Boudreault, F., Liu, F. Recent advances and new opportunities in lung mechanobiology. J Biomech. 43, 99-107 (2010).
  2. Waters, C. M., Roan, E., Navajas, D. Comprehensive Physiology. John Wiley, & Sons, Inc. (2011).
  3. Majkut, S., Dingal, P. C. D. P., Discher, D. E. Stress Sensitivity and Mechanotransduction during Heart Development. Current Biology. 24, R495-R501 (2014).
  4. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475, 316-323 (2011).
  5. Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. Mechanotransduction across the cell-surface and through the cytoskeleton. Science. 260, 1124-1127 (1993).
  6. Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).
  7. Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
  8. Waters, C. M. Reactive oxygen species in mechanotransduction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L484-L485 (2004).
  9. Chapman, K. E., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
  10. Chu, E. K., Whitehead, T., Slutsky, A. S. Effects of cyclic opening and closing at low- and high-volume ventilation on bronchoalveolar lavage cytokines. Crit Car Med. 32, 168-174 (2004).
  11. Tschumperlin, D., Margulies, S. Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro. Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).
  12. Vlahakis, N. E., Hubmayr, R. D. Cellular stress failure in ventilator-injured lungs. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1328-1342 (2005).
  13. Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L1235-L1241 (2012).
  14. Gamerdinger, K., et al. Mechanical load and mechanical integrity of lung cells - Experimental mechanostimulation of epithelial cell- and fibroblast-monolayers. J Mech Behav Biomed Mater. 4, 201-209 (2014).
  15. Hayashi, K., Naiki, T. Adaptation and remodeling of vascular wall; biomechanical response to hypertension. J Mech Behav Biomed Mater. 2, 3-19 (2009).
  16. Villemure, I., Stokes, I. Growth plate mechanics and mechanobiology. A survey of present understanding. J Biomech. 42, 1793-1803 (2009).
  17. Waters, C. M., et al. A system to impose prescribed homogenous strains on cultured cells. J Appl Physiol (1985). 91, 1600-1610 (2001).
  18. Gerstmair, A., Fois, G., Innerbichler, S., Dietl, P., Felder, E. A device for simultaneous live cell imaging during uni-axial mechanical strain or compression. J Appl Physiol (1985). 107, 613-620 (1985).
  19. Dassow, C., et al. A method to measure mechanical properties of pulmonary epithelial cell layers. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 101, 1164-1171 (2013).
  20. SmartMotor User's Guide v523. Animatics Corporation. Available from: http://www.animatics.com/download/publication/UsersGuide%20v523.pdf (2011).
  21. Chapman, K., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
  22. Birukov, K. G. Cyclic stretch, reactive oxygen species, and vascular remodeling. Antioxid Redox Signal. 11, 1651-1667 (2009).
  23. Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, 335-344 (2003).
  24. Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
  25. Pouvreau, S. Superoxide flashes in mouse skeletal muscle are produced by discrete arrays of active mitochondria operating coherently. PLoS One. 5, (2010).
  26. Yalcin, H. C., et al. Influence of cytoskeletal structure and mechanics on epithelial cell injury during cyclic airway reopening. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297, L881-L891 (2009).
  27. Jacob, A. M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and claudin 4. J Appl Physiol. 113, 1377-1387 (2012).
  28. DiPaolo, B. C., Lenormand, G., Fredberg, J. J., Margulies, S. S. Stretch magnitude and frequency-dependent actin cytoskeleton remodeling in alveolar epithelia. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C345-C353 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics