פלייט מדרגי 96-גם בהתבסס iPSC תרבות וייצור באמצעות מערכת רובוטית טיפול נוזל

Developmental Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Conway, M. K., Gerger, M. J., Balay, E. E., O'Connell, R., Hanson, S., Daily, N. J., Wakatsuki, T. Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System. J. Vis. Exp. (99), e52755, doi:10.3791/52755 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

קידום המשיך בתרבית תאי גזע pluripotent סוגר את הפער בין הספסל והמיטה לשימוש בתאים אלה ברפואת רגנרטיבית, גילוי תרופות ובדיקות בטיחות. על מנת לייצר גזע biopharmaceutics תא נגזר ותאים להנדסה והשתלת רקמות, טכנולוגיית תא-ייצור חסכוני היא חיונית. תחזוקה של pluripotency וביצועים יציבים של תאים ביישומים במורד הזרם (לדוגמא, התמיינות תאים) לאורך הזמן היא בעל חשיבות עליונה לייצור תאים בקנה מידה גדול. עם זאת, זה יכול להיות קשה להשגה במיוחד אם הם תאים בתרבית באופן ידני שבו המפעיל יכול להציג את ההשתנות משמעותית, כמו גם להיות יקר בקנה המידה-עד. כדי לאפשר תפוקה גבוהה, ייצור תאי גזע בקנה מידה גדולה ולהסיר פרוטוקולי תרבות תאי גזע רומן השפעת המפעיל באמצעות ספסל העליון רב-ערוצי נוזל טיפול רובוט פותחו הדורשים מעורבות טכנאי מינימאלית או ניסיון. עםתאים אלה אנושי פרוטוקולים מושרה גזע pluripotent (iPSCs) היו בתרבית בתנאים ללא מזין ישירות ממניות קפוא ונשמרו ב96-גם צלחות. בהתאם לשורת תאים ושיעור בהיקף של עד רצויה, המפעיל יכול בקלות לקבוע מתי מעבר מבוסס על סדרה של תמונות המראות את צפיפות המושבה האופטימלית לפיצול. אז ריאגנטים הצורך מוכנים לבצע פיצול מושבה לצלחות חדשות בלי צעד צנטריפוגה. אחרי 20 קטעים (~ 3 חודשים), שני קווי iPSC נשמרו karyotypes היציב, הביעו סמנים של תאי גזע, ומובחנים לשריר לב עם יעילות גבוהה. המערכת יכולה לבצע הקרנת תפוקה גבוהה הבאה של פרוטוקולים חדשים בידול או מניפולציה גנטית נועדו ל96-גם צלחות. טכנולוגיה זו תפחית את נטל העבודה וטכני לייצר מספר גדול של תאי גזע זהים למספר עצום של יישומים.

Introduction

השימוש בתאים אנושיים הנגרם pluripotent גזע (iPSCs) גדל באופן משמעותי מאז גזירתם בשינה 2007 1 לבדיקת מתחם, רפואת רגנרטיבית ומודלים מחלה 2-6. דרישה זו מגיעה מהיכולת של iPSC להניב מספר גדול של תאי pluripotent שיכול להיות מובחן לתוך תאים סומטיים בכמות שאין כמותו. טכניקות בידול מכוונים לשפר 7-10 ופיתוח של תאים אנושיים או דוגמנות רקמה וטיפול בתאים מגביר 11-14, כך גם הדרישה לייצור המוני של iPSCs באיכות גבוהה. הוא ציטט נרחב שבין מחלות אחרות, אוטם שריר לב או החלפה פונקציונלית ב-תא ידרוש מאות מיליון למליארד iPSC נגזר תאים סומטיים 15-18. דוגמנות רקמת 3D יתר על כן, מורכבת יותר ויותר לגילוי תרופות ולאherapy ידרוש מספר גדול של תאים 9,13,19. בכל דוגמאות הללו, מוגדרים, אחידים וiPSCs לשחזור חייב להיות זמין ופשוט כדי לייצר.

על מנת לייצר גזע biopharmaceutics תא נגזר ותאים להנדסה והשתלת רקמות, טכנולוגיית תא-ייצור חסכוני היא חיונית. ייצור בקנה מידה של iPSCs התמקד בתרבות השעיה 20 - 25 או השעיה עם השימוש במצעי microcarrier 26-28 גם בגלל טכניקות אלה פרוסות בהצלחה בקנה מידה גדולה שאינו iPSC ייצור מבוסס,, האיקריוטים. מספר קבוצות הפגינו מערכות תרבות השעיה שתנבנה תאי גזע pluripotent 20,21,23,24,29. עם זאת, גישות אלה לנצל מערכות יקרות ומורכבות לא זמינות לחוקרים לפתח תוכניות בידול רומן, נהיגה הנדסת רקמות ועושה Laboratמחקר בקנה מידה אורי. יתר על כן, תרבויות iPSC השעיה וmicrocarrier דורשות הסתגלות וטכניקות או כימיקלים לא מצאו בתרבות iPSC חסיד מסורתית כגון שימוש רצוף של מעכבי Rho-קינאז, סוכני antifoaming וסינון להסדיר צבירה. לחץ פיזי לתאים שכיח יותר בתרבות השעיה, שהוצג על ידי תסיסה מכאנית, כמו גם במהלך התנגשות microcarrier. נושאים אלה מגבילים את יכולת החיזוי והמהירות שבה נוצר זה עתה נובע יכול להיות מתורבת שורות תאים בתרחיף. אחרים פיתחו מערכות טיפול צלחת רובוטית המחקות טכניקות תרבות צלחת 30,31 אבל פלטפורמות אלה דורשים השקעות משמעותיות לציוד ומומחיות לפעול בנוסף לאתגרים הבסיסיים הקשורים לתרבות תאי גזע.

העבודה הבאה מתארת ​​את הפיתוח ותרגול של מערכת תרבות iPSC מדרגי שמנצל נוזל עצמאי, סטנדרטי ערוץ 8-רובוטיתצלחות מטפל ו96-היטב. שיטה זו נועדה לגשר בקנה מידה המעבדה תרבות iPSC וייצור iPSC בנפח גבוה (למשל, 10 7-1.5 x 10 9 תאים לכל שבוע לטכנאי) המאפשרים פיתוח טכנולוגיות אלה iPSC חדשים בקנה מידה בקלות את הייצור ללא השקעות בחומרה או בעבודה גדולה. שיטה זו היא זולה יחסית להגדיר, דורשת לא מעט ניסיון תרבות תאי גזע, תכנות או הנדסה, יש לו טביעת ציוד קטנה ללא הצורך במכסת מנוע תרבית תאים ייעודי, ומשתמשת בציוד תרבית תאים סטנדרטי כדי לאפשר בינוני עד גבוהה תפוקה האוטומטית ייצור תאים. המטרה הייתה לפתח מערכת מסוגלת תרבות תאי גזע להרחבה שיכולה להיות מנוצלת על ידי מעבדות חדשות לבלום תרבית תאים, אלה שימצאו במדריך טיפוח מחסום לפיתוח הרעיונות שלהם או אלה שרוצים אמצעי חסכוני לייצר מספר גדול של תאי גזע. הפלטפורמה שהוצגה כאן מסירה השפעת טכנאי בגזע תרבות תא ומנרמל את נהלי האכלה ומעבר כדי לאפשר ייצור תאי גזע עולה בקנה אחד.

Protocol

מערכת רובוטית הטיפול נוזלי, אשר לפרוטוקולים הבאים הייתה pipetmaX של Gilson, מאפשרים אוטומטית, תרבות תאי גזע להרחבה וייצור, תוך שמירה על תנאי תרבות חסיד מסורתיים בפורמט צלחת 96-היטב. כמו תרבות צלחת 6-גם מסורתית, iPSCs גדלים עם פרוטוקול זה כmonolayer של מושבות שונות אבל בפורמט צלחת 96-היטב. כל טוב יכול להיות isogenic או מובחן וגם תצורה יכולה להיות מתורבת במקביל מאז הרובוט יכול לשמור היטב כל הפרדה. יש השגרה רובוטית הטיפוסית iPSC תרבות שני שלבים: תכנית הזנה שבו תרבויות ניזונים על לוח זמנים להתאמה אישית ותכנית מעבר שבו המשתמש בוחר בשיטת הניתוק ויחס פיצול וכך השליטה צפיפות זריעה ושיעור קנה מידה. הפרוטוקולים הבאים מתארים כיצד תרבות חדשה שנפתחו, איך האכלה והמעבר הם השיגו ותוכניות נוספות שתקלנה על תרבות iPSC.

"Jove_content"> הערה: אנא ראה את רשימת חומרים להמלצות ספציפיות על חומר ציפוי מטריקס וריאגנטים ניתוק תוקף לפרוטוקולים הבאים.

1. צלחות 96-היטב מצופה הכנה תאי מטריקס ג'ל

  1. הסר את האריזה משש 96-גם צלחות חדשות, RT ומניח אותם על נוזל טיפול מיטת רובוט בעמדות 2, 3, 5, 7, 8, 9 (ראה איור 1 א לעמדות מיטה).
  2. הנח שוקת מראש צונן, 4 ° C 4-גם בעמדת מיטת 6.
  3. טור טען 12 למדף הקצה בעמדת מיטת 1 עם, 4 ° C 200 טיפים pipet μl טרום צוננים.
  4. מלא את השוקת הראשונה (השמאלית ביותר) גם בעמדת מיטת 6 עם 25 מיליליטר 4 מעלות צלזיוס DMEM / F12 על ידי שפיכת aliquot באמצעות טכניקה סטרילית. לחלופין, להשתמש pipet כדי להשלים את ההעברה.
  5. הסר את המכסים בצלחת 96-היטב ולהחליק כל למעמד מחזיק מכסה צלחת תוכנן במיוחד (PLHR, ראה איור 1 א). יש להימנע ממגעבחלק הפנימי של עפעפי צלחת.
    הערה: טיפול בחלק הפנימי של מכסה צלחת או לערום את מכסי הצלחת בי הפנימית של מכסה אחד נוגע מחוץ אחר הוא מסלול מצוין לזיהום.
  6. שימוש במשטח מגע שליטה רובוטית, לחץ על הסדרה של כפתורים הבאים כדי להתחיל את התהליך היטב הרטבה מראש:
    1. הקש "הפעל פרוטוקול".
    2. בחר "ג'ל מטריצת Prewet תאי" והקש על הבא.
    3. החלטת משתמש: הקש "מבחן לרוץ" להשתמש באשף צעד-אחר-צעד למבחן מראש בתכנית שנבחרה.
      הערה: הרובוט אינו פועל אלא התוכנה בודקת את הפרוטוקול לבעיות תוכנה. עם פרוטוקולים הוקמו, הקשה, "לדלג התקנה" מקובל.
    4. הקש "הפעל פרוטוקול".
  7. במהלך תהליך ההרטבה מראש (שלב 1.6) המשך לשלב 1.8.
  8. הפשרה על קרח aliquot 4 מ"ג אחד של גורם גדילה מופחתת ג'ל תאי מטריקס (GFRM) הכיל 50 מיליליטרצינור חרוטי מאוחסן ב -80 ° C. שמור aliquot על קרח עד מוכן לשימוש.
    הערה: GFRM יהיה לגבש אם מותר לבוא לRT ולא יהיה שימושי.
  9. Resuspend aliquot GFRM 4 מ"ג ב 24 מיליליטר 4 מעלות צלזיוס DMEM / F12 עם pipet זכוכית 25 מיליליטר. בעת העברת DMEM / F12, להשהות במשך 2-3 שניות כדי לאפשר pipet להתקרר לפני resuspending aliquot GFRM.
  10. כאשר תהליך קדם-ההרטבה (שלב 1.6) הוא מלא, המשך לשלב 1.11.
  11. העבר את 24 מיליליטר של תערובת GFRM DMEM / F12 ולרביעי של השוקת בעמדת מיטת 6.
  12. שימוש במשטח מגע שליטה רובוטית, לחץ על הסדרה של כפתורים הבאים כדי להתחיל בתהליך ציפוי ג'ל מטריקס:
    1. הקש "הפעל פרוטוקול".
    2. בחר "aliquot ג'ל מטריקס" והקש על הבא.
    3. החלטת משתמש: הקש "מבחן לרוץ" להשתמש באשף צעד-אחר-צעד למבחן מראש בתכנית שנבחרה.
      הערה: הרובוט אינו פועל אך rather התוכנה בודקת את הפרוטוקול לבעיות תוכנה. עם פרוטוקולים הוקמו, הקשה, "לדלג התקנה" מקובל.
    4. הקש "הפעל פרוטוקול".
  13. כאשר צעד 1.12 הושלם, להחליף את המכסים בצלחת.
  14. העבר את 96-גם צלחות ג'ל מצופה מטריקס ל37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, חממת humidified ולהחזיק שם 24 שעות ובשלב הצלחות תהיה מוכנות לשימוש או מאוחסן.
    הערה: בנסיבות מקילות, ניתן להשתמש בצלחות ג'ל מטריקס המצופים החדש אחרי 15-30 דקות של דגירה אבל O / N 24 דגירה שעות מומלצת.
  15. פרוטוקול חזור על שלבים 1.1, 1.3, 1.5-1.6, 1.10, 1.12-14 ועד שכל DMEM / F12 עם GFRM משמש.

2. 96-פלטות היטב מצופים אחסון תאי מטריקס ג'ל

  1. הסר 96-גם צלחות תאי מטריקס ג'ל מצופה מעל 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, חממת humidified.
  2. אופציונאלי:llow מטריקס 96-גם צלחות ג'ל מצופים להגיע לRT לפני שנמשיך לשלב 2.3.
    הערה: צעד אופציונאלי זה יקטין עיבוי לבנות כאשר הצלחות מונחות על 4 מעלות צלזיוס.
  3. מקם את הצלחות על מיטת רובוט הטיפול הנוזלית בעמדות 2, 3, 5, 7, 8, 9 (ראה איור 1 א לעמדות מיטה).
  4. טור טען 12 למדף הקצה בעמדת מיטת 1 עם RT 200 טיפים pipet μl.
  5. הנח מאגר ארבע שוקת בעמדת מיטת 6.
  6. מלא גם 4 (הימני ביותר) של המאגר עם RT DMEM / F12.
  7. הסר את המכסים בצלחת 96-היטב ולהחליק כל לPLHR.
  8. שימוש במשטח מגע שליטה רובוטית, לחץ על השילוב של כפתורים הבאים:
    1. הקש "הפעל פרוטוקול".
    2. בחר "aliquot ג'ל מטריקס" והקש על הבא.
    3. החלטת משתמש: הקש "מבחן לרוץ" להשתמש באשף צעד-אחר-צעד למבחן מראש בתכנית שנבחרה.
      הערה: רובולא לא לרוץ אלא התוכנה בודקת את הפרוטוקול לבעיות תוכנה. עם פרוטוקולים הוקמו, הקשה, "לדלג התקנה" מקובל.
    4. הקש "הפעל פרוטוקול".
  9. ברגע מלא, להחליף את המכסים בצלחת ולהסיר את הצלחות מהמיטה המכונה.
  10. לעטוף כל הצד של כל ג'ל מטריקס צלחת 96-היטב מצופה (שבו המכסה עומד בצלחת) עם אינץ 'אחד על ידי רצועת סרט פרפין 6 אינץ'. הקפד למתוח את סרט פרפין ליצור חותם אטום.
  11. אופציונאלי: תווית הצלחות עם התאריך של ציפוי ג'ל מטריקס השלים, המספר תאי ג'ל המטריצה ​​הרבה, שם משתמש וכל מידע אחר.
  12. אחסן את הצלחות ב 4 ° C שבו הם יהיו טובים לשימוש לתקופה של עד שבועיים.
    הערה: צלחות שימשו בהצלחה מעבר לגבול שני שבוע, לעומת זאת, זה לא מומלץ.

3. ביצוע צפיפות המושבה זריעת תאי גזעשיפוע בפורמט צלחת 96-היטב מתרבות חי או קפוא: איך להתחיל או שחזור מרווחי מעבר רגיל לקו תאי גזע

  1. אם מתחיל עם תרבות קפוא, המשך לשלב 3.2. אם מתחיל עם תרבות תאי גזע חי כבר בצלחת, להתחיל בשלב 3.5.
  2. להפשיר את התרבות קפואה מתערבל הצינור באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עד נתח קטן בלבד של קרח נשאר.
  3. אופציונאלי: לדלל את התאים המופשרים ל -10 מיליליטר RT נובע תקשורת צמיחת תאים (SCGM), צנטריפוגות במשך 2 דקות ב 300 XG, לשאוב תקשורת supernatant ו resuspend גלולה בתאי גזע ב7 מיליליטר SCGM טרי המכיל 10 מיקרומטר Y27632.
    הערה: צעד זה מבטל שריד של תקשורת ההקפאה.
  4. המשך לשלב 3.6.
  5. אם מתחיל עם חיה, כבר מצופה בתאי גזע: מעבר התאים הבריאים באמצעות ניתוק האנזימטית או אי-האנזימטית. נסה למסוק כולל של 1.5-3,000,000 תאים; בדרך כלל גם אחד של צלחת שש היטב. צנטריפוגה התאים שנקטפו ל2 דקות ב 300 XG, לשאוב תקשורת supernatant ו resuspend גלולה בתאי הגזע בSCGM הטרי 7 מיליליטר המכיל 10 מיקרומטר Y27632. המשך לשלב 3.6.
  6. להבטיח את התאים, או מתרבות קפוא או חי, מושעים ב -7 מיליליטר RT SCGM עם 10 מיקרומטר Y27632.
  7. טור טען 12 למדף הקצה בעמדת מיטה אחת עם RT 200 טיפים pipet μl.
  8. הנח מאגר ארבע שוקת במיטת עמדה 2.
  9. מניחים ג'ל מטריקס החדש אחד צלחת 96-היטב מצופה מראש לחמם 37 מעלות צלזיוס בעמדת מיטת 5 ולהסיר את המכסה הצבתו בPLHR.
  10. העבר 7 מיליליטר של תאי resuspended לטוב 3 של המאגר על ידי pipet או סטרילי לשפוך.
    1. שימוש במשטח מגע שליטה רובוטית, לחץ על השילוב של כפתורים הבאים:
    2. הקש "הפעל פרוטוקול".
    3. בחר "שיפוע צפיפות זריעה" והקש על הבא.
    4. החלטת משתמש: הקש "מבחן לרוץ" להשתמש באשף צעד-אחר-צעד למבחן מראש בחרתכנית ed.
      הערה: הרובוט אינו פועל אלא התוכנה בודקת את הפרוטוקול לבעיות תוכנה. עם פרוטוקולים הוקמו, הקשה, "לדלג התקנה" מקובל.
  11. הקש "הפעל פרוטוקול".
  12. כאשר סדרת הדילול מלאה, מחדש לכסות את הצלחת ומניחים ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, חממת humidified עד ההאכלה הבאה.
  13. אופציונאלי: תווית הצלחת עם התאריך, מידע זן, שם משתמש, סוג התקשורת ומידע רלוונטי אחר.
  14. במהלך הימים הבאים, להאכיל את צלחת 96-היטב כנדרש באמצעות פרוטוקול 4 להלן.
    הערה: צלחת תאי גזע טיפוסית תדרוש שינוי תקשורת מלא אחת לשעה 24 וSCGM אינו מכיל Y27632 להאכלה; רק בזריעה הראשונית לאחר מעבר. לפני ההאכלה, לבדוק את הצלחת לזיהום וצפיפות מושבה. ראה שלב 3.16 ליותר בניטור צפיפות מושבה.
  15. במהלך הימים הבאים, כמה עמודים ליד גלהיכנס לצלחת (בדרך כלל עמודים 5-8) יפנו צפיפות אידיאלית למעבר; לזהות צפיפות זה, להשוות את הצלחת 96-היטב למגוון הצפיפות מוצג באיור 3 עם המידע הבא בחשבון:
    1. מעבר כאשר המרחב בין רוב המושבות הוא כ -25% מקוטר מושבה סמוך.
      הערה: הרציונל לזהות את זמן המעבר היא שמחזור נוסף של האכלה וצמיחה יביא למושבות ביצירת קשר, שיש להימנע.
  16. כדי להתחיל צלחת דילול אחיד ולהתחיל תרבות רגילה, בחר עמודה שהיא בצפיפות והמעבר האידיאלי. ראה פרוטוקול 5 למעבר.

מושבות תאי גזע צלחת 96-היטב 4. האכלה

הערה: הפרוטוקול הבא מתאר את ההאכלה של צלחת מושבה אחת 96-גם תא גזע. הטכניקה ניתן לשנותם כדי להכיל 6 צלחות מוחלטת במקביל.

  1. הסר את של 96-היטבצלחת TEM מושבה תא משל 37 ° C, 5% CO 2, חממת humidified.
  2. בדוק את הצלחת לזיהום וצפיפות תאים. כדי להאכיל, להבטיח כי צפיפות המושבה היא מתחת לצפיפות המעבר האידיאלית. ראו איור 3 לקבלת מידע על צפיפות.
    הערה: הזיהום עלול להציג תקשורת עכורה וכלהיות מלווה בריח לא נעים. אגרגטים קטנים, ברור שאינם iPSC יכולים להיות גלויים תחת פיקוח מיקרוסקופי גם. כדי להעריך את צפיפות תאים, ראה שלב 3.16.1 לעיל.
  3. מניחים את צלחת המושבה תא 96-גם נובע במיטת עמדה 3 על משופע, 37 מעלות צלזיוס רמפה.
  4. טור טען 12 למדף הקצה בעמדת מיטת 1 עם RT 200 טיפים pipet μl.
  5. הנח שוקת 4 היטב במיטת עמדה 2.
  6. מלא גם 3 של השוקת בעמדת המיטה 2 עם 8 מיליליטר טרי, RT SCGM ללא Y27632 או על ידי העברה לשפוך או pipet סטרילי.
  7. הסר את מכסה צלחת 96-היטב מושבה תאי גזע הצבתו בPLHR.
  8. שימוש במשטח מגע שליטה רובוטית, לחץ על השילוב של כפתורים הבאים:
    1. הקש "הפעל פרוטוקול".
    2. בחר "מושבה Feed צלחת אחת" והקש על הבא.
    3. החלטת משתמש: הקש "מבחן לרוץ" להשתמש באשף צעד-אחר-צעד למבחן מראש בתכנית שנבחרה.
      שים לב, הרובוט אינו פועל אלא התוכנה בודקת את הפרוטוקול לבעיות תוכנה. עם פרוטוקולים הוקמו, הקשה, "לדלג התקנה" מקובל.
    4. הקש "הפעל פרוטוקול".
  9. כאשר פרוטוקול ההנקה מלא, מחדש לכסות את צלחת המושבה 96-גם בתאי גזע ולחזור ל37 ° C, CO 2, נדרש חממת humidified עד ההאכלה או המעבר הבא 5%. זה בדרך כלל נדרש לאחר 24 שעות.
    הערה: מומלץ לרשום את אירוע האכלה על עטיפת הצלחת עם התאריך, סוג התקשורת, שם משתמש ומידע רלוונטי אחר.

5. Passaging 96-היטב Plאכלתי גזע מושבות תאים

  1. לאחר כמה מחזורי האכלת צלחת המושבה 96-גם בתאי גזע תהיה מוכנה למעבר. פרוטוקול זה מתאר מעבר של עמודה אחת לצלחת אחת 96-היטב, המייצג את יחס 01:12 פיצול. המשתמש יכול להגדיר את יחס הפיצול ולבחור כל מספר של בארות או עמודות לפצל, כולל בחירת בארות שלא יכול להיות סמוך.
  2. השווה את צפיפות צלחת מושבה 96-גם בתאי גזע לאיור 3 כדי לקבוע אם למעבר. צפיפות המעבר האידיאלית היא כאשר המרחב בין רוב המושבות הוא כ -25% מקוטר מושבה סמוך או ההאכלה הבאה תביא המושבות גדלו לתוך זה.
  3. לבחון את צלחת המושבה תאי גזע 96-גם תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח שאין זיהום.
  4. מניחים את צלחת המושבה תא 96-גם נובע במיטת עמדה 3 על משופע, 37 מעלות צלזיוס רמפה.
  5. עומס עמודות 8-12 במעמד טעינת קצה בעמדת מיטת 1 עם pipet 200 μl RTטיפים.
  6. הנח שוקת 4 היטב במיטת עמדה 2.
  7. השאר גם שוקת 1 ריק, לשים 8.5 מיליליטר SCGM + 10 מיקרומטר Y27632 היטב 2, לשים 3.5 מיליליטר 30% פרוטאוליטים ומגיב collagenolytic ניתוק (או מגיב ניתוק מבוסס EDTA) וב3, לשים 4.5 מיליליטר PBS היטב 4.
    הערה: כל המגיבים יכולים להיות ב RT או 37 ° C. מפרקי החלבונים RT ומגיב ניתוק collagenolytic על 30% בדילול מלא עם PBS שימשו לשומן ופיברובלסטים נגזרים תרבות iPSC מתוארת כאן.
  8. מניחים צלחת אחת חדשה, מראש חימם 37 ° C ג'ל מטריקס מצופה 96-גם בעמדה 5 המיטה.
  9. הסר את מכסה 96-גם בתאי גזע צלחת מושבה, כמו גם את מכסה צלחת 96-היטב החדש ולמקם אותם הן בPLHR.
  10. שימוש במשטח מגע שליטה רובוטית, לחץ על השילוב של כפתורים הבאים:
    1. הקש "הפעל פרוטוקול".
    2. בחר "המושבה פיצול 1:12 טור 1" והקש על הבא.
    3. החלטת משתמש: הקש "מבחן לרוץ" לשימושאשף צעד-אחר-צעד למבחן מראש בתכנית שנבחרה.
      הערה: הרובוט אינו פועל אלא התוכנה בודקת את הפרוטוקול לבעיות תוכנה. עם פרוטוקולים הוקמו, הקשה, "לדלג התקנה" מקובל.
    4. הקש "הפעל פרוטוקול".
  11. ברגע שפרוטוקול המעבר סיים, מחדש לכסות את שני הצלחות.
  12. אופציונאלי: תווית הצלחת החדשה עם המידע הנדרש (כלומר, תאריך, קו תא, מספר קטע, סוג תקשורת, שם משתמש וכו ').
  13. חזור שני הצלחות ל37 ° C, CO 2, נדרש חממת humidified עד ההאכלה או המעבר הבא 5%. הערה: ההאכלה הבאה היא בדרך כלל לאחר 24 שעות.
    הערה: תאים ומושבות צריכים לצרף את הצלחת תוך 2-3 שעות של פיצול ונראים מאוד פרושים. זאת בשל נוכחותם של מעכבי Rho-kinase והתאים לרכז ולהציג את המורפולוגיה של תאי גזע האופייני (Wi כלומר, מושבות מרוצפות ארוזth קטן נפח תא יחס גרעין גדול) לאחר האכלת המעכב הראשונה Rho-kinase החופשית.

6. תאי גזע צלחת 96-היטב קציר לייצור

הערה: גזע מושבות תאים ניתן לקצור לשימוש בכל נקודה במהלך התרבות. בדרך כלל זה מתרחש כאשר התאים מוכנים למעבר (ראה פרוטוקול 5). פרוטוקול זה מתאר כיצד לקצור עשרה עמודים מצלחת מושבה 96-גם בתאי גזע.

  1. לבחון את צלחת המושבה תאי גזע 96-גם תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח שאין זיהום.
  2. מניחים את צלחת המושבה תא 96-גם נובע במיטת עמדה 3 על משופע, 37 מעלות צלזיוס רמפה.
  3. עמודות טען 11 ו -12 במעמד טעינת קצה בעמדת מיטת 1 עם RT 200 טיפים pipet μl.
  4. הנח שוקת 4 היטב במיטת עמדה 2.
  5. גם שוקת לעזוב 1 ריק, לשים 8.5 מיליליטר SCGM היטב 2, לשים 3.5 מיליליטר 30% פרוטאוליטים ומגיב collagenolytic ניתוק (או מגיב ניתוק מבוסס EDTA) וב3, לשים 4.5 מיליליטר PBS היטב 4.
    הערה: כל המגיבים יכולים להיות ב RT או 37 ° C.
  6. הסר את מכסה 96-היטב המושבה תאי גזע הצלחת ומניחים בPLHR.
  7. שימוש במשטח מגע שליטה רובוטית, לחץ על השילוב של כפתורים הבאים:
    1. הקש "הפעל פרוטוקול".
    2. בחר באפשרות "עמודות המושבה קציר 2-12" והקש על הבא.
    3. החלטת משתמש: הקש "מבחן לרוץ" להשתמש באשף צעד-אחר-צעד למבחן מראש בתכנית שנבחרה.
      הערה: הרובוט אינו פועל אלא התוכנה בודקת את הפרוטוקול לבעיות תוכנה. עם פרוטוקולים הוקמו, הקשה, "לדלג התקנה" מקובל.
    4. הקש "הפעל פרוטוקול".
      הערה: ברגע שהליך הגבייה הוא מלא, התאים יהיו בשוקת גם 2 ומוכנים לאיסוף.

Representative Results

פיתוח של פלטפורמת תרבות תאי גזע רובוטית צלחת מבוססת.

הביקוש לiPSCs גדל עקב שירותם בפיתוח תרופות ורפואת רגנרטיבית. עם זאת, ייצור להרחבה התמקד בתרבות השעיה 32 בציוד מורכב יחסית שאינם כולל חוקרים רבים וסוטים מן שיטות תרבות חסיד הוקמו. במקום באופן דרסטי לשנות שיטות צלחת מוכחת גזע מבוסס תרבית תאים, כגון מעבר לתרבות השעיה או באמצעות microcarrier, התמקדנו בminiaturizing ומיכון הטכניקות הקיימות שלנו חסיד iPSC התרבות. המטרה הראשונה הייתה להפוך האכלה וpassaging לנרמל את תהליך התרבות השלם. פלטפורמה מסוגלת קנה מידה עד מהיר עם טכנולוגיה הקיימת נדרשה גם. כדי להשיג מטרות אלה שיטה תוכננה לתאי גזע התרבות בצלחת 96-היטב ניצול מערכת אוטומטית טיפול נוזלי (איור 1). Protocols פיתח כאן עם רובוט הטיפול הנוזלי להאכלה והמעבר אינו דורש צעד צנטריפוגה או ניטור רציף על ידי טכנאי. פרוטוקולים אלו פותחו עם שני קווי iPSC חופשיים מזין; אחד נגזר מfibroblasts ואחרים מתאי שומן 33.

מערכת הטיפול נוזלי המחשב מבוקר (איור 1 א) מורכבת ממשטח אופקי שנע קדמית ואחורי. יש המיטה תשע, כ נבכי ממוספרים 5 x 3.3 אינץ 'עם לחץ שמירת קטעים לקבל צלחות תרבית תאים סטנדרטיים, מאגרים נוזליים וחומרה מותאמת אישית אחרת. מהלכי ראש pipet שמאל לימין (בניצב לתנועת מיטה), כמו גם למעלה ולמטה. יחד עם המיטה, ראש פיפטה ניתן לתכנת כדי להסיר או לספק תקשורת בכל מקום במיטה אחרי שלקחתי את הטיפים פיפטה ממדף פעמי. במידת צורך, כל אחד מ96-הבארות יכול להיות כל הזמן נפרד כדי למנוע זיהום צולב. בתצורה הנוכחית, 0 ל200 μl של תקשורת יכולה להיות מועבר על ידי כל קצה של ראש pipet, אבל טווחי נפח אחרים אפשריים המבוססים על גודל קצה.

כאשר passaging תאי גזע בצלחות סטנדרטיים, האנזימטית או ניתוק כימי בדרך כלל דורש דגירה על 37 מעלות צלזיוס. בדיקה ראשונית אישרה ניתוק עם מפרקי חלבונים ומגיבים ניתוק collagenolytic או מגיב מבוסס EDTA ביצע טוב יותר ב 37 מעלות צלזיוס מ RT הן לזמן לניתוק וההומוגניות של גודל מושבה הופק עבור שני 96 גם הקווים שלנו iPSC (מידע לא מוצג). כדי להפוך את תהליך הפיצול ולמנוע העברת צלחות ובמתוך חממה, רמפות שקבלו משופעת, טמפרטורה מבוקרת וreproducibly למקם תרבות צלחות סטנדרטית נבנו (איור 1 א). כאשר הרמפות היו מחוממות ל -37 מעלות צלזיוס, מפרקי חלבונים ומגיבים ניתוק collagenolytic או ניתוק מבוסס EDTA של iPSCs מ96-גם צלחות היה דומה לצלחות להציב 37 ° C חממה (n נתוניםמוצג ot). הרמפות המשופעות גם נוצלו כדי לאפשר טיפים pipet לאסוף תוכן של היטב כל (פחות מ -5 נפח שייר UL) על ידי הגעה לנקודה הנמוכה ביותר בבאר אילו שאיפה מצלחת שטוחה עזבה נפח שייר של כ 10-15 μl, וכתוצאה מכך באובדן תא. הרמפה המשופעת גם אפשרה לבארות להישטף (triturated) על ידי תקשורת ולהוציא בחלק העליון של משופע היטב ולאסוף אותו בתחתית.

תרבות רובוטית של תאי גזע בפורמט צלחת 96-היטב; האכלה וpassaging.

יש תרבות של iPSCs באמצעות מערכת טיפול נוזל רובוטית שני שלבים; מעבר והאכלה. כאשר מושבה מוכנה למעבר, זה מחולק ביחס שנקבע מראש לזרע צלחת חדשה אשר לאחר מכן מוזנת במרווחי זמן קבועים עד שהוא מוכן למעבר שוב (איור 1). ניתן להתחיל תרבויות קפואות או אי-96-גם בפורמט 96-היטב ונכנסות למעבר / הזנה מיידמחזור. תאים שאינם משמשים לשמירה על המושבה, המהווה את הרוב המכריע של צלחת, נקצרים לשימושים אחרים ומייצגים את רכיב הייצור של מערכת זו.

האכלת 96-היטב iPSCs התרבותי היא מושלמת כאשר כל התקשורת או מוסר לאחר תקופה של התרבות והופקד במאגר פסולת. אז תקשורת טריה aliquoted לאותה הצלחת. הרובוט יכול להשתמש טיפים חדשים ושקתות תקשורת להפריד כל גם להאכלה להתאמה אישית מלאה, כוללים מיזוג תקשורת ממוזגת עם מדיה חדשה.

מעבר אופייני של תאי גזע דורש שיטה של ​​ניתוק ולעתים קרובות צעד צנטריפוגה. הפרוטוקולים שתוארו כאן נועד לנרמל ניתוק ולחסל צנטריפוגה. פרוטוקול המעבר מתחיל כאשר הרובוט מספק מגיב דיסוציאציה ל96-גם צלחות רכוב על 37 מעלות רמפות משופעים C. לאחר זמן מוגדר מראש, התאים ניתקו נאספים עם פעולת שטיפה שבו יש למשתמש לניהול עבודותl על העמדה, חזרה, נפח, ושיעור טחינה דקה. זמן אנזים, שיעור טחינה דקה ומספר חזרות טחינה דקה היו מספיק כדי להשתנות גודל ניתק מושבה והומוגניות (איור 2), אבל בכל פרמטר הוא מתכוונן כדי להתאים לדרישות של קו תא נתון. שליטה זו מסירה שונות שהוצגה על ידי טכנאים שpipet עם שיעורים משתנים, עמדות, וחזרתי שוב ושוב. ברגע שהתאים ניתק נאספים ונקוו במאגר עם תקשורת טרי, הם מופצים לצלחת חדשה. כדי להימנע מבעיות צנטריפוגה וזריעה משפלת מצע או המוות של תאים עקב אנזים פעולה, מגיב ניתוק היה מדולל לנקודת המינימום של דיסוציאציה המקובלת שהביאו לזריעה אמינה. טכניקה זו הייתה יעילה למפרקי חלבונים ומגיבים ניתוק collagenolytic במדיום mTeSR1 34, שבו יש תכולת חלבון גבוהה יחסית, אלא גם יעילה בתקשורת חלבון נמוכה כמו חיוניים-8 35

השליטה צפיפות הזריעה של תאי גזע לאחר המעבר היא בעל חשיבות עליונה לתרבות תאי גזע שגרתית ומוצלחת. זריעה נמוכה מדי או גבוה יכולה לגרום לבידול ואובדן pluripotency בנוסף לגרימת מרווחי מעבר סדירים מחוץ לרחם. תרבות תאי גזע טיפוסית מסתמכת על פיצול יחס שבו גם אחד מצלחת 6-גם משמש לזרע צלחת כל חדשה 6-היטב (1: פיצול 6). עם רובוט הטיפול הנוזלי יחס זה יכול להיות מותאם כדי להתאים לצרכימים של המשתמש (לדוגמה, 1: 6, 1: 9, 01:12, וכו ') ויש לה ההשפעה הרבה ביותר על מרווח המעבר. הרובוט יכול לקצור עמודה פחות מ, עמודה אחת שלמה (8 בארות), או יותר מעמודה אחת בהתאם לצרכים של המשתמש, אשר אמורים להיקבע באופן אמפירי. IPSCs שומן ופיברובלסטים נגזר שמר את לוח הזמנים של שלושה ימים רגילים האכלה עם מעבר ביום הרביעי כשלפצל 01:12. במקרה זה עמודה אחת נקצרה ומשמשת לזרע 96-גם צלחת חדשה אחד, יצירת פיצול 01:12 עם כל מחזור (איור 3 א). 11 בארות הנותרות היו אז זמינות עבור יישומים במורד הזרם. למסוק בארות ייצור אלה 11, פרוטוקול המעבר חזר על עצמו, פרט לתאים הופקדו לשוקת לאוסף. לחלופין, ניתן להשאיר את התאים על הצלחת ולהשתמש בם ישירות.

כדי להשיג מעבר צפיפות זריעה עקבי למעבר בלי לספור, ולשמור על לוח זמני פיצול שיגרתי, הפרוטוקולים שלנו קוראים לפיצול אותו המספר קבוע מראש של עמודות כאשר המושבה היא בצפיפות אידיאלית למעבר. כדי לסייע למשתמשים לזהות את הצפיפות הנכונה למעבר, סדרה של תמונות נוצרה מראה מגוון של צפיפויות עם צפיפות אידיאלית מעבר המודגש (איור 3). כדי לקבוע מתי מעבר, טכנאי בוחן הצלחת שלהם ומשווה אותו לקנה מידת תמונת צפיפות. הרעיוןצפיפות l למעבר נקבעה מהתרבות של iPSCs השומן ופיברובלסטים נגזרים ונמצאה שכאשר המרחב בין רוב המושבות היה כ -25% מקוטר מושבה סמוך. חשובה שהמושבות תחולקנה homogenously. סכום זה של הפרדת מושבה בקורלציה עם הצפיפות הרצויה המרבית כי מחזור האכלה נוסף אחד יביא מושבות נגיעה, אשר הוא הטריגר לבידול מחוץ לרחם.

פרוטוקול הכרחי פיתח כאן מתייחס איך להתחיל תרבות בפורמט 96-היטב וכיצד לאפס תרבות לאחר בעיה צפיפות. כאשר תרבות חדשה שנפתחו, הצפיפות הטובה ביותר הזריעה ומספר מחזורי האכלה לפני passaging אינן ידועות. כדי להבטיח צפיפות שמישה לאחר זריעה, הרובוט מפיץ תאים קיימים או מופשרים פני צלחת 96-היטב בדילול סדרתי (איור 4 א). תוצאות דוגמא של שיפוע כזה מוצגות באיור 4 ב-E. לאחר כמה האכלהמחזורים, כמה עמודים להתקרב הצפיפות האידיאלית לפצל, ובשלב זה טכנאי משתמש ברובוט זרע צלחת דילול אחיד להתחיל תרבות רגילה. פרוטוקול שיפוע צפיפות זה היה בשימוש גם כדי לשחזר מרווחי מעבר רגילים והומוגניות מושבה לצלחת לא סדירה. אם מעבר מתעכב או שלא נענו, צפיפות מושבה והגודל הפכו גבוהות מדי, בעוד שאם מעבר הוא מוקדם מדי, צפיפות מושבה היא נמוכה מדי ומושבות בודדות עשויות להיות גדולות מדי, בלי שמופצים באופן שווה על פני היטב. פרוטוקול שיפוע הצפיפות פותר בעיות אלה ומאפשר למשתמש להפעיל מחדש על ידי בחירת סט זורעים באופן אידיאלי של בארות.

שני קווי iPSC נשארו pluripotent לאחר 3 חודשים של תרבות רובוטית.

תחזוקה של pluripotency בתאי גזע יכולה להיות מושפעת לרעה על ידי תנאי תרבות 36,37. כדי להעריך אם שומן ופיברובלסטים נגזרו קווי iPSC (-iPSC, F-iPSC, בהתאמה) נשמר pluripotency כאשר בתרבית רובוט ב96-גם צלחות לתקופה ארוכה של זמן, שני הקווים היו בתרבית בנוזל טיפול רובוט כפי שתואר לעיל במשך 3 חודשים ולאחר מכן סמני pluripotency נבדקו. לתקופה זו שני הקווים היו passaged עם מגיב ניתוק פרוטאוליטים וcollagenolytic יותר מ -20 פעמים ללא צנטריפוגה. 96-גם צלחות קבועים מ- iPSC וקווי F-iPSC המוכתם לOct4 וNanog הציגו הצטברות גרעינית של סמנים אלה תוך SSEA-4 נצפה על פני התא (5A-L איור). זה עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים לiPSCs pluripotent 38-41. Counterstaining עם DAPI לא חשף את כל תאים נוספים שלא היו גם חיובי לשלושה סמני pluripotency. פגמים בכרומוזומים הם נצפו נפוצים בתאי גזע תרבות 42,43 אבל לא יכולים להשפיע על חלוקת סמני pluripotency כמו אלה שמוצגים באיור 5 א-L. Kניתוח aryotype גילה לי שני קווי iPSC רובוט passaged 46 כרומוזומים רגילים, דבר המצביעים על שיטת התרבות רובוטית לא הציגה חוסר יציבות כרומוזומלית מעבר למה שעלול להתרחש בדרך כלל (איור 5M-N).

לחקור ביטוי גנים בתאי גזע הוקם סמני 1,41,44,45 בקווי iPSC רובוט התרבותיים, רנ"א הכל נאסף במקביל למכתים וניתוח קריוטיפ. היו שני קווי iPSC צלחת 96-היטב ביטוי דומה של סמני pluripotency NANOG, POU5F1 וREX1 אילו cardiomyocytes מובחן מכל שורה לא, וגם לא בשורה נפרדת של fibroblasts עורי האנושי (HDFs) (איור 6). Cardiomyocytes נגזר משני הקווים היו MYL7 חיובי ואילו HDFs ותאי גזע לא הביעו MYL7. שני קווי iPSC הובדלו לשריר לב עם המולקולה הקטנה, טכניקת מניפולציה מסלול ה- Wnt תיארה לאחרונה 46 (איור 7). בידול לתוך שריר לב בפורמט 96-גם היה מוצלח בגדול יותר מ -80% מהבארות (מידע לא מוצג). יחד, נתונים אלה מצביעים על 3 חודשים ויותר מ -20 קטעים של תרבות רובוטית הביאו תאי chromosomally רגילים מציגים תכנית שעתוק בקנה אחד עם pluripotency שהיו גם מסוגל בידול לשריר לב.

איור 1
מערכת () לכיסוח נוזל טיפול מוצגת עם פריסה טיפוסית מיטה לאיור 1. סקירה כללית של ציוד תרבית תאי גזע רובוטית ושגרת תרבות iPSC טיפוסית. 96-גם נובע תרבית תאים. ריאגנטים נוזליים טיפים חדשים סטרילי pipet (טיפים), מיכל נשלף פסולת קצה (פסולת), רב גם שוקת autoclavable למחזיקים נדרשים (נוזלים), 96-גם צלחות ממוקמות ד נתמך בטמפרטורה מבוקרת, רמפה משופעת (96-גם צלחות), 8 ראש pipet רובוטית ערוץ שזז (ראש Pipet) שמאלה / ימינה ולמעלה / למטה. מדף צלחת מכסה מחזיק (PLHR). מספרי עמדת המיטה מוצגים להלן בטבלה. יש תרבות (ב) לכיסוח iPSC שני שלבים: האכלה ומעבר. המחזור של ייצור תאים מתחיל כאשר צלחת מושבה מוכנה למעבר. המשתמש בוחר את היחס הרצוי למעבר ובזרעי רובוט קבוצה חדשה של 96-גם צלחות אז האכילו במרווחים זמן קבועים עד מוכן למעבר שוב. כאשר הצלחות מוכנות למעבר, רוב כל צלחת אינו משמש לזרע צלחות מושבה שלאחר מכן, והוא זמין לשימושים אחרים, ובכך מייצג את שלב הייצור של המערכת. יכולות להיות הציגו שורות תאים קפואות או קיימות בכל עת ומתוחזק במחזור ההזנה / המעבר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

e_content "FO: לשמור-together.within עמודים =" תמיד "> איור 2
איור 2. פרמטרים טיפול נוזל רובוטית יכול לשמש כדי לשלוט מאפייני ניתוק המושבה iPSC. כל תמונת נציג תערוכות iPSCs פיברובלסטים נגזרים ניתק לאחר הטיפול המצוין ועדיין תלוי ב96-היטב. (למעלה שורה, - C) אנזים זמן, אין טחינה דקה. iPSCs נגזר פיברובלסטים גדל ב96-גם צלחות היו נתונים להגדלת זמנים של מפרקי חלבונים ודיסוציאציה מגיב ניתוק collagenolytic ולא טחינה דקה רובוטית בוצע. שיעור טחינה דק, 3 דקות אנזים - (F בשורה אמצעי, ד). תאים נחשפו לשלוש דקות של מפרקי חלבונים וטיפול מגיב ניתוק collagenolytic ואז תקשורת צמיחת 175 μl יושמה וכל pipetted גם למעלה ולמטה פעם אחת בשיעור שצוין. μl / sec = p מיקרוליטראה שני. (בשורה תחתונה, G - I) טחינה דקה חזרות, 3 אנזים דקות, 160 μl / sec. תאים נחשפו למפרקי חלבונים ומגיבים ניתוק collagenolytic במשך 3 דקות, 175 תקשורת צמיחת μl יושמה, אז triturated 160 μl / שניות למספר מצויינים של חזרות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. שומן טיפוסי וערכת תחזוקת מושבה פיברובלסטים iPSC וסדרה של תמונות צפיפות מושבה כדי לקבוע מתי מעבר לשמור על מחזור ההאכלה / מעבר רגיל. (א) החלו בשומן או פיברובלסטים 96-היטב מושבה iPSC מוכן למעבר, עמודה אחת של תאים הייתה passaged ברובוט ללא צנטריפוגה ומדוללתעד 12 עמודים חדשים שהואכלו במרווחים מסוימים לאחר מכן עד הצלחת הייתה מוכנה למעבר שוב. לייצור תאים, עמודות לא משמשות כדי לשמור על המושבה היו passaged ונאספו לשימוש מאוחר יותר. כל מספר של עמודות ניתן passaged לשלוט קצב התרחבות. (ב) כדי לקבוע מתי מעבר, סדרה של תמונות שנתפסו צפיפות כל שעות 24 הועמדו למשתמשים. בתיבה האדומה העליונה (בתוך 72 שעות לאחר זריעה ראשונית) המושבה היא לא צפופה מספיק למעבר וצריכה להיות מוזנת. כאשר הצפיפות מתאימה שמוצגת בתיבה הירוקה (ב ~ 96 שעות), המושבה היא בצפיפות אידיאלית למעבר. על ידי 120 שעות, המושבה היא צפופה מדי למעבר ויש להימנע תרחיש זה. האחרונים עשויים להיפתר עם שיפוע צפיפות זריעה אבל תרבות שגרתית בצפיפות זה מאוד לא מומלץ. בר לבן שווה 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בversi גדולעל של נתון זה.

איור 4
איור 4. 96-גם מערכת התרבות רובוטית מאפשרת למשתמשים להתחיל תרבויות משורות תאים קפואות או פעילים ולבצע שיפוע זריעה. () פתרון תא הוא הוכן על ידי המשתמש ממניות תא קפוא או לאחר קצירת תרבות פעילה והניח על הרובוט. מערכת רובוטית לאחר מכן מבצעת פרוטוקול דילול סדרתי להפיץ את פתרון התא הראשוני לאורך צלחת 96-היטב עם שיפוע הצפיפות מופץ על ידי טור. - ה) דוגמאות לצפיפות תאים מארבעת עשרה עמודים מ, 48 שעות לאחר זריעת פרוטוקול שיפוע צפיפות. קווים לבנים שווים 225 מיקרומטר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זהדמות.

איור 5
Pluripotency 5. איור נשמר לשומן ופיברובלסטים נגזרו קווי iPSC במהלך 96-גם תרבות רובוטית 22 (שומן) או 23 קטעים (פיברובלסטים) (~ 3 חודשים). (- L) שומן ושורות תאי פיברובלסטים נגזרים iPSC היו רובוט הפד וpassaged כמתואר בטקסט ללא צנטריפוגה ב96-גם צלחות במשך 22 או 23 מעברים אז קבועים ומוכתמים עבור סמני pluripotency Oct4, Nanog, או Ssea4 עם counterstain DAPI. בר לבן שווה 100 מיקרומטר. (M - N). תרבויות מקבילות לאלה המתוארים בהוגשו לניתוח קריוטיפ שחשף משלים רגילה של 46 כרומוזומים אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר oF נתון זה.

איור 6
iPSCs איור 6. שומני (96-A) ופיברובלסטים (96-F) נגזר בתרבית במשך יותר מ -20 קטעים בפורמט 96-היטב רובוטית נשמר ביטוי גני pluripotency ומובחן לשריר לב. סה"כ mRNA היה שחולץ משני קווי iPSC רובוט התרבותיים כמו גם cardiomyocytes מובחן משני הקווים (CM-= cardiomyocytes iPSC נגזר שומן, CM-F = פיברובלסטים iPSC נגזר cardiomyocytes, נאסף 14 ימים לאחר אינדוקציה בידול) ומשמש לRT-PCR לחקור סמני pluripotency NANOG, POU5F1, REX1, MYL7 cardiomyocyte הסמן וGAPDH שליטת טעינה. fibroblasts עורי האנושי (HDF) גם נאסף ומשמש כאינו iPSC, שליטה שאינה cardiomyocyte. אנא לחץ על כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
איור 7. פיברובלסטים וiPSCs השומן נגזר שמרו את היכולת להתמיין cardiomyocytes לאחר לטווח ארוך 96-גם תרבות רובוטית (- H). שומן וiPSCs פיברובלסטים בתרבית בפורמט 96-היטב רובוטית ליותר מ -20 קטעים הובדלו לשריר לב . 14 ימים לאחר אינדוקציה בידול, cardiomyocytes צלחת קשור 96-גם היו מנותק וreplated בצפיפות נמוכה על גבי שקופיות זכוכית לimmunostaining של טרופונין T (אדום), F- אקטין (ירוק) וגרעינים (כחול). אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.

p_upload / 52,755 / 52755fig8.jpg "/>
איור 8. גמלון תרבית תאי גזע צלחת 96-היטב. בהיקף של עד ייצור תאי גזע תלוי במספר הצלחות המשמשות לזרע הקבוצה הבאה של צלחות. המשתמש יכול גם לשמור על רמת ייצור אחד על ידי passaging את אותו המספר של צלחות בכל הזדמנות פיצול או להרחיב את הייצור על ידי זריעה יותר צלחות. לדוגמא, במחזור 0, צלחת אחת 96-גם היא passaged לשנתי עשר צלחות חדשות (מחזור 1), יצירת התרחבות של פי 12. שיעור זה עשוי להישמר אם אחד משנים עשר הצלחות הוא passaged לקבוצה חדשה של שנים עשר צלחות (מחזור 1 עד 2) או מורחב על ידי passaging צלחות מרובות (מחזור 2 עד 3). במהלך מעבר, כל צלחות לא משמשות כדי לשמור על המושבה זמינות עבור יישומים במורד הזרם. לכן, passaging 12 צלחות באופן שיגרתי יכול להניב כמה ש144 צלחות בשני קטעים: 12 לתחזוקת מושבה ו -132 לשימושים אחרים."> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 9
יעילה 9. איור של תרבות צלחת 96-היטב המבוססת על ייצור תאים עולה בהרבה על טיפוח ידני. כפי שצוין באיור 8, צלחת אחת יכולה להיות passaged זרע עשר צלחות, אשר לאחר מכן ניתן passaged 144 צלחות. שיעור זה של הרחבה ניתן להשיג בשתי הזדמנויות פיצול. טכנאי דורש כ -3.5 דקות להאכיל צלחת 6-גם אחד ואילו הם מבלים כ -30 שניות עם צלחת אחת 96-גם לבחון אותו על המיקרוסקופ ולמקם אותו על הרובוט. אם הטכנאי מבצע 144 צלחות, הם ישקיעו כ 1.2 צלחות טיפול HR כאשר האכלה עם הרובוט ואילו תרבות הידנית ידרוש שעות 8 ייעודיות כדי להאכיל. אנא לחצו כאן כדי view גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

במחקר הנוכחי פיתחנו שיטה של ​​תרבות רובוטיות לייצור iPSC שממזערת וממכן האכלה והמעבר בפורמט צלחת 96-היטב גם בעת מאפשרת קנה מידה עד יעילה. רובוט טיפול נוזלי שימש להאכיל באופן שגרתי מושבות iPSC ומעברם במרווחים זמן קבועים על ידי ניתוק האנזימטית. הרובוט גם לתכנת לייצר צלחות מצופים ג'ל מטריקס ולבצע שיפוע צפיפות זריעה. כאשר פיברובלסטים וiPSCs שומן נגזר היו בתרבית במערכת זו ליותר מ -20 קטעים, כ -3 חודשים, pluripotency נשמר, כמו היו karyotypes היציב. שני שורות התאים היו מסוגלים בידול לשריר לב. יחד, האוסף של פרוטוקולים שתואר כאן מאפשר למשתמשים עם ניסיון מועט מאוד בתאי גזע תרבות, או גישה מוגבלת לציוד תרבות מיוחד, לתאי גזע תרבות ולהשיג ייצור תאים גבוה או רב-קו טיפול עם מינימאלית עבודה ועלות.

s = "jove_content"> הפרוטוקולים רובוטית המפורטים כאן מספקים שיטה לקנה מידה עד חסכוני של ייצור וטיפול iPSC. יתרון אחד הוא התרבות של תאי גזע להרחבה בפורמט המבוסס צלחת הוקמה הפגין כאן והעבר 44,47 - 49 כדי לשמור על pluripotency. בעוד פורמטים אחרים של תאי pluripotent תשואת תרבות תאי גזע מדרגי 20,23,29 שיטה מבוססת צלחת זה דורש בעצם לא חל שינוי בפורמט התרבות, כמו adaption להשעיה, שימוש בכימיקלים או antifoaming שימוש ממושך של מעכבי Rho-kinase 20. שיטה מבוססת צלחת זו ולכן במהירות, וצפויה יכולה, להכיל קווים חדשים, כי תנאי התרבות דומים. ככל שהשימוש בiPSCs לדוגמנות מחלה מגביר 4,6,19,50, קווי iPSC חדשים נוצרים באופן רציף. הטכניקות המתוארות כאן הן מתאימות ביותר לקווי תרבות חדשה במדיום לעוצמת שמע גבוה ותפוקה בגלל המחסום למעבר אל הפורמט הוא lאוו. זה נכון גם לעבודה והציוד הדרוש כדי לשמור על המושבות. לבסוף, בגלל הפורמט והטיפול דומים לסביבה המשמשת לחישוב ולאמת קווי iPSC, ביצועי תרבות, כגון בידול מכוון, עשוי להיות צפויים יותר.

איור 8 ממחיש אסטרטגיה אחת לקנה מידה מייצור תאי גזע ב96-גם צלחות. צלחת אחת (מחזור 0) משמשת לזרע רובוט 12 צלחות חדשות, גידול של פי 12 (מחזור 0-1). אחרי כמה ימים של האכלה, אחד משנים עשר הצלחות הוא passaged זרע קבוצה נוספת של שנים עשר צלחות (מחזור 1 למחזור 2). הצלחות עשר שנותרו זמינות כעת לשימושים אחרים ומייצגות את רכיב הייצור של המערכת. בקצב הזה, מעבר של צלחת אחת יספק 11 צלחות בכל מחזור, או כל 3-4 ימים. מתודולוגיה זו וניתן לשנותם יותר כאשר צלחות מרובות passaged כפי שמוצגות במעבר מהמחזור 2 למחזור 3. במחזור 3, שתי צלחותתמיד נהג לשמור על המושבה והזרע 24 צלחות חדשות. 22 צלחות הנותרות אז זמינות לשימוש לאחר כל מחזור מעבר. בכל נקודה במחזור תחזוקת המשתמש יכול זרע יותר צלחות להגדיל את הייצור. דוגמא אחת תהיה מעבר לכל עמודה לשני מחזורי צמיחה. המעבר הראשון ממיר צלחת אחת לשנתי עשר צלחות, וכל אחד מעשר הצלחות משמש לזרע 144 צלחות. במקרה זה, משתמש מתחיל עם צלחת אחת ואחרי שני מעברים, או על 1.5-2 שבועות של תרבות, יש 144 צלחות. לדוגמא, קווי iPSC פיברובלסטים ושומן להניב כ 25-75,000,000 תאים לכל צלחת 96-היטב כאשר מוכנים למעבר. 144 צלחות לכן יכולות לייצג על 4-7 x 10 9 תאים.

מהו נטל העבודה לביצוע 144 96-גם צלחות רובוט? אחת המטרות לעבודה זו הייתה הפקת תאי גזע להרחבה שצמצמה עבודה בהשוואה ל( צלחת כלומר, 6 היטב) מסורתית נובע תרבית תאים. ACC הרובוטomplishes זה על ידי הקלה בצורך להתמודד מבחינה פיזית כל צלחת במהלך ההאכלה וpassaging. בעוד קשקשי ייצור צלחת 96-היטב באופן ליניארי כמו שזה יהיה ב6-גם צלחות מסורתיות, זמן טכנאי מבלה בעבודה עם הצלחות הוא פחות משמעותי באמצעות תרבות רובוטית. יעילות הייצור של תרבות רובוטית נגזרת מהבדל זה (איור 9). נמצא טכנאים יכולים להסיר 6-גם צלחת מן החממה, לבדוק את זה במיקרוסקופ, אז לשאוב ולהאכיל את הצלחת בכ -3.5 דקות. לשם השוואה, טכנאים לבלות כ -30 שניות הסרת צלחת 96-היטב מהחממה ובודקים אותו במיקרוסקופ לצפיפות וזיהום לפני הצבתו על הרובוט. עם פרוטוקול האכלה מורחב דומה לזה שתואר לעיל, ניתן לטעון שש 96-גם צלחות והפד, אשר לוקחת כ -21 דקות, או 3.5 דקות לכל צלחת. סה"כ הזמן שחלף כדי להאכיל את הצלחת הוא השוואה בין הרובוטIC ושיטות ידניות, אלא יד להאכיל 6 צלחות טכנאי נדרש לכל 21 דקות ואילו הטכנאי מבלה רק 3 דקות טיפול שש הצלחות לרובוט (בדיקת 30 שניות לכל צלחת). כאיור 9 מופעים, זמן טכנאי מבלה טיפול 144 צלחות באמצעות הרובוט הוא כ -1.2 שעות לעומת 8 שעות באופן ידני והרובוט לעולם לא יעשה טעות טיפול הצלחות או העברת נוזלים.

שיטות תרבות iPSC 96-היטב המתוארות כאן לספק פלטפורמה צייתנית למשימות הקרנה מורכבות. מכיוון שכל גם הוא זהה מבחינה גנטית וזרע באותו צפיפות מאותו המאגר הראשוני, יכול להיות מופץ משתנה בין הצלחת ומתוחזק על ידי הרובוט עם מאגרים זמינים מסחרי להפריד תנאים. זה יהיה שימושי עבור ניסויים כגון פיתוח צמיחת תאי גזע תקשורת 34,35,47, בדיקות מצע או מצב התרבות ומחקרי רעילות ניצול תאי גזע51. מאז כל שורת תאי גזע היא ייחודית במונחים של דרישות גודל מושבה והמעבר אופטימליות, ניתן להשתמש במערכת זו לווסת צפיפות זריעה, תדירות האכלה וטיפול מעבר על ידי מניפולציה של העמודות שנקטפו, התסיסה המכנית במהלך מעבר ותדירות ההאכלה. Iterating דרך המשתנים הללו יאפשר למשתמש למצוא במהירות סט של תנאים מתאימים לתרבות של קו חדש או לפתח טכניקות תרבות חדשות. מערכת רובוטית היא גם מסוגלת לשמור על 96 מושבות תאי גזע מקבילות אך עצמאיות. כאשר iPSC נגזרים מהתאים סומטיים או משובט לאחר מניפולציה גנטית, רבים שיבוטים מקבילים מוקרנים להניב קווי iPSC פוטנציאליים. ברגע שתאים בודדים הם זורעים לתוך 96-גם צלחות, מערכת זו יכולה להאכיל ומעבר 96-גם צלחות שמירה כל מושבה הפרדה. זה מאפשר תפוקה גבוהה מאוד בעת בחירת שיבוטים פוטנציאל ומבטל את הקושי בculturing הפיזי 96 קווים מקבילים. שיטה זו גםllows בקנה המידה גדול ייצור של כל שיבוט כך חומר שכבר זמין לניתוח מקביל. לבסוף, אנו רואים שילוב טכניקות אלה התרבות עם מערכת סחר צלחת רובוטית המספקת צלחות ומהחממה מאפשרת תרבות אוטומטית לחלוטין. זה יכול להיות מושלם עם יותר רובוטיקה המורכבת המאפשרת להרחבה גדולה יותר מאז הפרוטוקולים הבסיסיים שתוארו כאן הם להעברה למערכות אחרות המבוססות צלחת.

השלבים הקריטיים הראשונים כדי לטפל בפרוטוקולים הם אלה המונעים ולבדוק לזיהום כגון צעדים 1.5 ו -4.2. זיהום, כפי שפורט לעיל, ניתן להימנע בהצלחה אם טכניקה סטרילית טובה ושכל ישר מנוצלים. זה הכרחי, ללא קשר לפורמט תרבות תאי גזע, שצק המפעיל לזיהום ועושה זאת בפרוטוקול זה בצעדים שצוינו יהיה להפחית באופן משמעותי את הסיכון לזיהום. יישום ג'ל מטריקס הנכון הוא ESS שניצעד ential להצלחה הכוללת של פרוטוקול זה. ללא ציפוי כראוי 96-גם הצלחות, תאי הגזע לא יגדלו. בעיה נפוצה אחת היא ציפוי גם לא שלם. ניסיון הוכיח כי בועות אוויר, משיכה אלקטרוסטטית ופעולת נימים לעכב ציפוי גם מלא. הצעד מראש ההרטבה (1.6) פותח כדי לשפר את הציפוי גם תחתון באופן משמעותי ולא צריך לדלג עליו. צעד ההרטבה מראש זה מופיע כדי להפחית את הידרופוביות לכאורה של צלחת 96-היטב פלסטיק כך שכאשר ציפוי ג'ל מטריקס מיושם הוא מופץ באופן שווה על פני גם תחתי ודפנות. מומלץ גם לטפוח בעדינות 96-גם הצלחות נגד יד נקייה מצופה פעם אחת כדי להבטיח הפצת פתרון ג'ל מטריקס אפילו תאית. הפרמטרים הניתוק הם גם חשובים כדי לייעל. דגירה ממושכת עם אנזים או מגיב ניתוק מבוסס EDTA תגרום תאים בודדים שיכולה או לא יכולה להיות המטרה במעבר. לכן, המפעילצריך להקדיש תשומת לב מיוחדת לאופן שזמן ניתוק, כוח טחינה דקה, וחזר שוב ושוב לשטוף להשפיע מורפולוגיה מושבה ובריאות ולהתאים בהתאם.

הבנת המגבלות לטכניקות המתוארות כאן הן בעל חשיבות עליונה לפעולה מוצלחת. כמו בכל הגדרת תרבות תאים אחרת, השימוש בלוחות 96-גם מהווה סיכון לזיהום גבוה יחסית. כפי שתואר לעיל, טכנאי הוא טיפול בכל צלחת במהלך ההאכלה וpassaging; לדוגמא, בעת פתיחת המכסה, לשים את הצלחת על מיטת הרובוט, ולבדוק את הצלחת על המיקרוסקופ. לכן, כאמור, לאחר שלב 1.5, זה הכרחי שלא לגעת בחלק הפנימי של כל מכסה צלחת או לחשוף את החלק הזה לכל משטח מזוהם כמו בלוקים המשופעים חימום או סיכות אנכיות על המיטה. במהלך פיתוח פרוטוקול מגבלה זו התגלתה והייתה המניע לפיתוח מתלה להחזיק מכסים בצלחת כדי לשמור על סטריליות. כמו כן, מאגרי השוקת, טיפים pipet וoאספקת יס על מיטת רובוט טיפול הנוזלית הן מקורות פוטנציאליים לזיהום, כי הם פתוחים לסביבה ומטופלים על ידי הטכנאי. לכן, טכניקה סטרילית טובה צריכה להיות מיושמת כמו צמצום תנועות על פני חומרי תרבות חשופים או נוזלים פתוחים. מגבלה נוספת היא שכאשר הפרוטוקול בקנה מידה גדול, מבחינה ויזואלית בודק כל גם של> 100 96-גם צלחות היא מסורבל. זה יכול להיות מטופלים על ידי חזותי בודק את כל הצלחת לסימנים של זיהום, כגון תקשורת עכורה, לזהות בארות חשודות. לקנה מידה עד עתיד, שימוש במיקרוסקופ ומחוון של צמיחת תאים וזיהום פוטנציאלי אוטומטיים ישולב.

לסיכום, 96-גם הפלטפורמה מבוססת התפוקה גבוהה שתוארה כאן מציעה שיטה לשחזור, איכות גבוהה לתרבות תאי גזע והפקה בפורמט צלחת. שיטה זו מקטינה את הניסיון הנדרש, זמן דרוש ועבודת ציוד הייעודי לגזע תוך תרבית תאיםשמירה על היתרונות של תרבות חסיד מסורתית.

Disclosures

המחברים MKC, MJG, EEB, NJD וRO הם או היו בזמנם של עובדי פיתוח של InvivoSciences, INC שהגו ופיתחו את הפרוטוקולים רובוטית שתוארו כאן. TW הוא CSO לInvivoSciences INC. SH הנו עובד Gilson INC.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקי NIH, R44 GM087784 וR01 HL109505. מחברים מודים לצוות הטכני וOEM בGilson, INC לתמיכה טכנית מורחבת.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates Corning 3596 96-well; Well volume: 360 μl; Cell growth area: 0.32 cm2; Individually wrapped
Seahorse Trough SeahorseBio 201308-100 Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs
Gilson Tips Gilson F167023 10 racks gilson 96 tips D200 tips
DMEM/F12 Life Technologies 12500062 DMEM/F12 powder.  Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.
Growth Factor Reduced Matrigel Corning 354230 Referred to as, "extracellular matrix gel" in the text. Matrigel GFR, 10 ml
mTeSR1 StemCell Technologies 5857 mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.
E8 Media StemCell Technologies 5940 TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance
Y27632 AdooQ BioScience A11001-50 Rock inhinitor Y-27632 2HCI
Accutase Innovative Cell Technologies ACCUTASE Referred to as, "proteolytic and collagenolytic dissociation reagent" in the text. Accutase 500 ml sterile cell solution
PBS Fisher SH30256FS PBS w/o Ca Mg 500 ml, 6/pk
Gilson PIPETMAX Gilson PIPETMAX http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature protocols. 2, (12), 3081-3089 (2007).
  2. Grskovic, M., Javaherian, A., Strulovici, B., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells--opportunities for disease modelling and drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 10, 915-929 (2011).
  3. Shi, Y. Induced pluripotent stem cells, new tools for drug discovery and new hope for stem cell therapies. Current Molecular Pharmacology. 2, 15-18 (2009).
  4. Xu, X., Zhong, Z. Disease modeling and drug screening for neurological diseases using human induced pluripotent stem cells. Nature Publishing Group. 34, (6), 755-764 (2013).
  5. Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell stem cell. 3, (4), 369-381 (2008).
  6. Ebert, P., Liang, J. W. Induced Pluripotent Stem Cells as a Disease Modeling and Drug Screening Platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60, (4), 408-416 (2012).
  7. Pa Lalit,, Hei, D. J., Raval, A. N., Kamp, T. J. Induced pluripotent stem cells for post-myocardial infarction repair: remarkable opportunities and challenges. Circulation research. 114, 1328-1345 (2014).
  8. Compagnucci, C., Nizzardo, M., Corti, S., Zanni, G., Bertini, E. In vitro neurogenesis: development and functional implications of iPSC technology. Cellular and Molecular Life Sciences. 1-17 (2013).
  9. Yi, F., Liu, G. -H., Belmonte, J. C. I. Human induced pluripotent stem cells derived hepatocytes: rising promise for disease modeling, drug development and cell therapy. Protein & Cell. 3, 246-250 (2012).
  10. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. a, Elefanty, aG., Kamp, T. J. Differentiation of Human Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes: A Methods Overview. Circulation Research. 111, (3), 344-358 (2012).
  11. Okano, H., et al. Steps toward safe cell therapy using induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 112, 523-533 (2013).
  12. Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The Potential for Immunogenicity of Autologous Induced Pluripotent Stem Cell-derived Therapies. The Journal of biological chemistry. 289, 4571-4577 (2014).
  13. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science translational medicine. 4, (130), 130ra47 (2012).
  14. Gunaseeli, I., Doss, M. X., Antzelevitch, C., Hescheler, J., Sachinidis, A. Induced pluripotent stem cells as a model for accelerated patient- and disease-specific drug discovery. Current medicinal chemistry. 17, 759-766 (2010).
  15. Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 114, 201-235 (2009).
  16. Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends in Biotechnology. 30, 350-359 (2012).
  17. Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Stem/Progenitor cell sources of insulin-producing cells for the treatment of diabetes. Tissue engineering. 13, 1399-1412 (2007).
  18. Jing, D., Parikh, A., Canty, J. M., Tzanakakis, E. S. Stem cells for heart cell therapies. Tissue engineering. Part B, Reviews. 14, 393-406 (2008).
  19. Soldner, F., Jaenisch, R. iPSC Disease Modeling. Science. 338, 1155-1156 (2012).
  20. Olmer, R., et al. Long term expansion of undifferentiated human iPS and ES cells in suspension culture using a defined medium. Stem cell research. 5, (1), 51-64 (2010).
  21. Wang, Y., Chou, B. -K., Dowey, S., He, C., Gerecht, S., Cheng, L. Scalable expansion of human induced pluripotent stem cells in the defined xeno-free E8 medium under adherent and suspension culture conditions. Stem cell research. 11, (3), 1103-1116 (2013).
  22. Chen, V. C., et al. Scalable GMP compliant suspension culture system for human ES cells. Stem cell research. 8, (3), 388-402 (2012).
  23. Amit, M., Laevsky, I., Miropolsky, Y., Shariki, K., Peri, M., Itskovitz-Eldor, J. Dynamic suspension culture for scalable expansion of undifferentiated human pluripotent stem cells. Nature protocols. 6, (5), 572-579 (2011).
  24. Olmer, R., et al. Suspension Culture of Human Pluripotent Stem Cells in Controlled. Stirred Bioreactors. Tissue engineering. Part C. 18, (10), (2012).
  25. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S., Ph, D. Scalable Stirred-Suspension Bioreactor Culture. Tissue engineering. Part A. 16, (2), (2010).
  26. Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 2, 219-230 (2009).
  27. Chen, A. K. -L., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnology advances. 31, 1032-1046 (2013).
  28. Yang, H. S., Jeon, O., Bhang, S. H., Lee, S. -H., Kim, B. -S. Suspension culture of mammalian cells using thermosensitive microcarrier that allows cell detachment without proteolytic enzyme treatment. Cell transplantation. 19, 1123-1132 (2010).
  29. Zweigerdt, R., Olmer, R., Singh, H., Haverich, A., Martin, U. Scalable expansion of human pluripotent stem cells in suspension culture. Nature. 6, (5), (2011).
  30. Kami, D., et al. Large-scale cell production of stem cells for clinical application using the automated cell processing machine. BMC biotechnology. 13, 102 (2013).
  31. Hussain, W., Moens, N., Veraitch, F. S., Hernandez, D., Mason, C., Lye, G. J. Reproducible culture and differentiation of mouse embryonic stem cells using an automated microwell platform. Biochemical engineering journal. 77, (100), 246-257 (2013).
  32. Tandon, N., Marolt, D., Cimetta, E., Vunjak-Novakovic, G. Bioreactor engineering of stem cell environments. Biotechnology Advances. 31, 1020-1031 (2013).
  33. Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15720-15725 (2009).
  34. Ludwig, T. E., Bergendahl, V., Levenstein, M. E., Yu, J., Probasco, M. D., Thomson, J. A. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature. 3, 637-646 (2006).
  35. Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature methods. 8, (5), 424-429 (2011).
  36. Kinney, M. A., Sargent, C. Y., McDevitt, T. C. The multiparametric effects of hydrodynamic environments on stem cell culture. Tissue engineering. Part B, Reviews. 17, 249-262 (2011).
  37. Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem cells (Dayton, Ohio). 31, (2013).
  38. Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, (7175), 141-146 (2008).
  39. Chambers, I., et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113, (5), (2003).
  40. Wright, A. J., Andrews, P. W. Surface marker antigens in the characterization of human embryonic stem cells. Stem cell research. 3, (1), 3-11 (2009).
  41. Thomson, J. a Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, (5391), 1145-1147 (1998).
  42. Mayshar, Y., et al. Identification and classification of chromosomal aberrations in human induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7, (4), 521-531 (2010).
  43. Martins-Taylor, K., Xu, R. -H. Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells. Stem cells(Dayton, Ohio). 30, (1), 22-27 (2012).
  44. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, (7151), 313-317 (2007).
  45. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature. 26, (11), 1276-1284 (2008).
  46. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (27), E1848-E1857 (2012).
  47. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature biotechnology. 24, (2), 185-187 (2006).
  48. Wang, L., Li, L., Menendez, P., Cerdan, C., Bhatia, M. Human embryonic stem cells maintained in the absence of mouse embryonic fibroblasts or conditioned media are capable of hematopoietic development. Blood. 105, (12), 4598-4603 (2005).
  49. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science(New York, N.Y.). 318, (5858), 1917-1920 (2007).
  50. Kim, C. Disease modeling and cell based therapy with iPSC: future therapeutic option with fast and safe application. Blood research. 49, 7-14 (2014).
  51. Jung, E. -M., et al. Evaluation of developmental toxicity using undifferentiated human embryonic stem cells. Journal of applied toxicology: JAT. (February. (2014).

Comments

1 Comment

  1. For setting the protocol how could I download it? Especially I would like to know how the ramp is specified in your protocol? Did you made ramp as a specialized labware or did you do advanced protocols(injections, moves, etc)?
    Sincerely Ji Young Ryu

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 13, 2017 - 3:45 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics