Vitreodynamic分析のための全硝子体液解剖

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Murali, K., Kashani, A. H., Humayun, M. S. Whole Vitreous Humor Dissection for Vitreodynamic Analysis. J. Vis. Exp. (99), e52759, doi:10.3791/52759 (2015).

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Abstract

Introduction

この方法の目的は、細部にvitreodynamic分析の目的のために、死体の眼から、硝子体コアと皮質無傷で、全体、無傷の硝子体を単離するための技術です。硝子体生理学の分野が成長してきたように、このような流体力学の研究者としての学際的研究者は、硝子体1の物理的および生体力学的特性を検討しています。そのためには、細部への学際的な研究者を支援するために、全体、無傷の硝子体を分離する技術が不可欠です。

セバーグ 23は、ヒト死体の目にエレガントな全体硝子体解剖を実施し、その結果の説明図を示しました。しかし、使用される技術は、詳細に記載されなかった非専門家が独立した方法を複製することはできません。他の研究は、このような吸引または部分的切開などの簡単な方法を使用して、死体眼から硝子体を収穫しましたこれらは両方とも全体、無傷の硝子体にはなりません。 Gisladottis 4およびXu 5は、死体の目から収穫硝子体液に透過性を調査します。硝子体抽出のない方法が記載されなかったので、それらはシリンジで硝子体液を吸引することを仮定しました。ワッツ 6は、外科的手法でウサギ硝子体液を単離する方法を説明することによって、さらに一歩行ってきました。しかし、この方法だけではなく、硝子体コア硝子体皮質の単離をもたらします。シェイエ 7は、後に4つのユニークな領域に硝子体を組織し、エレガントな分析のための各部分を分析する方法を説明しました。この技術は、しかしながら、全体としてそのまま硝子体をもたらさありません。

現在の技術は現在、死体の目で行われている生物物理学的実験を容易にするために開発されました。以前の方法は、記載のようにBOVEは、1)いずれも完全に全体の硝子体を分離しないため制限されている、2)収穫硝子体コアと皮質は3)硝子体の解剖学的構造が維​​持されていない、均質化されている、または4)解剖技術が十分に他の分野の研究者による複製のために詳述されていません。また、強​​膜と脈絡膜、硝子体の可視化の不透明度に起因するが、無傷の眼球に制限されています。これは、眼全体の内側にすることができる測定の精度と実現可能性を制限します。また、硝子体の周囲の解剖学的構造は、硝子体の生化学的および物理的性質の研究を混乱することができます。

近年では、硝子科学の本体は飛躍的に成長しており、全体の硝子体は、その個々の部分とは異なる特性を有することを信じる理由があります。 vitreodynamicsのresearcのための硝子体の物理的、生体力学的、および化学的特性を調査への関心の高まりがありますそのような薬物送達、硝子体内酸素8および硝子体切除などの臨床医学への応用を持っている時間、。硝子体を操作するための薬理学的物質を使用して薬理学的vitreodynamicsは、硝子体切除術の成果9を改善するために使用することができます。生体力学的特性は、硝子体内薬物送達技術10-12を改善するために使用することができる硝子体液の流れをモデル化するために使用されます。硝子体の様々なセグメントの物理的特性は、硝子体網膜酸素輸送13を理解するために重要です。提案された硝子体切開法は、無傷硝子体液の種々の特性を研究するために使用することができます。これは、ベンチトップ実験をより見やすくして全体、無傷の硝子体上で行うことを可能にします。

要約すると、硝子体の研究のための現在の方法は、いずれの適切記載されていない、または不完全な分離に硝子体コアと皮質をもたらします。したがって、Eを実行する必要があります透明な眼モデルでxperiments死体の眼に存在する硝子体の解剖学的構造を保持したまま。

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Protocol

すべて摘出した目は、食肉処理場から入手し、すべての実験は、機関のバイオセーフティ法に従って行いました。

  1. 表面に除核目を下に固定します。目の周りの過剰な組織を通じて組織ピンを配置し、発泡スチロールのボードにそれを固定することによってこれを行います。
  2. 眼からperilimbal結膜を分析し、デタッチ。
    1. 輪部で結膜を切開し、ぶっきらぼう強膜からそれを分析するために微細な鉗子(0.3鉗子)とmicroscissors(ウェストコットのはさみ)を使用します。鈍的切開は、さらに切開を可能にするために進むように角膜輪部に沿って結膜をカット。
    2. できるだけ多くの強膜を露出させるためにすべての方法目(360度)の周りに結膜を削除します。
      注:これは、残りの手順の間に外科的ピンやピンセットで目を固定容易にするために、結膜の少量を残して便利です。
  3. 一方に沿って十分な厚さの強膜フラップを作成目(手術用メスの刃69)の側面。
    1. 暗く着色された脈絡膜が表示されるまで、静かにメス(手術用メスの刃11)と強膜に切断して角膜縁に角膜​​輪部へ〜5ミリメ​​ートル強膜切開平行と3mmの後方を確認します。脈絡膜自体を切開しないように注意してください。
    2. それは内側に静かに脈絡膜を押すことにより、これらの組織との間の潜在的なスペースを大きくすることが可能になるまで慎重に、はさみ(鈍的切開を使用して)またはメスのいずれかで、強膜と脈絡膜の間に平面に沿って詳細に分析。
    3. T字型の切開を作成し、鋭いmicroscissorsとの最初の強膜切開に垂直な他の強膜切開を行います。
    4. そして、ぶっきらぼうに、基礎となる脈絡膜から強膜組織を除去し、穏やかに前述したように、強膜から離れて脈絡膜をプッシュする円周様式で解剖し続けています。
    5. 必要に応じて、強膜弁を拡大。
      1. 静かに強膜から脈絡膜を解剖鈍プロセス全体。
      2. 角膜輪部に垂直に切開が視神経に到達し、角膜輪部に切開製平行アイ円周(45°)の3分の1以上である。までフラップを拡大
      3. 鈍的切開中に目を操作するためのレバレッジのソースとして強膜弁を使用してください。フラップのカウンタートラクションを鈍的切開のためのそれが容易になります。
    6. 他の強膜弁の前の手順を繰り返します。
  4. 脈絡膜の大面積を露光するために強膜フラップを切り取ります。
  5. 眼の周囲に、ステップ3で切開(360度)を続けます。
  6. 残りの脈絡膜、網膜組織を削除します。
    1. 露出された領域内に、静かに残りの脈絡膜、網膜組織をはねのけるために綿の先端を使用しています。代わりに、静かに鉗子で組織を取得し、基本となる硝子体からそれを剥がします。
    2. 必要に応じて、脈絡膜STに切開を作ります視神経からarting。その後、網膜と硝子体皮質を露出するために静かに脈絡膜を剥がします。
  7. 離れて強膜からの脈絡膜を解剖鈍を継続した後、全体を得るために、脈絡膜をはがし、そのまま硝子体。
  8. 所望の位置に全体硝子体を配置するために角膜に付着した強膜リムを使用してください。この時点で、硝子体が前方強膜とレンズに取り付けられています。
  9. すべての強膜を除去し、レンズの周りに、強膜の内側から硝子体を解剖鈍いです。
  10. 必要であれば離れた硝子体からのレンズをすくうために鈍いツールを使用します。様々なvitreodynamic実験用のサンプルを使用してください。
    1. 空気にさらされる既知の表面積を有するガラスビーカーに試料を配置します。サンプルの端に酸素感受性プローブ​​を配置します。サンプルに既知の距離(R)にプローブを移動させるためにマイクロマニピュレーターを使用してください。
    2. 理論拡散方程式を得るためにフィックの法則を使用してください。ダとTAステップ10.1に収集の実験拡散係数/反応項を得ます

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Representative Results

プロトコルに続いて、コアおよび皮質( 図3)をそのままにして、成功した硝子体切開につながります。これは、硝子体皮質に付着した網膜の残留個から明らかです。無傷の全体硝子体液は、特定のvitreodynamic実験のためのいくつかの方法で使用することができます。我々のケースでは、無傷の硝子体液中の酸素の拡散速度と、それが対応する時定数だが( 図2)を検討しました。本手法を用いて、(コアと皮質)切開した硝子体は、既知の露出表面積を有するガラスビーカーに入れました。これは、ガラス質のコア6を分離する以前に公開された方法を用いて回収した硝子体と比較しました。他のすべての要因は、実験群と対照群の間で一貫性の保たれました。硝子体の表面は、公知の酸素圧(〜160 mmHgで)を有する空気に曝露しました。硝子体中の酸素分圧が低い(<10 mmHgで)でした。 vitrのレートに基づいて風水によって決定eous酸素消費量ゲル状の硝子体のための14、我々は(定常または非定常状態の形で)1次元の酸素輸送のための方程式を使用することができます。酸素分圧を硝子面内の既知の距離を測定することにより、我々は実験的に拡散係数を検証することができます。酸素分圧は、オックスフォードなどの酸素プローブを用いて記録し、エラー率が±10%でした。サンプルは、30秒毎に収集しました。硝子体皮質の存在は半ば硝子体への酸素の拡散速度に影響を与えます。硝子体皮質の存在下で、酸素の拡散は、より長い時間間隔で発生します。

硝子体コアと皮質の物理的特性は、健康と病気における影響力を持っています。例えば、局所的な、補足眼酸素は、網膜虚血8のための治療として提案されています。硝子体皮質を介して酸素のために異なる拡散係数を理解しますコアは、網膜への酸素供給の実際のレートを予測するために研究者を可能にします。

図1
図1:(国立眼研究所から変更された、米国国立衛生研究所)関連する解剖学的構造を表示する眼の断面図角膜は目の前で最も部分を形成し、目の光の大部分を提供する透明な組織ですパワー。角膜輪部は、角膜、結膜と強膜の接合です。強膜は、視神経を満たしている眼のほとんどの側面に輪部から延びています。結膜は、眼のラインが非常に外薄い上皮であり、外部環境と強膜との間の境界を形成します。眼の内部コンポーネントは、前房、レンズ、虹彩、毛様体、後室、後部腔、網膜および脈絡膜で構成されています。 vitreou複数のコアは、眼の後部空洞内、硝子体の中央領域を含みます。硝子体皮質は、硝子体の周りに配置され、扁平部、網膜血管、視神経乳頭や黄斑を含む、いくつかの点で網膜に取り付けられています。硝子体ベースは、鋸状縁に3mmの後方に鋸状縁に〜2mmの前方から延びる3次元ゾーンです。脈絡膜は、強膜と網膜の間に位置し、外側の網膜への血液供給を提供して血管組織層です。網膜は、眼の光送信容量をsubserves眼の神経感覚層です。強膜は、眼の壁に構造的な支持の大部分を提供する白色不透明層です。

図2
図2:そのまま全体のVに比べ硝子体コア(緑線)での酸素分圧の時間に対する硝子体液の酸素分圧のプロットプロットitreous(青線)。酸素検知プローブが試料の中央に配置し、試料を160 mmHgでの酸素分圧を有する空気に曝露しました。

図3
図3:孤立した全硝子体の例 。上の写真はまだ強膜リムに取り付けられた全無傷の硝子体の一例です。中央の写真は、強膜のないが、いくつかの残りの網膜組織と全体無傷の硝子体の一例です。底部は、全体、無傷の硝子体の一例です。

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Discussion

慎重に硝子体解剖中に実行されなければならない2つの重要なステップがあります。全層強膜フラップを作成するステップ3は、全体の解剖に重要です。ケアは、全層強膜フラップを作成する際に脈絡膜にカットしないように注意する必要があります。他の重要なステップは、脈絡膜から強膜を離れて解剖されています。このステップは、慎重に硝子体がこぼれることができ、そこから脈絡膜内に複数の穴を作成することを防止するために行われなければなりません。プロトコルを変更してもそのまま​​全体硝子体液を分析する方法があります。ステップ6は、硝子体の組織を所望の位置に配置された後に脈絡膜の端部で除去することができ、ステップ8まで遅延させることができます。

この手順の制限は、解剖時に、無傷の硝子体切開の成功と精度を提案する唯一の視覚的な手がかりがあるということです。硝子体コアと皮質は肉眼で透明と区別できないの両方であるので、この挑戦することができます。硝子体網膜への付着に気付いことによって、硝子体皮質の正常な解剖が発生したかどうかを判定することが可能です。それ以外の場合、このようなケナログなどの薬理学的物質は、硝子体の可視化15を改善するために使用することができるが、容易に一つは硝子体皮質と硝子体コアとを区別することを可能にすることはできません。この技術の別の制約は、硝子体ゲルの解剖するために最も効果的であることです。ヒトの硝子体ゲルは、年齢とともに液化を受ける非再生組織です。この液化は、完全に目から全体、無傷の硝子体を解剖から私たちを防ぐことができます。このように、私たちの技術は、例えば、ウシ、ブタやウサギなどの動物、または液状化の有意な量を持っていない若い人間の眼の硝子体にも及びます。これらの動物における硝子体液はゲル状態で完全になる傾向があります。

しかし、現在、DESCされている全く確立された方法は、ありません死体の目から全そのまま硝子体を解剖するために、詳細にribed。現在、十分に詳述されているのみで、硝子体解剖技術は硝子体7のユニークなが、別々の領域の解剖または単に硝子体コア6の切開を伴います。

解剖無傷の硝子体液のアプリケーションが理解の下と下に活用されています。硝子体での手術経験など、臨床病理組織学的、および生化学的研究は、硝子体の化学的および構造的特性が著しく16,17を変化させることができることを示唆しています。したがって、眼の生理学および解剖学的構造における硝子体の機能を研究するために、全硝子体の構造を維持することが必要です。無傷の硝子体は、実験中に、より良い視覚化のために透明な地球儀に外植することができます。次いで、それらを、生体力学的/物理プロップの測定を改善するために、機械的/化学的試験の種々のために使用することができます硝子体液のerties。例えば、我々は解剖全体無傷の硝子体が引用されたレオロジー実験6,18に生理食塩水、粘性の代替、または硝子体コアの代わりに使用することができることを示唆しています。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.3 forceps Storz Opthalmics E1793
Westcott Tenotomy Scissors Curved Right Storz Opthalmics E3320 R
Scalpel Handle No. 3 VWR 25607-947
Scalpel Blade, #11, for #3 Handle VWR 470174-844

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References

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