전신 산화 스트레스의 간접 측정으로 혜성 분석

Biology
 

Summary

혜성 분석은 다른 요인에 의해 유도 된 DNA 나누기를 측정한다. DNA 손상을 유발 (산화 스트레스를 제외한) 모든 요인들이 일정하게 유지되는 경우, DNA 손상의 양이 산화 스트레스 좋은 간접 파라미터이다. 이 프로토콜의 목적은 산화 적 스트레스의 간접적 인 측정에 혜성 분석을 사용하는 것이다.

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Fang, L., Neutzner, A., Turtschi, S., Flammer, J., Mozaffarieh, M. Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress. J. Vis. Exp. (99), e52763, doi:10.3791/52763 (2015).

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Abstract

산소없이 살 수없는 높은 진핵 생물; 그러나 역설적으로, 산소는 그들에게 해가 될 수 있습니다. 그것이 다른 파이 * 고결 궤도에있는 두 개의 비공유 전자를 가지고 있기 때문에, 산소 분자는 화학적으로 비교적 불활성이다. 이 두 전자들은 자신의 축에 대한 동일 방향으로 회전 즉, 평행 한 스핀을 갖는다. 산소 분자가없는 매우 반응성 이유이다. 산소의 활성화는 두 개의 서로 다른 메커니즘에 의해 발생할 수 있습니다; 어느 시간 (가의 감소)를 통해 하나의 전자 환원을 통해, 또는 충분한 에너지의 흡수를 통해 부대 전자 중 하나의 회전을 반대로. 이것은 반응성 산화 화학 종 (ROS)의 생성을 초래한다. 인체 생리 학적 상태에서 ROS를 제거하는 여러 가지 방법이있다. ROS 생성은 보수 능력, 산화 스트레스의 결과 및 다른 손상 분자를 초과하는 경우. 산화 스트레스는 저를 할 수있는 여러 가지 방법이 있습니다asured. 이 논문은 또한 DNA 나누기의 측정을 허용한다 "혜성 분석법"로 알려진 세포 겔 전기 영동,라는 방법 중 하나에 초점을 맞춘다. 산화 스트레스 이외의 DNA 손상을 유발하는 것으로 알려진 모든 요인들이 일정하게 유지되는 경우, 혜성 분석법에 의해 측정 된 DNA 손상의 양이 산화 스트레스 좋은 파라미터이다. 원리는 간단하며, DNA 분자가 음으로 하전된다는 사실에 의존한다. 완전한 DNA 분자는 전기 영동시 이동하지 않도록 큰 크기를 갖는다. DNA 나누기 그러나 양극쪽으로 전계 이동 작은 단편으로 존재하는 경우 결과. 작은 조각 빠르게 이동한다. 단편은 서로 다른 크기를 가지고 전기의 최종 결과는 별개 라인 오히려 혜성의 형상으로 연속이 아니다. 시스템은 세포의 DNA 나누기 얻어진 "혜성"및 이와의 정량을 허용한다.

Introduction

혜성 분석은 처음 스웨덴어 과학자 Ostling 및 요한슨 (1)에 의해 개발되었다. DNA는 음전하 분자이다. 전기 영동시, 작은 손상, DNA 단편을 빠르게 양전하 양극 (2)을 향해 이동한다. DNA 단편 작을 양극쪽으로 빠르게 자신 마이그레이션 손상, DNA 손상과 손상된 DNA 단편 (3)으로 이루어지는 "꼬리"구성된 "헤드"전형적인 "혜성"을 형성한다. 손상된 DNA를 5 매우 균형 잡힌 DNA 나누기의 생성을 유지 본체 (4) 다른 메커니즘에 의해 복구 할 수 있습니다. 그러나, 저울이 DNA 바꿈 대신 경우 나누기 쌓일 수 궁극적 질환의 발전에 기여한다.

우리의 DNA는 주어진 시간 6 약 0.000165 % 손상을 겪고있다. 단일 가닥 DNA 나누기는 DNA 이중 나선의 두 가닥 중 하나에 결함 참조DNA 이중 나선의 두 가닥이 손상되면 이중 가닥 DNA 나누기가 발생하는 반면. 이러한 세포의 연령, 담배 연기, 다양한 약물 또는 산화 스트레스 7-9으로 주어진 시간에 DNA 나누기의 양을 향상시킬 수있다 여러가지 요인이있다. 향상된 DNA 파손으로 이어지는 모든 요인들이 일정하게 유지된다면, 혜성 분석법에 의해 DNA 나누기 부량은 산화 스트레스 좋은 간접 파라미터이다.

혜성 분석의 방법을 포함한 안과 의학에서 점점 오늘날 사용된다. 그 이유 중 하나는 산화 스트레스가 더욱 더 한 방법 간접적으로 정량 할 수있는 산화 스트레스와 각종 질병 8-11 및 혜성 분석 용기구 병인으로 인식한다는 것이다.

Protocol

바젤 대학에서 수행 혜성 분석에 관한 연구는, 안과학 교실은 바젤의 지역 윤리위원회에 의해 승인되었다

시약 1. 준비

  1. 둘 베코 인산염 완충 식염수 (PBS) (칼슘 + +, 마그네슘 + + 무료), PBS (1 패 패킷)과 미디어에 DH 2 O의 990 ml에 추가하여 솔루션을 준비합니다. 7.4 pH를 조정합니다. 실온에서 보관하십시오.
  2. 용균 솔루션을 준비 : 1,000 ml의 DH 2 O에서 2.5 M의 NaCl (146.1 g)을, 100 mM의 EDTA (37.2 g) 및 10 mM의 후, Trizma베이스 (1.2 g)을 추가 준비하려면
  3. 1,500 ml의 DH 2 O 10 M의 NaOH 30 ml의 7.5 ml를 0.2M EDTA, QS를 추가하여 전기 영동 버퍼 (300 mM의 수산화 나트륨 / 1 mM의 EDTA)를 준비하고 잘 섞는다. 총 부피는 겔 상자 용량에 의존한다. 앞서> (13)의 pH가되도록 버퍼의 pH를 측정하고, 사용하기.
  4. 0.4 M 트리스 함유 중화 버퍼 준비 (# 농축 (GM는 48.5 ~ 800 ml의 DH 2 O는, pH를 7.5로 조정하기 위해 첨가)62, DH 2 O 10 M의 HCl) 1,000 ㎖의 실온에서 솔루션을 저장합니다.
  5. 염색 솔루션을 준비합니다. 에티 디움 브로마이드 (EtBr이, 10 배 주식, 20 μg의 / ㎖)에 실온에서 50 ml의 DH 2 O 및 저장소에 EtBr이 10 mg을 추가합니다. 1X 주식 - 9 ml의 DH 2 O와 함께 1 ml의 혼합 신중한! 이 알려진 발암 물질로 적절한 예방 조치와 EtBr이를 처리합니다.

백혈구 2. 분리

  1. 정맥 천자를 사용하여 헤파린과 같은 항응고제와 인간의 혈액 샘플 (20 ㎖)을 구합니다.
  2. 이러한 Histopaque 같은 밀도 구배 전지 세퍼레이터를 사용하여 림프구를 분리.
    1. 600 μL 세포 분리 액체를 통해 1 PBS 또는 (FBS)없이 RPMI와 비율과 층 : 간단히, 1에 혈액을 희석.
    2. 4 ℃에서 20 분 동안 원심 분리기 1,800 XG. PBS / RPMI의 3-5 ml의에 '버피'코트를 기음과 림프구 펠렛 10 분 동안 300 XG에 원심 분리 하였다.
    3. (단지 PBS 사이의 경계 위에서 RPMI를 림프구 검색피펫을 이용) 및 세포 분리 액. 플라즈마 및 각 튜브의 액체 전지 세퍼레이터 층과의 계면으로부터 백혈구를 제거하고 대역 한 50 ㎖ 튜브에 수집한다.
  3. 감기 둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM)과 50 ㎖에 총 볼륨을 가져와. 10 분 동안 300 XG에 세포 현탁액을 DMEM로 3 회 세척 할 것.
  4. 혈구 계를 사용하여 세포의 총 수를 카운트. PBS의 세포를 일시 중단하고 10 7 세포 / 튜브의 microcentrifuge 튜브에 aliquote.
  5. 피펫 5 ㎖ 일회용 플라스틱 튜브에 0.4 ml의 세포. 40 ℃에서 1.2 ml의 1 % 낮은 겔화 온도 아가로 오스를 추가합니다. 믹스 및 신속하고 미리 코팅 된 슬라이드의 아가로 덮인 표면에 세포 현탁액 1.2 ml의 피펫. 거품을 생산하지 마십시오.
  6. 아가로 오스는 약 2 분 동안 젤을 허용합니다. 겔화에 사용되는 시간과 온도와 일치하고, 그 아가로 오스가 완전히 분해 용액에 침지하기 전에 설정되어 있는지 확인하십시오. 의 완전 후등은 4 ~ ºC에서 솔루션을 용균에 잠수함.

3. 용해 및 전기 영동

참고 : 설명하는 절차는 pH가> (13) 알칼리 조건에서 전기입니다.

  1. ~ 4 ºC에서 최소 2 시간 후, 부드럽게 용균 솔루션에서 슬라이드를 제거합니다. 장소는 가능한 한 함께 그들을 가깝게 슬라이딩, 하나의 끝 부분에 수평 젤 상자에 나란히 슬라이드.
  2. 액체 레벨이 완전히 슬라이드 (아가로 오스를 통해 거품을 피하기) 커버까지 갓 산도> (13) 전기 영동 버퍼와 버퍼 저수지를 입력합니다.
  3. 20 분은 DNA의 풀림 및 알칼리 불안정한 손상의 표현을 허용하는 슬라이드 알칼리 버퍼에 앉아 보자.
  4. 25 볼트 (~ 0.75 V / ㎝)에 전원을 켜고 높이거나 버퍼 수준을 낮춤으로써 300 밀리 암페어의 전류를 조정합니다. 30 분간 슬라이드를 Electrophorese.
  5. 전원을 끄십시오. 조심스럽게 버퍼와 P에서 슬라이드를 올려드레인 트레이에 레이스. 현명한 코트를 중화 버퍼와 슬라이드를 삭제합니다. 슬라이드가 적어도 5 분 동안 앉아 있도록 허용합니다. 슬라이드를 배출하고 두 번 더 반복한다.
  6. 80 μL 1X 에티 디움 브로마이드 (EtBr이)와 슬라이드를 얼룩 5 분간 방치 한 후 과잉 얼룩을 제거하기 위해 냉각 된 증류수에 담근다. 그런 다음 슬라이드를 통해 커버 슬립을 배치하고 즉시 저장합니다. 스토어는 건조한 상태에서 실온에서 한 달 동안 슬라이드.
    주의 : 다른 DNA 얼룩 (예를 들면, SYBR 그린)도 사용될 수있다. 주의! 대부분의 염료가 돌연변이이기 때문에 보호 장갑을 착용하십시오.

DNA 나누기 4. 정량

  1. DNA 손상을 시각화하기 위해, 40X 목적 형광 현미경 EtBr이 묻은 DNA 슬라이드를 관찰합니다.
  2. DNA 이동의 길이와 이주 DNA (도 1A)의 비율을 측정함으로써 세포의 DNA 손상을 정량적으로 평가. Tail- 모멘트와 올리브-mome에 의한 DNA 손상 (그림 1B)를 정량화NT. 꼬리 순간 올리브 -Moment의 정의는 이전에 8-10을 부여하고있다.
    참고 : 우리의 경험에서이 매개 변수 중 하나에 의해 충실하기에 충분하다. 세포는 현미경 슬라이드와 사진 세포를 통해 검사 자동화 된 도구를 설정하여 촬영됩니다. DNA 나누기 정량은 이미지 분석 소프트웨어 패키지에 의해 수행 될 수있다. 커스텀 셀의 이미지를 캡처하고 DNA 손상을 정량화 만들어 여러 소프트웨어 패키지가있다. 우리는 실험을하는 동안 같은 소프트웨어 패키지를 사용하는 것이 좋습니다. 실험실 기술자는 그대로 셀 또는 혜성이 컴퓨터에 득점을 식별하고 그 위에 마우스로 클릭합니다. 혜성 또는 그대로 셀은 자동으로 획득됩니다.

Representative Results

혜성 분석의 방법은 재현 가능한 결과를 렌더링 아니지만, 다양한 요인에 의해 영향을받을 수있다. 하나의 이러한 인자는 백혈구 전에 용해하고, 겔 전기 영동 또는이 단계는 새롭게 제조 된 백혈구를 수행할지 여부를 동결 보존되어 있는지의 여부이다. 도시도 2를 그 백혈구가 용해 및 겔 전기 SS- DNA 전에는 동결 보존 하였다 그룹 2에 휴식은 용해 및 젤 -electrophoresis 갓 준비 세포에서 수행 한 그룹 1보다 유의하게 높았다.

분석은 간접적 전신 산화 스트레스를 평가하는데 사용될 수있다. 표 1은 흡연자와 건강한 과목에서 Tail- 모멘트와 올리브 ... 순간에 대한 설명이 통계를 보여줍니다. 데이터는보다 매일 더 담배의 절반 팩을 흡연하는 순환 백혈구 9 ssDNA를 나누기를 두 배로 것으로 나타났다.

그림 1A

그림 1B
도 1 (A)는 혜성 시험 분석 동안 사용 된 현미경을 도시한다. (B) Δ 밝은 머리와 꼬리 (작은 DNA 조각을 손상) 전형적인 "혜성"을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
백혈구가 새로 제조 된 백혈구가 용해 및 겔 전기 이전에 사용 된 경우보다 (그룹 2) 동결 보존 때 그림 2. ssDNA를 나누기는 유의하게 높았다.

표 1. 흡연자의 ssDNA를 두 배 이상 수가 건강한 비 흡연자 일치 연령과 성별에 비해 중단했다.

Discussion

스웨덴어 과학자 Ostling 및 요한슨은 세포 하나에서 DNA 손상을 정량화하는 혜성 분석을 사용하여 자신의 분야에서 처음이었다. 중성 조건은 두 과학자들이 사용한다는 점만을 이중 가닥 DNA 나누기의 검출을 허용했다. 싱 등은. 나중에 단일 및 이중 가닥 DNA 나누기를 평가하고 알칼리 불안정한 사이트 (12)을 감지 할 수있는 민감한 버전을 생산 알칼리 조건에서 사용하기위한 분석을 적용. 초기 개발 이후, 분석은 상이한 세포 유형에서 13-15 DNA 손상의 유형을 평가하기에 적합하도록 다양한 단계에서 수정되었다.

모든 기술에서와 같이, 기술 정보에 엄격한주의를 기울이지 16 것은 정확한 결과를 얻기 위해 중요하다. 우리의 경험을 바탕으로 최상의 결과를 얻을 경우 모든 방법 론적 스텝에서 정량-되는 전문 실험실 TECHN에 의해​​ 혜성 수행에 솔루션 준비icians. 신선하고 정확하게 준비된 용지 적절한 피펫 기법 정확한 타이밍과 새로 제조 한 백혈구 (이전 결과 섹션에서 언급 된 바와 같이)의 사용 용도는 정확한 결과 (17)를 얻기 위해 분해 및 겔 전기 영동을 위해서는 필수적이다.

이 분석에서 모든 개별 단계는 신뢰할 수있는 결과를 얻기위한 동등하게 중요하다. 일반적으로 가장 좋은 결과에서 (16)를 얻을 수있다 혜성 정량화까지 솔루션 준비에서 매 방법 론적 단계는 전문 실험실 technicians.Important에 의해 수행되는 경우 것 같다 신선하고 제대로 준비 미디어의 사용 적절한 피펫 기법, 정확한 타이밍은 이미 결과 분석 부 (17)로부터 적절한 결과를 얻기 위해 분해 및 겔 전기 영동 새로 제조 한 백혈구 사용 함.

다른 방법을 할 때, 혜성 분석 기술은 ADVAN이의 tages과 단점. 민감한 방법이기 때문에, 분석은 DNA 휴식을 증가 때문에 결과에 영향을 미칠 수있는 요소 (예를 들면, 자외선)에 취약합니다. 연구되고있는 것을 제외하고, 산화 스트레스를 향상시킬 수있다 상관 계수는 피해야한다. 스트레스는 산화 스트레스 백혈구에서뿐만 아니라 다른 모든 혈액 매체와 림프구에서뿐만 아니라의 수준을 높일 수 있습니다. 앞서 언급 한 바와 같이 산화 스트레스 18,19 측정 다양한 더 직접적인 방법이있다. 혜성 분석은 어떤 장점이 많은 방법 중 하나입니다. 이들은 상대적 저비용 (<10,000 세포)에 필요한 세포의 수가 적은 환자 당 필요한 피 따라서 작은 시료 세포 (약 3 일간)에서 DNA 손상을 계량하는 데 필요한 시간의 상대적인 짧은 기간, 그 감도를 포함 서로 다른 세포 유형에서 엉덩이의 DNA 손상에 넓은 확산 적용. 우리는이 경험을 가지고 있기 때문에 과거에 우리는 백혈구와 함께 작동하도록 선택세포 형과 계획, 특정 연구에 적용했다. 혜성 분석법의 또 다른 장점은 서로 다른 유형 및 DNA 손상의 레벨을 검출하는데 사용될 수 있으며, 따라서 이러한 DNA 복구 과정, 보충 실험 또는 유전 독성 연구와 같은 산화 적 스트레스 또한 연구의 다양한 분야에 적용 할 수 있다는 것이다.

산화 스트레스는 이제 여러 질환의 발병 기전에서 중요한 역할을 인식한다. 혜성 분석 방법은 산화 스트레스 18,19 측정 많은 방법 중 하나를하면서, 비교적 간단하고 저렴한 다재다능하다. 습득하면,이 방법은 산화 스트레스가 역할을 담당 8-10,20,21되는 의학의 모든 분야에서 사용될 수있다.

Disclosures

없음.

Acknowledgments

우리는 재정적으로 산화 스트레스에 우리의 연구를 지원하기 위해, 트리 젠 리히텐슈타인, LHW 재단에게 감사의 말씀을 전합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dimethylsulfoxide (DMSO) Qualigens (CPW59)
Disodium EDTA HiMedia (RM1370)
Ethidium Bromide Sigma (E-8751)
Histopaque Sigma (1077-1)
Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free) HiMedia (TS1006)
Sodium Chloride (NaCl) Ranbaxy Rankem (S0160)
Sodium Hydroxide (NaOH) BDH-Merck (89021)
Triton X-100 HiMedia (RM 845)
Trizma Base Spectrochem
Materials required for gel electrophoresis
Normal Melting Agarose (NMA) HiMedia (RM273)
Low Melting Point Agarose (LMPA) Sigma (A9414)
Methanol - Qualigens
Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm) Blue Star
Microcentrifuge Tubes Tarsons (500010)
Micropipettor and Tips Tarsons
Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides

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References

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