Ensayo Cometa como una medida indirecta de estrés oxidativo sistémico

Biology
 

Summary

Ensayo cometa mide roturas en el ADN, inducidas por diferentes factores. Si se mantienen constantes todos los factores (excepto el estrés oxidativo) que causan daño en el ADN, la cantidad de daño en el ADN es un buen parámetro indirecto de estrés oxidativo. El objetivo de este protocolo es usar ensayo cometa para la medición indirecta de estrés oxidativo.

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Fang, L., Neutzner, A., Turtschi, S., Flammer, J., Mozaffarieh, M. Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress. J. Vis. Exp. (99), e52763, doi:10.3791/52763 (2015).

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Abstract

Organismos eucariotas superiores no pueden vivir sin oxígeno; sin embargo, paradójicamente, el oxígeno puede ser perjudicial para ellos. La molécula de oxígeno es químicamente relativamente inerte porque tiene dos electrones desapareados ubicados en diferentes orbitales pi * anti-unión. Estos dos electrones tienen espines paralelos, lo que significa que giran en la misma dirección alrededor de sus propios ejes. Esta es la razón por la molécula de oxígeno no es muy reactivo. La activación de oxígeno puede ocurrir por dos mecanismos diferentes; ya sea a través de la reducción a través de un electrón en un momento (reducción monovalente), o mediante la absorción de energía suficiente para invertir el giro de uno de los electrones desapareados. Esto resulta en la producción de especies oxidativas reactivas (ROS). Hay un número de maneras en que el cuerpo humano elimina ROS en su estado fisiológico. Si la producción de ROS supera la capacidad de reparación, los resultados de estrés oxidativo y los daños de diferentes moléculas. Hay muchos métodos diferentes por los que el estrés oxidativo puede ser míasured. Este manuscrito se centra en uno de los métodos llamados electroforesis en gel de célula, también conocido como "ensayo cometa", que permite la medición de roturas en el ADN. Si se mantienen constantes todos los factores conocidos para causar daño en el ADN, que no sea el estrés oxidativo, la cantidad de daño en el ADN medido por el ensayo de cometa es un buen parámetro de estrés oxidativo. El principio es simple y se basa en el hecho de que las moléculas de ADN están cargadas negativamente. Una molécula de ADN intacto tiene un tamaño tan grande que no migra durante la electroforesis. Roturas en el ADN, sin embargo, si está presente resultado en fragmentos más pequeños que se mueven en el campo eléctrico hacia el ánodo. Los fragmentos más pequeños migran más rápido. Como los fragmentos tienen diferentes tamaños el resultado final de la electroforesis no es una línea distinta, sino más bien un continuo con la forma de una cometa. El sistema permite una cuantificación de la "cometa" resultante y por lo tanto de las roturas en el ADN en la célula.

Introduction

Ensayo cometa fue desarrollado por primera vez por científicos suecos Ostling y Johanson 1. El ADN es una molécula cargada negativamente. Durante la electroforesis, los fragmentos de ADN más pequeñas, dañadas viajan más rápido hacia un ánodo cargado positivamente 2. El más pequeño de los fragmentos de ADN, más rápido su migración hacia el ánodo para formar un "cometa" típico con una "cabeza", compuesto por intacta, el ADN dañado y una "cola", compuesto de fragmentos de ADN dañadas 3. ADN dañado puede ser reparado por diferentes mecanismos en el cuerpo 4, que mantienen la generación de ADN se rompe bastante equilibradas 5. Sin embargo, si el saldo es a favor de ADN se rompe, se rompe se acumulan y en última instancia, contribuir al desarrollo de una enfermedad.

Nuestro ADN sufre aproximadamente 0.000165% de daños en un momento dado 6. Breaks ADN monocatenario se refieren a un defecto en una de las dos hebras de la doble hélice de ADNmientras que las pausas de doble cadena de ADN son causadas cuando las dos cadenas de la doble hélice de ADN están dañados. Hay varios factores que pueden aumentar la cantidad de roturas en el ADN en un momento dado, como la edad de la célula, el humo del cigarrillo, diversos fármacos o el estrés oxidativo 7-9. Si se mantienen constantes todos los factores que conducen a roturas en el ADN mejoradas, a continuación, la cuantificación de ADN se rompe por medio del ensayo cometa es un buen parámetro indirecto del estrés oxidativo.

El método de ensayo cometa se utiliza cada vez más hoy en la medicina incluyendo oftalmología. Una razón para esto es que el estrés oxidativo es más y más reconocido como un mecanismo patogénico para diversas enfermedades 8-11 y ensayo cometa es un método con el que el estrés oxidativo se puede cuantificar indirectamente.

Protocol

Estudios sobre ensayo cometa realizadas en la Universidad de Basilea, Departamento de Oftalmología fueron aprobados por el Comité Ético Local de Basilea

1. Preparación de los reactivos

  1. Prepare la solución mediante la adición de PBS (1 L de paquetes) y 990 ml de dH2O a los medios de comunicación Tampón fosfato salino de Dulbecco (PBS) (libre de Ca ++, Mg ++). Ajustar el pH a 7,4. Guarde a temperatura ambiente.
  2. Preparar la solución de lisis: Para preparar 1000 ml Añadir NaCl 2,5 M (146,1 g), EDTA 100 mM (37,2 g) y 10 mM de base Trizma (1,2 g) en dH 2 O.
  3. Preparar tampón de electroforesis (300 mM NaOH / EDTA 1 mM) mediante la adición de 30 ml de NaOH 10 M y 7,5 ml de 0,2 M EDTA, QS para 1500 ml dH 2 O y mezclar bien. El volumen total depende de la capacidad de la caja del gel. Antes de usar, medir el pH del tampón para asegurar un pH> 13.
  4. Preparar tampón de neutralización que contiene 0,4 M Tris (48,5 gm añadido a ~ 800 ml dH2O, ajustar el pH a 7,5), se concentró (& #62; HCl 10 M) en 1000 ml con dH2O Guarde la solución a temperatura ambiente.
  5. Prepare la solución de tinción. Para bromuro de etidio (EtBr; 10x Stock, 20 mg / ml) añadir 10 mg de EtBr en 50 ml dH2O y almacenar a temperatura ambiente. Para 1x Acción - mezclar 1 ml con 9 ml dH2O PRUDENTE! Maneje con precaución EtBr adecuada ya que es un carcinógeno conocido.

2. Aislamiento de leucocitos

  1. Obtener muestras de sangre humana (20 ml) con anti-coagulante tales como la heparina usando punción venosa.
  2. Separar los linfocitos utilizando un separador de células en gradiente de densidad, tales como Histopaque.
    1. Brevemente, diluir la sangre en proporción 1: 1 con PBS o RPMI (sin FBS) y la capa de más de 600 l de líquido separador de células.
    2. Centrífuga 1800 xg durante 20 min a 4 ° C. Aspirar el escudo 'Buffy' en 3-5 ml de PBS / RPMI y se centrifugaron a 300 xg durante 10 min para sedimentar los linfocitos.
    3. Recuperar los linfocitos desde justo por encima de límite entre PBS (RPMI) Y el líquido separador de células, utilizando una pipeta. Retire las bandas de leucocitos desde la interfaz entre el plasma y las capas líquidas separador de células de cada tubo y recoger en un tubo de 50 ml.
  3. Llevar el volumen total a 50 ml con medio Eagle modificado de Dulbecco frío (DMEM). Se lava la suspensión celular tres veces con DMEM a 300 xg durante 10 min.
  4. Cuente el número total de células utilizando un hemocitómetro. Suspender las células en PBS y alícuotas en tubos de microcentrífuga a 10 7 células / tubo.
  5. Pipetear 0,4 ml de células en un tubo de plástico desechable de 5 ml. Añadir 1,2 ml 1% de agarosa de baja temperatura de gelificación a 40 ° C. Mezclar y rápidamente y pipetear 1,2 ml de suspensión celular sobre la superficie de agarosa-cubierto de un portaobjetos pre-recubiertos. Evitar la producción de burbujas.
  6. Deje que el gel de agarosa al por alrededor de 2 min. Sea consistente con el tiempo y la temperatura utilizada para la gelificación, y asegúrese de que agarosa está totalmente ajustado antes de sumergirse en la solución de lisis. Después plenamente set, sumergir en solución de lisis a ~ 4 ºC.

3. Lisis y Electroforesis

NOTA: El procedimiento descrito es para la electroforesis en condiciones de pH> 13 alcalinas.

  1. Después de al menos 2 horas a ~ 4 ºC, retire con cuidado los portaobjetos de la solución de lisis. Lugar desliza de lado a lado en la caja de gel horizontal cerca de un extremo, deslizándolas tan cerca como sea posible.
  2. Llenar los depósitos tampón con tampón de pH> 13 electroforesis recién hecho hasta que el nivel del líquido cubre completamente las diapositivas (evitar burbujas sobre la agarosa).
  3. Deje diapositivas se sientan en el tampón alcalino durante 20 min para permitir el desenrollamiento del ADN y la expresión de daños alcalino-lábil.
  4. Encienda la fuente de alimentación de 25 voltios (~ 0,75 V / cm) y ajustar la corriente de 300 miliamperios subiendo o bajando el nivel de amortiguación. La electroforesis los portaobjetos durante 30 min.
  5. Desconecte la alimentación. Levante con cuidado las diapositivas de la memoria intermedia y pencaje en una bandeja de drenaje. Caída de la capa sabia las diapositivas con la neutralización de búfer. Permitir a las diapositivas para sentarse durante al menos 5 minutos. Escurrir las diapositivas y repetir dos veces más.
  6. Teñir las diapositivas con 80 l 1x bromuro de etidio (EtBr) y dejar actuar durante 5 minutos y luego se sumerge en agua destilada fría para eliminar el exceso de tinte. A continuación, coloque un cubreobjetos sobre el portaobjetos y almacenarlos inmediatamente. Tienda desliza durante un mes a temperatura ambiente en un lugar seco.
    NOTA: Otras manchas de ADN (por ejemplo, SYBR-verde) puede también ser utilizado. ¡Precaución! usar guantes protectores como la mayoría de los tintes son mutagénicos.

4. Cuantificación de ADN Breaks

  1. Para visualizar el daño en el ADN, observar la diapositiva ADN teñido con EtBr bajo un microscopio de fluorescencia objetivo de 40X.
  2. Evaluar cuantitativamente el daño del ADN en las células mediante la medición de la longitud de la migración del ADN y el porcentaje de ADN migrado (Figura 1A). Cuantificar el daño del ADN (Figura 1B) por el momento cola- y Olive-moment. Definiciones de Cola-Momento y Olive -Moment previamente se les ha dado 8-10.
    NOTA: En nuestra experiencia es suficiente para pegarse por uno de los parámetros. Las células son fotografiadas mediante el establecimiento de la herramienta automatizada que escanea sobre las células portaobjetos de microscopio y fotografías. Cuantificación de roturas en el ADN se puede hacer por paquetes de software de análisis de imagen. Hay varios paquetes de software diferentes que se hacen de encargo para capturar la imagen de las células y cuantificar el daño del ADN. Se recomienda utilizar el mismo paquete de software de todo el experimento. El técnico de laboratorio identifica la célula intacta o un cometa que se anotaron en el equipo y hace clic con el ratón sobre ella. La célula cometa o intacta después se anotó de forma automática.

Representative Results

Aunque el método de ensayo cometa hace resultados reproducibles, puede ser influenciada por una variedad de factores. Uno de estos factores es si o no los leucocitos son crioconservados antes de la lisis y la electroforesis en gel o si este paso se lleva a cabo en los leucocitos recién preparados. La Figura 2 muestra que en el Grupo 2, donde los leucocitos fueron crioconservados antes de la lisis de ADN y electroforesis en gel de SS- roturas fueron significativamente más altos, que en el Grupo 1, donde la lisis y gel -electrophoresis se realizó en las células recién preparadas.

El ensayo también se puede utilizar para evaluar indirectamente el estrés oxidativo sistémico. La Tabla 1 muestra los estadísticos descriptivos de cola- momento y momento oliva en fumadores y sujetos sanos. Los datos revelan que fumar medio paquete de cigarrillos al día más que duplica descansos ssDNA en los leucocitos circulantes 9.

Figura 1A

Figura 1B
Figura 1. (A) Representa el microscopio utilizado durante el análisis de ensayo cometa. (B) Δ representa a un "cometa" típico con una cabeza brillante y la cola (dañado fragmentos de ADN más pequeños). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. rompe ssDNA fueron significativamente más altos cuando los leucocitos fueron crioconservados (Grupo 2) que cuando se utilizaron los leucocitos recién preparadas antes de la lisis y la electroforesis en gel.

Tabla 1. Los fumadores tenían más del doble del número de ssDNA rompe en comparación con la edad y el sexo emparejado sanos no fumadores.

Discussion

Científicos suecos Ostling y Johanson fueron los primeros en su campo para utilizar ensayo cometa para cuantificar el daño del ADN en las células 1. Las condiciones neutras que los dos científicos utilizaron, sin embargo, sólo se permite la detección de roturas de doble cadena de ADN. Singh et al. Más tarde adaptó el ensayo para su uso en condiciones alcalinas, que produjo una versión sensible que podría evaluar roturas de doble y de cadena simple de ADN y detectar sitios álcali-lábiles 12. Desde su desarrollo inicial, el ensayo ha sido modificado en varias etapas para que sea adecuado para la evaluación de los tipos de daño en el ADN en diferentes tipos de células 13-15.

Al igual que con todas las técnicas, prestando una atención rigurosa a los detalles técnicos, es importante para obtener resultados precisos 16. Basándonos en nuestra experiencia, se obtienen mejores resultados si cada paso de la preparación metodológica solución al cometa cuantificación se realiza por expertos techn laboratorioicians. El uso de medio fresco y preparado correctamente, las técnicas adecuadas de pipeteo, la temporización exacta y (como se mencionó anteriormente en la sección de resultados) el uso de leucocitos recién preparados son esenciales para que la lisis y la electroforesis en gel para obtener resultados precisos 17.

Todos los pasos individuales en este ensayo son igualmente importantes para la obtención de resultados fiables. 16 En los mejores resultados generales se obtienen si cada paso metodológico sencillo de preparación de la solución hasta la cuantificación cometa se realiza technicians.Important laboratorio experto parecen el uso de medios frescos y correctamente preparados , técnicas de pipeteo adecuadas, fecha exacta y como ya se hace referencia en la sección de resultados del uso de los leucocitos recién preparados para la lisis y la electroforesis en gel para obtener resultados adecuados del ensayo de 17.

Como hacer otras metodologías, la técnica de ensayo cometa tiene su advanventajas y desventajas. Al ser un método sensible, el ensayo es vulnerable a los factores (por ejemplo, luz UV), que podría aumentar roturas en el ADN y por lo tanto afectar los resultados. Cualquier factor que puede aumentar el estrés oxidativo, excepto lo que se está investigando, se debe evitar. Los factores estresantes pueden aumentar el nivel de estrés oxidativo no sólo en los leucocitos, sino también en todos los demás medios de sangre y linfocitos. Como se mencionó anteriormente, hay muchas maneras diferentes y más directas de medir el estrés oxidativo 18,19. El ensayo cometa es uno de los muchos métodos que tiene ciertas ventajas. Estos incluyen su bajo costo relativo, el pequeño número de células requeridas (<10 000 células) y así las pequeñas muestras de sangre requeridas por paciente, el período relativamente corto de tiempo requerido para cuantificar el daño del ADN en las células (aproximadamente 3 días), su sensibilidad y su extendida aplicabilidad al daño del ADN asnos en diferentes tipos de células. En el pasado hemos elegir trabajar con leucocitos ya que teníamos experiencia con estede tipo celular y era aplicable para el estudio particular previsto. Otra ventaja del ensayo cometa es que puede ser utilizado para detectar diferentes tipos y niveles de daño del ADN y por lo tanto se puede aplicar en varias otras áreas de estudios, además de estrés oxidativo, tales como estudios de reparación del ADN, ensayos de suplementación o estudios de genotoxicidad.

El estrés oxidativo es ahora reconocido como jugando un papel crítico en la patogénesis de múltiples enfermedades. El método de ensayo de cometa, mientras que una de las muchas formas de medir el estrés oxidativo 18,19, es relativamente simple, versátil y barato. Cuando dominado, este método se puede utilizar en todas las áreas de la medicina en la que el estrés oxidativo juega papel 8-10,20,21.

Disclosures

Ninguno.

Acknowledgments

Nos gustaría dar las gracias a la LRP Stiftung, en Triesen Liechtenstein, por apoyar financieramente nuestra investigación sobre el estrés oxidativo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dimethylsulfoxide (DMSO) Qualigens (CPW59)
Disodium EDTA HiMedia (RM1370)
Ethidium Bromide Sigma (E-8751)
Histopaque Sigma (1077-1)
Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free) HiMedia (TS1006)
Sodium Chloride (NaCl) Ranbaxy Rankem (S0160)
Sodium Hydroxide (NaOH) BDH-Merck (89021)
Triton X-100 HiMedia (RM 845)
Trizma Base Spectrochem
Materials required for gel electrophoresis
Normal Melting Agarose (NMA) HiMedia (RM273)
Low Melting Point Agarose (LMPA) Sigma (A9414)
Methanol - Qualigens
Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm) Blue Star
Microcentrifuge Tubes Tarsons (500010)
Micropipettor and Tips Tarsons
Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides

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References

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