나노 입자 백신 접종 후 분석 항원 특이 CD8 + T 세포 반응에 대한 전체 동물 이미징 및 유세포 기술

Immunology and Infection

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Ochyl, L. J., Moon, J. J. Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination. J. Vis. Exp. (98), e52771, doi:10.3791/52771 (2015).

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Abstract

Introduction

전통적인 백신 개발은 주로 시행 착오의 실험 방법을 이용 하였다. 그러나, 생체 재료 및 면역 활성화의 분자 결정의 발견의 다양한 배열의 최근 발전과 함께, 그것은 합리적으로 병원균 1, 2에서 파생 된 생물 물리학 및 생화학 적 단서와 백신 제제를 설계 할 수있게되었습니다. 특히, 다양한 입자 약물 전달 플랫폼은 림프절에 상주 열화 백신 성분을 보호하고, 제시 세포를 항원 (장갑차)에 그들의 공동 전달을 향상 그들이 소단위 항원과 면역 자극 에이전트와 공동으로로드 될 수있는 백신 캐리어로서 검토되어왔다 노드 (림프절)은, 따라서 면역 자극 및 활성화 3-5을 극대화. 이전에 강력한 백신 플랫폼,로 입증 된이 보고서에서 우리는, "병원균 모방"나노 입자 시스템의 합성을 설명이라고 interbilayer 가교 다중 층 소포 (ICMVs)강력한 세포 독성 T 림프구 (CTL) 및 전신과 점막 조직 구획 6-9 모두에서 체액 성 면역 반응의 도출을위한 M. 특히, ICMVs 접종 실질적으로 종래의 보조제 (예를 들면, 명반과 몬타나 이드) (7)와 함께 백신에 비해, 말라리아 항원에 대해 혈청 IgG의 수준이 향상되고 또한 종양 세포 및 쥐 9 바이러스 챌린지 모델에 대해 강력한 CTL 반응을 유도 달성했다. 여기에, 모델 백신 나노 입자 시스템으로 ICMVs를 사용하여, 우리는 입자 크기와 제타 전위 측정 및 배수 림프절에 입자 인신 매매의 추적 저온 절단 된 조직 (7)의 공 초점 영상을 활용 (dLNs)를 포함한 백신 나노 제형의 특성에 대한 방법을 설명합니다. 또, 루시퍼 라제 발현 항원 특이 적 CD8 + T 세포의 대체 9,10- 전송 후에 마우스에서 CTL 반응의 팽창을 분석 전체 동물 이미징 기반 방법을 제시한다. 마지막으로, 우리 드나노 입자 6,9 접종 마우스에서 내인성 T 세포 반응의 길이 정량 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 스크라이브 테트라 머 염색.

ICMVs는 화학적 가교제 디티 6 지질 층 내에 가교 말레이 미드 기능화 인지질 헤드 그룹에 의해 안정화되는 다중 층 구조로 간단한 제어 리포좀 융합에 의해 합성 지질 나노 입자 기반 제형이다. ICMVs 합성되면, 나노 입자의 작은 분율은 입자의 크기 및 제타 전위 동적 광산란 (DLS) 시스템 및 제타 전위 분석기 (즉, 입자의 표면 전하)를 결정하는데 사용될 수있다. 확산 계수의 결정 입자 (11)의 유체 역학적 크기를 허용 입자 현탁액에 빛의 산란에 DLS는 변화를 측정. 일괄 합성 배치에서 일관된 입자 크기를 달성하는 것은 중요입자 크기 때문에 장갑차 (12, 13)에 의해 dLNs 이후의 세포 흡수에 백신 입자의 림프 배출에 영향을 미치는 주요 요소 중 하나입니다. 또한, 제타 전위는 입자와 입자 표면 전하 (11)의 전기 영동 이동도의 측정을 허용 전류가인가되는 입자 속도를 측정함으로써 얻어 질 수있다. 입자의 표면 전하가 저장 중 및 생체 내 투여 후 14, 15 입자 분산에 직접적인 영향을 콜로이드 안정성을 결정하기 때문에 입자의 일관된 제타 전위 값을 보장하는 것은 중요하다. dLNs에 입자 현지화를 추적하기 위해, ICMVs은 친 유성 염료 및 공유 태그가 항원을 포함하여 원하는 형광으로 표시 할 수 있습니다. 접종 후, 마우스를, 절제 dLNs는, 다양한 시점에서 안락사 저온 절단하고, 공 초점 현미경으로 분석 될 수있다. 이 기술은 림프 드레 이즈의 시각화 할 수 있습니다나노 입자 백신 사업자와 dLNs에 항원 모두 닝. 우리는 이전에 7 도시 한 바와 같이 조직 섹션들은 부가 적 항원과 배 중심의 형성과 관련된 셀 유형과 같은 형광 표지 된 항체 및 더 많은 정보를 획득하기 위해 이용, 물들 일 수있다.

입자 합성이 최적화되고 dLNs에 매매가 확인되면, 생체의 CTL 확대 추출의 유효성을 확인하는 것이 중요하다. 나노 백신에 응답하여 항원 특이 적 CD8 + T 세포의 추출을 분석하기 위해, 우리는 상세한 면역 학적 분석을 허용 OVA 257-264 펩티드 (SIINFEKL) 면역 CD8 + T 세포 에피토프와, 모델 항원, 난백 알부민 (OVA)을 이용했다 초기 백신 개발 16,17 대한 항원 특이 적 T 세포 반응. 특히, 팽창 및 항원 특이 적 CD8 + T 세포의 이동의 역학을 심문, 우리가 생성 한T 세포 수용체 (H-2K의 B와 관련) SIINFEKL 특정 (TCR)와 CD8 + T 세포를 가지고 OT-I 유전자 변형 쥐와 유전자 변형 마우스 (배낭)을 루시 페라 제 - 표현 반딧불 건너 이중 형질 전환 마우스 모델. 이러한 OT-I / 루크 생쥐에서 루시퍼 라제 발현, OT-I CD8 + T 세포를 단리 할 수​​ 있고, 나이브 C57BL / 6 마​​우스에 대체 전송 제조. 씨를 뿌린 후에 OVA 함유 나노 입자가 성공적으로 면역화 동물 전체 촬상 시스템 9,10와 생물 발광 신호를 모니터링함으로써 추적 될 수 전사 T 세포의 확장을 초래할 것이다. 이러한 비 침습적 전신 영상 법은 길이 방식으로 말초 조직에 T 세포 림프 조직에서의 보급 확대와 관련된 프로세스를 드러내는 과거 18-20에 다른 바이러스 또는 종양 항원으로 사용되어왔다.

적응 적 전송 항원 특이 적 CD8 + T 세포의 분석에 상보, endogeno우리 T 세포 반응이 채용되어, 접종 네 형광 표지 된 MHC 클래스 I 분자로 이루어진 펩타이드 MHC 량체 착물, 펩티드 에피토프와 함께로드하는 펩티드 - 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 테트라 분석법 (21)으로 관찰 할 수 남기 항원 - 특이 적으로 TCR 및 레이블 CD8 + T 세포에 결합한다. 펩티드 - MHC 테트라 분석은 림프 및 말초 조직에서 항원 특이 적 CD8 + T 세포를 식별하기위한 단말기 부검 연구에서 또는 일련의 혈액 무로부터 얻은 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)를 가진 길이 방향 연구 중 수행 될 수있다. 펩티드와 MHC 테트라 림프구 묻힌 후, 유동 세포 계측법 분석하는 CD8 + T 세포의 빈도 사이의 CTL의 표현형 또는 정량 분석​​에 대한 상세에 대해 수행된다.

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Protocol

이 프로토콜에 설명 된 모든 실험은 기존의 정책과 지침에 따라 사용 및 미시간 대학에서 동물 케어 (UCUCA)에 대학위원회의 승인을 수행 하였다.

1. 합성 및 ICMVs의 특성 단백질 항원과 보조제 분자와 공동로드

  1. 믹스 1 : 1,2- dioleoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린 (DOPC) 및 1,2- dioleoyl- SN -glycero -3- phosphoethanolamine- N의 1 몰비 - [4- (p의 -maleimidophenyl) 부 티르 아미드] 클로로포름 (MPB), 배치 당 1.26 μmol으로 총 지질 양을 유지하는 (즉, DOPC 500 μg의과 MPB 630 μg의) 20 ㎖의 유리 바이알 (직경 = 28mm, 높이 = 61mm)이다.
  2. 원하는 농도에서 지질 용액에 같은 모노 포스 포릴 지질 A (MPLA) 또는 친 유성 염료 (예를 들어, DID)와 같은 지용성 약물을 추가합니다. 철저하게 추가 건조 nitroge으로 정화하여 유기 용매를 제거N 가스 및 진공 O / N에 따라 샘플을 배치.
  3. 수용성 약물 (예, 단백질 항원)을 함유 된 10 mM 비스 - 트리스 프로판 (BTP, pH를 7.0) 200 μL를 첨가하여 지질 막을 수화. 10 초 RT에서 1 시간 동안 매 10 분 소용돌이.
  4. 유리에서 내용, 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 바이알 도시 샘플 빙수 욕에서 및 125 W / 20kHz의 프로브 팁 초음파기에 설정 40 %의 강도를 사용하여 5 분 동안 연속적으로 초음파 처리 옮긴다.
  5. 각 배치 (작업 농도 2.4 mM)을, 소용돌이, 그리고 탁상 마이크로 원심을 사용하여 간단히 원심 분리기에 150 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT)의 4 μl를 추가합니다.
  6. 200 mM의 염화칼슘 (2) 40 μl를 추가하고 피펫 (작업 농도 33 mM)을 혼합. DTT와 지질 층 MPB가 함유 가교 할 수 있도록, 1 시간 동안 37 ° C에서 샘플을 인큐베이션.
  7. 원심 분리 샘플을 15 분 동안 20,000 XG에서 ddiH 2 O. 200 μL의 상등액을 제거하고 재현 탁
  8. 단계를 반복 1.7 원심 분리기 다시 두 번째 ddiH 2 O를 세척 한 후 상층 액에서 염화칼슘 2, 미 반응 DTT 및 캡슐화화물 물질을 제거합니다.
  9. ddiH 2 O 2 kDa의 폴리에틸렌 글리콜 - 티올 (PEG-SH)의 10 ㎎ / ㎖를 준비 PEG-SH 용액 100 ㎕의 각 샘플을 ICMV 재현 탁하고, 30 분 동안 37 ° C에서 배양한다.
  10. 두 ddiH 2 O 세척 (1.7 단계)을 수행하고, 4 ° C에서 최종 ICMV의 PBS의 펠렛 및 저장을 재현 탁. 입자가 장기간 보관 후 바닥에 침전 수 있으므로 앞서, ICMV 현탁액을 혼합, 사용할 수 있습니다.
  11. 입자의 특성 분석을 위해, 각 배치에서 ICMVs의 작은 분취 량 (~ 10 %)를 제거하고 2 ddiH O. 1 ml의 총 부피로 희석 개별적 제타 세포 측정 및 입경 분산도 지수, 및 DLS 및 (제조사의 프로토콜에 따라) 제타 전위 측정 장치를 이용하여 시료의 제타 전위의 단일 샘플을 놓는다.

의 림프절 배수 2. 시험 공 초점 현미경으로 ICMVs을 형광 - 태그

  1. ICMVs의 준비 형광 표지 된 항원과 친 유성 형광 염료와 함께로드
    1. 제조자의 지시에 따라, 난 알부민 알렉사 형석 555 숙신 에스테르와 반응과 같은 형광 표지 된 단백질을 준비한다.
    2. 지질 껍질에 형광 태그 ICMVs를 준비하려면, 친 유성 형광 염료 (예를 들면, 1,1'- 디 옥타 데실 3,3,3- ', 3'-Tetramethylindodicarbocyanine, () DID) (지질 필름의 제조시 단계를 추가 1.2) 0.05 % 몰 지질의 양에. 지질 필름 수화 (단계 1.3), 형광 표지 된 항원을 포함하는 사용 버퍼, 완벽한 ICMV 합성 단계 1.4-1.11에 설명 된대로.
  2. 꼬리 기지에서 나노 입자의 피하 투여
    1. 유도 챔버 U 구비 제어 흐름 증발기를 사용하여 마우스를 마취IACUC에 따라 3 % 이소 플루 란과 산소 유량 1.5 L / 분 tilizing 동물 프로토콜을 승인 하였다. 마우스가 무의식되면, 주사 부위에 최적의 액세스를 허용하고 동물에게 불편 함을 최소화하기 위해 오프 입고 마취 신속 전에 다음 단계를 수행한다. 대안 적 마취를 유지하도록 적절한 피팅 노즈콘을 사용한다. 생쥐 이상 5 분 동안 마취 경우, 시술 후 자극을 최소화해야 눈 윤활유를 적용.
    2. 살균 및 피하 바늘을 가시화하는 데 사용될 수 보이는 피부의 작은 패치를 노출 모피 부품을 젖은 머리카락을 습윤 70 % 에탄올로 꼬리의 기부를 스프레이.
    3. 목적하는 항원의 양과 PBS에 접종 용량 100 ㎕ 당 보조제를 함유하는 입자 분사 현탁액을 제조 (예를 들어, 10 μg의 OVA 및 사출 량 100 ㎕ 당 0.3 μg의 MPLA는 과거 6,9 사용되고있다).
    4. 입자 서스펜션 INT 그리기OA의 27 ~ 29 G 바늘과 주사기와 꼬리의 기지에서 바늘을 삽입 (~ 헤어 라인에서 5mm) 경사와 함께 위로 향하게 입자 서스펜션 (22)의 50 μl를 주입.
    5. 과도한 역류를 방지하고 바늘을 뽑아 동점 압력 몇 초 동안 기다립니다. 모두 배수 서혜부 림프절을 대상으로 꼬리베이스의 반대편에 주사를 반복합니다.
  3. 공 초점 현미경으로 림프절 저온부의 준비 및 시험.
    1. IACUC 동물 프로토콜을 승인에 따라 유도 기흉 다음 이산화탄소 질식으로 마우스를 안락사. Bedoya 23에서 입증 된 프로토콜에 따라 서혜부 림프절을 추출하고 4 ℃의 PBS 1 ml의 조직을 배치하여 피를 씻어.
    2. 조직과 조직에서 PBS를 흡수하여 조직 cryomolds에 조직을 배치 (10 × 10 × 5mm 3) OCT를 매체 (24)를 동결 정상에 미리 채워진. 스냅 TIS 동결30 초 동안 액체 질소에 블록을 고소. 또한, 30 분 동안 드라이 아이스에 조직 블록을 배치합니다. ° C의 냉동고에서 -80 냉동 조직을 저장합니다.
    3. -20 ° C (24)로 설정 저온 유지 장치에 5 ~ 10 μm의 두께 조직 절편을 잘라.
    4. 필요한 경우, 면역 형광 라벨을 수행하고, 이전에 24 증명으로 공 초점 현미경으로 조직을 검사합니다.

항원 특이 3. 모니터링 확장은, 동물 전체 이미징 나노 입자 백신 후 CD8 + T 세포는 루시퍼 라제 발현

  1. OT-I / 인 Luc 형질 전환 마우스에서 OVA 특이 257-264, 루시퍼 라제를 발현하는 CD8 + T 세포의 분리
    1. 이산화탄소 질식과 OT-I / 뤽 형질 전환 마우스를 안락사와 IACUC에 따라 기흉 동물 프로토콜을 승인 유도한다. 췌장 (23)에서 조직을 떼어 조심스럽게 복강에 접근에 의해 멸균 방식으로 비장을 수확하고,조직 문화 후드에 전송을위한 4 ℃의 PBS + 2 % FBS 5 ml의 장소.
    2. (한 번에 3 비장까지) 50 ML 원뿔 원심 분리 관을 통해 70 μm의 나일론 스트레이너에 비장를 놓습니다. 3 ㎖ 주사기로부터 플런저를 사용하여 여과기를 통해 세포를 분쇄.
    3. 플런저 및 PBS + 2 % FBS와 스트레이너를 씻어 버린다. 300 x g에서 10 분간, 10 ㎖ / 50 ㎖ 튜브에서 비장에 전량 가져와 혈구 계산 세포 현탁액의 작은 샘플을 채취하고, 원심 분리기.
    4. 시판 자기 음성 선별 키트를 사용하여 제조사의 지침에 따라 CD8 + T 세포 집단을 분리.
    5. PBS로 세포를 세척 한 후, 절연 CD8 + T 세포의 수를 계산. 단리 된 CD8 + T 세포의 순도를 평가하기 위해, 다음 αCD8-APC 항체 20 μL를 추가하고, 10 분 동안 마우스 CD16 / 32 항체 (0.025 ㎎ / ㎖) 20 μL에 ~ 20,000-30,000 세포를 배양 (0.005 ㎎ / ㎖) 30 분 동안 품어. PEBSA V / w PBS에서 4 ° C에서 + 1 % 모든 배양을 rform. 유세포 분석 (25)을 수행합니다.
  2. 자신의 확장 후 예방 접종의 입양 격리 CD8 + T 세포의 전송 및 시각화
    1. 정맥 꼬리 정맥 주입 (22) (일 -1)를 통해 PBS의 200 μL 부피 1-10 × 105 세포를 투여함으로써 순진한 C57BL / 6 마우스에 절연 OT-I / 루크 CD8 + T 세포의 대체 전송을 수행. C57BL / 6 마​​우스에 그 모피와 검은 피부 패치를 감안하면 생물 발광 신호를 방해 할 수 있습니다, 면도 흰둥이 C57BL / 6 마​​우스는 이러한 연구에 이상적입니다.
    2. 이전 (2.2 절)을​​ 설명 어느 날 (0 일) 후, 백신을 관리 할 수​​ 있습니다.
    3. 복강 PBS의 300 μL 부피 kg 마우스의 체중 당 150 mg의 루시페린를 관리. 10 분 후 (단계 2.2.1 에서처럼) 이소 플루 란 마취 생쥐 5-10 분 w위한 생물 발광 신호를 취득하여 OT-I / 루크 CD8 + T 세포를 시각화전체 동물 이미징 시스템 i 번째 (IVIS는, 자세한 지침에 대한 윌슨 (26) 참조). 종 연구에 필요한만큼 반복합니다.

분석 용 PBMCs를 항 MHC 펩타이드 테트라 머 염색 항원 특이 적 CD8 + T 세포

주 : 다음 프로토콜 절차 적응 적 대체하지 않고 전사 OT-I / 루크 CD8 + T 세포 또는 C57BL / 6 마​​우스로 전송 C57BL / 6 마​​우스를 이용하여 수행 될 수있다.

  1. 접종 후, 원하는 시점에서, K 2 EDTA로 피복 튜브 턱밑 출혈 기법 27 통해 마우스에서 혈액의 약 100 μL (4-6 방울)을 수집하고 응고를 방지하기 위해 여러 번 반전.
  2. , 마이크로 원심 튜브에 혈액 100 ㎕를 이동시켜 용해 완충액 1 ㎖를 추가하고, 적혈구 (적혈구)를 제거하기 위하여 2 ~ 3 분 동안 배양. 원심 분리기 샘플 1,500 XG에 5 분 상층 액을 제거합니다. 여전히 펠렛 경우(적혈구의 불완전한 제거를 나타내는) 적색 ppears는, 용해 완충액의 짧은 인큐베이션 (<1 분)으로 분해하는 단계를 반복한다.
  3. 5 분 동안 1,500 XG에서 1 (/ BSA V W PBS + 1 %) 외과 버퍼 ㎖의 원심 분리기와 나머지 PBMC를 씻으십시오.
  4. 기음 뜨는 및 바인딩 비특이적과 FcRγ 쇄 매개 항체를 차단하는 마우스 CD16 / 32 항체의 20 μL의 샘플 (0.025 ㎎ / ㎖)을 재현 탁. 실온에서 10 분 동안 품어.
  5. 4 ml의 둥근 바닥 외과 튜브에의 microcentrifuge 튜브에서 세포를 전송합니다. 각 샘플에 대한 제조업체의 사양에 따라 OVA 테트라 머 - SIINFEKL-PE의 용액 B H-2K의 20 μl를 추가하고 얼음에 30 분 동안 품어.
  6. 항체 칵테일을 준비합니다 (예를 들어, αCD8-APC, αCD44-FITC 및 αCD62L-PECy7 항체 (각각 0.005, 0.005, 0.002 ㎎ / ㎖ 농도)). 각 실험 시료 20 μl를 추가하고 얼음에 20 분 동안 품어. 라하여 하나의 형광 컨트롤을 준비위에 표시된 농도에서 각각의 형광 표지 된 사량 또는 항체와 세포를 beling.
  7. FACS 완충액으로 2 회 세척하고 DAPI의 2 μg의 / ㎖를 포함하는 외과 버퍼의 마지막 펠렛을 재현 탁. 분석 (자세한 내용과 예제는 Scheffold (25)에서 찾을 수있다) 세포 계측법 셀은 흐름에 대한 준비가되어 있습니다.

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Representative Results

ICMVs의 합성에 관련된 단계는도 1 내지 6에 도시된다. 간략하게, 모든 친 유성 약물 또는 형광 염료를 함유하는 지질 막이 친수성 약물의 존재 하에서 수화된다. 이러한 칼슘과 같은 가의 양이온은, 다중 층 소포에 음이온 성 리포좀의 융합을 드라이브에 추가됩니다. DTT 등, 지질 층 apposing, 마지막 외부 말레이 미드 그룹을 나머지의 "스테이플"말레이 미드 기능화 지질에 첨가되는 가교제는 다이 티올, 티올-PEG 잔기와 반응에서 급냉된다. 각 배치의 작은 부분은 용이 DLS 및 제타 전위 분석 시스템과 입경 분산도 지수, 및 제타 전위를 측정함으로써 품질 제어 측정을 실시 할 수있다. 그 결과 입자는 OVA-캡슐화 P에 대한 평균 130 ± 20 나노 미터의 크기, 0.22 ± 0.02의 다 분산 지수 및 -54 ± 3 MV의 제타 전위와 상대적으로 균일하다기사 (그림 1B 및 1C). 입자의 건조 중량을 측정 입자의 전형적인 수율은 ~ 50 % 6입니다.

전술 한 프로토콜을 사용하여, ICMVs는 생체 내에서 항원 전달 및 나노 입자의 시각화를 허용 형광 표지 된 단백질 항원과 친 유성 형광 염료와 공동으로로드 될 수있다. 가용성 형태에 대 ICMVs에서 항원 전달의 패턴을 비교하려면, C57BL / 6 마​​우스 (100) 중 수용성 또는 ICMV 제제를 표지 않았고, 배수 서혜부 림프절에 OVA AlexaFluor555-태그의 μg의 다양한에서 적출에 꼬리 기지에서 SC를 투여 하였다 DLN 조직 냉동 섹션의 준비를위한 시간을 가리 킵니다. 공 초점 현미경으로 시각화 수용성 항원 신속하게 4 시간 내 dLNs에 도달뿐만 아니라, 24 시간 (그림 2) 7 매우 빠르게 지워 졌음을 지적했다. 대조적으로, OVA로드 ICMVs이 계속 누적하여 24 시간에 의해 dLNs의 외주에서 검출 된dLNs에서 OVA-ICMVs 다량 증착, 4 일째 검사로서 (도 2). 공 초점 현미경은 AlexaFluor555-태그 OVA의 공동 현지화를 보여 ICMVs이 ICMVs 7 내에서 캡슐화 단백질 항원 및 기타 면역 제의 안정 공동 배달을 허용 할 것을 제안, dLNs 내 ICMVs을 표지 않았다.

OT-I / 루크 트랜스 제닉 마우스에서 CD8 + T 세포의 분리는 용이하게 3도. ~ 8-12 × 106 세포를 마우스 비장 당 수득 시판 자기 음성 선별 키트 수행을 적응 적으로 전송 된 C57BL / 6 마우스를 도시 할 수있다 5 × 10 5 OT-I / 뤽 CD8 + T 일 -1에 세포 및 10 μg의 OVA의 및 수용성 또는 ICMV 제제에 하나 MPLA의 0.3 μg의의 SC 관리에 0 일에 예방 접종. IVIS와 생물 발광 영상은 예방 접종을 최소화 OT-I / 뤽 신호를 보여 주었다 0 이전에 하루에 수행. 그러나, 4 일 후 예방 접종에 의해, 마우스는 예방 접종OVA로 / MPLA-ICMVs은 꼬리베이스 영역 (28) 배수 림프절입니다 서혜부 림프절 내에서 강력한 생물 발광 신호를했다. 대조적으로, 백신의 가용성 형태로 면역화 된 마우스는 서혜부 dLNs 내의 OT-I / 루크 CD8 + T 세포의 팽창 정도 감소 하였다.

모델 항원으로 OVA를 사용하면 면역 OVA 257-264 펩타이드 (SIINFEKL)에 특정 내생 CD8 + T 세포의 확장을 모니터링 할 수 있습니다. 예를 들어, C57BL / 6 마​​우스는 일 0, 21 일에 예방 접종을하고, SC 10 μg의 OVA의 관리 및 ICMVs 또는 가용성 형태 중 0.3 μg의 MPLA 35, 및 PBMC를에서 CD8 + T 세포 중 SIINFEKL 특정 CD8 + T 세포의 주파수 SIINFEKL-H-2K B 형 사량-PE. 그림 4A로 염색 한 PBMC의 유세포 분석에 의해 결정 하였다는 SIINFEKL-H-2K B 형 사량 하루 41 6 PBMC를에서 CD8 + T 세포 중 + 세포의 산포도 세포 계측법 대표하는 흐름을 보여줍니다. Figur을전자 4B는 SIINFEKL - 사량 + CD8 + T 세포 사이의 중앙 메모리 표현형과 CD62L + CD44 + 세포의 대표 산포도를 보여줍니다. 도 4c에 도시 된 PBMC를 매주 모니터링 ICMV 접종 상당히 강한 CD8 + T 세포 반응을 유도하는 반면 수용성 OVA 백신 CD8에서 피크 28 % SIINFEKL - 테트라 머 + T 세포를 달성하는, 항원 특이 적 CD8 + T 세포의 최소한의 팽창을 유발 지적 + 낮 T 세포군은 41 6. 여기에 제시 테트라 머 염색 프로토콜을 사용하여, 우리는 미처리 또는 PBS 처리 동물에서 (N = 15), 0.04 %의 OVA 특이 적 T 세포 ± 0.11 %의 배경 주파수를 관찰하고, 우리는 검출 할 (데이터 미도 p- 값 <0.005) 0.05 % ± 0.46 %로 낮은 항원 특이 적 CD8 + T 세포의 빈도는 통계적으로 유의 한 증가.

그림 1
(B)에 의해 분석 DLS 주제로 입도 분포가 도시되어있다. (C) 평균 유체 역학적 크기, 다 분산 지수 및 ICMVs의의 제타 전위 OVA와 MPLA가 표시됩니다와 공동은로드. 패널 (A)는 문 등. 6에서 수정되었습니다. 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
항원의 그림 2. 분석 공 초점 현미경으로 림프절로 배출. C57BL / 6 마우스 중 하나를 용액 또는 ICMVs에 (파란색으로 표시) 100 μg의의 형광 접합 (빨간색으로 표시) OVA 5 μg의 MPLA와 예방 접종을했다. 사타구니 배수 림프절이 표시된 시점에서 절제 저온 절단 및 공 촛점 현미경으로 이미지화 하였다. 대표 공 초점 현미경 사진이 표시됩니다. 핑크 신호는 OVA와 ICMVs의 공동 현지화를 나타냅니다. 이 그림은 문 등. 7에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. Monitorin예방 접종. C57BL / 6 알비노 생쥐 g 후 T 세포 팽창 적응 적 -1 일에 5 × 105 뤽 OT-I + CD8 + T 세포와 IV를 옮겼다. 0 일째에, 동물은 10 μg의 OVA 및 0.1 μg의 MPLA 중 수용성 또는 ICMV 제형으로 투여 하였다. 동물 이소 플루 란 마취 및 (150 ㎎ / ㎏, 300 μL 주입 IP) IVIS에 인수되었다 루크 + OT-1 CD8 + T 세포에서, 그리고 생물 발광 신호 루시페린과 함께 투여 하였다. 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 그림.

그림 4
ICMV 예방 접종 후 내인성 OVA 특정 CD8 + T 세포의 그림 4. 확장. C57BL / 6 마우스는 나도 10 OVA의 μg의 0.1 MPLA의 μg의 면역했다N 용액 또는 일 0, 21 ICMVs, 35 (화살표). 말초 혈액 단핵 세포 중에서 OVA 특이 적 T 세포의 빈도는 SIINFEKL-MHC-I 테트라 머 + CD8 + T 세포의 유세포 분석에 의해 시간이 지남에 따라 평가 하였다. (A) 41 일 쇼 SIINFEKL-MHC-I 테트라 머 + CD8 + T 세포와 (B) CD62L + CD44 + 세포, 중추 메모리 T 세포의 마커에 개별 마우스의 산포도 주제 유동 세포 계측법. (C) T 세포의 팽창 및 수축의 전반적인 동력학이 도시되어있다. 이 그림은 문 등. 6에서 수정되었습니다. 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

본 문서에서 제공된 프로토콜 ICMVs 불리는 합성과 새로운 지질 계 나노 입자 시스템의 특성을 설명하고, 항원 특이 적 CD8 + T 세포 반응을 유도하는 나노 입자 기반 백신 제형의 유효성을 검증하는 방법을 제공한다. ICMV 합성은 종종 손실의 결과로 일반적으로 제조하기위한 유기 용매를 필요로하는 다른 일반적으로 사용되는 고분자 나노 입자 시스템 (예를 들면, 폴리 (락 티드 - 코 - 글리콜 라이드) 산성 입자)에 비해 큰 장점 모든 수성 상태에서 완료 단백질 항원은 29, 30를 항원. 또한, 광범위한 성능 및 안정성에서 ICMVs 이점 따라서 장갑차 (31, 32) 내에서 동일한 세포 내 구획에 표적 항원과 보조제의 동시 전송을 허용하는, 소수성과 친수성을 모두 6 분자를 캡슐화. 모델 백신 나노 입자로 ICMVs를 사용하여, 우리가 절차를 설명했다(1) 나노 입자의 합성 및 특성화 dLNs에 나노 입자의 배수 (2) 검증, 및 항원 특이 적 CD8 + T 세포 반응의 추출 검사 (3) 비 침습적 생물 발광 공명 영상 법 (4) 펩티드 - MHC을 사용한 PBMC를에 사량 염색 분석.

그것은 그들이 큰 림프 배출에 영향을 생체 내 투여시의 흡수로 장갑차 수 특히 입자 크기 및 표면 전하를 들어, 배치마다 나노 입자 합성에 균일 성을 보장하기 위해 중요하다. DLS 및 제타 전위 분석은 입자 크기와 표면 전하에 대한 품질 검사의 빠른 방법을 제공한다. 개별 입자의 형태에 대한 상세한 분석을 위해, 이들 기술들은 이러한 유리화 수성층 6,33,34에서 "소프트"입자의 형태를 유지 극저온 전자 현미경 (EM 크라이)와 같은 고해상도 전자 현미경으로 보완 될 수있다 . 항원과 adjuv의 캡슐화 효율개미는 결정 및 합성 사이에 균일하게 유지해야합니다. 단백질 항원이 밴드의 강도를 기반으로 absorbance- 형광 기반의 단백질 정량 키트를 사용하여 정량화, 또는 (36) 염색 SDS-PAGE (35)와 쿠마 또는은을 이용하여 분석하고 정량화 할 수있는 반면 같은 MPLA와 같은 보조제는, 형광 6 태그 할 수 있습니다 . 최적의 반응성이 완료 합성에 필요하므로 입자 준비 불일치, 만료되거나 잘못 저장된 시약에서 발생할 수 있습니다. 이를 위하여, 말레이 미드와 티올 - 관능 화 시약은 빈번한 동결 - 해동 사이클없이 -80 ° C에서 작은 분취 량으로 보관한다.

보다 작은 100 나노 미터는 일반적으로 효율적으로 큰 입자 (500 ~ 2,000 ㎚) 반면, dLNs 13 림프관과 트래픽을 입력 것으로 생각된다 입자는 조직 상주 DC가 12,37하여 능동 수송을 필요로한다. 우리의 손에, 150-2에 이르기까지 유체 역학적 크기 ICMVs50 효율적으로 현지화 및 광범위한 CTL과 체액 반응 6,7의 결과로, DLN에 유지 nm의. 투여 24 시간 이내에 ICMVs는 dLNs에 낭하 부비동 식세포와 연관시키고, 유세포는 일 (1) 상에 수행되는 분석 4 dLNs 내의 대부분 ICMVs가 랑게르한스과 관련된 입자의 단지 작은 부분 LN 상주 장갑차에 의해 흡수 된 것으로 나타났다 및 피부 수지상 7. 이러한 결과는 수동 수송 dLNs에 ICMV 밀매의 주요 모드입니다 것으로 나타났다. 이 연구는 dLNs 자신의 현지화 및 유통 패턴을 묘사하기 위해 형광 표지 된 나노 입자와 단백질 항원을 이용했다. 저온 절단 dLNs의 공 초점 현미경 LN 구조의 식별을위한 추가적인 면역 조직 화학을 할 수 있습니다 (예를 들어, GL-7 배 중심의 표현) 및 배합 구성 요소 (예를 들어, 수지상 세포와 상호 작용하는 세포 - 중 CD11c, 대 식세포 - F4 / 80, CD169, 및 B- 셀 & #8211; B220) 7,9. 이 기술은 7,9를 입자의 흡수에 대한 책임 장갑차의 서브 세트를 서술하기 dLNs로부터 수확 된 세포의 유세포 분석과 병렬로 수행 될 수있다 또는 전체 동물 이미징 형광 신호가 강하고 조직자가 형광 신호가 간섭하지 않는 것을 제공 dLNs 38,39로 주사 부위에서 백신 전달을 정량한다.

효과적인 면역 강력한 활성화 접종 하였다 생물 발광, 항원 특이적인 트랜스 제닉 T 세포의 대체 전송 후에 전신 생물 발광 이미징에 의해 추적 될 수있는 항원 특이 적 세포 독성 T 세포의 확장을 필요로한다. 이 방법의 추가 장점은 따라서 면역 학적 분석에 필요한 동물의 수를 감소 힘드는 세포 분리 procedur의 사용을 피하고, 장시간 동일한 동물에서 CTL 매매 반복 시각화 전위ES. 이러한 영상 기술을 이용하여, 우리는 최근 ICMVs의 폐 투여는 단백질 항원과 면역 제와 공동로드 시연 폐에서 항원 특이 적 CD8 + T 세포 및 종격동 림프절 및 원위부 점막 조직에의 CTL의 후속 보급 유력한 추출에 주도 , 파이어 패치, 맹장, 및 질 기관 (9)을 포함. 유세포이 새로 확장 CD8 + T 세포가 4 β 7 + 인테그린 표현과 점막 바이러스 도전 (9)에 대한 중재 보호 면역 반응을 α 특징으로하는 "점막 호밍"표현형으로 각인 된 것으로 나타났다 분석. 생물 발광 CD8 + T 세포의 전체 동물 촬상 또한 최근 Hailemicheal 외., 종양 항원 펩티드가 불완전 프로 인트 아쥬 반트로 제제화 것을 증명에 의해 사용되었다 (IFA는 수 중유 에멀젼) 부위에서 T 세포의 격리를 초래 주사멀리 종양 덩어리에서 백신 "창고"로, T 세포 기능 장애 및 삭제 (40)로 이어지는.

테트라 머 염색은 다양한 백신 제형 (21)로부터 생성 된 내인성 CTL 반응의 수준을 정량화하기 위해 과거에 널리 이용되고있다. 이 기술은 일반적으로 특정 관련성 종양 - 관련 항원 (41, 42)에 대한 CTL 반응을 확인하기 위해 초기 인간 암 면역 치료 임상 시험에서 사용된다. PBMC를 쉽게 마우스로부터 수거하고, 유동 세포 계측법에 대해 제조 될 수있다; 따라서 더 광범위한 분석을 필요로하기 전에 암 모델에서 종양 내에서 언급 한 바와 같이하지만, 인해 창고 형성 백신 세포 현지화에 T 세포 확장의 전체 범위를 공개하지 않을 수 있습니다. 유동 세포 계측법과이 방법의 호환성 메모리 마커 (CD44, CD62L, CD127,과 Bcl-2 및 KLRG-1)와 항원 특이 적 T 세포의 판정 이펙터 중앙 메모리 및 이펙터 메모리 CE를 구별 할 수 있도록(최근 리뷰 (46, 47)에 요약 된 바와 같이) 테트라 + T 세포 (43) 또는-오래 지속 조직 상주의 CTL 44, 45 중 LLS. 매우 팽창 된 항원 특이 적 T 세포 면역 48,49 고갈의 표시를 나타낼 수 있기 때문에, 테트라 머 염색 분석법 CTL 반응의 초기 평가를 제공한다. CTL 반응의 기능적 평가는 최소의 에피토프와 림프구의 생체 자극 후 효소 결합 된 Immunospot (ELISPOT) (50) 또는 세포 내 사이토 카인 염색 (51)뿐만 아니라 퍼포 린 및 그랜 자임 B (52)와 세포의 세포 내 농도를 측정하여 검사하는 사이토 카인 방출에 의해 수행 될 수있다 탈과립 53시 CD107a 및 CD107b의 표현. 또한, 기능의 CTL의 세포 용해는 직접 시험 관내 또는 생체 내에서 수행 54-56 CTL 세포 독성 분석법으로 평가할 수있다.

체액 성 면역 반응의 유도나노 입자 백신 접종이 CD8 + T 세포와 병렬로 공부하실 수 있습니다 후 여기에 제시된 분석. 항체 친화도 및 에피토프 인식의 폭이 카오 트로픽 제를 사용하여 ELISA 프로토콜을 수정하여 평가 될 수있는 반면 항체가이 효소 면역 분석법 (ELISA)을 전통적인 방법에 의해 분석 될 수있다 (예를 들면, 우레아) 항체 동안은 결합 기판 및 기판, 각각 7과 같은 항원 내에서 하위 도메인의 사용. 강력한 체액 성 반응의 도출은 난포 도우미 CD4 + T 세포의 확장 (T FH) 57이 필요합니다. 입자 백신 접종에 응답 T의 FH 세포의 확장을 조사하기 위해, 여기에 제시된 프로토콜은 쉽게 순진받는 마우스로 입양 세포 전송 다음 OT-II 형질 전환 마우스에서 항원 특이 CD4 + T 세포의 분리를 위해 적용 할 수 있습니다. 접종 후, 림프 조직을 채취 할 수 있고, 유세포 분석을 저지하는 분석(자신들의 CD4 + CXCR5 + PD-1 + 표현형에 의해 식별) 항원 특이 적 T 세포의 FH의 광산 확장 7.

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Disclosures

퍼킨 엘머는이 문서의 발행시 발생하는 생산 비용을 제공했다.

Acknowledgments

이 연구는 국립 보건 연구소 1K22AI097291-01을 부여하여 지원 대상 수 UL1TR000433에서 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 번역 상 과학을 전진을위한 국가 센터로했다. 우리는 또한 백신 나노 입자 및 OT-I / 뤽 형질 전환 마우스의 초기 작업에 기여하기위한 프레드 허친슨 암 센터에서 MIT 교수 마티아스 스테판에서 교수 대럴 어바인을 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB) Avanti Polar Lipids, INC. 870012
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, INC. 850375
Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA) Avanti Polar Lipids, INC. 699800
20 ml glass vials Wheaton 0334125D
Symphny Vacuum Oven VWR 414004-580
Ovalbumin (OVA) Worthington 3054
Bis-Tris Propane (BTP) Fisher BP2943
Q125 Sonicator (125 W/20 kHz) Qsonica Q125-110
Dithiothreitol (DTT) Fisher BP172
2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH) Laysan Bio MPEG-SH-2000-1g
Malvern ZetaSizer Nano ZSP  Malvern
ZetaSizer Cuvettes Malvern DTS1070
2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy
1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID) Life Technologies D-7757
Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS) Life Technologies A37571
Tissue-Tek OCT freezing medium  VWR 25608-930
Tissue Cryomolds VWR 25608-922
3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging
C57BL/6 mice Jackson 000664
Albino C57BL/6 mice Jackson 000058
OT-1 C57BL/6 mice Jackson 003831
70 μm nylon strainer BD 352350
EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit StemCell 19853
IVIS® whole animal imaging system Perkin Elmer
4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells
K2EDTA tubes BD 365974
ACK lysis buffer Life Technologies A10492-01 
Anti-CD16/32 Fc Block Ebioscience 14-0161-86
H-2Kb OVA Tetramer MBL TS-5001-1C
Anti-CD8-APC BD 553031
Anti-CD44-FITC BD 553133
Anti-CD62L-PECy7 Ebioscience 25-0621-82
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) SIGMA D8417-10MG
CyAn Flow Cytometer Beckman Coulter
FlowJo Software FlowJo

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