טכניקות הדמיה כל-החיה והזרימה Cytometric לתגובות ניתוח של אנטיגן ספציפי CD8 + T תא לאחר Nanoparticle חיסון

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ochyl, L. J., Moon, J. J. Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination. J. Vis. Exp. (98), e52771, doi:10.3791/52771 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

פיתוח חיסון מסורתי בעיקר העסיק את הגישה האמפירית של ניסוי וטעייה. עם זאת, עם ההתפתחות האחרונה של מגוון רחב של ביו-חומרים וגילוי של גורמים מולקולריים של הפעלה חיסונית, ניתן כיום לעצב באופן רציונלי ניסוחים חיסון עם רמזי biophysical וביוכימיים הנגזרים מגורמי המחלה 1,2. בפרט, פלטפורמות משלוח הסמים חלקיקים שונות נבדקו כנישאי חיסון כפי שהם יכולים להיות שותף מלא באנטיגנים מקטע וסוכני immunostimulatory, להגן על רכיבי חיסון משפלה, ולשפר את שיתוף מסירתם לאנטיגן תאי מציגים (נגמ"שים) המתגוררים בהלימפה בלוטות (LNs), ובכך למקסם את הגירוי וההפעלה 3-5 חיסוניים. בדו"ח זה, אנו מתארים את הסינתזה של מערכת "מחקה לפתוגן" ננו-חלקיקים, המכונה שלפוחית ​​interbilayer-crosslinked multilamellar (ICMVs), שכבר הוכיח בעבר כplatfor חיסון חזקמ 'לדיבוב של הלימפוציטים חזקים T ציטוטוקסי (CTL) ותגובות חיסוניות הלחות בשני תאי רקמה מערכתיים ורירית 6-9. בפרט, חיסון עם ICMVs הושג משופר באופן משמעותי את רמות נוגדנים בסרום נגד אנטיגן מלריה, בהשוואה לחיסון עם adjuvants הקונבנציונלי (לדוגמא, אלום וMontanide) 7 וגם עורר תגובות CTL חזקות נגד תאים סרטניים ודגמי אתגר נגיפיים בעכברים 9. כאן, באמצעות ICMVs כמערכת חיסון ננו-חלקיקי מודל, אנו מתארים שיטות לאפיון של ננו-ניסוחים חיסון, כולל גודל חלקיקים ומדידות פוטנציאל זטה ומעקב של סחר בחלקיקים לLNs ניקוז (dLNs) ניצול ההדמיה confocal של רקמות cryosectioned 7. בנוסף, אנו מציגים שיטה של ניתוח הרחבת תגובות CTL בעכברים לאחר העברת מאמצת של תאי CD8 + T אנטיגן הספציפי להביע לוציפראז 9,10 מבוססת הדמיה כל-חיה. לבסוף, אנו דהצביעת tetramer סופר של תאים ההיקפיים mononuclear הדם (PBMCs) לכימות אורך של תגובות תא T אנדוגני בעכברים שחוסנו בחלקיקים 6,9.

ICMVs הוא ניסוח ננו-חלקיקים המבוססים על שומנים מסונתזים על ידי היתוך מבוקר של יפוזומים פשוטים למבני multilamellar, אשר לאחר מכן התייצבו כימי על ידי קבוצות ראש פוספוליפידים cross-linking פונקציונליות maleimide בתוך שכבות שומנים עם dithiol crosslinkers 6. ברגע שICMVs מסונתזים, חלק קטן של חלקיקים יכול לשמש כדי לקבוע את גודל חלקיקים ופוטנציאל זטה (כלומר, תשלום פני השטח של חלקיקים) עם פיזור אור דינמי מערכת (DLS) ומנתח פוטנציאל זטה. DLS אמצעי שינויים בפיזור אור בהשעיות חלקיקים, המאפשרים קביעת מקדם הדיפוזיה והגודל הידרודינמית של חלקיקים 11. השגת גודל חלקיקים עקבי מיצווה לסינתזה אצווה היא קריטיתמאז גודל חלקיקים הוא אחד הגורמים העיקריים המשפיעים על הניקוז לימפטי של חלקיקי חיסון לdLNs וספיגה סלולרית לאחר מכן על ידי נגמ"שים 12,13. בנוסף, ניתן להשיג פוטנציאל זטה על ידי מדידת המהירות של החלקיקים כאשר זרם חשמלי מוחל, המאפשרת קביעת ניידות electrophoretic של חלקיקים וחלקיקי משטח תשלום 11. הבטחת ערכי פוטנציאל זטה עקבית של חלקיקים היא חשובה שכן תשלום של חלקיקי משטח קובע יציבות colloidal, שבה יש השפעה ישירה על פיזור חלקיקים במהלך אחסון ולאחר in vivo ממשל 14,15. על מנת לעקוב אחר חלקיק הלוקליזציה לdLNs, יכול להיות מתויג ICMVs עם fluorophores הרצויה כולל צבעי lipophilic ואנטיגנים קוולנטית מתוייגים. בעקבות חיסון, יכולים להיות מורדמים עכברים בנקודות זמן שונים, dLNs כריתה, cryosectioned, וניתחו עם מיקרוסקופיה confocal. טכניקה זו מאפשרת הדמיה של דראי הלימפהנינג של שני נשאי חיסון ננו-חלקיקים ואנטיגן לdLNs. בנוסף יכולים להיות מוכתמים סעיפי הרקמות עם נוגדנים שכותרתו fluorescently ומנוצל כדי לקבל מידע נוסף, כגון סוגים של תאים הקשורים לאנטיגן והיווצרות מרכזים נבטי כפי שהראינו בעבר 7.

ברגע שסינתזת החלקיקים היא מותאמת והסחר לdLNs הוא אישר, חשוב לאמת דיבוב של in vivo הרחבת CTL. על מנת לנתח את הדיבוב של תאי CD8 + T אנטיגן הספציפי בתגובה לחיסון ננו-חלקיקים, שנוצלנו אנטיגן מודל, ovalbumin (OVA), עם OVA 257-264 פפטיד (SIINFEKL) epitope תא CD8 + T immunodominant, המאפשר ניתוח מפורט חיסוני של תגובות תא T אנטיגן הספציפי ל16,17 פיתוח חיסון ראשוני. בפרט, לחקור את הדינמיקה של התרחבות ונדידה של תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי, יש לנו שנוצרומודל עכבר כפול מהונדס על ידי חציית הגחלילית בלוציפראז להביע עכברים הטרנסגניים (לוק) עם עכברים הטרנסגניים OT-לי שיש תאי CD8 + T עם T-cell קולט (TCR) ספציפי לSIINFEKL (בשיתוף עם H-2K ב). מעכברי OT-I / לוק אלה, להביע לוציפראז, יכולים להיות מבודדים תאי OT-אני CD8 + T ומוכנה להעברת מאמצת לעכברי C57BL / 6 נאיביים. ברגע שהזרע, חיסון מוצלח עם חלקיקים המכיל OVA יגרום הרחבת תאי T הועברו, אשר יכול להיות במעקב על ידי ניטור אות פליטת אור עם 9,10 מערכת הדמיה חיה שלמה. טכניקת הדמיה זה לא פולשנית כל הגוף כבר בשימוש עם אנטיגנים נגיפיים או גידול אחרים ב18-20 העבר, חושפת תהליכים מעורבים בהרחבת T תא ברקמות הלימפה והפצה לרקמות היקפית באופן אורך.

משלים לניתוח adoptively תאי CD8 + T אנטיגן הספציפי הועברו, endogenoתגובות תא T לפרסם חיסון ניתן לבדוק עם מורכב פפטיד-גדול histocompatibility (MHC) assay tetramer 21, שבו מורכב tetramer פפטיד-MHC, מורכב מארבע כיתת MHC-מתויג fluorophore אני מולקולות עמוסות epitopes פפטיד, מועסק כדי לאגד TCR ותווית תאי CD8 + T באופן אנטיגן ספציפי. Assay tetramer פפטיד-MHC יכול להתבצע גם במחקרי נתיחה לאחר מות מסוף לזהות תאי CD8 + T אנטיגן הספציפי בהלימפה ורקמות היקפית או במחקרים ארוכי טווח עם תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) המתקבלים מהדם סידורי מושך. לאחר מכתים ימפוציטים עם tetramer פפטיד-MHC, cytometry זרימת הניתוח מבוצע ניתוחים מפורטים על הפנוטיפ של תאי-ההרג או כימות של התדר שלהם בין תאי CD8 + T.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים שתוארו בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת האוניברסיטה על שימוש וטיפול של בעלי חיים (UCUCA) באוניברסיטת מישיגן ומבוצעים על פי המדיניות והנחיות שנקבעה.

1. סינתזה ואפיון של ICMVs Co-עמוס חלבון Antigen וAdjuvant מולקולות

  1. לערבב 1: 1 יחס טוחנת של 1,2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (dOPC) ו1,2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [4 (-maleimidophenyl p) butyramide] (MPB) בכלורופורם, שמירה על סך סכום שומנים ב1.26 μmol ליצווה (כלומר, 500 מיקרוגרם של dOPC ו 630 מיקרוגרם של MPB) בבקבוקון 20 מיליליטר זכוכית (קוטר = 28 מ"מ וגובה = 61 מ"מ).
  2. להוסיף תרופות lipophilic, כגון השומנים monophosphoryl (MPLA) או צבעי lipophilic (למשל, האם), לפתרון השומנים בריכוז רצוי. ביסודיות להסיר את הממס האורגני על ידי טיהור עם nitroge יבש נוסףn גז והצבת הדגימות תחת ואקום O / N.
  3. מימה סרט השומנים על ידי הוספת 200 μl 10 פרופאן מ"מ BIS-טריס (BTP, pH 7.0) המכיל תרופות מסיסים במים (לדוגמא, אנטיגנים חלבון). וורטקס במשך 10 שניות כל 10 דקות במשך שעה 1 ב RT.
  4. העבר את התוכן מזכוכית בקבוקון לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר, דגימות מקום באמבט קרח-מים, וsonicate ברציפות במשך 5 דקות באמצעות עצמת 40% הגדרה בsonicator בדיקה-קצה / 20 kHz 125 W.
  5. הוסף 4 μl של 150 מ"מ dithiothreitol (DTT) לכל מנה (עובד ריכוז 2.4 מ"מ), מערבולת, ו צנטריפוגות בקצרה באמצעות microcentrifuge שולחן.
  6. הוסף 40 μl של 200 מ"מ CaCl 2 ולערבב עם פיפטה (עובד ריכוז 33 מ"מ). דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי לאפשר crosslinking של MPB המכיל שכבות שומנים עם DTT.
  7. צנטריפוגה דגימות 20,000 XG במשך 15 דקות, להסיר את supernatant, וגלול ב200 μl של ddiH 2 O.
  8. חזור על שלב 1.7 ו צנטריפוגות שוב לאחר שטיפת O השנייה ddiH 2 כדי להסיר CaCl 2, DTT unreacted, וחומרי מטען unencapsulated מsupernatant.
  9. הכן 10 מ"ג / מיליליטר של 2 kDa פוליאתילן גליקול-תיאול (PEG-SH) בddiH 2 O. Resuspend כל דגימת ICMV בפתרון של PEG-SH 100 μl ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  10. לבצע שני 2 O שוטף ddiH (שלב 1.7) וresuspend גלולה הסופי ICMV בPBS ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. לפני השימוש, לערבב את ההשעיה ICMV, כמו חלקיקים עשויים ליישב לתחתית לאחר אחסון ממושך.
  11. לאפיון של חלקיקים, להסיר aliquot קטן (~ 10%) של ICMVs מכל אצווה ולדלל באופן אינדיבידואלי בנפח כולל של 1 מיליליטר של ddiH 2 O. הנח מדגם יחיד בגודל Zetasizer חלקיקי תא ומידה, מדד polydispersity, ופוטנציאל זטה של ​​הדגימות באמצעות מערכת zeta פוטנציאל מדידה (על פי הפרוטוקול של היצרן) DLS ו.

2. בחינת לימפה צומת הניקוז של הקרינה מתויגות ICMVs עם מיקרוסקופיה confocal

  1. הכנת ICMVs עמוסה אנטיגן fluorophore מתויג וצבע ניאון lipophilic
    1. הכן חלבון מתויג fluorophore, כגון ovalbumin הגיב באסתר 555-succinimidyl אלקסה פלואוריד, על פי הוראות היצרן.
    2. כדי להכין ICMVs מתויג עם fluorophore במעטפת השומנית, להוסיף צבע lipophilic ניאון, (למשל, 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindodicarbocyanine, (לא)) שלב במהלך הכנת סרט השומנים ( 1.2) בשעה 0.05% כמות שומנים טוחנות. ללחות שומנים סרט (שלב 1.3), המכיל מאגר השימוש אנטיגן fluorophore מתויג, וסינתזת ICMV מלאה כפי שמתואר בשלבים 1.4-1.11.
  2. ממשל תת עורית של חלקיקים בבסיס זנב
    1. להרדים עכבר באמצעות זרימה מאדה מבוקרת מצוידים בתא אינדוקציה utilizing 3% isoflurane ו -1.5 ליטר / דקת זרימת חמצן על פי IACUC אישר פרוטוקול בעלי חיים. ברגע שהעכבר הוא מחוסר הכרה, בצע את השלבים הבאים במהירות לפני ההרדמה מתפוגג כדי לאפשר גישה אופטימלית לאתר של ההזרקה ולמזער אי נוחות לבעלי החיים. לחלופין, להשתמש בחרטום הולם נכון כדי לשמור על הרדמה. אם עכברים מורדמים למשך זמן ארוך יותר מ -5 דקות, להחיל סיכה העין דרושה כדי למזער גירוי לאחר ההליך.
    2. לרסס את בסיס הזנב עם אתנול 70% כדי לטהר ולהרטיב את חלק הפרווה השיער הרטוב לחשוף תיקון קטן של עור גלוי, אשר יכול לשמש כדי לחזות את המחט מתחת לעור.
    3. הכינו השעיה הזרקת חלקיקים המכילה כמות רצויה של אנטיגן ומשלים לשל מינון חיסון 100 μl בPBS (למשל, 10 מיקרוגרם OVA ו0.3 מיקרוגרם לMPLA של מינון הזרקה 100 μl נעשו שימוש ב6,9 העבר).
    4. צייר את int ההשעיה חלקיקיםמזרק OA עם מחט G 27-29 ולהכניס את המחט בבסיס הזנב (~ 5 מ"מ מקו השיער) עם השיפוע כלפי מעלה ולהזריק 50 μl של ההשעיה חלקיק 22.
    5. המתן מספר שניות ללחץ להשוות כדי למנוע חזרה זרימה מוגזמת ולמשוך את המחט. חזור על ההזרקה בצד השני של בסיס הזנב האחר למקד שני LNs מפשעתי הניקוז.
  3. הכנת cryosections בלוטה לימפה ובדיקה עם מיקרוסקופ confocal.
    1. להרדים את העכבר עם CO 2 מחנק, ואחריו pneumothorax המושרה על פי IACUC אישר פרוטוקול בעלי חיים. לחלץ LNs מפשעתי על פי פרוטוקול הפגין בבדויה 23 ולשטוף את הדם על ידי הצבת הרקמות ב 1 מיליליטר של 4 מעלות צלזיוס PBS.
    2. ספוג PBS מהרקמות עם רקמות ולמקם את הרקמה בcryomolds רקמה (10 x 10 x 5 מ"מ 3) מראש מלא לראש עם אוקטובר הקפאת 24 בינוניים. Snap להקפיא את TISלתבוע בלוק בחנקן נוזלי למשך 30 שניות. לחלופין, למקם את בלוק רקמה על קרח יבש למשך 30 דקות. אחסן רקמה קפוא במקפיא -80 מעלות צלזיוס.
    3. לחתוך קטעי רקמה 5-10 מיקרומטר עבים בcryostat להגדיר ב -20 ° C. 24.
    4. במידת צורך, לבצע תיוג immunofluorescence, ולבחון את הרקמה עם מיקרוסקופיה confocal כפי שהודגמה בעבר 24.

3. הרחבת ניטור של אנטיגן ספציפי, לוציפראז להביע תאי CD8 + T לאחר Nanoparticle חיסון עם כל חיה הדמיה

  1. בידוד של OVA -specific 257-264, תאי CD8 + T-לבטא לוציפראז מעכברים מהונדסים OT-I / לוק
    1. להרדים עכבר מהונדס OT-I / לוק עם CO 2 מחנק ולגרום pneumothorax לפי IACUC אישר פרוטוקול בעלי חיים. לקצור את הטחול באופן סטרילי על ידי הגישה חלל הצפק ובזהירות ניתוק הרקמה מהלבלב 23, ומקום 5 מיליליטר של 4 מעלות צלזיוס PBS + 2% FBS להעברה למכסת מנוע בתרבית רקמה.
    2. מניחים את הטחול במסננת ניילון 70 מיקרומטר על שפופרת 50 מיליליטר חרוטי צנטריפוגות (עד 3 טחולים בכל פעם). באמצעות בוכנה של מזרק 3 מיליליטר, לטחון את התאים דרך המסננת.
    3. שטוף את הבוכנה ואת המסננת עם PBS + 2% FBS וזורקים. תביא את הנפח הכולל עד 10 מיליליטר / טחול בשפופרת 50 מיליליטר, לקחת דגימה קטנה של ההשעיה התא לספור עם hemocytometer, וצנטריפוגות במשך 10 דקות ב 300 x גרם.
    4. באמצעות ערכת בחירה זמינה מסחרי מגנטית שלילית, לבודד את אוכלוסיית תאי CD8 + T על ידי ביצוע הוראות היצרן.
    5. לאחר שטיפת תאים עם PBS, לספור את מספר תאי CD8 + T מבודדים. כדי להעריך טוהר של תאי CD8 + T המבודדים, דגירה ~ 20,000-30,000 תאים ב -20 μl של CD16 עכבר / 32 נוגדן (0.025 מ"ג / מיליליטר) במשך 10 דקות, ולאחר מכן להוסיף 20 μl של נוגדן αCD8-APC (0.005 מ"ג / מיליליטר) דגירה במשך 30 דקות. פrform כל incubations על 4 מעלות צלזיוס בPBS + 1% w / v BSA. ביצוע ניתוח cytometric זרימה 25.
  2. העברת מאמצת של תאי CD8 + T מבודדים ויזואליזציה של פוסט הרחבת החיסון שלהם
    1. לבצע העברת מאמצת של תאים המבודד OT-I / לוק CD8 + T לC57BL / 6 עכברים נאיביים על ידי מתן 1-10 × 10 5 תאים בנפח 200 μl של PBS באמצעות הזרקה לוריד זנב וריד 22 (יום -1). בהתחשב בכך שתיקוני הפרווה ועור שחור בעכברי C57BL / 6 עלול להפריע לאות bioluminescent, לבקן המגולח עכברי C57BL / 6 הם אידיאליים עבור מחקרים אלה.
    2. לאחר יום אחד (יום 0), לנהל את החיסון כפי שתואר לעיל (סעיף 2.2).
    3. נהל 150 מ"ג של luciferin למשקל גוף עכבר קילוגרם intraperitoneally ב300 μl נפח של PBS. לאחר 10 דקות, להרדים את העכברים עם isoflurane (כמו בשלב 2.2.1) ולדמיין תאי OT-I / לוק CD8 + T על ידי רכישת אות פליטת אור למשך 5-10 דקות wה- i מערכת הדמיה חיה שלמה (IVIS; מתייחס לווילסון 26 להדרכה מפורטת). חזור על פי צורך למחקרים ארוכי טווח.

תאי CD8 + T 4. פפטיד-MHC tetramer הכתמה של PBMCs לניתוח של אנטיגן ספציפי

הערה: הליך הפרוטוקול הבא יכול להתבצע באמצעות או / 6 עכברים C57BL הועברו adoptively עם תאי OT-I / לוק CD8 + T או C57BL עכברים / 6 ללא העברת המאמצת.

  1. בנקודת זמן רצויה לאחר חיסון, לאסוף כ -100 μl דם (4-6 טיפות) מעכברים באמצעות טכניקת דימום submandibular 27 לתוך צינור מצופה K 2 EDTA ולהפוך כמה פעמים כדי למנוע קרישה.
  2. העבר את דם 100 μl לצינור microcentrifuge, להוסיף 1 מיליליטר של חיץ תמוגה, ודגירה של 2 עד 3 דקות כדי להסיר תאי דם אדומים (RBCs). צנטריפוגה דגימות במשך 5 דקות ב 1500 XG ולהסיר את supernatant. אם גלולה עדייןppears האדום (המצביע על ההסרה חלקית של תאי דם אדום), לחזור על שלב תמוגה עם דגירה קצרה (<1 דקות) של מאגר תמוגה.
  3. שטוף את PBMCs נותר עם 1 מיליליטר של חיץ FACS (PBS + 1% w / v BSA) וצנטריפוגות ב 1500 XG במשך 5 דקות.
  4. לשאוב supernatant ו resuspend המדגם ב -20 μl של CD16 / 32 נוגדן עכבר (0.025 מ"ג / מיליליטר) כדי לחסום נוגדן ספציפי ותיווך FCR מחייב. דגירה של 10 דקות ב RT.
  5. העבר את התאים מצינורות microcentrifuge ל 4 מיליליטר צינורות FACS סיבוב תחתון. הוסף 20 μl של H-2K ב פתרון OVA tetramer-SIINFEKL-PE לפי המפרט של היצרן לכל דגימה ודגירה במשך 30 דקות על קרח.
  6. הכן את הקוקטייל של הנוגדנים (למשל, נוגדני αCD8-APC, αCD44-FITC, וαCD62L-PECy7 (0.005, 0.005, 0.002 ומ"ג / מיליליטר ריכוז, בהתאמה)). הוסף 20 μl לכל דגימת ניסוי, ודגירה של 20 דקות על קרח. הכן בקרות fluorophore יחידים על ידי להbeling תאים עם כל tetramer מתויג fluorophore או נוגדן בריכוז שצוין לעיל.
  7. לשטוף 2 פעמים עם חיץ FACS וresuspend גלולה הסופי במאגר FACS המכיל 2 מיקרוגרם / מיליליטר של DAPI. התאים מוכנים כעת לcytometry זרימה (ניתן למצוא את פרטים ודוגמאות בScheffold 25) ניתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הצעדים מעורבים בסינתזה של ICMVs הם באיור 1 6. בקצרה, סרט שומנים המכילים כל תרופות lipophilic או צבעי ניאון הוא התייבשות בנוכחות תרופות הידרופילי. קטיונים דו ערכיים, כגון Ca 2 +, מתווספים לנהוג היתוך של יפוזומים אניוני לתוך שלפוחית ​​multilamellar. Dithiol crosslinker, כגון DTT, הוא הוסיף שומנים פונקציונליות maleimide "מצרך" על apposing שכבות שומנים בדם, ולבסוף נותרו קבוצות maleimide חיצוניות הרווה בתגובה עם moieties-PEG thiolated. חלק קטן של כל מנה יכול להיות נתונה בקלות למדידות בקרת איכות על ידי קביעת גודל חלקיקים, מדד polydispersity, ופוטנציאל זטה עם מערכת ניתוח פוטנציאל זטה DLS ו. החלקיקים וכתוצאה מכך הם הומוגני יחסית עם גודל ממוצע של 130 ± 20 ננומטר, מדד polydispersity של 0.22 ± 0.02, ופוטנציאל זטה של ​​-54 ± 3 mV לעמ מתמצת-OVAמאמרים (איור 1 ו1C). תשואה אופיינית של חלקיקים, שנמדדה במשקל יבש של חלקיקים, היא ~ 50% 6.

שימוש בפרוטוקול שתואר לעיל, ICMVs יכול להיות שותף מלא באנטיגן חלבון fluorophore מתויג וצבע lipophilic ניאון, המאפשר הדמיה של משלוח אנטיגן וננו-חלקיקי in vivo. כדי להשוות את דפוסי אספקת אנטיגן בצורה מסיסה לעומת בICMVs, עכברי C57BL / 6 ניתנו sc בבסיס זנב עם 100 מיקרוגרם של AlexaFluor555 מתויג OVA או בLNs מפשעתי או לא מסיס שכותרת הניסוחים ICMV, וניקוז היו נכרת בשונה נקודות זמן להכנת cryo-סעיפי רקמות DLN. הדמיה עם מיקרוסקופיה confocal ציינה כי אנטיגן המסיס הגיע במהירות dLNs בתוך 4 שעות, אלא גם נוקה בקצב מהיר מאוד עם 24 שעות (איור 2) 7. לעומת זאת, ICMVs טעון OVA התגלו בפריפריה של dLNs על ידי 24 שעות, עם הצטברות המשךכבדק ביום 4, הפקדת סכום גדול של OVA-ICMVs בdLNs (איור 2). micrographs confocal הראה גם שיתוף לוקליזציה של OVA מתויג AlexaFluor555 ועשה כותרת ICMVs בתוך dLNs, המצביע על כך ICMVs לאפשר שיתוף משלוח יציב של אנטיגנים חלבון וסוכני immunostimulatory אחרים כמוס בתוך 7 ICMVs.

בידוד של תאי CD8 + T מעכבר מהונדס OT-I / לוק יכול להתבצע בקלות עם ערכת הבחירה זמינה המסחרית המגנטית השלילית, מניב ~ 8-12 x 10 6 תאים לכל טחול עכבר. איור 3 מראה C57BL / 6 עכברים הועברו adoptively עם 5 x 10 5 תאי OT-I / לוק CD8 + T ביום -1, וחוסן ביום 0 עם ממשל sc של 10 מיקרוגרם של OVA ו -0.3 מיקרוגרם של MPLA גם בניסוחים מסיסים או ICMV. הדמיה פליטת אור עם IVIS בוצעה ביום 0 לפני החיסון הראה אות OT-I / לוק מינימאלי. עם זאת, יום 4 לאחר חיסון על ידי, עכברים שחוסנועם OVA הייתה / MPLA-ICMVs אות פליטת אור חזקה בתוך LNs מפשעתי, שהם LNs ניקוז באזור בסיס הזנב 28. לעומת זאת, עכברים שחוסנו עם הצורה מסיסה של החיסון הראו הרבה הרחבה מופחתת של תאי OT-I / לוק CD8 + T בתוך dLNs מפשעתי.

באמצעות OVA כאנטיגן מודל מאפשר ניטור של התרחבות של תאי CD8 + T אנדוגני ספציפיים לפפטיד immunodominant OVA 257-264 (SIINFEKL). לדוגמא, C57BL / 6 עכברים שחוסנו בימים 0, 21, ו -35 עם ממשל sc של 10 מיקרוגרם OVA ו -0.3 מיקרוגרם MPLA באו ICMVs או צורה מסיסה, ותדרים של תאי CD8 + T SIINFEKL ספציפי בין תאי CD8 + T בPBMCs נקבעו על ידי ניתוח cytometric זרימת PBMCs מוכתם tetramer-PE SIINFEKL-H-2K ב. איור 4 א מראה זרימת נציג cytometry מגרשי פיזור של tetramer ב SIINFEKL-H-2K + תאים בין תאי CD8 + T בPBMCs ביום 41 6. Figurדואר 4B תערוכות מגרשי פיזור נציג של תאי CD62L + CD44 + עם פנוטיפ זיכרון המרכזי בין SIINFEKL-tetramer + תאי CD8 + T. ניטור שבועי של PBMCs שמוצג באיור 4C הצביע על כך שחיסון OVA מסיס שהושרו הרחבה מינימאלית של תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי, ואילו חיסון ICMV שהושרו באופן משמעותי תגובות תא CD8 + T חזקות, השיג 28% SIINFEKL-tetramer שיא + תאי T בCD8 + אוכלוסיית תאי T על ידי יום 41 6. שימוש בפרוטוקול מכתים tetramer שהוצג כאן, ראתה את תדירות הרקע של 0.11% ± תאי T OVA ספציפי 0.04% (N = 15) בבעלי חיים שלא טופלו או שטופל PBS, ואנחנו יכולים לזהות עלייה מובהקת סטטיסטי בתדרי תא CD8 + T אנטיגן הספציפי נמוכים כמו 0.46% ± 0.05% (p-value <0.005, מידע לא מוצג).

איור 1
(B) מוצג. גודל ממוצע הידרודינמית, מדד polydispersity, ופוטנציאל זטה של ICMVs (ג) שיתוף עמוס OVA וMPLA מוצגים. לוח () שונה מet al הירח. 6. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.

איור 2
איור 2. ניתוח של אנטיגן ניקוז לבלוטות לימפה עם מיקרוסקופיה confocal. C57Bl / 6 עכברים שחוסנו עם MPLA fluorophore מצומדות OVA (מוצג באדום) ו5 מיקרוגרם 100 מיקרוגרם או בפתרון או ICMVs (מוצגת בכחול). בלוטות הלימפה מפשעתי ניקוז היו נכרת בנקודות זמן שצוינו, cryosectioned, וצלמו עם מיקרוסקופיה confocal. micrographs confocal נציג מוצג. אותות הוורודים מצביעים שיתוף לוקליזציה של OVA וICMVs. נתון זה שונה מet al הירח. 7. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. Monitorinהרחבת תא T g לאחר חיסון. C57Bl / 6 עכברי בקן הועברה adoptively iv עם 5 x 10 5 תאים לוק + OT-אני CD8 + T ביום -1. ביום 0, החיות מנוהלות עם 10 מיקרוגרם של OVA ו -0.1 מיקרוגרם של MPLA או כניסוחים מסיסים או ICMV. בעלי החיים היו מורדמים עם isoflurane ומנוהלים עם luciferin (150 מ"ג / קילוגרם, IP 300 μl מוזרק), ואות פליטת אור מתאי לוק + OT-1 CD8 + T נרכש עם IVIS. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.

איור 4
הרחבת איור 4. תאי CD8 + T OVA הספציפי אנדוגני לאחר חיסון ICMV. C57Bl / 6 עכברים שחוסנו עם 10 מיקרוגרם של OVA ו -0.1 מיקרוגרם של MPLA או שפתרון n או ICMVs בימים 0, 21, ו -35 (חיצים). תדירות של תאי T OVA ספציפי בין תאי דם היקפי mononuclear הוערכה לאורך זמן על ידי ניתוח התזרים cytometric של SIINFEKL-MHC-אני tetramer + תאי CD8 + T. זרימת נציג cytometry מגרשי פיזור מעכברים בודדים ביום 41 תכנית SIINFEKL-MHC-אני tetramer + + תאי T CD8 ו( ב) תאי CD62L + CD44 +, סמן של תאי T הזיכרון מרכזיים (). (ג) קינטיקה הכוללת של הרחבת תא T והתכווצות מוצגת. נתון זה שונה מet al הירח. 6. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול האמור במאמר זה מתאר את הסינתזה ואפיון של מערכת ננו-חלקיקים המבוססים על שומנים חדשה, המכונה ICMVs, ומספק את התהליך של אימות אפקטיבי של ניסוחים חיסון המבוסס על ננו-חלקיקים לגרום לתגובות תא אנטיגן הספציפי CD8 + T. סינתזת ICMV תושלם בכל המצב המימי, וזה יתרון גדול לעומת מערכות אחרות נפוצות פולימרי ננו-חלקיקים (למשל, פולי (lactide-שיתוף glycolide) חלקיקי חומצה), אשר בדרך כלל דורשים ממסים אורגניים להכנה, לעתים קרובות גורמות לאובדן של antigenicity בחלבון אנטיגנים 29,30. בנוסף, יתרון ICMVs מיציבות והיכולת נרחבות כדי לתמצת מולקולות שני הידרופובי והידרופילי 6, ובכך מאפשר שיתוף משלוח של אנטיגנים וadjuvants הממוקדים לאותו תא תאיים בתוך נגמ"שים 31,32. באמצעות ICMVs כחלקיק חיסון מודל, כאן יש לנו התווינו את הנהליםל( 1) סינתזת ננו-חלקיקים ואפיון, (2) אימות של ניקוז ננו-חלקיקים לdLNs, ובדיקה של דיבוב של תגובות תא אנטיגן הספציפי CD8 + T באמצעות (3) טכניקת הדמיה פליטת אור לא פולשנית ו( 4) פפטיד-MHC assay מכתים tetramer על PBMCs.

זה קריטי כדי להבטיח אחידות בסינתזת ננו-חלקיקים מתצוו אצווה, במיוחד לגודל חלקיקים ותשלום פני השטח כפי שהם יכולים להשפיע באופן משמעותי ניקוז לימפתי וספיג בנגמ"שים על in vivo ממשל. DLS וניתוח פוטנציאל זטה לספק שיטות מהירות של בדיקת איכות ובגודל חלקיקים אחראי פני השטח. לניתוח מפורט יותר על מורפולוגיה של חלקיקים בודדים, יכולות להיות כהשלמה טכניקות אלה עם מיקרוסקופ אלקטרונים ברזולוציה גבוהה, כגון מיקרוסקופיה קריו-האלקטרון (cryo-EM) המשמרת מורפולוגיה של חלקיקים "רכים" בשכבה מימית מזוגגת 6,33,34 . יעילות Encapsulation של אנטיגנים וadjuvנמלים גם צריכים להיקבע והמשיכו אחידים בין סינתזות. Adjuvants, כגון MPLA, יכול להיות מתויג עם fluorophore 6 ואילו ניתן לכמת אנטיגנים חלבון באמצעות ערכות כימות חלבון absorbance- וקרינה מבוססות, או ניתחו ניצול SDS-עמוד 35 וCoomassie או כסף מכתימים 36, ולכמת מבוססים על עוצמת להקה . חוסר עקביות בהכנת חלקיקים עלולה לגרום מחומרים כימיים שפגו תוקף או גרוע-מאוחסנים, כתגובתיות אופטימלית היא הכרחית לסינתזה שלמה. לשם כך, maleimide- וצריכים להישמר thiol- ריאגנטים פונקציונליות בaliquots הקטן ב -80 ° C ללא להקפיא להפשיר מחזורים תכופים.

חלקיקים קטנים יותר מ -100 ננומטר נחשבים בדרך כלל להיכנס ביעילות הכלים ותנועת הלימפה לdLNs 13, ואילו חלקיקים גדולים יותר (500-2,000 ננומטר) דורשים תחבורה פעילה על ידי DCs רקמות תושב 12,37. בידיים שלנו, ICMVs עם הגודל הידרודינמית החל 150-250 ננומטר יעילות מקומי והתמידו בDLN, וכתוצאה מכך CTL הנרחב ותגובות הלחות 6,7. בתוך 24 שעות של ממשל, ICMVs היו קשור עם מקרופאגים סינוס subcapsular בdLNs, ותזרים cytometric ניתוחים שבוצע בימים 1 ו -4 ציינו כי רוב ICMVs בתוך dLNs נלקחו על ידי נגמ"שים LN-תושב עם רק חלק קטן מחלקיקים הקשורים לנגרהנס וDCs עורי 7. תוצאות אלו מצביעות על כך שהובלה פסיבית היא המצב העיקרי של סחר ICMV לdLNs. מחקרים אלו מנוצלים חלקיקים מתויג fluorophore ואנטיגנים חלבון להתוות דפוסי הלוקליזציה והפצתם בdLNs. מיקרוסקופיה confocal של dLNs cryosectioned מאפשרת היסטוכימיה immunofluorescence נוספת לזיהוי מבני LN (למשל, GL-7 ביטוי במרכזים נבטי) ותאי אינטראקציה עם רכיבי הניסוח (למשל, DCS - CD11c, מקרופאגים - F4 / 80, CD169, וB- תאים & #8211; B220) 7,9. טכניקה זו יכולה להתבצע במקביל לזרימה cytometry ניתוחים של תאים שנקטפו מdLNs להתוות תת קבוצות של נגמ"שים אחראים לחלקיקים ספיגים 7,9 או עם הדמיה כל-חיה כדי לכמת משלוח חיסון מאתר ההזרקה לdLNs 38,39, ובלבד שאותות הניאון חזקים וautofluorescence רקמות אינו מפריע לאותות.

חיסון יעיל דורש הפעלה והרחבת תאי אנטיגן הספציפי T ציטוטוקסי, אשר יכול להיות במעקב על ידי ההדמיה פליטת אור של כל הגוף לאחר העברת מאמצת של bioluminescent, תאי T מהונדסים אנטיגן ספציפי, ואחריו חיסון חזקים. יתרון הנוסף של שיטה זו הוא הפוטנציאל להדמיה חוזרת ונשנית של סחר CTL באותו בעלי החיים לתקופה ממושכת, ובכך להקטין את מספר בעלי החיים הנדרשים לניתוחים חיסוניים והימנעות משימוש בprocedur בידוד תא מייגעes. השימוש בטכניקת הדמיה זו, יש לנו לאחרונה הוכיח כי ממשל ריאות של ICMVs שיתוף עמוס אנטיגן חלבון וסוכן immunostimulatory הובילו לגילוי חזק של תאי אנטיגן הספציפי CD8 + T בריאות וLNs mediastinal וההפצה הבאה של תאי-ההרג לרקמות הריריות דיסטלי , לרבות התיקונים של Peyer, cecum, ודרכי נרתיק 9. cytometric זרימת הניתוחים הראה כי תאי CD8 + T עתה הרחיבו אלה טבועים עם פנוטיפ "רירית-ביות" מאופיין בα β 4 7 + ביטוי integrin ותגובות חיסוניות הגנתיות תיווך נגד רירית אתגר נגיפי 9. ההדמיה כל-החיה של תאי CD8 + T bioluminescent נוצלה גם לאחרונה על ידי et Hailemicheal al., שהוכיח כי הפפטיד אנטיגן הגידול גיבש לאדג'ובנט של פרוינד שלם (IFA, תחליב שמן ב-מים) הביא לתפיסתם של תאי T באתר של ההזרקהעם חיסון "מחסן" הרחק מהמון הגידול, שמוביל לחוסר תפקוד של תאי T ומחיקת 40.

צביעת tetramer כבר בשימוש נרחב בעבר לכמת את הרמה של תגובות אנדוגני CTL וכתוצאה מניסוחי חיסון שונים 21. טכניקה זו היא גם רלוונטית ושימוש נרחב בניסויים בבני אדם בתחילת טיפול חיסוני סרטן קליני כדי לאשר תגובות CTL לאנטיגנים הקשורים גידול ספציפי 41,42. ניתן לאסוף בקלות PBMCs מעכברים ומוכן לcytometry זרימה; עם זאת, זה לא יכול לחשוף את ההיקף המלא של הרחבת תא T בשל לוקליזציה תא לחיסוני דיפו יוצרי כאמור לפני או בתוך גידולים במודלי סרטן, וכן הוא מחייב ניתוח נרחב יותר. תאימות של שיטה זו עם cytometry הזרימה מאפשרת קביעה של תאי T אנטיגן ספציפי עם סמני זיכרון (CD44, CD62L, CD127, Bcl-2, וKLRG-1) להבחין מפעיל, זיכרון מרכזי, וספירת זיכרון מפעילLLS בין תאי tetramer + T 43 או תאי-ההרג תושב רקמה ארוך טווח 44,45 (כפי שסוכם בסקירות האחרונות 46,47). עם זאת, assay מכתים tetramer מספק הערכה הראשונית בלבד של תגובות CTL מאז תאי T אנטיגן הספציפי התרחבו הפערים עשויים להפגין סימנים של תשישות חיסונית 48,49. הערכה תפקודית של תגובות CTL יכול להתבצע על ידי שחרור ציטוקינים בחינה עם Immunospot אנזים צמוד (ELISPOT) 50 או מכתים ציטוקינים תאיים 51 לאחר גירוי vivo לשעבר של לימפוציטים עם אפיטופים מינימאליים, כמו גם על ידי מדידת הרמות תאיות של perforin וgranzyme B 52 ותאי ביטוי של CD107a וCD107b על degranulation 53. בנוסף, פונקצית cytolytic של תאי-ההרג ניתן להעריך באופן ישיר עם מבחני רעילים CTL מבוצעים במבחנה או בvivo 54-56.

אינדוקציה של תגובות חיסוניות הלחותלאחר חיסון ננו-חלקיקים ניתן ללמוד במקביל לתא CD8 + T ניתוחים שהוצג כאן. ניתן לנתח titers נוגדנים בשיטה המסורתית של assay immunosorbent צמוד אנזים (ELISA) תוך זיקת נוגדן ולרוחבה של הכרת epitope ניתן להעריך על ידי שינוי פרוטוקול ELISA עם השימוש של סוכן chaotropic (למשל, אוריאה) בנוגדן מחייבת מצע והשימוש בתחומי משנה בתוך אנטיגנים כמו מצעים, בהתאמה 7. דיבוב של תגובות הלחות חזקות דורש הרחבת עוזר זקיקי תאי CD4 + T (T FH) 57. לחקור הרחבת תאי T FH בתגובה לחיסון חלקיקים, הפרוטוקול המובא כאן ניתן להתאים בקלות לבידוד של אנטיגן הספציפי לתאים מסוג CD4 + T מעכברים מהונדסים OT-השני, ואחרי העברת תא מאמצת לעכברים נמען נאיביים. לאחר חיסון, ניתן לקצור רקמות הלימפה וניתחו עם התזרים cytometric מנתח להרתיע7 הרחבת מכרה של תאי T FH אנטיגן ספציפי (המזוהות על ידי CD4 + CXCR5 + PD-1 + הפנוטיפ שלהם).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

פרקין אלמר סיפק את עלות הייצור שנגרם במהלך הפרסום של מאמר זה.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות להעניק 1K22AI097291-01 ועל ידי המרכז הלאומי לקידום מדעי Translational של המכון הלאומי לבריאות בפרס מספר UL1TR000433. אנחנו גם מכירים פרופ 'אירווין דארל ב- MIT ופרופ' מתיאס סטפן בפרד האצ'ינסון מרכז הסרטן על תרומתם בעבודה הראשונית על חלקיקי החיסון ועכברים הטרנסגניים OT-I / לוק.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB) Avanti Polar Lipids, INC. 870012
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, INC. 850375
Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA) Avanti Polar Lipids, INC. 699800
20 ml glass vials Wheaton 0334125D
Symphny Vacuum Oven VWR 414004-580
Ovalbumin (OVA) Worthington 3054
Bis-Tris Propane (BTP) Fisher BP2943
Q125 Sonicator (125 W/20 kHz) Qsonica Q125-110
Dithiothreitol (DTT) Fisher BP172
2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH) Laysan Bio MPEG-SH-2000-1g
Malvern ZetaSizer Nano ZSP  Malvern
ZetaSizer Cuvettes Malvern DTS1070
2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy
1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID) Life Technologies D-7757
Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS) Life Technologies A37571
Tissue-Tek OCT freezing medium  VWR 25608-930
Tissue Cryomolds VWR 25608-922
3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging
C57BL/6 mice Jackson 000664
Albino C57BL/6 mice Jackson 000058
OT-1 C57BL/6 mice Jackson 003831
70 μm nylon strainer BD 352350
EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit StemCell 19853
IVIS® whole animal imaging system Perkin Elmer
4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells
K2EDTA tubes BD 365974
ACK lysis buffer Life Technologies A10492-01 
Anti-CD16/32 Fc Block Ebioscience 14-0161-86
H-2Kb OVA Tetramer MBL TS-5001-1C
Anti-CD8-APC BD 553031
Anti-CD44-FITC BD 553133
Anti-CD62L-PECy7 Ebioscience 25-0621-82
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) SIGMA D8417-10MG
CyAn Flow Cytometer Beckman Coulter
FlowJo Software FlowJo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Irvine, D. J., Swartz, M. A., Szeto, G. L. Engineering synthetic vaccines using cues from natural immunity. Nature materials. 12, 978-990 (2013).
  2. Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. Engineering nano- and microparticles to tune immunity. Advanced materials. 24, 3724-3746 (2012).
  3. Sahdev, P., Ochyl, L. J., Moon, J. J. Biomaterials for nanoparticle vaccine delivery systems. Pharmaceutical Research. (2014).
  4. Zhao, L., et al. Nanoparticle vaccines. Vaccine. 32, 327-337 (2014).
  5. Riet, E., Ainai, A., Suzuki, T., Kersten, G., Hasegawa, H. Combatting infectious diseases; nanotechnology as a platform for rational vaccine design. Advanced drug delivery reviews. 74C, 28-34 (2014).
  6. Moon, J. J., et al. Interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles as synthetic vaccines for potent humoral and cellular immune responses. Nature Materials. 10, 243-251 (2011).
  7. Moon, J. J., et al. Enhancing humoral responses to a malaria antigen with nanoparticle vaccines that expand Tfh cells and promote germinal center induction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1080-1085 (2012).
  8. DeMuth, P. C., Moon, J. J., Suh, H., Hammond, P. T., Irvine, D. J. Releasable layer-by-layer assembly of stabilized lipid nanocapsules on microneedles for enhanced transcutaneous vaccine delivery. ACS Nano. 6, 8041-8051 (2012).
  9. Li, A. V., et al. Generation of Effector Memory T Cell-Based Mucosal and Systemic Immunity with Pulmonary Nanoparticle Vaccination. Science Translational Medicine. 5, 204ra130 (2013).
  10. Stephan, M. T., Moon, J. J., Um, S. H., Bershteyn, A., Irvine, D. J. Therapeutic cell engineering with surface-conjugated synthetic nanoparticles. Nature Medicine. 16, 1035-1041 (2010).
  11. Murdock, R. C., Braydich-Stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of nanomaterial dispersion in solution prior to In vitro exposure using dynamic light scattering technique. Toxicological Sciences. 101, 239-253 (2008).
  12. Manolova, V., et al. Nanoparticles target distinct dendritic cell populations according to their size. European Journal of Immunology. 38, 1404-1413 (2008).
  13. Reddy, S. T., et al. Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines. Nature Biotechnology. 25, 1159-1164 (2007).
  14. Kaur, R., Bramwell, V. W., Kirby, D. J., Perrie, Y. Manipulation of the surface pegylation in combination with reduced vesicle size of cationic liposomal adjuvants modifies their clearance kinetics from the injection site, and the rate and type of T cell response. Journal of Controlled Release. 164, 331-337 (2012).
  15. Zhuang, Y., et al. PEGylated cationic liposomes robustly augment vaccine-induced immune responses: Role of lymphatic trafficking and biodistribution. Journal of Controlled Release. 159, 135-142 (2012).
  16. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  17. Clarke, S. R. M., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and Cell Biology. 78, 110-117 (2000).
  18. Azadniv, M., Dugger, K., Bowers, W. J., Weaver, C., Crispe, I. N. Imaging CD8(+) T cell dynamics in vivo using a transgenic luciferase reporter. International Immunology. 19, 1165-1173 (2007).
  19. Kim, D., Hung, C. F., Wu, T. C. Monitoring the trafficking of adoptively transferred antigen- specific CD8-positive T cells in vivo, using noninvasive luminescence imaging. Human gene therapy. 18, 575-588 (2007).
  20. Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14342-14346 (2008).
  21. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
  22. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. e2771 (2012).
  23. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii, J. Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. e50765 (2013).
  24. Chen, Y., et al. Visualization of the interstitial cells of cajal (ICC) network in mice. Journal of Visualized Experiments. (2011).
  25. Scheffold, A., Busch, D. H., Kern, F. In Cellular Diagnostics Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Karger. Sack, U., Tárnok, D. H., Rothe, G. 476-502 (2009).
  26. Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. e740 (2008).
  27. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34, 39-43 (2005).
  28. Tilney, N. L. Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat. Journal of Anatomy. 109, 369-383 (1971).
  29. Stivaktakis, N., et al. PLA and PLGA microspheres of beta-galactosidase: Effect of formulation factors on protein antigenicity and immunogenicity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 70A, 139-148 (2004).
  30. Bilati, U., Allemann, E., Doelker, E. Nanoprecipitation versus emulsion-based techniques for the encapsulation of proteins into biodegradable nanoparticles and process-related stability issues. AAPS PharmSciTech. 6, E594-E604 (2005).
  31. Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440, 808-812 (2006).
  32. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
  33. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly reviews of biophysics. 21, 129-228 (1988).
  34. Vinson, P. K., Talmon, Y., Walter, A. Vesicle-micelle transition of phosphatidylcholine and octyl glucoside elucidated by cryo-transmission electron microscopy. Biophysical Journal. 56, 669-681 (1989).
  35. Schagger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nature Protocols. 1, 16-22 (2006).
  36. Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nat Protoc. 1, 1852-1858 (2006).
  37. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews Immunology. 5, 617-628 (2005).
  38. Liu, H., et al. Structure-based programming of lymph-node targeting in molecular vaccines. Nature. 507, 519-522 (2014).
  39. Xu, Z., et al. Multifunctional nanoparticles co-delivering Trp2 peptide and CpG adjuvant induce potent cytotoxic T-lymphocyte response against melanoma and its lung metastasis. Journal of Controlled Release. 172, 259-265 (2013).
  40. Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nature Medicine. 19, 465 (2013).
  41. Slingluff, C. L., et al. Phase I trial of a melanoma vaccine with gp100(280-288) peptide and tetanus helper peptide in adjuvant: Immunologic and clinical outcomes. Clinical Cancer Research. 7, 3012-3024 (2001).
  42. Speiser, D. E., et al. Rapid and strong human CD8(+) T cell responses to vaccination with peptide, IFA, and CpG oligodeoxynucleotide 7909. Journal of Clinical Investigation. 115, 739-746 (2005).
  43. Araki, K., et al. mTOR regulates memory CD8 T-cell differentiation. Nature. 460, 108-112 (2009).
  44. Masopust, D., Vezys, V., Marzo, A. L., Lefrancois, L. Preferential localization of effector memory cells in nonlymphoid tissue. Science. 291, 2413-2417 (2001).
  45. Cuburu, N., et al. Intravaginal immunization with HPV vectors induces tissue-resident CD8+ T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 122, 4606-4620 (2012).
  46. Ahlers, J. D., Belyakov, I. M. Memories that last forever: strategies for optimizing vaccine T-cell memory. Blood. 115, 1678-1689 (2010).
  47. Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nature Reviews Immunology. 8, 247-258 (2008).
  48. Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
  49. Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27, 670-684 (2007).
  50. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65, 109-121 (1983).
  51. Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. Chapter 6, (Unit 6 24), (2007).
  52. Wonderlich, J., Shearer, G., Livingstone, A., Brooks, A. Induction and measurement of cytotoxic T lymphocyte activity. Current protocols in immunology. Chapter 3, (Unit 6 24), (2006).
  53. Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation. Journal of Immunological Methods. 281, 65-78 (2003).
  54. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
  55. Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. Journal of Visualized Experiments. e51105 (2013).
  56. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of visualized experiments. e51627 (2014).
  57. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual review of immunology. 29, 621-663 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics