Imaging Whole-animal y de citometría de flujo Las técnicas para T CD8 + respuestas celulares Análisis de antígeno-específicos después de nanopartículas Vacunación

Immunology and Infection

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Ochyl, L. J., Moon, J. J. Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination. J. Vis. Exp. (98), e52771, doi:10.3791/52771 (2015).

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Abstract

Introduction

Desarrollo de la vacuna tradicional ha empleado principalmente el enfoque empírico de ensayo y error. Sin embargo, con el reciente desarrollo de una amplia variedad de biomateriales y descubrimiento de los determinantes moleculares de la activación inmune, ahora es posible diseñar racionalmente formulaciones de vacunas con señales biofísicos y bioquímicos derivados de patógenos 1,2. En particular, varias plataformas de administración de fármacos de partículas han sido examinadas como portadores de vacuna, ya que pueden ser co-cargado con antígenos de subunidades y agentes inmunoestimulantes, proteger componentes de la vacuna de la degradación, y mejorar su co-entrega a células presentadoras de antígeno (APCs) que reside en la linfa nodos (LNS), maximizando así la estimulación inmune y la activación 3-5. En este informe, se describe la síntesis de un sistema de nanopartículas "patógenos imitando", denominado vesículas multilamelares-interbilayer reticulado (ICMVs), que se han demostrado previamente como platfor vacuna potentem para elicitación de robusta de linfocitos T citotóxicos (CTL) y respuestas inmunes humorales en ambos compartimentos de tejido sistémicas y mucosas 6-9. En particular, la vacunación con ICMVs Conseguido mejorado sustancialmente los niveles de IgG en suero contra un antígeno de la malaria, en comparación con la vacunación con adyuvantes convencionales (por ejemplo, alumbre y Montanide) 7 y también suscitó respuestas CTL potentes contra las células tumorales y modelos de desafío virales en ratones 9. Aquí, utilizando ICMVs como un sistema de nanopartículas vacuna modelo, se describen los métodos para la caracterización de la vacuna nano-formulaciones, incluyendo el tamaño de las partículas y las mediciones de potencial zeta y el seguimiento de la trata de partículas para los LN de drenaje (dLNs) que utilizan la imagen confocal de tejidos cryosectioned 7. Además, se presenta un método basado en imágenes-toda-animales de analizar la expansión de las respuestas de CTL en ratones después de la transferencia adoptiva de células T CD8 + específicas de antígeno que expresan luciferasa 9,10. Finalmente, detinción de tetrámero escriba de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) para la cuantificación longitudinal de las respuestas de células T endógenas en ratones vacunados con nanopartículas de 6,9.

ICMVs son una formulación de nanopartículas a base de lípidos sintetizados por fusión controlada de liposomas simples en estructuras multilaminares, que luego son estabilizadas químicamente por grupos de cabeza de fosfolípidos de maleimida-funcionalizado de reticulación dentro de las capas de lípidos con ditiol reticulantes 6. Una vez ICMVs se sintetizan, una pequeña fracción de nanopartículas se puede utilizar para determinar el tamaño de partícula y el potencial zeta (es decir, la carga superficial de las partículas) con un sistema de dispersión de luz dinámica (DLS) y un analizador de potencial zeta. DLS mide los cambios en la dispersión de luz en suspensiones de partículas, lo que permite la determinación del coeficiente de difusión y el tamaño hidrodinámico de partículas 11. El logro de tamaño de partícula consistente de lote a lote síntesis es críticoya que el tamaño de partícula es uno de los principales factores que influyen en el drenaje linfático de partículas de vacunas para dLNs y captación celular posterior por APCs 12,13. Además, el potencial zeta puede obtenerse mediante la medición de la velocidad de las partículas cuando se aplica una corriente eléctrica, que permite la determinación de la movilidad electroforética de las partículas y superficie de las partículas de carga 11. Garantizar valores de potencial zeta consistentes de partículas es importante ya que la carga superficial de las partículas determina la estabilidad coloidal, la cual tiene un impacto directo sobre la dispersión de partículas durante el almacenamiento y después de la administración in vivo 14,15. Con el fin de realizar un seguimiento de la localización de partículas para dLNs, ICMVs pueden ser etiquetados con fluoróforos deseados incluyendo colorantes lipófilos y antígenos covalentemente etiquetados. Después de la inmunización, los ratones pueden ser sacrificados en diversos puntos temporales, dLNs resecadas, cryosectioned, y se analizaron con microscopía confocal. Esta técnica permite la visualización de Desagüe linfáticoción tanto de los transportistas y el antígeno de la vacuna dLNs nanopartícula. Las secciones de tejido, además, se pueden teñir con anticuerpos marcados fluorescentemente y utilizado para obtener más información, tales como tipos de células asociadas con el antígeno y la formación de centros germinales como hemos demostrado previamente 7.

Una vez que la síntesis de partículas está optimizado y el tráfico a las dLNs se confirma, es importante para validar la elicitación de expansión de CTL in vivo. Con el fin de analizar la elicitación de las células T CD8 + específicas de antígeno en respuesta a la vacunación de nanopartículas, hemos utilizado un antígeno modelo, ovoalbúmina (OVA), con OVA 257-264 péptido (SIINFEKL) inmunodominante epítopo de células T CD8 +, que permite análisis inmunológicos detalladas de las respuestas de células T específicas de antígeno de 16,17 inicial el desarrollo de vacunas. En particular, para interrogar a la dinámica de expansión y migración de las células T CD8 + específicas de antígeno, hemos generado unamodelo de doble ratón transgénico mediante el cruce de luciferasa de luciérnaga-expresión de ratones transgénicos (Luc) con OT-I ratones transgénicos que poseen las células T CD8 + con receptor de células T (TCR) específico para SIINFEKL (en asociación con H-2K b). A partir de estos ratones OT-I / Luc, luciferasa que expresan, las células T OT-I CD8 + pueden ser aislados y preparados para la transferencia adoptiva en ingenuas ratones C57BL / 6. Una vez sembrada, la inmunización con éxito con nanopartículas que contienen OVA-dará lugar a la expansión de las células T transferidas, que pueden ser rastreados mediante el control de la señal de bioluminiscencia con todo un sistema de imagen 9,10 animal. Esta técnica de formación de imágenes de todo el cuerpo no invasiva se ha utilizado con otros antígenos virales o tumorales en el pasado 18-20, revelando procesos implicados en la expansión de células T en los tejidos linfoides y difusión a los tejidos periféricos de una manera longitudinal.

Complementario al análisis de adoptivamente células T CD8 + específicas de antígeno transferidos, endogenolas respuestas de células T después de la vacunación nos puede ser examinado con el complejo péptido-mayor de histocompatibilidad (MHC) de ensayo tetrámero 21, en ​​el que un complejo tetrámero MHC-péptido, que consta de cuatro fluoróforo de etiquetado MHC de clase I moléculas cargado con epítopos de péptidos, se emplea para unirse TCR y la etiqueta las células T CD8 + de una manera específica de antígeno. El ensayo de tetrámero de péptido-MHC se puede realizar ya sea en estudios de necropsia terminales para identificar las células T CD8 + específicas de antígeno en tejidos linfoides y periféricas o en estudios longitudinales con células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) obtenidas a partir de extracciones de sangre en serie. Después de la tinción de los linfocitos con el péptido-MHC tetrámero, citometría de flujo análisis se realiza para los análisis detallados sobre el fenotipo de los CTL o cuantificación de su frecuencia entre las células T CD8 +.

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Protocol

Todos los experimentos descritos en este protocolo fue aprobado por el Comité Universitario de Uso y Cuidado de los Animales (UCUCA) de la Universidad de Michigan y realizaron de acuerdo con las políticas y directrices establecidas.

1. Síntesis y caracterización de ICMVs Co-cargado con proteína de antígeno y adyuvante Moléculas

  1. Mezclar 1: 1 relación molar de 1,2-dioleoyl- sn -glicero-3-fosfocolina (DOPC) y 1,2-dioleoyl- sn -glicero-3-phosphoethanolamine- N - [4- (p -maleimidophenyl) butiramida] (MPB) en cloroformo, manteniendo la cantidad total de lípidos en 1,26 mol por lotes (es decir, 500 g de DOPC y 630 g de MPB) en un vial de vidrio de 20 ml (diámetro = 28 mm y la altura = 61 mm).
  2. Añadir fármacos lipófilos, como monofosforil lípido A (MPLA), o colorantes lipófilos (por ejemplo, DiD), a la solución de los lípidos en la concentración deseada. Eliminar completamente el disolvente orgánico purgando con nitroge extra secon gas y la colocación de las muestras al vacío O / N.
  3. Hidratar la película lipídica mediante la adición de 200 l de 10 mM de propano bis-tris (BTP, pH 7,0) que contiene fármacos solubles en agua (por ejemplo, antígenos de proteína). Vortex durante 10 s cada 10 min durante 1 hora a RT.
  4. Transferir el contenido del frasco de vidrio en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, colocar las muestras en un baño de agua helada, y sonicar continuamente durante 5 min usando la intensidad del 40% en un ajuste / 20 kHz sonicador de sonda de punta de 125 W.
  5. Añadir 4 l de ditiotreitol 150 mM (DTT) a cada lote (trabajando concentración 2,4 mM), vórtice, y centrifugar brevemente utilizando una microcentrífuga de mesa.
  6. Añadir 40 l de 200 mM CaCl 2 y mezclar con la pipeta (trabajando concentración 33 mM). Incubar las muestras a 37 ° C durante 1 hora para permitir la reticulación de MPB-que contiene capas de lípidos con DTT.
  7. Centrifugar las muestras a 20.000 xg durante 15 minutos, retire el sobrenadante y resuspender en 200 l de ddiH 2 O.
  8. Repita el paso 1.7 y centrifugar de nuevo después de la segunda ddiH 2 O de lavado para eliminar CaCl 2, DTT sin reaccionar, y materiales de carga no encapsuladas a partir del sobrenadante.
  9. Preparar 10 mg / ml de 2 kDa polietilenglicol-tiol (PEG-SH) en ddiH 2 O. Resuspender cada muestra ICMV en 100 l de solución de PEG-SH y se incuba a 37 ° C durante 30 min.
  10. Realice dos ddiH 2 O lavados (paso 1.7) y resuspender el botón ICMV final en PBS y se almacena a 4 ° C. Antes de usar, mezclar la suspensión ICMV, como partículas pueden depositarse en el fondo después de un almacenamiento prolongado.
  11. Para la caracterización de partículas, extraer una pequeña alícuota (~ 10%) de ICMVs de cada lote y diluir individualmente en un volumen total de 1 ml de ddiH 2 O. Coloque una sola muestra en un tamaño de partícula Zetasizer celular y medida, índice de polidispersidad, y el potencial zeta de las muestras usando un DLS y sistema de medición potencial zeta (de acuerdo con el protocolo del fabricante).

2. El examen de Nódulo Linfático Drenaje de ICMVs fluorescencia etiquetada con Microscopía Confocal

  1. Preparación de ICMVs cargado con antígeno-fluoróforo etiquetado y colorante fluorescente lipofílico
    1. Preparar proteína fluoróforo de etiquetado, tales como ovoalbúmina hace reaccionar con Alexa Fluor 555-éster de succinimidilo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    2. Para preparar ICMVs etiquetados con fluoróforo en la cáscara de los lípidos, añadir colorante fluorescente lipofílica, (por ejemplo, 1,1-dioctadecil-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindodicarbocyanine, (DiD)) durante la preparación de la película lipídica (Paso 1.2) en 0,05% de lípidos cantidad molar. Para lípidos hidratación película (Paso 1.3), tampón uso que contiene el antígeno fluoróforo etiquetado, y la síntesis ICMV completa tal como se describe en los pasos 1.4 a 1.11.
  2. La administración subcutánea de nanopartículas a base de la cola
    1. Anestesiar ratón usando un vaporizador flujo controlado equipado con una cámara de inducción utilizing 3% isoflurano y 1,5 l / min de flujo de oxígeno de acuerdo con un protocolo aprobado IACUC animal. Una vez que el ratón está inconsciente, realice los siguientes pasos con rapidez antes de la anestesia que desaparecen para permitir un acceso óptimo a el sitio de la inyección y minimizar las molestias al animal. También puede utilizar un buen cono de la nariz apropiado para mantener la anestesia. Si los ratones se anestesiaron durante más de 5 min, aplicar lubricante necesario para minimizar la irritación del ojo después del procedimiento.
    2. Pulverizar la base de la cola con etanol al 70% para desinfectar y humedecer la parte de piel el pelo mojado para exponer un pequeño parche de piel visible, que puede ser utilizado para visualizar la aguja bajo la piel.
    3. Prepare suspensión inyección de partículas que contiene la cantidad deseada de antígeno y adyuvante por 100 l de dosis de vacunación en PBS (por ejemplo, 10 g OVA y 0,3 g MPLA por 100 l de dosis de inyección se ha utilizado en el pasado 6,9).
    4. Dibujar el int suspensión de partículasjeringuilla oa una aguja 27-29 G e insertar la aguja en la base de la cola (~ 5 mm de la línea del cabello) con el bisel hacia arriba e inyectar 50 l de la suspensión de partículas 22.
    5. Espere unos segundos para que la presión de igualar para evitar excesiva de reflujo y tire de la aguja. Repetir la inyección en el otro lado de la base de la cola para dirigirse tanto que drenan los LN inguinales.
  3. Preparación de cryosections ganglios linfáticos y el examen con el microscopio confocal.
    1. La eutanasia del ratón con asfixia con CO2, seguido por neumotórax inducida de acuerdo con un protocolo aprobado IACUC animal. Extraer los LN inguinales, según el protocolo demostrado en Bedoya 23 y lavar la sangre mediante la colocación de los tejidos en 1 ml de PBS 4 ° C.
    2. Absorbe el PBS de los tejidos con tejidos y colocar el tejido en criomoldes de tejido (10 x 10 x 5 mm 3) precargada a la cima con 24 octubre medio de congelación. Snap congelar la tisdemandar bloque en nitrógeno líquido durante 30 segundos. Como alternativa, coloque bloque de tejido en hielo seco durante 30 minutos. Almacenar tejido congelado en -80 ° C congelador.
    3. Cortar secciones de tejido de 5-10 m de espesor en un criostato fijado en -20 ° C 24.
    4. Si es necesario, lleve a cabo el etiquetado de inmunofluorescencia, y examinar el tejido con la microscopía confocal como previamente demostrada 24.

3. Monitoreo de expansión de antígeno-específica, luciferasa que expresan las células T CD8 + después de nanopartículas vacunación con Whole Animal Imaging

  1. Aislamiento de OVA 257-264 específico de, las células T CD8 + que expresan luciferasa de OT-I / Luc ratones transgénicos
    1. La eutanasia a un ratón transgénico OT-I / Luc con asfixia de CO 2 e inducir un neumotórax de acuerdo con un protocolo aprobado IACUC animal. Se recoge el bazo de una manera estéril mediante el acceso a la cavidad peritoneal y con cuidado de extraer el tejido del páncreas 23, ylugar en 5 ml de 4 ° C PBS + FBS al 2% para la transferencia a la campana de cultivo de tejidos.
    2. Coloque el bazo en un colador de nylon 70 micras sobre un tubo de centrífuga cónico de 50 ml (hasta 3 bazos a la vez). El uso de un émbolo de una jeringa de 3 ml, moler las células a través del colador.
    3. Lave el émbolo y el filtro con PBS + FBS al 2% y deseche. Llevar el volumen total a 10 ml / bazo en el tubo de 50 ml, tomar una pequeña muestra de la suspensión celular a contar con un hemocitómetro, y se centrifuga durante 10 min a 300 x g.
    4. El uso de un kit de selección negativa magnético disponible comercialmente, aislar la población de células T CD8 +, siguiendo las instrucciones del fabricante.
    5. Después de lavar las células con PBS, contar el número de células T CD8 + aisladas. Para evaluar la pureza de las células T CD8 + aisladas, incubar ~ 20.000-30.000 células en 20 l de CD16 de ratón / 32 anticuerpo (0,025 mg / ml) durante 10 min, a continuación, añadir 20 l de anticuerpo αCD8-APC (0,005 mg / ml) y se incuba durante 30 min. Performa todas las incubaciones a 4 ° C en PBS + 1% w / v BSA. Realizar análisis de citometría de flujo 25.
  2. La transferencia adoptiva de células T CD8 + aisladas y la visualización de su expansión después de la vacunación
    1. Realice la transferencia adoptiva de células T aisladas OT-I / Luc CD8 + en ingenuo C57BL / 6 ratones mediante la administración de 1-10 × 10 5 células en un volumen de 200 l de PBS mediante inyección intravenosa vena de la cola 22 (día -1). Teniendo en cuenta que los parches de piel y de la piel negro en ratones C57BL / 6 puede interferir con la señal bioluminiscente, albinos afeitado C57BL / 6 ratones son ideales para estos estudios.
    2. Después de un día (día 0), administrar la vacuna como se describe anteriormente (sección 2.2).
    3. Administrar 150 mg de luciferina por kg de peso corporal del ratón por vía intraperitoneal en un volumen de 300 l de PBS. Después de 10 min, anestesiar los ratones con isoflurano (como en el paso 2.2.1) y visualizar las células T OT-I / Luc CD8 + mediante la adquisición de la señal de la bioluminiscencia durante 5-10 min won un sistema de imágenes de animales conjunto (IVIS; consulte Wilson 26 para obtener instrucciones detalladas). Repita según sea necesario para los estudios longitudinales.

Las células 4. péptido-MHC de tetrámeros La tinción de PBMCs de Análisis del antígeno T CD8 + específicas

Nota: El procedimiento siguiente protocolo se puede realizar utilizando cualquiera de ratones C57BL / 6 adoptiva transferidos con las células T OT-I / Luc CD8 + o C57BL / 6 ratones sin la transferencia adoptiva.

  1. En un punto de tiempo deseado después de la vacunación, recoger aproximadamente 100 l de sangre (4-6 gotas) de los ratones a través de la técnica de sangrado submandibular 27 en un tubo revestido con K 2 EDTA y se invierte varias veces para prevenir la coagulación.
  2. Transferir 100 l de sangre a un tubo de microcentrífuga, añadir 1 ml de tampón de lisis, y se incuba durante 2 a 3 min con el fin de eliminar los glóbulos rojos (GR). Centrifugar las muestras durante 5 min a 1.500 xg y eliminar el sobrenadante. Si el pellet todavía unappears rojo (que indica eliminación incompleta de los glóbulos rojos), repetir la etapa de lisis con una breve incubación (<1 min) de tampón de lisis.
  3. Lavar las PBMCs restantes con 1 ml de tampón FACS (PBS + 1% p / v BSA) y centrifugar a 1500 xg durante 5 min.
  4. Aspirar el sobrenadante y resuspender la muestra en 20 l de ratón CD16 / 32 anticuerpo (0,025 mg / ml) para bloquear el anticuerpo no específica y mediada por FcR vinculante. Incubar durante 10 min a TA.
  5. Transferir las células a partir de tubos de microcentrífuga en 4 ml de fondo redondo de tubos de FACS. Añadir 20 l de H-2K b solución OVA Tetramer-SIINFEKL-PE de acuerdo con las especificaciones del fabricante a cada muestra y se incuba durante 30 minutos en hielo.
  6. Prepare el cóctel de anticuerpos (por ejemplo, αCD8-APC, αCD44-FITC y αCD62L-PECy7 anticuerpos (0.005, / ml de concentración 0.005 y 0.002 mg, respectivamente)). Añadir 20 l a cada muestra experimental, y se incuba durante 20 min en hielo. Preparar controles individuales fluoróforo por labeling células con cada tetrámero fluoróforo de etiquetado o anticuerpo a la concentración indicada anteriormente.
  7. Lavar 2 veces con tampón FACS y resuspender el sedimento final en tampón FACS que contiene 2 mg / ml de DAPI. Las células están ahora listas para citometría de flujo (análisis de detalles y ejemplos se pueden encontrar en Scheffold 25).

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Representative Results

Los pasos implicados en la síntesis de ICMVs se ilustran en la Figura 1 6. En resumen, una película lipídica que contiene cualquier fármacos lipófilos o colorantes fluorescentes se hidrata en presencia de fármacos hidrófilos. Los cationes divalentes, tales como Ca 2+, se añaden a conducir fusión de liposomas aniónicos en vesículas multilamelares. Ditiol agente de reticulación, tales como la TDT, se añade a los lípidos de maleimida-funcionalizado "grapas" en apposing capas de lípidos, y finalmente restante grupos maleimida externos se inactivó en una reacción con restos de PEG-tiolados. Una pequeña fracción de cada lote se puede someter fácilmente a las mediciones de control de calidad mediante la determinación de tamaño de partícula, índice de polidispersidad, y el potencial zeta con un DLS y zeta sistema de análisis de potencial. Las partículas resultantes son relativamente homogénea con un tamaño medio de 130 ± 20 nm, índice de polidispersidad de 0,22 ± 0,02, y el potencial zeta de -54 ± 3 mV para OVA-p encapsularartículos (Figura 1B y 1C). Rendimiento típico de partículas, medido en peso seco de las partículas, es de ~ 50% 6.

Utilizando el protocolo descrito anteriormente, ICMVs puede ser co-cargado con proteína de antígeno-fluoróforo etiquetado y colorante lipófilo fluorescente, permitiendo la visualización de antígeno y la entrega de nanopartículas in vivo. Para comparar los patrones de entrega antígeno en forma soluble frente en ICMVs, C57BL / 6 ratones se les administró sc en la base de la cola con 100 g de AlexaFluor555-etiquetado OVA ya sea en los LN inguinal solubles o etiquetados DiD formulaciones ICMV y drenantes fueron extirpados en varios puntos de tiempo para la preparación de DLN tejido crio-secciones. Visualización con microscopía confocal indicó que antígeno soluble rápidamente alcanzó los dLNs dentro de 4 horas, pero también se aclaró muy rápidamente con 24 horas (Figura 2) 7. En contraste, se detectaron ICMVs OVA-cargado en la periferia de dLNs por 24 hr, con la acumulación continuacomo se examinó en el día 4, el depósito de una gran cantidad de OVA-ICMVs en dLNs (Figura 2). Micrografías confocales también mostraron co-localización de etiquetado-AlexaFluor555 OVA y ICMVs dentro dLNs-etiquetados hizo, lo que sugiere que ICMVs permiten co-suministro estable de antígenos de proteínas y otros agentes inmunoestimuladores encapsulados dentro de ICMVs 7.

Aislamiento de células T CD8 + de OT-I / Luc ratón transgénico se puede realizar fácilmente con el kit de selección negativa magnético comercialmente disponible, produciendo ~ 8-12 x 10 6 células por un bazo de ratón. La figura 3 muestra ratones C57BL / 6 con adoptivamente transferidas 5 x 10 5 células OT-I / Luc CD8 + T en el día -1 y inmunizados en el día 0 con la administración subcutánea de 10 mg de OVA y 0,3 g de MPLA ya sea en formulaciones solubles o ICMV. Imágenes de bioluminiscencia con IVIS realizó en el día 0 antes de la vacunación mostró una mínima señal de OT-I / Luc. Sin embargo, después de la vacunación por día 4, los ratones inmunizadoscon OVA / MPLA-ICMVs tenía señal de bioluminiscencia robusta dentro LN inguinal, que son los LN drenan la región base de la cola 28. En contraste, los ratones inmunizados con la forma soluble de la vacuna mostraron mucho más reducido expansión de células T OT-I / Luc CD8 + dentro de dLNs inguinales.

Uso de OVA como un antígeno modelo permite la monitorización de la expansión de endógenas células T CD8 + específicas para OVA 257-264 péptido inmunodominante (SIINFEKL). Por ejemplo, C57BL / 6 ratones fueron inmunizados los días 0, 21, y 35 con la administración sc de 10 g OVA y 0,3 g MPLA en cualquiera ICMVs o forma soluble, y las frecuencias de células SIINFEKL-T CD8 + específicas entre las células T CD8 + en PBMCs se determinaron por análisis de flujo citométrico de PBMCs teñidas con SIINFEKL-H-2K b tetrámero-PE. La Figura 4A muestra un resultado representativo de citometría de gráficos de dispersión de SIINFEKL-H-2K b tetrámero + células entre las células T CD8 + en PBMC en día 41 6. Figure 4B muestra gráficos de dispersión representativos de células CD62L + CD44 + con fenotipo de memoria central entre las células T CD8 + SIINFEKL-tetrámero +. Monitoreo semanal de PBMCs se muestran en la Figura 4C indicó que la vacuna soluble OVA provocó mínima expansión de células T CD8 + específicas de antígeno, mientras que la vacunación ICMV suscitó significativamente más fuerte respuestas de células T CD8 +, logrando una células T pico de 28% SIINFEKL-tetrámero + en el CD8 + población de células T por día 41 6. Utilizando el protocolo de tinción de tetrámero que aquí se presenta, se observó la frecuencia de fondo de 0,11% ± 0,04% de células T-OVA específica (N = 15) en los animales no tratados o tratados con PBS, y podemos detectar aumento estadísticamente significativo en las frecuencias específicas de antígeno de células T CD8 + tan bajas como 0,46% ± 0,05% (valor de p <0,005, datos no mostrados).

Figura 1
(A) se sintetizan en los siguientes 4 pasos.; (I) tensioactivos aniónicos, liposomas maleimida-funcionalizado se prepara a partir de películas lipídicas secas; (Ii) se añaden cationes divalentes para inducir la fusión de liposomas y la formación de vesículas multilamelares; (Iii) Se añaden ditioles membrana permeable, que reticular maleimida-lípidos en bicapas lipídicas yuxtapuestas en las paredes de la vesícula; y (iv) las partículas lipídicas resultantes se pegiladas con PEG terminada en tiol. (B) la distribución de partículas como Representante analizó por DLS se muestra. (C) Tamaño medio hidrodinámico, índice de polidispersidad y potencial zeta de ICMVs co-cargado con OVA y MPLA se muestran. El panel (A) se ha modificado de Moon et al. 6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.

Figura 2
Figura 2. Análisis de antígeno de drenaje a los ganglios linfáticos con microscopía confocal. C57BL / 6 ratones fueron inmunizados con 100 g-fluoróforo conjugado OVA (mostrado en rojo) y 5 g MPLA ya sea en solución o ICMVs (mostrado en azul). El drenaje de los ganglios linfáticos inguinales fueron extirpados en los puntos de tiempo indicados, cryosectioned, y la imagen con la microscopía confocal. Se muestran micrografías confocal representativos. Señales rosadas indican co-localización de OVA y ICMVs. Esta cifra se ha modificado desde la Luna et al. 7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Monitorinla expansión de células T después de la vacunación g. C57BL / 6 ratones albinos se transfirieron adoptivamente iv con 5 x 10 5 células T Luc + OT-I CD8 + en el día -1. En el día 0, los animales fueron administrados con 10 g de OVA y 0,1 g de MPLA ya sea como formulaciones solubles o ICMV. Los animales fueron anestesiados con isoflurano y administrar con luciferina (150 mg / kg, 300 l ip inyectado), y la señal de la bioluminiscencia de las células T Luc + OT-1 CD8 + fue adquirido con IVIS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. La expansión de las células endógenas-OVA específica T CD8 + después de la vacunación ICMV. C57BL / 6 ratones fueron inmunizados con 10 g de OVA y 0,1 g de MPLA ya sea isolución n o ICMVs en los días 0, 21 y 35 (flechas). La frecuencia de células T específicos de OVA entre las células mononucleares de sangre periférica se evaluó con el tiempo por análisis de citometría de flujo de células T CD8 + SIINFEKL-MHC-I + tetrámero. (A) El flujo de Representante citometría de gráficos de dispersión de ratones individuales en el día 41 muestran SIINFEKL-MHC-I tetrámero + células T CD8 + y células CD44 + CD62L + (B), marcador de las células T de memoria centrales. (C) la cinética global de la expansión de células T y la contracción se muestra. Esta cifra se ha modificado desde la Luna et al. 6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.

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Discussion

El protocolo previsto en este artículo se describe la síntesis y caracterización de un nuevo sistema de nanopartículas a base de lípidos, denominados ICMVs, y proporciona el proceso de validar la efectividad de las formulaciones vacunales basados ​​en nanopartículas para inducir respuestas de células T CD8 + específicas de antígeno. ICMV síntesis se completa en todas las condiciones acuosa, que es una importante ventaja en comparación con otros sistemas de nanopartículas poliméricas comúnmente utilizados (por ejemplo, poli (lactida-co-glicolida) partículas de ácido), que normalmente requieren disolventes orgánicos para la preparación, a menudo resultando en la pérdida de antigenicidad en proteínas antígenos 29,30. Además, ICMVs beneficio de la amplia estabilidad y capacidad para encapsular moléculas tanto hidrófobos e hidrófilos 6, permitiendo así co-administración de antígenos y adyuvantes dirigidos al mismo compartimiento intracelular dentro de APCs 31,32. Usando ICMVs como una nanopartícula vacuna modelo, aquí hemos esbozado los procedimientospara (1) la síntesis de nanopartículas y caracterización, (2) la validación de drenaje de nanopartículas a dLNs, y el examen de obtención de respuestas de células T CD8 + específicas de antígeno usando (3) una técnica de imágenes de bioluminiscencia no invasivo y (4) el péptido-MHC ensayo de tinción de tetrámero en PBMCs.

Es crítico para asegurar la uniformidad en la síntesis de nanopartículas de lote a lote, especialmente para tamaño de partícula y carga de la superficie, ya que pueden afectar en gran medida el drenaje linfático y la captación por las APC tras la administración in vivo. DLS y análisis del potencial zeta proporcionan métodos rápidos de control de calidad sobre el tamaño de las partículas y la carga superficial. Para un análisis más detallado sobre la morfología de las partículas individuales, estas técnicas se pueden complementar con microscopía electrónica de alta resolución, como la crio-microscopía electrónica (crio-ME) que preserva la morfología de las partículas "suaves" en la capa acuosa vitrificado 6,33,34 . Eficiencia de encapsulación de antígenos y adjuvhormigas también deben ser determinados y se mantienen uniforme entre las síntesis. Los adyuvantes, tales como MPLA, se pueden etiquetar con un fluoróforo 6 mientras que los antígenos proteicos se pueden cuantificar usando kits de cuantificación de proteínas absorbance- y basados ​​en fluorescencia, o analizaron utilizando SDS-PAGE y 35 de Coomassie o tinción de plata 36, y cuantificados sobre la base de la intensidad de banda . Las inconsistencias en la preparación de partículas pueden resultar de reactivos caducados o almacenados pobremente, como la reactividad óptima es necesario para la síntesis completa. Con este fin, maleimide- y tiol reactivos funcionalizados deben mantenerse en pequeñas alícuotas a -80 ° C sin ciclos de congelación-descongelación frecuentes.

Las partículas menores de 100 nm se piensa generalmente para entrar efectivamente los vasos linfáticos y el tráfico a dLNs 13, mientras que las partículas más grandes (500-2.000 nm) requieren el transporte activo por el residente de tejido DC 12,37. En nuestras manos, ICMVs con el tamaño hidrodinámico que van 150-250 Nm localizados de manera eficiente y persistieron en el DLN, dando como resultado una amplia CTL y respuestas humorales 6,7. Dentro de 24 horas de la administración, ICMVs se asociaron con macrófagos seno subcapsular en dLNs, y los análisis de citometría de flujo realizaron en los días 1 y 4 indican que la mayoría de ICMVs dentro dLNs fueron tomadas por APCs LN-residentes con sólo una pequeña porción de partículas asociado con Langerhans y los DC dérmicas 7. Estos resultados indicaron que el transporte pasivo es el principal modo de ICMV tráfico a dLNs. Estos estudios han utilizado nanopartículas fluoróforo de etiquetado y antígenos proteicos para delinear sus patrones de localización y distribución en dLNs. La microscopía confocal de dLNs cryosectioned permite histoquímica inmunofluorescencia adicional para la identificación de las estructuras LN (por ejemplo, GL-7 expresión en centros germinales) y las células que interactúan con los componentes de la formulación (por ejemplo, países en desarrollo - CD11c, macrófagos - F4 / 80, CD169, y B- células y #8211; B220) 7,9. Esta técnica se puede realizar en paralelo con los análisis de citometría de flujo de células cosechadas a partir de dLNs para delinear los subconjuntos de APCs responsables de la captación de partículas 7,9 o con imágenes de todo el animal para cuantificar la administración de vacunas en el sitio de inyección para dLNs 38,39, siempre que las señales fluorescentes son fuertes y autofluorescencia del tejido no interfiere con las señales.

La inmunización efectiva requiere la activación robusta y expansión de las células T citotóxicas específicas de antígeno, que pueden ser rastreados por imágenes de bioluminiscencia de todo el cuerpo después de la transferencia adoptiva de bioluminiscente, las células T transgénicas específicas de antígeno, seguido de la vacunación. El beneficio adicional de este método es el potencial para la visualización repetida de tráfico de CTL en los mismos animales durante un período prolongado, reduciendo así el número de animales necesarios para los análisis inmunológicos y evitando el uso de laborioso procedur aislamiento de célulases. Usando esta técnica de formación de imágenes, hemos demostrado recientemente que la administración pulmonar de ICMVs co-cargado con antígeno de proteína y un agente inmunoestimulador llevado a potente elicitación de antígenos específicos de células T CD8 + en el pulmón y los LN mediastínicos y posterior difusión de los CTL a tejidos mucosos distales , incluidas las placas de Peyer, el ciego y el tracto vaginal 9. Los análisis de citometría de flujo mostró que estas células T CD8 + expandidas fueron recién impresas con un fenotipo "mucosal-homing" caracterizado por α 4 β 7 + expresión de la integrina y las respuestas inmunes protectoras mediadas contra la mucosa desafío viral 9. La formación de imágenes de todo el animal de las células T CD8 + bioluminiscentes también fue utilizado recientemente por Hailemicheal et al., Que demostró que el péptido antígeno tumoral formula en adyuvante incompleto de Freund (IFA, emulsión de aceite-en-agua) dio como resultado el secuestro de las células T en el sitio de la inyeccióncon la vacuna "depot" lejos de las masas tumorales, dando lugar a disfunción de las células T y la supresión 40.

Tinción de tetrámeros se ha utilizado ampliamente en el pasado para cuantificar el nivel de las respuestas de CTL endógenos resultantes de diversas formulaciones de vacunas 21. Esta técnica también es relevante y comúnmente utilizado en los ensayos clínicos de inmunoterapia de cáncer humano pronto para confirmar las respuestas de CTL a antígenos específicos asociados a tumores 41,42. PBMCs se pueden recoger fácilmente de los ratones y se prepararon para citometría de flujo; sin embargo, no puede revelar la extensión completa de la expansión de células T debido a la localización de células a las vacunas depot-forman como se ha mencionado antes o dentro de los tumores en modelos de cáncer, por lo que requiere un análisis más extenso. Compatibilidad de este método con citometría de flujo permite la determinación de células T específicas de antígeno con marcadores de memoria (CD44, CD62L, CD127, Bcl-2, y KLRG-1) para distinguir efector, la memoria central, y ce memoria efectorlls entre los tetrámero + células T 43 o de larga duración CTL residentes del tejido 44,45 (que se resumen en los últimos comentarios 46,47). Sin embargo, el ensayo de tinción de tetrámero proporciona sólo la evaluación inicial de las respuestas CTL ya que las células T específicas de antígeno altamente expandidas pueden mostrar signos de agotamiento inmune 48,49. Evaluación funcional de respuestas de CTL se puede realizar mediante el examen de la liberación de citoquinas con inmunospot ligado a enzima (ELISPOT) 50 o tinción intracelular de citoquinas 51 después de la estimulación ex vivo de linfocitos con epítopos mínimos, así como mediante la medición de los niveles intracelulares de perforina y granzima B 52 y extracelular expresión de CD107a y CD107b sobre la desgranulación 53. Además, la función citolítica de CTL se puede evaluar directamente con los ensayos de CTL de citotoxicidad realizados in vitro o in vivo 54-56.

La inducción de respuestas inmunes humoralesdespués de la vacunación de nanopartículas puede ser estudiado en paralelo con la célula T CD8 + análisis presentados aquí. Los títulos de anticuerpos pueden ser analizados por el método tradicional de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), mientras que la afinidad del anticuerpo y la amplitud de reconocimiento epítopo pueden ser evaluados mediante la modificación del protocolo de ELISA con el uso de agente caotrópico (por ejemplo, urea) durante la unión del anticuerpo a la sustrato y el uso de subdominios dentro de antígenos como sustratos, respectivamente 7. Elicitación de respuestas humorales potentes requiere la expansión de auxiliares folicular células T CD4 + (T fh) 57. Para investigar la expansión de células T fh en respuesta a la vacunación de partículas, el protocolo presentado aquí se puede adaptar fácilmente para el aislamiento de células T CD4 + específicas de antígeno a partir de ratones transgénicos OT-II, seguido por transferencia adoptiva de células en ratones receptores no tratados previamente. Después de la vacunación, los tejidos linfoides pueden ser cosechadas y se analizaron con análisis de citometría de flujo para disuadirexpansión de la mina de las células T específicas de antígeno fh (identificados por su CD4 + CXCR5 + PD-1 + fenotipo) 7.

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Disclosures

Perkin Elmer siempre que el coste de producción incurridos durante la publicación de este artículo.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud otorga 1K22AI097291-01 y por el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias de traslación de los Institutos Nacionales de la Salud con el Número Premio UL1TR000433. También reconocemos Prof. Darrell Irvine en el MIT y profesor Matthias Stephan en el Centro del Cáncer Fred Hutchinson por su contribución en el trabajo inicial sobre las nanopartículas de vacunas y ratones transgénicos OT-I / Luc.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB) Avanti Polar Lipids, INC. 870012
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, INC. 850375
Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA) Avanti Polar Lipids, INC. 699800
20 ml glass vials Wheaton 0334125D
Symphny Vacuum Oven VWR 414004-580
Ovalbumin (OVA) Worthington 3054
Bis-Tris Propane (BTP) Fisher BP2943
Q125 Sonicator (125 W/20 kHz) Qsonica Q125-110
Dithiothreitol (DTT) Fisher BP172
2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH) Laysan Bio MPEG-SH-2000-1g
Malvern ZetaSizer Nano ZSP  Malvern
ZetaSizer Cuvettes Malvern DTS1070
2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy
1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID) Life Technologies D-7757
Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS) Life Technologies A37571
Tissue-Tek OCT freezing medium  VWR 25608-930
Tissue Cryomolds VWR 25608-922
3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging
C57BL/6 mice Jackson 000664
Albino C57BL/6 mice Jackson 000058
OT-1 C57BL/6 mice Jackson 003831
70 μm nylon strainer BD 352350
EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit StemCell 19853
IVIS® whole animal imaging system Perkin Elmer
4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells
K2EDTA tubes BD 365974
ACK lysis buffer Life Technologies A10492-01 
Anti-CD16/32 Fc Block Ebioscience 14-0161-86
H-2Kb OVA Tetramer MBL TS-5001-1C
Anti-CD8-APC BD 553031
Anti-CD44-FITC BD 553133
Anti-CD62L-PECy7 Ebioscience 25-0621-82
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) SIGMA D8417-10MG
CyAn Flow Cytometer Beckman Coulter
FlowJo Software FlowJo

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