نموذج الفأر من منيع للمستضد الخيفي الناجم عن رفض الأوعية الدموية وزراعة تصلب الشرايين

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Enns, W., von Rossum, A., Choy, J. Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis. J. Vis. Exp. (99), e52800, doi:10.3791/52800 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

على مدى السنوات الماضية 30+، قد تضاءلت التقدم في الأدوية المثبطة للمناعة رفض الكسب غير المشروع بسبب الرفض الحاد ولكن يبقى الرفض المزمن تحديا رئيسيا. مظهر من مظاهر الرئيسي لرفض زرع قلب المزمن هو تصلب الشرايين زرع (TA) 1،2. يتميز هذا الشرط من قبل تضخم باطنة وضعف حركي الشرايين المزروع ويتطور نتيجة لاستهداف المناعية لخلايا العضلات البطانية وسلس من قبل النظام المناعي المتلقي. وسلط الضوء على استهداف معين من الأوعية الدموية الكسب غير المشروع نظرا لاعتراف الأجانب معقد التوافق النسيجي الببتيد الرئيسي (MHC) من خلال تطوير TA حصريا في الشرايين الكسب غير المشروع في حين أن يجنب السفن المضيفة 3. وتمشيا مع هذه هي الملاحظة التي TA لا يحدث تجريبيا عند المتلقي هو متطابقة وراثيا إلى الجهة المانحة أو عند المتلقي يفتقر T و B الخلايا 4. إصابة الأوعية الدموية المناعية وdysfunctioن يتسبب في تطوير سماكة باطنة والتليف، فضلا عن تراكم الدهون الشاذة والبروتينات ECM، في TA 5. باطنة سماكة تميل إلى أن تكون متحدة في جميع أنحاء كامل 4-6 شجرة الشرايين. فقدان الكسب غير المشروع وفاة تحدث عادة نتيجة لنقص التروية التدريجي الناجم عن انسداد الشرايين اللمعية المزروع 4.

في عام 1991، Mennander وآخرون. 7 رائدة نموذجا مداخلة الأبهر في الفئران لنموذج TA. لقد عدة مجموعات تكييفها في وقت لاحق هذا الإجراء لاستخدامها في الفئران. في هذا النموذج، وقطاعات الأبهر المزروع تتطور الآفات التي تحتوي على مزايا مماثلة لTA لاحظت في زرع السريرية. وهذا يشمل باطنة سماكة تتميز تراكم خلايا تشبه العضلات الملساء والكريات البيض المتلقي 7. على مدى العقود الماضية 2 وقد استخدم هذا النموذج لتوليد فكرة مهمة في آليات الأوعية الدموية إصابة والرفض وTA. يمكن أن يكون لناإد لبحث المسائل المتعلقة الاستجابات المناعية والأوعية الدموية خلال علم الأمراض في الشرايين. اختيار الآثار مستضد عدم تطابق القدرة على المعالجة الملائمة لهذه الأسئلة.

زرع عبر الحواجز MHC كاملة يسمح بإجراء تقييم شامل من الاستجابات المناعية التي تعرف أن تشارك في رفض زرع الأعضاء. وهذا يشمل CD4 و CD8 T الاعتراف خلية المباشر واستهداف الأجانب الببتيد MHC قدمها الخلايا المشتقة من الكسب غير المشروع، CD4 غير المباشر (وربما CD8) T الاعتراف خلية واستهداف alloantigens المستمدة من الكسب غير المشروع الذي قدمه مستضد المتلقي تقديم الخلايا، والأضداد الاعتراف بوساطة من alloantigens على سطوح الخلايا الوعائية 8. ومع ذلك، فإن استجابة الأوعية الدموية للإصابة في كامل التجارب MHC متطابقة قد يكون مختلفا عن ذلك الذي لوحظ سريريا. أظهر جونسون وآخرون. 9 أنه في ترقيع مداخلة الأبهر زرعها عبر كامل الحاجز MHC عدم تطابق، ومعظم منالخلايا neointimal من أصل المتلقي وليس من أصل المانحة. وهذا يختلف عن تلك التي لوحظت في عمليات زرع الإنسان حيث معظم خلايا العضلات الملساء باطنة من أصل المانحة 9،10. لحساب هذا القيد، وقد وضعت نماذج تجريبية البديلة التي تشمل تطعيم عبر الطفيفة عدم التطابق التوافق النسيجي المستضد التي تثير ردود الأوعية الدموية التي تشبه على نحو أوثق تلك التي لوحظت في زرع السريري 11. في حين أن هذه النماذج البديلة تسمح الاستنتاجات الهامة التي ينبغي اتخاذها بشأن الردود الأوعية الدموية التي تدفع تطوير TA، والعمليات المناعية التي تسبب رفض الأوعية الدموية في القصر مستضد التوافق النسيجي الطعوم غير متطابقة تماما لا إعادة الاستسلام، تلك التي تحدث في إعداد سريرية. على سبيل المثال، يتم الاعتراف مستضدات التوافق النسيجي طفيفة سيئة من قبل الكسب غير المشروع الأجسام المضادة التفاعل 12. وبالنظر إلى الاعتبارات المذكورة أعلاه، فإنه من المهم النظر في questi المرضيةعلى يجري بحثها عند اختيار نوع المستضد عدم تطابق المستخدمة في نموذج مداخلة الأبهر. نحن هنا وصف بروتوكول مفصلة عن الفئران الأبهر مداخلة التطعيم. وصفنا مداخلة التطعيم بين الفئران كاملة MHC-متطابقة ولكن يتم استخدام نفس البروتوكول للتطعيم عبر مستضد سلالات الفئران غير متطابقة الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم استعراض كافة البروتوكولات في هذه الدراسة والموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاق رعاية الحيوان جامعة سايمون فريزر. استخدام BALB / cYJ (H2 د) الفئران المانحة وC57BL / 6 الفئران (H2 ب) المستفيدة لفحص ردود الفعل خيفي. وتستخدم الفئران لإجراء التجارب تتراوح أعمارهم بين 8 إلى 12 أسابيع. استخدام الفئران إما ذكرا أو أنثى. تتكون الضوابط مسانج قطاعات الأبهر من C57BL / 6 المانحين إلى C57BL / 6 المتلقين.

1. المانحة والمتلقية إعداد

ملاحظة: يتم تخدير كل من المتبرع والمتلقي وأعدت قبل الجراحة لتقليل نقص التروية من الكسب غير المشروع. يتم استخدام التخدير عن طريق الحقن في بروتوكول لمنع عرقلة الحيوانية المعدات اللازمة لإيصال التخدير استنشاقه. ومع ذلك، إذا رغبت في ذلك، مخدر استنشاقه هو بديل مناسب. من الحقن الأولي من التخدير، والإجراء بأكمله يستغرق حوالي 90 دقيقة لإكمالها. الوقت الدماغية من الكسب غير المشروع هو أقل ثان 30 دقيقة.

  1. تخدير الفأر مع الحقن داخل الصفاق الكيتامين (100 ملغ / كغ، و 10 ملغ / مل)، وزيلازين (10 ملغ / كغ، 1 ملغ / مل). سيتم مخدرا الماوس في غضون 10 إلى 15 دقيقة. تقييم عمق التخدير بواسطة معسر الجزء الدهنية من لوحة القدم الحيوان. إدارة 1/3 من الجرعة الأصلية للكوكتيل مخدر، حسب الحاجة، حتى الحيوان لا يحمل الانسحاب لا ارادي. رصد معدل التنفس عن كثب بعد يدار كل الكوكتيل. أثناء الجراحة، وتقييم مستوى التخدير كل 15 دقيقة عن طريق معسر جدار البطن الأمامي مع زوج من الملقط. ينبغي أن تظل الفئران مخدرة بعمق من 60 إلى 90 دقيقة.
  2. تليين عيون الماوس، مع مرهم للعين لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
  3. حلاقة الشعر أقرب إلى الجلد ممكن على المنطقة البطنية البطن من منتصف الصدر إلى العانة. توخي الحذر بشكل خاص على عدم شق أي الجلد. لا تستخدم كريم مزيل الشعر لأنه قد يتم استيعاب طn لالجلد ويمكن أن تكون التهابات.
  4. وضع الحيوان في موقف ضعيف على منشفة فوق الطاولة أو وسادة التدفئة.
  5. تنظيف موقع الجراحية مع فرك مبدئي مع 2٪ chlorohexidine. إعداد منطقة عمل كبيرة لتعظيم الجراحي الميداني. بدء الغسل في وسط الموقع جراحية ونقل إلى الخارج بطريقة خطية أو دائرية. التخلص من الشاش. كرر هذا الإجراء لا يقل عن 5 مرات أكثر. تطبيق لوحة الإعدادية الكحول لنفس المنطقة. وبمجرد أن الكحول هو جاف، وإعداد منطقة نظيفة مع حل Betadine وثنى بشاش معقم.

2. نهاية إلى نهاية التحام الداخلي

  1. عملية المانحة
    1. الحفاظ على تقنية العقيم طوال العملية. تنظيف جميع كونترتوب وطاولة الجراحة الأسطح مع 0.5٪ تسارع الهيدروجين بيروكسيد حل قبل استخدامها. التفاف وتعقيم جميع الأدوات الجراحية، الشاش، والستائر، والعباءات قبل استخدامها. التحقق من عقم الصكوك مع البخارمعقم شريط مؤشر وضعها في كل علبة. وتستخدم القفازات الجراحية المعقمة والتخلص منها بين العمليات الجراحية. لجراحات متعددة، تعقيم الأدوات الجراحية بين الاستخدامات مع الساخن الزجاج حبة تعقيم.
    2. ضع الماوس المانحة في موقف ضعيف على نظيفة، رقيقة مجلس زجاجي ملفوفة مع ثنى العقيمة تحت المجهر التشغيل في 8-30X التكبير.
    3. بعد التأكد من التخدير الجراحي كافية على النحو المبين في القسم 1.1، المضي قدما في عملية جراحية.
    4. باستخدام مقص العقيمة، وجعل خط الوسط واحد أقل شق البطن الطولية، من العانة إلى عملية سيفي الشكل.
    5. باستخدام ضام صغيرة، افتح جدران البطن لفضح تجويف.
    6. باستخدام القطن المعقم يميل تطبيقها، سحب بلطف الأمعاء متفوق على يسار الحيوان، وتغطي مع الشاش مبللة بمحلول ملحي. نقل الأعضاء التناسلية دون المستوى وتحديد الشريان الأورطي infrarenal والوريد الأجوف السفلي (IVC). موييسعشرة الأنسجة المعرضة بشكل دوري مع محلول ملحي.
    7. باستخدام رقم 5 ملقط طبي، فصل الشريان الأورطي من IVC، من مستوى الشريان الكلوي الأيسر إلى التشعب. استخدام 10-0 الغرز حيدة البولياميد لligate فروع صغيرة بالقرب من الشريان الأورطي.
    8. مرة واحدة وقد تم فصل الشريان الأورطي المتبرع من IVC، تشبع السفينة مع المياه المالحة، وتغطي تجويف يتعرض مع شاش مبلل وتعيين المانحة جانبا على منطقة معقمة. التحقق من حالة المتبرع (الجهاز التنفسي وظيفة القلب والأوعية الدموية، وعمق التخدير) كل 15 دقيقة. بدء العمل على المتلقي، وعزل الشريان الأورطي كما هو موضح أدناه (خطوات 2.2.1 إلى 2.2.7).
    9. مرة واحدة وقد تم فصل الشريان الأورطي المستلم من IVC وتوضع جانبا، وعودة المانحة تحت المجهر. المشبك عبر (القريبة والبعيدة لهذا الجزء من الفائدة) الشريان الأورطي المانحة، ما يقرب من 5 مم وبصرف النظر، مع اثنين من 4 مم المشابك الاوعية الدموية الدقيقة.
    10. باستخدام microscissors Vannas-توبنجن،المسح الشامل شريحة الكسب غير المشروع الصغير (3-4 ملم في الطول) من الشريان الأورطي البطني.
    11. باستخدام 25 G 5/8 إبرة تعلق على حقنة، تدفق الشريان الأورطي رفعه مع heparinized (100 U / مل) محلول ملحي. ضمان رأس الإبرة لا تتلامس مع السفينة.
    12. مكان الشريان الأورطي في heparinized (100 U / مل) محلول ملحي على الجليد وتوضع جانبا. في حين لا يزال تحت التخدير العميق، والإفراج عن المشابك الاوعية الدموية الدقيقة. الموت ببطء المانحة من خلال استنزاف.
    13. زرع السفينة المانحة خلال 30 دقيقة من الختان. على الرغم من أنه من الممكن استخدام السفينة المانحة واحد لعدة مستلمين التي كتبها استئصال بطول أكبر من الشريان الأورطي، والحفاظ على الوقت الدماغية إلى أقل من 30 دقيقة.
  2. عملية المتلقي
    1. الحفاظ على تقنية العقيم طوال العملية، كما هو الحال في عملية المانحة.
    2. ضع الماوس المتلقي في موقف ضعيف على لوحة زجاجي رقيق ملفوفة مع ثنى العقيمة تحت المجهر التشغيل في 8-30X التكبير.
    3. AFثالثا ضمان التخدير المناسب، والمضي قدما بالجراحة عند الحيوان لا يحمل الانسحاب لا ارادي.
    4. باستخدام مقص العقيمة، وجعل خط الوسط واحد أقل شق البطن الطولية، من العانة إلى عملية سيفي الشكل.
    5. باستخدام ضام صغيرة، افتح جدران البطن لفضح تجويف.
    6. باستخدام القطن المعقم يميل تطبيقها، سحب بلطف الأمعاء متفوق على يسار الحيوان، وتغطي مع الشاش مبللة بمحلول ملحي. نقل الأعضاء التناسلية دون المستوى وتحديد الشريان الأورطي infrarenal وIVC. ترطيب الأنسجة المعرضة بشكل دوري مع محلول ملحي.
    7. فصل الشريان الأورطي من IVC، من مستوى الشريان الكلوي الأيسر إلى التشعب. إذا لزم الأمر، استخدم 10-0 خيوط البولي أميد حيدة لligate فروع صغيرة بالقرب من الشريان الأورطي.
    8. المشبك عبر (القريبة والبعيدة لهذا الجزء من الفائدة) الشريان الأورطي، ما يقرب من 5 مم وبصرف النظر، مع اثنين من 4 مم المشابك الاوعية الدموية الدقيقة.
    9. باستخدام microscissors Vannas-توبنجن، وجعل بضع الأبهر أفقي واحد وبتر شريحة صغيرة (لا يزيد عن 0.5 ملم) من الشريان الأورطي البطني لاستيعاب الكسب غير المشروع الأبهر المانحة.
    10. تدفق الشريان الأورطي رفعه مع heparinized (100 U / مل) محلول ملحي. يجب أن يكون الأبهر الكسب غير المشروع المانحة من الطول المناسب للاتصال مقطوع نهايات الأبهر المستلم.
    11. وضع الكسب غير المشروع الأبهر المانحة في موقف مثلي ويفاغر نهاية الكسب غير المشروع من قبل الجهة المانحة لهذه الغاية المستلم، مطابقة الكسب غير المشروع التوجه التشريحية منها مع أن المتلقي.
    12. فهم بلطف الط الغلالة السفينة وإيفرت باستخدام قليلا ملقط NO.5 الطبية. باستخدام ملقط، دفع إبرة تعلق على 10-0 مادة البولي أميد حيدة خياطة من خلال سمك الكامل للجدار الوعاء الدموي من أجل تأمين الكسب غير المشروع الأبهر المانحة لسفينة مقطوعة المستلم. احرص على التأكد من أن افتتاح السفينة لا أغلقت ر المقررس خياطة غير مقصودة من الجدار الخلفي للسفينة.
    13. لغرز مستمرة، ومكان الغرز البقاء في 9:00 في كل من طرفي العليا والسفلى من الكسب غير المشروع. ابتداء من نهاية العلوي من الكسب غير المشروع من 03:00، يفاغر نهايات مقطوعة مع 2 خيوط تشغيل وتأمين خياطة لخياطة البقاء.
      1. الوجه الكسب غير المشروع مرارا ومواصلة خياطة تشغيل لالظهرية جزء من السفينة، وتلبية خياطة أصل الوقف. تأمين دون تطبيق الكثير من الضغط على متن السفينة. تكرار خياطة لأقل مفاغرة.
        ملاحظة: خيوط متقطعة تبدأ بنفس طريقة خياطة مستمرة باستثناء أن السفينة هو anastomosed مع ثلاث غرز فصل بين الغرز البقاء. الوقت مفاغرة هو عادة 20 دقيقة.
    14. وبمجرد أن مفاغرة كاملة، والإفراج عن المشبك الاوعية الدموية الدقيقة البعيدة للسماح الدم إلى الوراء في التدفق وتحقق من وجود تسرب من المواقع anastomosed. إذا كان هناك تسرب، فوراذ وضع غرزة لإغلاق موقع معيب. إذا لم يكن هناك نزيف في المواقع، ثم حرر المشبك الداني.
    15. دراسة الزرع وتحقق أنه لا يوجد انسداد الدم في الكسب غير المشروع، والقريبة والجزء الأعلى من السفينة المستلم. نمط نبض قوي في السفينة كل من المتبرع والمتلقي هو مؤشر أساسي أن الدم يتدفق بحرية. باستخدام زوج من ملقط، فهم بلطف واحدة من نهاية الغرز إقامة وإيفرت قليلا السفينة للتفتيش على الجدار الخلفي للسفينة.
      ملاحظة: يجب أن يكون هناك التجعيد من جدار الوعاء الدموي على طرفي المواقع anastomosed. ضعف تدفق الدم بعد إزالة المشابك هو علامة على تجلط الدم.
    16. باستخدام أدوات تطبيقها القطن يميل، وعودة الأمعاء إلى تجويف البطن.
    17. مع حامل إبرة Castroviejo وملقط غريف، إغلاق جدار البطن مع خيوط البولي بروبلين باستخدام 5-0 خياطة مستمرة. إغلاق طبقة الجلد مع نفسهالغرز باستخدام الإغلاق تحت البشرة.
    18. إدارة Torbugesic (1 ملغ / كلغ) ايم فور الانتهاء من عملية الزرع.
    19. تعطي على الفور، في النظام، Atipamezole (1 ملغ / كلغ)، كيتوبروفين (5 ملغ / كلغ) ودرجة حرارة الحل تحت الجلد أفرز اللبن قارع الأجراس.
    20. مباشرة بعد الجراحة، وضع الفئران في قفص ساخنة تحت بطانية المياه بين عشية وضحاها (12 ساعة). خلال فترة الانتعاش مخدر، ضع الحيوانات وحدها في منطقة دون عائق جافة ونظيفة. خط القفص (تعقيمها) مع مناشف ورقية نظيفة وضبط درجة حرارة بطانية المياه إلى ما يقرب من 20 إلى 22 ° C. توفير يطحن الجافة والرطبة libitum الإعلانية في الطابق القفص.
      ملاحظة: ثمة عنصر هام من الرعاية بعد الجراحة هو مراقبة تدخل الحيوانية والمناسب، حسب الاقتضاء، أثناء التعافي من التخدير والجراحة. فإن شدة اللازمة للرصد تختلف مع الحيوان، وربما تكون أكبر خلال فترة الانتعاش التخدير الفورية وشاركmpared لاحقا في التعافي بعد العملية الجراحية.
    21. باستمرار مراقبة الحيوانات وجود التخدير خضعوا مراقبتها حتى يشفى تماما. يجب أن يكون الحيوان قادرا على الحفاظ على الاستلقاء القصية دون مساعدة، وأنه يجب أن تظهر هادئة وخالية من الألم قبل أن يمكن تركت دون معالجة.
    22. إعطاء البوبرينورفين (0.1 ملغم / كغم BID) وكيتوبروفين (5 ملغ / كغ SID) لمدة ثلاثة أيام، على حد سواء تحت الجلد.
    23. مراقبة القلب والأوعية الدموية وظيفة الجهاز التنفسي، درجة حرارة الجسم، وآلام ما بعد الجراحة أو عدم الراحة أثناء التعافي من التخدير لمدة لا تقل عن ثلاثة أيام. قد تكون هناك حاجة للرعاية إضافية، مثل إدارة المسكنات وأدوية أخرى، والسوائل الوريدية للحد من الجفاف والكهارل الخسارة.
    24. تقييم نجاح جراحة زرع من خلال مراقبة وظيفة الحركة في الأطراف الخلفية. النجاح الكامل لعملية الزرع ينطوي على تدفق الدم دون عائق إلى أطرافه الخلفية والذيل، والتي يجب أن يكون فوريا بعد شفائهم من أنيمالقاعدة والشفاء الكامل مع عدم وجود شلل في الأطراف الخلفية في اليوم الثاني

3. الأنسجة مجموعة

ملاحظة: تتراوح نقطة نهاية محددة سلفا 3-60 أيام حسب نوع التحليل المطلوب وطبيعة عدم تطابق المستضد. عموما، سماكة باطنة الشريان هي قوية في يوم 30 بعد زرع في جميع أنحاء كاملة MHC سلالات الفئران غير متطابقة.

  1. تخدير الفأر مع الحقن داخل الصفاق الكيتامين (100 ملغ / كغ، و 10 ملغ / مل)، وزيلازين (10 ملغ / كغ، 1 ملغ / مل). تقييم عمق التخدير بواسطة معسر الجزء الدهنية من لوحة القدم الحيوان. المضي قدما في عملية جراحية عند الحيوان لا يحمل الانسحاب لا ارادي.
  2. تنظيف موقع الجراحية بالماء وتنتهي مع الكحول 70٪.
  3. وضع الحيوان في موقف ضعيف على صينية مبطنة مع لوحة ماصة.
  4. فتح تجويف البطن مع خط الوسط واسع شق طولي. وضع ضام الذاتي الاحتفاظ لفضح تجويف، وعلى IVCد الشريان الأورطي البطني.
  5. فصل بلطف شريحة الأبهر المانحة المزروعة من IVC المجاورة باستخدام زوج من رقم 5 ملقط طبي. توخي الحذر بشكل خاص لا لتجريد البرانية السفينة المزروعة.
  6. كشف التجويف الصدري من خلال قطع الأضلاع على طول جانبي العمود الفقري الصدري على طول الطريق إلى مدخل الصدري. تعكس جدار الصدر الأمامي متفوق لفضح التامور وتأمين القفص الصدري مع زوج من مرقئ.
  7. مرة واحدة يتعرض لها القلب، اضافة الى وجود 25 G 5/8 إبرة (تعلق على حقنة) في البطين الأيسر والاحمرار مع 0.1 مل من heparinized (100 U / مل) محلول ملحي.
  8. باستخدام زوج من مقص، وإزالة الأذين الأيمن للسماح الدم، والمياه المالحة heparinized، وتثبيتي لمغادرة الجسم أثناء الارواء. يروي هذا الحيوان مع 5 مل من 4٪ لامتصاص العرق أو حتى تشغيل السوائل واضحة. إزالة القلب لضمان القتل الرحيم.
  9. المكوس زرع شريحة السفينة وتزج في الفقرة 4٪الفورمالديهايد مدة لا تزيد عن ساعة واحدة. ضبط سفينة المزروعة في أكتوبر (درجة الحرارة المثلى القطع) مصفوفة وتجميد فلاش. القسم السفينة تحت ناظم البرد وضعت في 8 أم سمك. أقسام صمة عار مع Haematoxylin ويوزين و / أو فيرهوف-فان Gieson (فان Gieson) وصمة عار مرنة.

4. التحليل الصرفي من الطعوم

ملاحظة: يتميز TA التي كتبها باطنة سماكة 13. في هذا النموذج، سماكة باطنة وانخفاض الناتج في حجم التجويف هي تعكس شدة مناعية إصابة الأوعية الدموية. تستخدم ضوابط طعم إسوي لتحديد الخصائص الأساسية للسفن في غياب الاستجابات المناعية خيفي. هذه الضوابط يسمح أيضا تقييم الضرر الشرايين التي تحدث نتيجة لإجراء العمليات الجراحية. يجب أن يكون هناك سماكة باطنة في syngrafts.

  1. لفحص سماكة باطنة واللمعية انسداد، وقياس المساحة داخل الخلية البطانيةطبقة، الصفيحة الداخلية المرنة (IEL) والصفيحة المرنة الخارجية (ثعبان البحر) على مرونة فان Gieson قطاعات الشريان ملطخة برمجيات تحليل الصور. يمكن استخدام المعلمات أدناه لتحديد التغيرات في الشرايين تعكس TA.
    1. قياس منطقة باطنة المطلقة: منطقة داخل الصفيحة المرنة الداخلية - المساحة داخل طبقة الخلايا البطانية. يوفر هذا القياس المطلق للتوسع باطنة، وهي السمة المميزة لTA.
    2. قياس منطقة المطلقة وسطي: منطقة داخل الصفيحة المرنة الخارجية - منطقة داخل الصفيحة المرنة الداخلية. يوفر هذا القياس المطلق للتدهور وسطي أو النمو، التي يمكن أن تحدث أحيانا نتيجة للتغيرات مناعية لهذه المنطقة من جدار الوعاء الدموي.
    3. قياس منطقة السفينة الإجمالية حسب المنطقة داخل الصفيحة المرنة الخارجية. هذا يوفر قياس السفينة التي تنطوي على إعادة توسع أو انقباض الشرايين نتيجة الضرر المناعية.
    4. التدبيرالبطانية / وسائل الإعلام: (منطقة داخل الصفيحة المرنة الداخلية - منطقة داخل طبقة الخلايا البطانية) / (منطقة داخل الصفيحة المرنة الخارجية - منطقة داخل الصفيحة المرنة الداخلية). وهذا يوفر مقياس نسبي للتوسع باطنة وتطبيع للاختلافات في حجم السفينة.
    5. قياس تضييق٪ اللمعية: [(منطقة داخل الصفيحة المرنة الداخلية - منطقة داخل طبقة الخلايا البطانية) / المنطقة مع الصفيحة المرنة الداخلية)] * 100. وهذا يوفر مقياسا لمدى انسداد اللمعية، والذي ينتج من مزيج من التوسع باطنة وإعادة عرض (نحو الداخل أو نحو الخارج) من جدار الوعاء الدموي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذا النموذج، وموسط الشريان الأورطي البطني من ماوس BALB / cYJ في الشريان الأورطي infrarenal من C57BL / 6 المتلقي. هذا يسمح بإجراء تقييم شامل لمنيع للمستضد الخيفي الردود التي تستهدف الشرايين المزروع. المناعية إصابة الأوعية الدموية في هذا النموذج يبادر الردود تعويضية الأوعية الدموية التي تبلغ ذروتها في سماكة باطنة، تضيق اللمعية وتجنيد الخلايا المناعية (الشكلان 1 و 2). هذه المعايير ثم يكون بمثابة التدريجي قراءة لشدة منيع للمستضد الخيفي الردود، رفض الأوعية الدموية، وTA. نجاح العملية يمكن تقييمها من خلال تطوير قوية سماكة باطنة الشريان شرائح المزروع وغياب باطنة سماكة في الضوابط طعم إسوي. سريريا المناعة ذات الصلة يمكن استخدامها مع هذا النموذج إلى أكثر شبها زرع السريري. كما يمكن استخدام هذا النموذج مع حيوانات معدلة وراثيا لدراسة تأثير بروتينات معينة / مسارات في منيع للمستضد الخيفي الردود علىالصورة فعلنا 14.

المزروع قطاعات الأبهر تطوير باطنة سماكة

تم فحص كمية المزروع تلف الأوعية الدموية بوساطة المناعة عن طريق قياس سماكة باطنة واللمعية تضيق الأبهر في قطاعات المطعمة في يوم 30 بعد الزرع. شرائح الشريان المزروع تطوير سماكة باطنة كبيرة وانسداد اللمعية ولم يلاحظ أي تغييرات في طعم إسوي قطاعات الشريان التحكم (الشكل 1).

تراكم الكريات البيض في قطاعات الأبهر المزروع.

تم فحص تراكم الكريات البيض في الشرايين المزروع عن طريق قياس عدد خلايا CD4 T، خلايا CD8 T، والضامة (ماك-3) 15 قبل المناعية. وقد استخدم ماك 3 وصمة عار لالضامة في هذه الدراسة على الرغم من علامات أخرى مثل F4 / 80، ويمكن أيضا أن تستخدم 16. خلايا CD4 T، تم الكشف عن خلايا CD8 T والضامة في البطانية الشرايين المزروع (الشكل 2)

الشكل 1
الشكل 1: تحليل النسيجي الشرايين المطعمة (A) وموسط قطاعات الشريان الأورطي البطني من مسانج والفئران خيفي في aortas البطن مقطوعة من C57BL / 6 الفئران. كانت تحصد الشرايين المطعمة في يوم 30 بعد الزرع. وترد photomicrographs تمثيلية من فان مرونة الشرايين جيسين الملون. شريط النطاق = 0.1 مم = 100 ميكرون (B) رسم بياني يصور كيف يتم قياس طبقات مختلفة من السفينة، L: التجويف، E: الطبقة البطانية، I: البطانية، M: وسائل الإعلام، A: البرانية (C) الكمي ل البطانية / نسبة وسائل الإعلام و٪ اللمعية تضييق من 30 يوما مسانج (ن = 3) وخيفي (ن = 6) زرع، * P <0.05.= "_ فارغة"> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2: تراكم الخلايا المناعية في الشرايين المزروع. photomicrographs التمثيلية للالمزروع قطاعات الأبهر ملطخة immunohistochemically ل(A) CD4، (B) CD8، و (C) ماك 3 و counterstained مع الهيماتوكسيلين ترد. مقياس شريط = 0.1 مم = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وصفناها بروتوكول للمداخلة الأبهر تطعيم في الفئران يمكن أن يكون مفيدا لدراسة بوساطة المناعي الرفض الأوعية الدموية وTA. هذا النموذج يمكن أن تستخدم للتحقيق في أسباب TA فضلا عن وضع استراتيجيات علاجية جديدة. وقد استخدم في الماضي لإنشاء الدور الأساسي للحصانة التكيفية، السامة للخلايا استجابات الخلايا T، ردود المستجيب CD4 T الخلية بوساطة خلوى، والأجسام المضادة التي تتوسط الضرر الكسب غير المشروع في TA 14،17-21. زرع شريان في الفئران صعب نظرا لصغر حجم واضح للحيوان؛ ومع ذلك، مع الممارسة والعناية الواجبة، ويمكن تحقيق عملية جراحية ناجحة. النجاح يعتمد على المباح للسفينة. هذا ينطوي على ضمان أن الكسب غير المشروع لا تتضرر من جراء التعامل مع غير صحيح السفينة مع ملقط، انقباض في التجويف السفينة، خياطة الجدار الخلفي للسفينة، وخياطة المتكررة من نفس الموقع. تسرب من السفينة هو أيضا مشكلة ويتطلب الحرص على البريدتكفل للتنقسم عدد وموقف غرز بالتساوي في جميع أنحاء جدار الوعاء الدموي. ومن الضروري أيضا أن الكسب غير المشروع نقص التروية يتم التقليل إلى أقل من 30 دقيقة. مع هذا، نسبة نجاح أكبر من 95٪ لا يمكن أن يتحقق.

الأبهر هو أكبر شريان في الماوس ولذلك فإن هذا الإجراء هو النهج أبسط المجهرية للتحقيق في رفض الأوعية الدموية في هذا النموذج الحيواني. أيضا، يتم المطعمة قطاع الأبهر في موقع ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية، يواجه تدفق الدم الطبيعي، وباطنة سماكة يتطور بسرعة. نموذج الرئيسي الأخرى المستخدمة لتقييم الرفض الأوعية الدموية وTA هو زرع قلب منتبذ، والتي لديها ميزة من دراسة تطوير TA في الشرايين التاجية، وفي سياق زرع القلب وهذا هو السيناريو السريري الأكثر ملاءمة لTA. ومع ذلك، يتم وضعها زرع القلب غيري الموضع في موقع غير الفسيولوجية داخل الجسم (عادة anastamosed إلى الوريد الأجوف والشريان الأبهر في البطن)، والقلب لا يضخ الدم من خلال البطينين نظرا لطبيعة رجعية من إمدادات الدم إلى القلب المزروع. على هذا النحو، وطبيعة تدفق الدم عبر شجرة الشرايين التاجية قد تكون مختلفة عن ما هو من ذوي الخبرة عادة عن طريق الأوعية الدموية التاجية 22،23. أيضا، استراتيجيات للتغلب يجب أن تدمج الرفض الحاد للقلب من أجل تقييم التغيرات في الشرايين. في كلا النموذجين، من المهم أن تختار بعناية نوع المستضد عدم تطابق استخدامها من أجل أن تكون قادرة على التصدي بشكل مناسب أسئلة محددة تتعلق رفض الأوعية الدموية وTA.

باختصار، الأبهر مداخلة التطعيم هو أسلوب فعال للتحقيق بوساطة المناعة تضرر الشرايين وTA. ويمكن أن يتقن بشكل روتيني مع الممارسة والاجتهاد من جانب الباحث. مرة واحدة يتقن، يمكن تعديل هذا الإجراء لتطعيم مداخلة قطاعات الشرايين الأخرى، مثل الشريان السباتي، القد تمكن في بحث مسائل علمية إضافية. أيضا، فإن استخدام هذا النموذج يمكن أن تمتد إلى ما بعد دراسة الزرع. مداخلة ترقيع الشرايين يمكن أن تستخدم لإدخال شرائح من الشرايين المعدلة (على سبيل المثال المعدلة وراثيا أو تغذية الدهن) الفئران إلى نظرائهم من غير تعديل، أو العكس بالعكس، لعزل التأثيرات البيولوجية للجزيئات إلى خلايا جدار الشريان مقابل خلايا جدار غير الشريانية 24 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة والقلب والسكتة الدماغية مؤسسة من قبل الميلاد ويوكون (JCC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J (H-2b) Jackson Laboratories, Bar Harbour ME Strain# 000664
Balb/cBYJ Jackson Laboratories, Bar Harbour ME Strain# 001026
Ketamine Hydrochloride Injection USP 100 mg/ml Ketalean DIN 00612316
Xylazine Injection 20 mg/ml Rompum DIN 02169592
Ketoprofen Injection 100 mg/ml Anafen DIN 01938126
Butorphanol Tartrate injection 10 mg/ml Torbugesic DIN 008450000
Buprenorphine Injection 0.3 mg/ml Reckitt Benckiser B.N. 5241
Atipamezole hydrochloride sterile injectable solution Antisedan DIN 02237744
Heparin Sodium Injection, USP, 1,000 units/ml McKesson Distribution DIN 02264315
Tears naturale ophthalmic ointment Alcon DIN 02082519
Stereomicroscope Leica M80
0.9% Sodium Chloride, sterile Baxter Corporation
Lactated Ringer’s solution, sterile Baxter Corporation
0.9% Sodium Chloride Injection, sterile, 10 ml Baxter Corporation
Alcohol Prep Pads Loris
Povidone Iodine Betadine
Chlorohexidine Gluconate 4% w/v Germi-Stat
Black Polyamide Monofilament AROSurgical Instruments T4A10Q07
Suture, 10-0 suture, 70 microns Corporation
Blue monofilament suture 5-0, P3 needle Ethicon 8698G
1 ml Syringe BD REF 309659
10 ml Syringe BD REF 309604
1cc TB insulin syringe with 28 G 1/2 BD REF 309309
25 G 7/8, hypodermic needle BD REF 305124
27 G 1/2, hypodermic needle BD REF 305109
Colibri Retractor- 1.5 cm spread 4 cm Fine Science Tools 17000-04
S&T CAF-4 Clip applying forceps, without lock Fine Science Tools 00072-14
Supergrip forceps, S&T Fine Science Tools 00632-11
Medical No.5 forceps Fine Science Tools 11253-20
Lexer Baby Scissors Fine Science Tools 14078-10
Micro Adson forceps serrated Fine Science Tools 11018-12
Vannas-Tubingen microscissors Fine Science Tools 15003-08
Micro clamps, b-1; 3.5mm x 1mm; 7mm length Fine Science Tools 00396-01
Graefe-forceps, 10cm 1x2 teeth Fine Science Tools 11054-10
Castroviejo with lock and tungsten jaws Fine Science Tools 12565-14
Hot glass bead sterilizer Inotech 250 IS-250 - Steri-250
Non-woven gauzes Progene
Cotton Tipped Applicators Puritan
Beard Trimmer Wahl
Heating pad Sunbeam

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Billingham, M. E. Graft coronary disease: the lesions and the patients. Transplant Proc. 21, 3665-3666 (1989).
  2. Foegh, M. L. Chronic rejection--graft arteriosclerosis. Transplant Proc. 22, 119-122 (1990).
  3. Libby, P., Pober, J. S. Chronic rejection. Immunity. 14, 387-397 (2001).
  4. Tellides, G., Pober, J. S. Interferon-gamma axis in graft arteriosclerosis. Circulation research. 100, 622-632 (2007).
  5. Johnson, D. E., Gao, S. Z., Schroeder, J. S., DeCampli, W. M., Billingham, M. E. The spectrum of coronary artery pathologic findings in human cardiac allografts. The Journal of heart transplantation. 8, 349-359 (1989).
  6. Gao, S. Z., Alderman, E. L., Schroeder, J. S., Silverman, J. F., Hunt, S. A. Accelerated coronary vascular disease in the heart transplant patient: coronary arteriographic findings. Journal of the American College of Cardiology. 12, 334-340 (1988).
  7. Mennander, A., et al. Chronic rejection in rat aortic allografts. An experimental model for transplant arteriosclerosis. Arterioscler Thromb. 11, 671-680 (1991).
  8. Choy, J. C. Granzymes and perforin in solid organ transplant rejection. Cell Death Differ. 17, 567-576 (2010).
  9. Johnson, P., Carpenter, M., Hirsch, G., Lee, T. Recipient cells form the intimal proliferative lesion in the rat aortic model of allograft arteriosclerosis. Am J Transplant. 2, 207-214 (2002).
  10. Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation. 112, 2951-2958 (2005).
  11. Yu, L., et al. AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting interferon-gamma-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion. Circ Res. 109, 418-427 (2011).
  12. Miller, C., DeWitt, C. W. Cellular and humoral responses to major and minor histocompatibility antigens. Transplant Proc. 5, 303-305 (1973).
  13. Tsutsui, H., et al. Lumen loss in transplant coronary artery disease is a biphasic process involving early intimal thickening and late constrictive remodeling: results from a 5-year serial intravascular ultrasound study. Circulation. 104, 653-657 (2001).
  14. Rossum, A., Enns, W., Shi, P., MacEwan, G. E., Choy, J. C. Bim regulates allogeneic immune responses and transplant arteriosclerosis through effects on T cell activation and death. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 1290-1297 (2014).
  15. Ho, M. K., Springer, T. A. Tissue distribution, structural characterization, and biosynthesis of Mac-3, a macrophage surface glycoprotein exhibiting molecular weight heterogeneity. J Biol Chem. 258, 636-642 (1983).
  16. Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney international. 67, 2488-2493 (2005).
  17. Shi, C., et al. Immunologic basis of transplant-associated arteriosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 4051-4056 (1996).
  18. Skaro, A. I., et al. CD8+ T cells mediate aortic allograft vasculopathy by direct killing and an interferon-gamma-dependent indirect pathway. Cardiovasc Res. 65, 283-291 (2005).
  19. Tellides, G., et al. Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes. Nature. 403, 207-211 (2000).
  20. Wang, Y., et al. Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation. Circ Res. 101, 560-569 (2007).
  21. Soulez, M., et al. The perlecan fragment LG3 is a novel regulator of obliterative remodeling associated with allograft vascular rejection. Circ Res. 110, 94-104 (2012).
  22. Choy, J. C., Kerjner, A., Wong, B. W., McManus, B. M., Granville, D. J. Perforin mediates endothelial cell death and resultant transplant vascular disease in cardiac allografts. Am J Pathol. 165, 127-133 (2004).
  23. Choy, J. C., et al. Granzyme B induces endothelial cell apoptosis and contributes to the development of transplant vascular disease. Am J Transplant. 5, 494-499 (2005).
  24. Reis, E. D., et al. Dramatic remodeling of advanced atherosclerotic plaques of the apolipoprotein E-deficient mouse in a novel transplantation model. Journal of vascular surgery. 34, 541-547 (2001).
  25. Potteaux, S., et al. Suppressed monocyte recruitment drives macrophage removal from atherosclerotic plaques of Apoe-/- mice during disease regression. J Clin Invest. 121, 2025-2036 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics