Modelo de ratón de rechazo vascular inducida por aloinmune y Arteriosclerosis Trasplante

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Enns, W., von Rossum, A., Choy, J. Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis. J. Vis. Exp. (99), e52800, doi:10.3791/52800 (2015).

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Abstract

Introduction

Durante los últimos 30 años, los avances en los fármacos inmunosupresores han disminuido el rechazo del injerto por rechazo agudo, pero el rechazo crónico sigue siendo un desafío principal. La principal manifestación de rechazo al trasplante cardíaco crónico es la arteriosclerosis del trasplante (TA) 1,2. Esta condición se caracteriza por hiperplasia de la íntima y la disfunción vasomotor de las arterias de aloinjertos y se desarrolla como resultado de la focalización inmunológica de las células musculares lisas y endoteliales por el sistema inmune del destinatario. La orientación específica de la vasculatura del injerto debido al reconocimiento de complejo de histocompatibilidad principal de péptido extranjera (MHC) se pone de relieve por el desarrollo de TA exclusivamente en las arterias de injerto sin afectar los vasos anfitrionas 3. En consonancia con esto es la observación de que la TA no se produce experimentalmente cuando el destinatario es genéticamente idéntico al donante o cuando el receptor carece de células T y B 4. Lesión vascular mediada inmunológicamente y dysfunction hace que el desarrollo de engrosamiento de la íntima y fibrosis, así como la acumulación aberrante de los lípidos y las proteínas ECM, en TA 5. Engrosamiento de la íntima tiende a ser concéntrico a lo largo de todo el árbol arterial 4-6. Pérdida del injerto y la muerte por lo general se producen como consecuencia de la isquemia progresiva como consecuencia de la oclusión luminal de las arterias de aloinjertos 4.

En 1991, Mennander et al. 7 fue pionera en un modelo de interposición aórtica en ratas para modelar TA. Varios grupos han adaptado posteriormente este procedimiento para su uso en ratones. En este modelo, los segmentos aórticos de aloinjertos desarrollan lesiones que tienen características comparables a TA observaron en los trasplantes clínicos. Esto incluye engrosamiento de la íntima que se caracteriza por la acumulación de células de músculo liso como receptores 7 y leucocitos. Durante los últimos 2 décadas este modelo ha sido utilizado para generar importante información sobre los mecanismos de lesión vascular, el rechazo y TA. Puede ser nosotrosed para examinar cuestiones relacionadas con la respuesta inmune y vasculares durante la patología arterial. La elección de los impactos desajuste antígeno la capacidad para hacer frente adecuadamente a estas preguntas.

Trasplante a través de barreras completas MHC permite una evaluación completa de las respuestas inmunes que se sabe que están implicados en el rechazo del trasplante de órganos. Esto incluye el reconocimiento de células CD4 y CD8 T directo y la focalización de extranjera péptido-MHC presentado por células del injerto derivado, CD4 indirecto (y posiblemente CD8) el reconocimiento de células T y la orientación de los aloantígenos de injerto derivado presentados por células presentadoras de antígeno receptor, y anticuerpo reconocimiento mediado de aloantígenos en las superficies celulares vasculares 8. Sin embargo, la respuesta a la lesión vascular en los experimentos completos coincidentes-MHC puede ser diferente que el observado clínicamente. Johnson et al. 9 mostró que, en los injertos de interposición aórticos trasplantados a través de una barrera completa MHC falta de coincidencia, la mayoría delas células de la neoíntima son de origen destinatario y no de origen donante. Esto es diferente que la observada en los trasplantes humanos donde la mayoría de las células del músculo liso de la íntima son de origen donante 9,10. Para tener en cuenta esta limitación, los modelos experimentales alternativos que implican injerto a través de los descalces de antígeno de histocompatibilidad menor importancia se han desarrollado que desencadenan respuestas vasculares que se asemejan más a los observados en el trasplante clínico 11. Si bien estos modelos alternativos permiten conclusiones importantes que hacer con respecto a las respuestas vasculares que impulsan el desarrollo de la asistencia técnica, los procesos inmunológicos que causan rechazo vascular en antígeno de histocompatibilidad menor injertos no coincidentes no completamente re-capitular las que se producen en el ámbito clínico. Por ejemplo, los antígenos menores de histocompatibilidad se reconocen mal por injerto anticuerpos reactivos 12. Teniendo en cuenta las consideraciones anteriores, es importante considerar el questi patológicaal ser examinado en la elección del tipo de desajuste antígeno utilizado en un modelo interposición aórtica. Aquí se describe un protocolo detallado para murino injerto de interposición aórtica. Se describe el injerto de interposición entre los ratones MHC-coincidentes completos pero el mismo protocolo se utiliza para injertar a través de otras cepas de ratón coincidentes antígeno.

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Protocol

Todos los protocolos en este estudio fueron revisados ​​y aprobados por el comité de ética del cuidado de animales de la Universidad Simon Fraser. Uso Balb / CYJ (H2 d) los ratones donantes y / 6 ratones (H2 b) receptores C57Bl para examinar las reacciones alogénicos. Los ratones se utilizan para los experimentos entre las edades de 8 a 12 semanas. Utilice los ratones, ya sea hombre o mujer. Controles singénicos consisten en segmentos aórticos de ratones C57BL / 6 donantes en ratones C57BL / 6 destinatarios.

1. donante y el receptor Preparación

Nota: Tanto el donante y el receptor son anestesiados y preparados antes de la cirugía para minimizar la isquemia del injerto. Anestésicos inyectables se utilizan en el protocolo para evitar la obstrucción del animal por el equipo necesario para la entrega de los anestésicos inhalados. Sin embargo, si se desea, anestésico inhalado es una alternativa apropiada. A partir de la inyección inicial de los anestésicos, todo el procedimiento dura aproximadamente 90 min para completar. Tiempo de isquemia del injerto es menos than 30 min.

  1. Anestesiar al ratón con inyecciones intraperitoneales de ketamina (100 mg / kg; 10 mg / ml) y xilazina (10 mg / kg; 1 mg / ml). El ratón será sedado dentro de 10 a 15 min. Evaluar la profundidad de la anestesia pellizcando la parte grasa de la almohadilla de la pata animal. Administrar un tercio de la dosis original del cóctel anestésico, según sea necesario, hasta que el animal no presenta reflejo de retirada. Monitorear la frecuencia respiratoria de cerca después se administra cada cóctel. Durante la cirugía, evaluar el nivel de anestesia cada 15 min pellizcando la pared abdominal anterior con un par de fórceps. Los ratones debe permanecer profundamente anestesiado durante 60 a 90 min.
  2. Lubrique los ojos del ratón con una pomada oftálmica para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia.
  3. Afeitarse el pelo tan cerca de la piel como sea posible en la región ventral del abdomen de la mitad del tórax hasta el pubis. Tenga especial cuidado de no nick cualquier piel. No utilice crema depilatoria, ya que puede ser absorbida inPara la piel y puede ser inflamatoria.
  4. Colocar el animal en posición supina sobre una toalla encima de la mesa de la calefacción o almohadilla.
  5. Limpie el sitio de la cirugía con un exfoliante preliminar con 2% de clorhexidina. Prepare un área de trabajo grande para maximizar el campo quirúrgico. Iniciar fregar en el centro de la zona quirúrgica y mover hacia el exterior de una manera lineal o circular. Deseche la gasa. Repita este procedimiento al menos 5 veces más. Aplique una almohadilla con alcohol a la misma área. Una vez que el alcohol es seco, preparar el área limpia con una solución de Betadine y la caída con una gasa estéril.

2. Procedimiento de extremo a extremo anastomosis

  1. Donantes de Operación
    1. Mantener una técnica aséptica durante toda la operación. Limpie todas las superficies de la encimera y mesa quirúrgica con solución de peróxido de hidrógeno acelerado 0,5% antes de su uso. Envuelva y autoclave todos los instrumentos quirúrgicos, gasas, cortinas y vestidos antes de su uso. Verifique la esterilidad de los instrumentos con un vaportira indicadora esterilizador colocado en cada paquete. Guantes quirúrgicos estériles se utilizan y eliminarse entre cirugías. Para múltiples cirugías, esterilizar los instrumentos quirúrgicos entre los usos con el esterilizador de cuentas de vidrio caliente.
    2. Coloque el ratón donante en una posición supina sobre una tabla limpia, delgada Plexiglas envuelto con paño estéril bajo el microscopio de operación con una ampliación de 8-30X.
    3. Después de asegurarse de anestesia quirúrgica adecuadas tal como se indica en la sección 1.1, proceder con la cirugía.
    4. Con unas tijeras estériles, hacer una sola línea media inferior incisión abdominal longitudinal, desde el pubis hasta el proceso xifoides.
    5. Usando un pequeño retractor, abra las paredes abdominales para exponer la cavidad.
    6. El uso de algodón estéril con punta aplicadores, retraer con suavidad los intestinos superiormente al animal de izquierda y cubrir con una gasa humedecida con solución salina. Mueva los órganos reproductivos inferior y localizar la aorta infrarrenal y la vena cava inferior (VCI). Moisdiez los tejidos expuestos periódicamente con solución salina.
    7. Usando los fórceps No. médica 5, separar la aorta de la IVC, desde el nivel de la arteria renal izquierda a la bifurcación. Utilice 10-0 suturas de monofilamento de poliamida para ligar las ramas pequeñas cerca de la aorta.
    8. Una vez aorta del donante se ha separado de la IVC, saturar el recipiente con solución salina, cubrir la cavidad expuesta con una gasa humedecida y establecer el donante a un lado en un área estéril. Compruebe el estado del donante (respiratoria y la función cardiovascular, y la profundidad de la anestesia) cada 15 minutos. Comenzará a operar en el destinatario, aislar la aorta, como se describe a continuación (Pasos 2.2.1 a 2.2.7).
    9. Una vez que la aorta destinatario se ha separado de la VCI y dejar de lado, devuelva el donante en el microscopio. Cross abrazadera (proximal y distal al segmento de interés) de la aorta de donantes, aproximadamente 5 mm aparte, con dos pinzas microvasculares 4 mm.
    10. Utilizando los microtijeras Vannas-Tübingen,seccionar un segmento de injerto pequeña (3 a 4 mm de longitud) de la aorta abdominal.
    11. El uso de un 25 G 5/8 aguja unida a una jeringa, lave la aorta extirpada con heparinizada (100 U / ml) solución salina. Asegúrese de que la punta de la aguja no entra en contacto con el buque.
    12. Coloque aorta en heparinizada (100 U / ml) de solución salina en el hielo y dejar de lado. Si bien todavía bajo anestesia profunda, suelta las pinzas microvasculares. La eutanasia del donante por desangramiento.
    13. Implante el buque cedente dentro de los 30 min de la escisión. Aunque es posible usar un recipiente de donante para varios destinatarios mediante la escisión de una longitud mayor de aorta, mantener el tiempo de isquemia a menos de 30 min.
  2. Operación Receptor
    1. Mantener una técnica aséptica durante toda la operación, como en la operación de los donantes.
    2. Coloque el ratón receptor en una posición supina sobre una tabla delgada Plexiglas envuelto con paño estéril bajo el microscopio de operación con una ampliación de 8-30X.
    3. After asegurar una anestesia adecuada, proceder con la cirugía cuando el animal no presenta reflejo de retirada.
    4. Con unas tijeras estériles, hacer una sola línea media inferior incisión abdominal longitudinal, desde el pubis hasta el proceso xifoides.
    5. Usando un pequeño retractor, abra las paredes abdominales para exponer la cavidad.
    6. El uso de algodón estéril con punta aplicadores, retraer con suavidad los intestinos superiormente al animal de izquierda y cubrir con una gasa humedecida con solución salina. Mueva los órganos reproductivos inferior y localizar la aorta infrarrenal y la vena cava inferior. Humedezca los tejidos expuestos periódicamente con una solución salina.
    7. Separar la aorta de la IVC, desde el nivel de la arteria renal izquierda a la bifurcación. Si es necesario, utilice 10-0 suturas de monofilamento de poliamida para ligar las ramas pequeñas cerca de la aorta.
    8. Cross abrazadera (proximal y distal al segmento de interés) de la aorta, de aproximadamente 5 mm aparte, con dos pinzas microvasculares 4 mm.
    9. Usando las microtijeras Vannas-Tübingen, hacer una sola aortotomía horizontal y resecar un segmento pequeño (no más de 0,5 mm) de la aorta abdominal para acomodar el injerto aórtico donante.
    10. Enjuague la aorta extirpada con heparinizada (100 U / ml) solución salina. El injerto aórtico donante debe tener una longitud adecuada para conectar los extremos seccionados aorta del receptor.
    11. Coloque el injerto aórtico donante en la posición ortotópica y anastomosis extremo del injerto del donante al final del destinatario, igualando el respectivo injerto orientación anatómica con la del receptor.
    12. Agarrar suavemente la túnica externa del buque y eversión ligeramente utilizando los fórceps No.5 médicos. Usando los fórceps, conducir la aguja unida a la sutura con monofilamento de poliamida 10-0 a través de todo el espesor de la pared del vaso con el fin de asegurar el injerto aórtico donante al recipiente de resecado del destinatario. Tenga cuidado para asegurarse de que la abertura del vaso no está cerrada debido to costura inadvertida de la pared posterior de la embarcación.
    13. En las puntadas continuas, coloque suturas estancia en nueve tanto en los extremos superior e inferior del injerto. Comenzando en el extremo superior del injerto de tres, se anastomosan los extremos resecados con 2 suturas de funcionamiento y asegurar la sutura a la sutura estancia.
      1. Da la vuelta al injerto una y continuar con la sutura continua de dorsal parte de la embarcación, el cumplimiento de la sutura estancia origen. Asegure sin aplicar mucha presión en el recipiente. Repetir la sutura de la anastomosis baja.
        Nota: Las suturas interrumpidas comienzan la misma manera que la sutura continua con la excepción de que el recipiente se anastomosa con tres puntos de sutura separadas entre las suturas. Anastomosis tiempo es generalmente de 20 min.
    14. Una vez que la anastomosis se completa, suelte la pinza microvascular distal para permitir que la sangre fluya retrógrada y compruebe si hay fugas de los sitios anastomosados. Si hay una fuga, immediately coloque una puntada para cerrar el sitio defectuoso. Si no hay sangrado en los sitios, a continuación, suelte la pinza proximal.
    15. Examine el trasplante y compruebe que no hay obstrucción arterial en el injerto, y los extremos proximal y porción distal del vaso del destinatario. Modelo de pulso vigoroso en el recipiente, tanto el destinatario de los donantes y de una indicación primaria que la sangre fluya libremente. Usando el par de pinzas, agarre suavemente un extremo de las suturas y eversión ligeramente el recipiente para inspeccionar la pared posterior de la embarcación.
      Nota: No debe haber fruncido de la pared vascular en ambos extremos de los sitios anastomosados. La mala circulación sanguínea después de la eliminación de las pinzas es un signo de trombosis.
    16. El uso de aplicadores con punta de algodón, devolver los intestinos en la cavidad abdominal.
    17. Con el soporte de la aguja Castroviejo y fórceps Graefe, cierre de la pared abdominal con 5-0 suturas de polipropileno utilizando costura continua. Cierre la capa de piel con el mismosuturas utilizando el cierre subcuticular.
    18. Administrar Torbugesic (1 mg / kg) im inmediatamente después de concluir el trasplante.
    19. Dé de inmediato, en el orden, atipamezol (1 mg / kg), ketoprofeno (5 mg / kg) y se calentó la solución por vía subcutánea de Ringer lactato.
    20. Inmediatamente después de la cirugía, coloque los ratones en una jaula con calefacción bajo una manta de agua durante la noche (12 h). Durante el período de recuperación anestésica, colocar a los animales solos en una zona despejada limpio y seco. Línea de la jaula (autoclave) con toallas de papel limpias y ajustar la temperatura de la manta de agua a aproximadamente 20 a 22 ° C. Proporcionar croquetas secas y húmedas ad libitum en el suelo de la jaula.
      Nota: Un componente importante de la atención post-quirúrgica es la observación de la intervención de los animales y apropiado, según sea necesario, durante la recuperación de la anestesia y la cirugía. La intensidad necesaria de monitoreo variará con el animal y podría ser mayor durante el período de recuperación anestésica inmediata como compared para más adelante en la recuperación postoperatoria.
    21. Continuamente monitorear animales que la anestesia sufridas monitoreados hasta que se recuperen por completo. El animal debe ser capaz de mantener decúbito esternal sin ayuda y debe parecer tranquilo y libre de dolor antes de que pueda ser dejado sin atención.
    22. Dé buprenorfina (0,1 mg / kg BID) y ketoprofeno (5 mg / kg SID) para un período de tres días, ambos por vía subcutánea.
    23. Monitor cardiovascular y la función respiratoria, temperatura corporal, y el dolor postoperatorio o molestias durante la recuperación de la anestesia durante un mínimo de tres días. Cuidado adicional puede ser necesaria, tales como la administración de analgésicos y otros fármacos y fluidos parenterales para reducir al mínimo la pérdida de la deshidratación y electrolitos.
    24. Evaluar el éxito de la cirugía de trasplante mediante la observación de la función motora de las extremidades traseras. El éxito completo del trasplante implica el flujo de sangre sin obstáculos a la extremidad y la cola trasera, que debe ser inmediata tras la recuperación de la animal, y la recuperación completa sin parálisis de las extremidades traseras en el segundo día

3. Tissue Collection

Nota: Los puntos finales predeterminados estándar 3-60 días dependiendo del tipo de análisis deseado y la naturaleza de la falta de coincidencia antígeno. En general, el engrosamiento de la íntima es robusto en el día 30 después del trasplante a través de cepas completas ratón coincidentes MHC.

  1. Anestesiar al ratón con inyecciones intraperitoneales de ketamina (100 mg / kg; 10 mg / ml) y xilazina (10 mg / kg; 1 mg / ml). Evaluar la profundidad de la anestesia pellizcando la parte grasa de la almohadilla de la pata animal. Proceda con la cirugía cuando el animal no presenta reflejo de retirada.
  2. Limpiar el sitio quirúrgico con agua y terminando con 70% de alcohol.
  3. Colocar el animal en posición supina sobre una bandeja forrada con almohadilla absorbente.
  4. Abra la cavidad abdominal con una incisión longitudinal gran línea media. Coloque un retractor auto-retención para exponer la cavidad, la una IVCd la aorta abdominal.
  5. Separar suavemente el segmento aórtico donante trasplantado de la vecina IVC usando un par de pinzas 5 No. médica. Tenga especial cuidado de no despojar a la adventicia del vaso trasplantado.
  6. Exponer la cavidad torácica por el corte a través de las costillas a lo largo de ambos lados de la columna torácica todo el camino a la entrada torácica. Reflejar la pared anterior del tórax superiormente para exponer el pericardio y asegurar la caja torácica con un par de pinzas hemostáticas.
  7. Una vez que el corazón está expuesto, inserte un 25 G 5/8 aguja (unida a una jeringa) en el ventrículo izquierdo y al ras con 0,1 ml de solución salina heparinizada (100 U / ml).
  8. El uso de un par de tijeras, quite la aurícula derecha para permitir que la sangre, solución salina heparinizada y fijador para salir del cuerpo durante la perfusión. Perfundir el animal con 5 ml de paraformaldehído al 4% o hasta que se ejecuta el líquido claro. Quite el corazón para asegurar la eutanasia.
  9. Impuestos Especiales trasplantado segmento de vaso y sumergirse en el 4% párrformaldehído por no más de una hora. Ajuste el recipiente trasplantado en octubre (temperatura óptima de corte) de la matriz y la congelación de flash. Sección del buque en un criostato fijado en 8 um de espesor. Secciones se tiñen con hematoxilina y eosina y / o Verhoeff-van Gieson (van Gieson) tinción elástica.

4. Análisis morfológico de los injertos

Nota: TA se caracteriza por el engrosamiento de la íntima 13. En este modelo, engrosamiento de la íntima y una reducción resultante en el tamaño del lumen son un reflejo de la gravedad de la lesión vascular inmunomediada. Syngraft controles se utilizan para determinar las características basales de los vasos en ausencia de respuestas inmunes alogénicas. Estos controles permiten también la evaluación de daño arterial que se produce como resultado de la intervención quirúrgica. No debe haber engrosamiento de la íntima en syngrafts.

  1. Para examinar el engrosamiento de la íntima y la oclusión luminal, medir el área dentro de la célula endotelialcapa, lámina elástica interna (IEL) y la lámina elástica externa (EEL) en los segmentos de las arterias elásticas manchado van Gieson con un software de análisis de imágenes. Los parámetros siguientes se pueden utilizar para determinar los cambios arteriales reflectantes de TA.
    1. Mida el área de la íntima absoluta: área dentro de la lámina elástica interna - el área dentro de la capa de células endoteliales. Esto proporciona una medida absoluta de la expansión de la íntima, que es el sello de TA.
    2. Mida la absoluta zona medial: área dentro de la lámina elástica externa - área dentro de la lámina elástica interna. Esto proporciona una medida absoluta de la degradación medial o el crecimiento, que en ocasiones puede ocurrir como resultado de los cambios inmunes a esta región de la pared del vaso.
    3. Medir el área total recipiente como el área dentro de la lámina elástica externa. Esto proporciona una medida de remodelado vascular que implica la expansión o la constricción de las arterias como resultado de un daño inmunológico.
    4. Medidala íntima / media: (área dentro de la lámina elástica interna - área dentro de la capa de células endoteliales) / (área dentro de la lámina elástica externa - área dentro de la lámina elástica interna). Esto proporciona una medida relativa de expansión de la íntima y normaliza las diferencias en el tamaño de los buques.
    5. Mida el estrechamiento luminal%: [(área dentro de la lámina elástica interna - área dentro de la capa de células endoteliales) / área con la lámina elástica interna)] * 100. Esto proporciona una medida de la extensión de la oclusión luminal, que resulta de una combinación de expansión de la íntima y la remodelación (hacia dentro o hacia fuera) de la pared del vaso.

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Representative Results

En este modelo, la aorta abdominal de un ratón Balb / CYJ se interpone en la aorta infrarrenal de un C57BL / 6 destinatario. Esto permite una evaluación completa de aloinmunes respuestas que se dirigen a las arterias de aloinjertos. Lesión vascular inmunomediada en este modelo inicia respuestas reparadoras vasculares que culminan en el engrosamiento de la íntima, el estrechamiento luminal y el reclutamiento de células inmunes (Figuras 1 y 2). Estos criterios sirven entonces como una de salida para leer la gravedad de aloinmunes respuestas, rechazo vascular, y TA. El éxito del procedimiento puede ser evaluado por el desarrollo de robusta engrosamiento de la íntima de la arteria segmentos de aloinjertos y la ausencia de engrosamiento de la íntima en los controles syngraft. Clínicamente inmunosupresión relevante puede ser utilizado con este modelo para parecerse más a trasplante clínico. Este modelo también se puede usar con animales transgénicos para estudiar el efecto de proteínas / vías específicas en aloinmunes respuestas unas hemos hecho 14.

Segmentos aórticos aloinjertos desarrollan engrosamiento de la íntima

La cantidad de daño vascular del injerto mediada inmunológicamente se examinó mediante la cuantificación de engrosamiento de la íntima y estrechamiento luminal en segmentos aórticos injertados en el día 30 post-trasplante. Segmentos de arteria aloinjertos desarrollan engrosamiento de la íntima significativa y oclusión luminal y no hay cambios se observan en segmentos arteriales de control syngraft (Figura 1).

La acumulación de leucocitos en segmentos aórticos de aloinjertos.

La acumulación de leucocitos en las arterias de aloinjertos se examinó cuantificando el número de células T CD4, células T CD8 y macrófagos (Mac-3) 15 por inmunohistoquímica. Se utilizó Mac-3 para teñir para los macrófagos en este estudio, aunque otros marcadores, tales como F4 / 80, también se pueden utilizar 16. Las células T CD4, se detectaron células CD8 T y macrófagos en la íntima de las arterias de aloinjertos (Figura 2)

Figura 1
Figura 1: El análisis histológico de las arterias injertadas (A) segmentos de aorta abdominal de ratones singénicos y alogénicos fueron interpuestos en las aortas abdominales resecados de ratones C57BL / 6.. Las arterias injertadas fueron cosechadas en el día 30 post-trasplante. Se muestran fotomicrografías representativas de van elástico Giesen arterias manchados. Barra de escala = 0,1 mm = 100 m (B) Diagrama que representa cómo las diferentes capas de la vasija se miden, L:. Lumen, E: capa endotelial, I: íntima, M: medios de comunicación, A:. Adventicia (C) Cuantificación de íntima relación / media y el% de estrechamiento luminal de 30 días singénico (n = 3) y alogénico (n = 6) trasplantes, * P <0,05.= "_ Blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: la acumulación de células inmunes en las arterias de aloinjertos. Fotomicrografías representativas de segmentos aórticos de aloinjertos inmunohistoquímicamente tiñeron para (A) CD4, (B) CD8, y (C) Mac-3 y de contraste con hematoxilina se muestran. Barra de escala = 0,1 mm = 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Hemos descrito un protocolo para la interposición de injerto aórtico en ratones que es útil para estudiar el rechazo vascular inmunomediada y TA. Este modelo puede ser utilizado para investigar las causas de la TA, así como el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. Se ha utilizado en el pasado para establecer un papel esencial de la inmunidad adaptativa, las respuestas de células T citotóxicas, las respuestas efectoras CD4 de células T mediada por citoquinas, y el daño del injerto mediado por anticuerpos en TA 14,17-21. Arteria trasplante en ratones es difícil debido al pequeño tamaño evidente del animal; Sin embargo, con la práctica y la debida diligencia, cirugías exitosas se pueden lograr. El éxito depende de la permeabilidad del vaso. Esto implica asegurar que el injerto no está dañado por la manipulación indebida del recipiente con fórceps, constricción de la luz del vaso, la sutura de la pared posterior de la embarcación, y la sutura repetitivo del mismo sitio. Las fugas del recipiente también es problemática y requiere cuidado al correosegurar que el número y posición de los puntos de sutura se dividen de manera uniforme alrededor de la pared del vaso. También es esencial que la isquemia del injerto se reduce al mínimo a menos de 30 minutos. Con esto, una tasa de éxito de más del 95% se puede alcanzar.

La aorta es la arteria más grande del ratón por lo que este procedimiento es el método más simple de microcirugía para la investigación de rechazo vascular en este modelo animal. Además, el segmento aórtico se injerta en un lugar fisiológicamente relevantes, experimenta el flujo normal de la sangre, y el engrosamiento de la íntima se desarrolla rápidamente. El otro modelo principal utilizado para la evaluación del rechazo vascular y TA es el trasplante heterotópico de corazón, que tiene la ventaja de examinar el desarrollo de TA en las arterias coronarias y en el contexto del trasplante de corazón que es el escenario clínico más relevante para TA. Sin embargo, los trasplantes de corazón heterotópico se colocan en un lugar no fisiológico en el cuerpo (generalmente anastamosed a la vena cava yaorta en el abdomen) y el corazón no bombea sangre a través de los ventrículos debido a la naturaleza retrógrada del suministro de sangre en el corazón trasplantado. Como tal, la naturaleza del flujo de sangre a través del árbol coronario puede ser diferente de lo que normalmente experimentado por la vasculatura coronaria 22,23. Además, estrategias para superar el rechazo agudo del corazón debe ser incorporado con el fin de evaluar los cambios arteriales. En ambos modelos, es importante elegir cuidadosamente el tipo de desajuste antígeno utilizado con el fin de ser capaz de abordar adecuadamente cuestiones específicas relacionadas con el rechazo vascular y TA.

En resumen, el injerto de interposición aórtica es una técnica poderosa para la investigación de daño arterial inmune mediada y TA. Puede ser dominado de forma rutinaria con la práctica y diligencia por parte del investigador. Una vez dominado, este procedimiento puede ser modificado para el injerto de interposición de otros segmentos arteriales, tales como la arteria carótida, THa puede permitir que el examen de las cuestiones científicas adicionales. Además, el uso de este modelo se puede extender más allá del estudio de trasplante. La interposición de injerto de las arterias se puede utilizar para introducir segmentos arteriales de modificado (por ejemplo, transgénico o lípido-Fed) en ratones homólogos no modificados, o viceversa, para aislar los efectos biológicos de moléculas a células de la pared de la arteria frente a células de la pared no arteriales 24 , 25.

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Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud y Heart and Stroke Foundation de BC & Yukon (JCC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J (H-2b) Jackson Laboratories, Bar Harbour ME Strain# 000664
Balb/cBYJ Jackson Laboratories, Bar Harbour ME Strain# 001026
Ketamine Hydrochloride Injection USP 100 mg/ml Ketalean DIN 00612316
Xylazine Injection 20 mg/ml Rompum DIN 02169592
Ketoprofen Injection 100 mg/ml Anafen DIN 01938126
Butorphanol Tartrate injection 10 mg/ml Torbugesic DIN 008450000
Buprenorphine Injection 0.3 mg/ml Reckitt Benckiser B.N. 5241
Atipamezole hydrochloride sterile injectable solution Antisedan DIN 02237744
Heparin Sodium Injection, USP, 1,000 units/ml McKesson Distribution DIN 02264315
Tears naturale ophthalmic ointment Alcon DIN 02082519
Stereomicroscope Leica M80
0.9% Sodium Chloride, sterile Baxter Corporation
Lactated Ringer’s solution, sterile Baxter Corporation
0.9% Sodium Chloride Injection, sterile, 10 ml Baxter Corporation
Alcohol Prep Pads Loris
Povidone Iodine Betadine
Chlorohexidine Gluconate 4% w/v Germi-Stat
Black Polyamide Monofilament AROSurgical Instruments T4A10Q07
Suture, 10-0 suture, 70 microns Corporation
Blue monofilament suture 5-0, P3 needle Ethicon 8698G
1 ml Syringe BD REF 309659
10 ml Syringe BD REF 309604
1cc TB insulin syringe with 28 G 1/2 BD REF 309309
25 G 7/8, hypodermic needle BD REF 305124
27 G 1/2, hypodermic needle BD REF 305109
Colibri Retractor- 1.5 cm spread 4 cm Fine Science Tools 17000-04
S&T CAF-4 Clip applying forceps, without lock Fine Science Tools 00072-14
Supergrip forceps, S&T Fine Science Tools 00632-11
Medical No.5 forceps Fine Science Tools 11253-20
Lexer Baby Scissors Fine Science Tools 14078-10
Micro Adson forceps serrated Fine Science Tools 11018-12
Vannas-Tubingen microscissors Fine Science Tools 15003-08
Micro clamps, b-1; 3.5mm x 1mm; 7mm length Fine Science Tools 00396-01
Graefe-forceps, 10cm 1x2 teeth Fine Science Tools 11054-10
Castroviejo with lock and tungsten jaws Fine Science Tools 12565-14
Hot glass bead sterilizer Inotech 250 IS-250 - Steri-250
Non-woven gauzes Progene
Cotton Tipped Applicators Puritan
Beard Trimmer Wahl
Heating pad Sunbeam

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References

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