Musmodell av alloimmuna vaskulär Avslag och transplantations åderförkalkning

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Enns, W., von Rossum, A., Choy, J. Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis. J. Vis. Exp. (99), e52800, doi:10.3791/52800 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Under de senaste 30 + åren har framsteg inom immunosuppressiva läkemedel minskat avstötning på grund av akut avstötning, men kronisk avstötning fortfarande en stor utmaning. Huvud manifestationen av kronisk avstötning av hjärttransplantat är transplantation åderförkalkning (TA) 1,2. Detta tillstånd kännetecknas av intimal hyperplasi och vasomotorisk dysfunktion av allograft artärer och utvecklas som ett resultat av immunologisk målinriktning av endotelceller och glatta muskelceller genom mottagarens immunsystem. Den specifika inriktning av transplantatet kärl på grund av erkännande av utländsk peptid-MHC (MHC) understryks av utvecklingen av TA uteslutande i transplantat artärer utan att skada värd fartyg 3. I linje med detta är iakttagelsen att TA inte sker experimentellt när mottagaren är genetiskt identisk med givaren eller när mottagaren saknar T- och B-celler 4. Immunmedierad kärlskada och dysfunction orsakar utvecklingen av intimal förtjockning och fibros, samt den avvikande ackumulering av lipider och ECM-proteiner, i TA 5. Intimal förtjockning tenderar att vara koncentriska i hela artärträdet 4-6. Graft förlust och död uppstår oftast som en följd av progressiv ischemi till följd av luminal tilltäppning av allograft artärer 4.

1991 al. Mennander et 7 pionjärer en aortaintermodell hos råttor för att modellera TA. Flera grupper har därefter anpassat detta förfarande för användning i möss. I denna modell, allograft aortasegment utvecklar skador som har funktioner som är jämförbara med TA observerats i kliniska transplantationer. Detta inkluderar intimal förtjockning som kännetecknas av ackumulering av glattmuskelliknande celler och mottagande leukocyter 7. Under de senaste två decennierna denna modell har använts för att generera viktiga insikter om mekanismerna för kärlskada, avvisande och TA. Det kan vara ossed att behandla frågor som rör immun och kärlsvar under arteriell patologi. Valet av antigen obalans påverkar förmågan att på lämpligt sätt ta itu med dessa frågor.

Transplantation över hela MHC hinder tillåter en omfattande utvärdering av immunsvar som är kända för att vara inblandade i avstötning av transplanterade organ. Detta inkluderar direkta CD4 och CD8 T-celligenkänning och inriktning av främmande peptid-MHC presenteras av transplantat-härledda celler, indirekt CD4 (och möjligen CD8) T-celligenkänning och inriktning av moder härrörande alloantigener som lagts fram av mottagaren antigenpresenterande celler, och antikropps medierad erkännande av alloantigener på vaskulära cellytor 8. Emellertid kan den vaskulära svar på skada i kompletta MHC-felmatchade experiment vara annorlunda än den som observerats kliniskt. Al. Johnson et 9 visade att i aortamellan transplantat transplanterade över en komplett MHC obalans barriär, de flesta avde neointimala cellerna är av mottagarens ursprung och inte av givar ursprung. Detta är annorlunda än den som observerats i mänskliga transplantationer där de flesta intima glatta muskelceller är av donator ursprung 9,10. För att ta hänsyn till denna begränsning, har alternativa experimentmodeller som innebär ympning över mindre histokompatibilitetsantigen obalanser utvecklats som utlöser vaskulära svar som mer liknar de som observerats i klinisk transplantation 11. Även om dessa alternativa modeller möjliggör viktiga slutsatser som skall göras när det gäller de vaskulära reaktioner som driver utvecklingen av TA, de immunologiska processer som orsakar kärlavstötning hos mindre histokompatibilitetsantigen inkompatibla transplantat inte helt ny kapitulera de som förekommer i klinisk miljö. Till exempel, är mindre histokompatibilitetsantigener erkänt dåligt av transplantat reaktiva antikroppar 12. Med tanke på ovanstående, är det viktigt att tänka på den patologiska questipå att undersökas när man väljer vilken typ av antigen obalans som används i en aortainter modell. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för mus aortainter ympning. Vi beskriver inter ympning mellan kompletta MHC-omaka möss men samma protokoll används för ympning över andra antigen inkompatibla musstammar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla protokollen i denna studie har granskats och godkänts av Simon Fraser University djurvårds etikkommitté den. Använd Balb / cYJ (H2 d) donatormöss och C57BL / 6 (H2 b) recipientmöss att undersöka allogena reaktioner. Möss används för experiment i åldrarna 8 till 12 veckor. Använd antingen kvinnliga eller manliga möss. Syngena kontroller består av aortasegment från C57BL / 6 donatorer till C57BL / 6 mottagare.

1. givare och mottagare Förberedelse

Obs: Både givaren och mottagaren sövs och förbereds innan operationen för att minimera ischemi av transplantatet. Injektionsanestetika används i protokollet för att förhindra obstruktion av animaliska biprodukter utrustning som behövs för leverans av inhalerade anestesimedel. Om så önskas, är inhalerad anestetikum ett lämpligt alternativ. Från den första injektionen av bedövningsmedel, tar hela proceduren ungefär 90 minuter att slutföra. Ischemisk tid av transplantatet är mindre than 30 minuter.

  1. Söva musen med intraperitoneala injektioner av ketamin (100 mg / kg; 10 mg / ml) och xylazin (10 mg / kg, 1 mg / ml). Musen kommer att sedated inom 10 till 15 minuter. Utvärdera anestesidjupet genom att klämma den feta delen av djuret fotdynan. Administrera 1/3 av den ursprungliga dosen av bedövningsmedlet cocktail, efter behov, till dess att djuret inte uppvisar tillbakadragande reflexen. Övervaka andningsfrekvensen noga efter varje cocktail administreras. Under operationen, bedöma graden av anestesi var 15 min genom att klämma den främre bukväggen med en pincett. Mössen bör förbli djupt nedsövd för 60 till 90 minuter.
  2. Smörj mus ögon med en oftalmologiska salva för att förhindra torrhet under narkos.
  3. Raka håret så nära huden som möjligt på buken ventrala regionen från mitten av bröstkorgen till pubis. Var särskilt noga med att inte nick någon hud. Använd inte hårborttagningskräm, eftersom det kan absorberas into huden och kan vara inflammatorisk.
  4. Placera djuret i ryggläge på en handduk över värmebordet eller dyna.
  5. Rengör operationsområdet med en preliminär scrub med 2% klorhexidin. Förbered en stor arbetsyta för att maximera det kirurgiska området. Börja skura vid centrum av den kirurgiska platsen och flytta till utsidan i en linjär eller cirkulär sätt. Gör dig av med gasväv. Upprepa denna procedur minst fem gånger. Applicera en alkohol prep pad till samma område. När alkoholen är torr, förbereda rent område med Betadine lösning och drapera med steril gasbinda.

2. End-to-end anastomos ordningen

  1. Donator Drift
    1. Behåll aseptisk teknik i hela verksamheten. Rengör alla bänkskivan och kirurgisk bordsytor med 0,5% accelererad väteperoxidlösning före användning. Linda och autoklav alla kirurgiska instrument, gasväv, draperier och klänningar före användning. Kontrollera sterilitet av instrumenten med ångasteriliseringsindikatorremsa placeras i varje förpackning. Sterila operationshandskar används och kasseras mellan operationer. För flera operationer, sterilisera kirurgiska instrument mellan användning med den heta glaspärla autoklav.
    2. Placera givar musen i ryggläge på en ren, tunn plexiglas styrelse lindade med steril duk under operationsmikroskop vid 8-30X förstoring.
    3. Efter garantera tillräckliga kirurgisk anestesi som beskrivs i avsnitt 1.1, gå vidare med kirurgi.
    4. Med hjälp av steril sax, göra en enda mittlinje undre längsgående buksnitt, från pubis till xyphoid processen.
    5. Med hjälp av en liten upprullningsdon öppnar buken väggar för att exponera håligheten.
    6. Använd steril bomull tippas applikatorer, försiktigt dra tarmarna superiorly till djurets vänstra och täck med gasbinda fuktad med saltlösning. Flytta fortplantningsorganen inferiorly och lokalisera infrarenala aortan och nedre hålvenen (IVC). Moistio de exponerade vävnaderna med jämna mellanrum med koksaltlösning.
    7. Med användning av de medicinska No. 5 pincett, separera aorta från IVC, från nivån av den vänstra njurartären till bifurkation. Använd 10-0 polyamid monofilamentsuturer att ligera små grenar nära aorta.
    8. När givarens aortan har separerats från IVC, mätta kärlet med saltlösning, täcka den exponerade håligheten med fuktad gasväv och ställa givaren åt sidan på en steril yta. Kontrollera status för donatorn (respirations och kardiovaskulär funktion, och djupet av anestesi) varje 15 min. Börja verksamma på mottagaren, isolera aorta som beskrivs nedan (steg 2.2.1 till 2.2.7).
    9. När mottagaren aorta har separerats från IVC och ställ åt sidan, tillbaka givaren under mikroskop. Cross klämma (proximal och distal till segmentet ränta) givaren aorta, cirka 5 mm från varandra, med två 4 mm mikrovaskulära klämmor.
    10. Använda Vannas-Tübingen microscissors,transekt en liten transplantatsegment (3 till 4 mm i längd) av den abdominala aortan.
    11. Med hjälp av en 25 G 5/8 nål fäst vid en spruta, spola utskurna aorta med hepariniserad (100 U / ml) koksaltlösning. Se till spetsen på nålen inte kommer i kontakt med kärlet.
    12. Placera aorta i hepariniserat (100 U / ml) saltlösning på is och ställ åt sidan. Medan fortfarande under djup anestesi, släpper mikrovaskulära klämmor. Euthanize givaren genom blodtappning.
    13. Implantera fartyg som bidrar inom 30 minuter av excision. Även om det är möjligt att använda ett fartyg som bidrar till flera mottagare genom att skära ut en större längd på aortan, hålla den ischemiska tiden till mindre än 30 minuter.
  2. Other Drift
    1. Behåll aseptisk teknik i hela verksamheten, som i givar drift.
    2. Placera mottagaren musen i ryggläge på en tunn plexiglas styrelse lindade med steril duk under operationsmikroskop vid 8-30X förstoring.
    3. After säkerställa tillräcklig bedövning, fortsätt med kirurgi när djuret inte uppvisar tillbakadragande reflex.
    4. Med hjälp av steril sax, göra en enda mittlinje undre längsgående buksnitt, från pubis till xyphoid processen.
    5. Med hjälp av en liten upprullningsdon öppnar buken väggar för att exponera håligheten.
    6. Använd steril bomull tippas applikatorer, försiktigt dra tarmarna superiorly till djurets vänstra och täck med gasbinda fuktad med saltlösning. Flytta fortplantningsorganen inferiorly och lokalisera infrarenala aortan och IVC. Fukta de exponerade vävnaderna med jämna mellanrum med saltlösning.
    7. Separera aorta från IVC, från nivån av den vänstra njurartären till bifurkation. Om det behövs kan du använda 10-0 polyamid monofilamentsuturer att ligera små grenar nära aorta.
    8. Cross klämma (proximal och distal till segmentet ränta) aortan, cirka 5 mm från varandra, med två 4 mm mikrovaskulära klämmor.
    9. Med användning av de Vannas-Tubingen microscissors, göra en enda horisontell aortotomy och resekera ett litet segment (inte mer än 0,5 mm) av den abdominala aortan att inrymma givaren aortatransplantatet.
    10. Spola utskurna aortan med hepariniserad (100 U / ml) koksaltlösning. Givaren aortagraft bör vara av lämplig längd för att ansluta mottagarens avskurna aorta ändar.
    11. Placera givaren aortatransplantatet i orthotopic läge och anastomos givarens transplantat slut på mottagarens slut, matchar respektive transplantat anatomiska orientering med den hos mottagaren.
    12. Ta försiktigt tag tunica externa fartygets och vränga den en aning med hjälp av medicinska No.5 pincett. Med hjälp av pincett, driva nålen ansluten till 10-0 polyamid monofilamentsutur genom hela tjockleken på kärlväggen för att säkra givaren aortatransplantatet till mottagarens resekterade fartyg. Var noga med att se till att behållaröppningen inte är stängt på grund av to oavsiktlig sömmar av den bakre väggen av kärlet.
    13. För kontinuerliga sömmar, placera stay suturer vid 09:00 i både de övre och nedre ändarna av transplantatet. Från den övre änden av transplantatet från 03:00, anastomos de resekterade ändarna med 2 löpande suturer och säkra suturen till vistelsen sutur.
      1. Vänd transplantatet över och fortsätta driften suturen att ryggdelen av fartyget, möta ursprung vistelse sutur. Säkert utan att mycket press på fartyget. Upprepa suturering för lägre anastomos.
        Obs! Avbrutna suturer börjar på samma sätt som den kontinuerliga sutur med undantag av att fartyget anastomoseras med tre separata stygn mellan vistelse suturer. Anastomos Tiden är vanligen 20 minuter.
    14. När anastomosen är klar, släpp distala mikrovaskulära klämman för att möjliggöra bakåtsträvande blod att flyta och kontrollera läckage av de anastomoseras webbplatser. Om det finns ett läckage, immediately placera en söm för att stänga den defekta platsen. Om det inte finns någon blödning vid platserna, släpp sedan den proximala klämman.
    15. Undersök transplantationen och kontrollera att det inte finns något blod obstruktion i transplantatet, och den proximala och distala delen av mottagarens kärlet. Kraftig pulsmönster i både donatorns och mottagarens fartyg är en primär indikation på att blodet flödar fritt. Använda pincett, försiktigt tag ena änden av vistelsen suturer och något vränga fartyget att inspektera den bakre väggen av kärlet.
      Obs: Det bör inte finnas någon veckning av kärlväggen vid båda ändarna av anastomoseras webbplatser. Dåligt blodflöde efter avlägsnande av klämmorna är ett tecken på trombos.
    16. Använda bomull tippas applikatorer tillbaka tarmarna in i bukhålan.
    17. Med Castroviejo nålhållaren och Graefe pincett, stänger bukväggen med 5-0 polypropylen suturer använder kontinuerlig sömmar. Stäng hudskiktet med sammasuturer med användning subkutikulär stängning.
    18. Administrera Torbugesic (1 mg / kg) im direkt efter slutförandet av transplantatet.
    19. Ge omedelbart i den ordning, Atipamezol (1 mg / kg), ketoprofen (5 mg / kg) och värmde laktat Ringers lösning subkutant.
    20. Omedelbart efter operationen, placera möss i en uppvärmd bur under en vatten filt över natten (12 timmar). Under bedövningsmedel-återhämtningsperiod, placera djuren ensamma i en ren och torr fritt utrymme. Linje buren (autoklaverad) med rena pappershanddukar och justera temperaturen hos det vatten filten till ca 20 till 22 ° C. Ge torra och våta kibbles efter behag på burgolvet.
      Obs: En viktig komponent i postoperativ vård är observationen av djuret och lämpliga insatser som krävs, under återhämtning från anestesi och kirurgi. Den nödvändiga intensitet övervakning kommer att variera med djuret och kan vara större under den närmaste anestesiåterhämtningsperioden som compared senare i postoperativ återhämtning.
    21. Kontinuerligt övervaka djur som har genomgått anestesi övervakas tills de återhämta sig helt. Djuret måste kunna upprätthålla unassisted sternala VILA och det måste finnas lugn och smärtfri innan det kan lämnas utan uppsikt.
    22. Ge Buprenorfin (0,1 mg / kg två gånger dagligen) och ketoprofen (5 mg / kg SID) för en period av tre dagar, både subkutant.
    23. Övervaka hjärt- och lungfunktion, kroppstemperatur, och postoperativ smärta eller obehag under återhämtning från anestesi i minst tre dagar. Ytterligare vård kan behövas, såsom administration av analgetika och andra droger, och parenterala vätskor för att minimera uttorkning och elektrolyt förlust.
    24. Bedöma framgången av transplantationskirurgi genom att observera motoriken av bakbenen. Komplett framgång transplantationen innebär obehindrat blodflöde till bakbenet och svans, vilket bör ske omedelbart efter återvinning av animal, och fullständig återhämtning utan paralys av bakbenen på den andra dagen

3. Tissue Collection

Obs: förbestämt ändpunkter varierar 3-60 dagar beroende på den typ av analys som önskas och vilken typ av obalans antigenet. I allmänhet är intimaförtjockning robust vid dag 30 efter transplantation över hela MHC inkompatibla musstammar.

  1. Söva musen med intraperitoneala injektioner av ketamin (100 mg / kg; 10 mg / ml) och xylazin (10 mg / kg, 1 mg / ml). Utvärdera anestesidjupet genom att klämma den feta delen av djuret fotdynan. Fortsätt med kirurgi när djuret inte uppvisar tillbakadragande reflex.
  2. Rengör den kirurgiska platsen med vatten och slutar med 70% alkohol.
  3. Placera djuret i ryggläge på en bricka klädda med absorberande dyna.
  4. Öppna bukhålan med en stor mittlinjen längsgående snitt. Placera en självhållande upprullningsdon att exponera håligheten, IVC end bukaortan.
  5. Försiktigt separera transplanterade donatoraortasegment från grann IVC med hjälp av ett par av medicinsk nr 5 pincett. Var särskilt noga med att inte beröva adventitia av det transplanterade kärlet.
  6. Exponera brösthålan genom att skära genom revbenen längs båda sidor av bröstryggraden hela vägen mot bröst inlopp. Reflektera den främre bröstväggen mycket fint att avslöja hjärtsäck och säkra bröstkorgen med ett par hemostat.
  7. När hjärtat exponeras, infoga en 25 G 5/8 nål (fäst vid en spruta) in i den vänstra ventrikeln och i jämnhöjd med 0,1 ml hepariniserat (100 U / ml) koksaltlösning.
  8. Med användning av en sax, avlägsna höger förmak för att tillåta blod, hepariniserad saltlösning, och fixativ för att lämna kroppen under perfusionen. Perfundera djuret med 5 ml av 4% paraformaldehyd eller tills fluid körningar tydlig. Ta hjärtat att säkerställa dödshjälp.
  9. Punktskatter transplanterade kärlsegmentet och fördjupa sig i 4% paraformaldehyd för mer än en timme. Ställ det transplanterade kärlet i OCT (optimal skärtemperatur) matris och blixt frysa. Avsnitt kärlet under en kryostat inställd på 8 um tjocklek. Stain sektioner med hematoxylin och eosin och / eller Verhoeff-van Gieson (van Gieson) elastisk fläck.

4. Morfologisk analys av transplantat

Obs: TA kännetecknas av intimal förtjockning 13. I denna modell, intimal förtjockning och en resulterande reduktion av storleken av lumen är reflekterande av svårighetsgraden av immunmedierad kärlskada. Syngraft kontroller används för att bestämma de grundläggande egenskaperna hos fartyg i avsaknad av allogena immunsvar. Dessa kontroller medger även utvärdering av arteriell skada som sker som ett resultat av det kirurgiska ingreppet. Det bör inte vara intimaförtjockning i syngrafts.

  1. För att undersöka intimal förtjockning och luminala ocklusion, mäta området inom endotelcellenskiktet, inre elastisk lamina (IEL) och yttre elastisk lamina (EEL) på elastiska van Gieson färgade artärsegment med ett bildanalysprogram. Parametrarna nedan kan användas för att bestämma arteriella förändringar reflekterande av TA.
    1. Mät absolut intimala område: område inom den inre elastiska lamina - området inom endotelcellskikt. Detta ger en absolut mätning av intimal expansion, vilket är kännetecknet för TA.
    2. Mät absolut mediala området: område inom den yttre elastiska lamina - område inom den inre elastiska lamina. Detta ger en absolut mätning av mediala nedbrytning eller tillväxt, vilket ibland kan inträffa som ett resultat av immunmedierade förändringar i denna region av kärlväggen.
    3. Mät den totala kärl-området är det område inom den yttre elastiska lamina. Detta ger ett mått på kärl remodellering som innebär expansion eller sammandragning av artär som ett resultat av immunologisk skada.
    4. Åtgärdintima / media: (område inom den inre elastiska lamina - område inom endotelcellskikt) / (område inom den yttre elastiska lamina - område inom den inre elastiska lamina). Detta ger ett relativt mått på intimal expansion och normaliserar för skillnader i fartygsstorlek.
    5. Mät% Luminal Förträngning: [(område på den inre elastiska lamina - område inom endotelcellskikt) / område med den inre elastiska lamina)] * 100. Detta ger ett mått på omfattningen av luminala ocklusion, som är resultatet av en kombination av intima expansion och ombyggnad (aktiv eller passiv) av kärlväggen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denna modell är bukaorta från en Balb / cYJ musen placerad i den infrarenala aortan av en C57BL / 6 mottagare. Detta möjliggör en omfattande utvärdering av alloimmuna svar som riktar allograft artärer. Immunmedierad kärlskada i denna modell initierar vaskulära reparativa reaktioner som kulminerar i intimal förtjockning, luminal förträngning och rekrytering av immunceller (figurerna 1 och 2). Dessa kriterier fungerar sedan som en utläsning för svårighetsgraden av alloimmuna svar, vaskulär avstötning, och TA. Framgång för förfarandet kan bedömas genom utveckling av robusta intimaförtjockning av transplantat artär segment och frånvaron av intimal förtjockning i syngraft kontroller. Kliniskt relevant immunosuppression kan användas med den här modellen för att mer likna klinisk transplantation. Denna modell kan även användas med transgena djur för att studera effekten av specifika proteiner / banor i alloimmuna svar ens vi har gjort 14.

Allograft aortasegment utveckla intimaförtjockning

Mängden immunmedierad allograft kärlskada undersöktes genom att kvantifiera intimal förtjockning och luminala förträngning i ympade aorta segment på dag 30 efter transplantation. Allograft artärsegment utveckla betydande intimaförtjockning och luminala ocklusion och inga förändringar observeras i syngraft kontroll artär segment (Figur 1).

Ansamling av leukocyter vid allogen aortasegment.

Ansamlingen av leukocyter vid allogen artärer undersöktes genom att kvantifiera antalet CD4 T-celler, CD8 T-celler och makrofager (Mac-3) 15 genom immunhistokemi. Mac-3 användes för att färga för makrofager i denna studie även om andra markörer, såsom F4 / 80, kan också användas 16. CD4-T-celler, CD8 T-celler och makrofager detekterades i intiman av allograft artärer (fig 2)

Figur 1
Figur 1: Histologisk analys av ympade artärer (A) bukaortan segment från syngena och allogena möss insatt in i de resekterade abdominala aorta av C57BL / 6-möss.. De ympade artärerna skördades vid dag 30 efter transplantation. Representativa mikrofotografier av elastiska van Giesen färgade artärer visas. Skala bar = 0,1 mm = 100 m (B) Diagram som visar hur de olika lagren av fartyget mäts, L: lumen, E: endotelskikt jag: intima, M: media, A:.. Adventitia (C) Kvantifiering av intima / media förhållandet och% luminal förträngning från 30 dagars syngena (n = 3) och allogen (n = 6) transplantat, * P <0,05.= "_ Blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2: Immun cellackumulering i allograft artärer. Representativa mikrofotografier av allograft aortasegment immunhistokemiskt färgas för (A) CD4, (B) CD8, och (C) Mac-3 och motfärgades med hematoxylin visas. Skala bar = 0,1 mm = 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har beskrivit ett protokoll för aortainterposition ympning i möss som är användbart för att studera immunmedierad vaskulär avstötning och TA. Denna modell kan användas för att undersöka orsakerna till TA samt utveckling av nya terapeutiska strategier. Det har använts tidigare för att etablera en viktig roll för adaptiv immunitet, cytotoxiska T-cellsvar, cytokin-medierad CD4 T-cells effektorceller svar och antikroppsmedierad skada transplantatet i TA 14,17-21. Artery transplantation i möss är svårt på grund av den uppenbara begränsade storleken på djuret; dock med praktik och due diligence, framgångsrika operationer kan åstadkommas. Framgång beror på öppenheten hos kärlet. Detta innebär att säkerställa att transplantatet inte skadas av felaktigt hantering av kärlet med pincett, förträngning av kärllumen, suturering den bakre väggen av kärlet, och upprepande suturering av samma plats. Läckage av fartyget är också problematiskt och kräver omsorg för att eNsure att antalet och placeringen av stygn delas jämnt runt kärlväggen. Det är också viktigt att transplantat ischemi minimeras till mindre än 30 minuter. Med detta kan en framgång på mer än 95% uppnås.

Aorta är den största artären i musen så den här proceduren är den enklaste mikro metod för att undersöka kärl avslag i denna modell djur. Dessutom är aortasegmentet ympade i en fysiologiskt relevant plats, upplever normala blodflödet, och intimaförtjockning utvecklas snabbt. Den andra huvud modell som används för att bedöma vaskulär avstötning och TA är heterotop hjärttransplantation, som har fördelen av att undersöka utvecklingen av TA i hjärtats kranskärl och i samband med hjärttransplantation som är den mest relevanta kliniska scenario för TA. Emellertid är heterotopa hjärttransplantationer placeras i en icke-fysiologisk plats inuti kroppen (vanligen anastamosed till vena cava ochaorta i buken) och hjärtat inte pumpar blod genom ventriklarna på grund av den bakåtsträvande karaktären av blodtillförseln till det transplanterade hjärtat. Som sådan kan den typ av blodflödet genom krans trädet vara annorlunda än vad som normalt upplevs av kranskärlen 22,23. Dessutom, för att strategierna övervinna akut avstötning av hjärtat måste införlivas för att utvärdera arteriella förändringar. I båda modellerna, är det viktigt att noga välja vilken typ av antigen obalans utnyttjas för att kunna korrekt hantera specifika frågor om vaskulär avstötning och TA.

Sammanfattningsvis är aortainter ympning en kraftfull teknik för att undersöka immunmedierad arteriell skada och TA. Det kan rutinmässigt behärskar med praktik och omsorg på den del av forskaren. När behärskar, kan detta förfarande modifieras för mellan ympning av andra arteriella segment, såsom halspulsådern, thpå kan möjliggöra granskningen av ytterligare vetenskapliga frågor. Dessutom kan användningen av denna modell förlängas utöver studiet av transplantationen. Mellan ympning av artärer kan användas för att införa arteriella segment från modifierad (t.ex. transgena eller lipiden matad) möss till icke-modifierade motsvarigheter, eller vice versa, för att isolera de biologiska effekterna av molekyler till artärväggceller kontra icke-arteriella väggceller 24 , 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Detta arbete har finansierats med bidrag från den kanadensiska Institutes of Health Research och hjärta- och slaggrunden av BC & Yukon (JCC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J (H-2b) Jackson Laboratories, Bar Harbour ME Strain# 000664
Balb/cBYJ Jackson Laboratories, Bar Harbour ME Strain# 001026
Ketamine Hydrochloride Injection USP 100 mg/ml Ketalean DIN 00612316
Xylazine Injection 20 mg/ml Rompum DIN 02169592
Ketoprofen Injection 100 mg/ml Anafen DIN 01938126
Butorphanol Tartrate injection 10 mg/ml Torbugesic DIN 008450000
Buprenorphine Injection 0.3 mg/ml Reckitt Benckiser B.N. 5241
Atipamezole hydrochloride sterile injectable solution Antisedan DIN 02237744
Heparin Sodium Injection, USP, 1,000 units/ml McKesson Distribution DIN 02264315
Tears naturale ophthalmic ointment Alcon DIN 02082519
Stereomicroscope Leica M80
0.9% Sodium Chloride, sterile Baxter Corporation
Lactated Ringer’s solution, sterile Baxter Corporation
0.9% Sodium Chloride Injection, sterile, 10 ml Baxter Corporation
Alcohol Prep Pads Loris
Povidone Iodine Betadine
Chlorohexidine Gluconate 4% w/v Germi-Stat
Black Polyamide Monofilament AROSurgical Instruments T4A10Q07
Suture, 10-0 suture, 70 microns Corporation
Blue monofilament suture 5-0, P3 needle Ethicon 8698G
1 ml Syringe BD REF 309659
10 ml Syringe BD REF 309604
1cc TB insulin syringe with 28 G 1/2 BD REF 309309
25 G 7/8, hypodermic needle BD REF 305124
27 G 1/2, hypodermic needle BD REF 305109
Colibri Retractor- 1.5 cm spread 4 cm Fine Science Tools 17000-04
S&T CAF-4 Clip applying forceps, without lock Fine Science Tools 00072-14
Supergrip forceps, S&T Fine Science Tools 00632-11
Medical No.5 forceps Fine Science Tools 11253-20
Lexer Baby Scissors Fine Science Tools 14078-10
Micro Adson forceps serrated Fine Science Tools 11018-12
Vannas-Tubingen microscissors Fine Science Tools 15003-08
Micro clamps, b-1; 3.5mm x 1mm; 7mm length Fine Science Tools 00396-01
Graefe-forceps, 10cm 1x2 teeth Fine Science Tools 11054-10
Castroviejo with lock and tungsten jaws Fine Science Tools 12565-14
Hot glass bead sterilizer Inotech 250 IS-250 - Steri-250
Non-woven gauzes Progene
Cotton Tipped Applicators Puritan
Beard Trimmer Wahl
Heating pad Sunbeam

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Billingham, M. E. Graft coronary disease: the lesions and the patients. Transplant Proc. 21, 3665-3666 (1989).
  2. Foegh, M. L. Chronic rejection--graft arteriosclerosis. Transplant Proc. 22, 119-122 (1990).
  3. Libby, P., Pober, J. S. Chronic rejection. Immunity. 14, 387-397 (2001).
  4. Tellides, G., Pober, J. S. Interferon-gamma axis in graft arteriosclerosis. Circulation research. 100, 622-632 (2007).
  5. Johnson, D. E., Gao, S. Z., Schroeder, J. S., DeCampli, W. M., Billingham, M. E. The spectrum of coronary artery pathologic findings in human cardiac allografts. The Journal of heart transplantation. 8, 349-359 (1989).
  6. Gao, S. Z., Alderman, E. L., Schroeder, J. S., Silverman, J. F., Hunt, S. A. Accelerated coronary vascular disease in the heart transplant patient: coronary arteriographic findings. Journal of the American College of Cardiology. 12, 334-340 (1988).
  7. Mennander, A., et al. Chronic rejection in rat aortic allografts. An experimental model for transplant arteriosclerosis. Arterioscler Thromb. 11, 671-680 (1991).
  8. Choy, J. C. Granzymes and perforin in solid organ transplant rejection. Cell Death Differ. 17, 567-576 (2010).
  9. Johnson, P., Carpenter, M., Hirsch, G., Lee, T. Recipient cells form the intimal proliferative lesion in the rat aortic model of allograft arteriosclerosis. Am J Transplant. 2, 207-214 (2002).
  10. Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation. 112, 2951-2958 (2005).
  11. Yu, L., et al. AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting interferon-gamma-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion. Circ Res. 109, 418-427 (2011).
  12. Miller, C., DeWitt, C. W. Cellular and humoral responses to major and minor histocompatibility antigens. Transplant Proc. 5, 303-305 (1973).
  13. Tsutsui, H., et al. Lumen loss in transplant coronary artery disease is a biphasic process involving early intimal thickening and late constrictive remodeling: results from a 5-year serial intravascular ultrasound study. Circulation. 104, 653-657 (2001).
  14. Rossum, A., Enns, W., Shi, P., MacEwan, G. E., Choy, J. C. Bim regulates allogeneic immune responses and transplant arteriosclerosis through effects on T cell activation and death. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 1290-1297 (2014).
  15. Ho, M. K., Springer, T. A. Tissue distribution, structural characterization, and biosynthesis of Mac-3, a macrophage surface glycoprotein exhibiting molecular weight heterogeneity. J Biol Chem. 258, 636-642 (1983).
  16. Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney international. 67, 2488-2493 (2005).
  17. Shi, C., et al. Immunologic basis of transplant-associated arteriosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 4051-4056 (1996).
  18. Skaro, A. I., et al. CD8+ T cells mediate aortic allograft vasculopathy by direct killing and an interferon-gamma-dependent indirect pathway. Cardiovasc Res. 65, 283-291 (2005).
  19. Tellides, G., et al. Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes. Nature. 403, 207-211 (2000).
  20. Wang, Y., et al. Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation. Circ Res. 101, 560-569 (2007).
  21. Soulez, M., et al. The perlecan fragment LG3 is a novel regulator of obliterative remodeling associated with allograft vascular rejection. Circ Res. 110, 94-104 (2012).
  22. Choy, J. C., Kerjner, A., Wong, B. W., McManus, B. M., Granville, D. J. Perforin mediates endothelial cell death and resultant transplant vascular disease in cardiac allografts. Am J Pathol. 165, 127-133 (2004).
  23. Choy, J. C., et al. Granzyme B induces endothelial cell apoptosis and contributes to the development of transplant vascular disease. Am J Transplant. 5, 494-499 (2005).
  24. Reis, E. D., et al. Dramatic remodeling of advanced atherosclerotic plaques of the apolipoprotein E-deficient mouse in a novel transplantation model. Journal of vascular surgery. 34, 541-547 (2001).
  25. Potteaux, S., et al. Suppressed monocyte recruitment drives macrophage removal from atherosclerotic plaques of Apoe-/- mice during disease regression. J Clin Invest. 121, 2025-2036 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics