वसा ऊतकों डिपो में प्रत्यारोपण के लिए इनकैप्सुलेशन Thermogenic Preadipocytes

1Department of Human Sciences, The Ohio State University, 2Department of Minimally Invasive Surgery, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 3NSF Nanoscale Science and Engineering Center for Affordable Nanoengineering of Polymeric Biomedical Devices, The Ohio State University
Published 6/02/2015
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Medicine

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Summary

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Xu, L., Shen, Q., Mao, Z., Lee, L. J., Ziouzenkova, O. Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots. J. Vis. Exp. (100), e52806, doi:10.3791/52806 (2015).

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Abstract

सेल encapsulation अर्द्ध पारगम्य झिल्ली के भीतर व्यवहार्य कोशिकाओं को फंसाने के लिए विकसित किया गया था। engrafted समझाया कोशिकाओं लंबी अवधि के अस्तित्व को प्राप्त करने के लिए इलाज मेजबान के ऊतकों में कम आणविक भार चयापचयों का आदान-प्रदान कर सकते हैं। semipermeable झिल्ली प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा अस्वीकृति से बचने के लिए समझाया कोशिकाओं engrafted की अनुमति देता है। encapsulation प्रक्रिया ऐसी इंसुलिन के रूप में bioactive यौगिकों, अन्य हार्मोन, और साइटोकिन्स के एक नियंत्रित रिलीज सक्षम करने के लिए डिजाइन किया गया था। यहाँ हम मोटे चूहों के अंतर पेट वसा ऊतकों में गर्मी उत्पादन और ऊर्जा का अपव्यय (thermogenesis) के लिए लिपिड का उपभोग जो catabolic कोशिकाओं के encapsulation के लिए एक विधि का वर्णन। तापजनक catabolic कोशिकाओं के encapsulation मोटापे की रोकथाम और उपचार के लिए संभावित रूप से लागू हो सकता है और टाइप 2 मधुमेह हो सकता है। Catabolic कोशिकाओं के एक अन्य संभावित आवेदन एल्कोहल या अन्य विषाक्त चयापचयों और पर्यावरण प्रदूषण से detoxification के शामिल हो सकते हैं।

Introduction

पुराने रोगों 1 की बढ़ती घटनाओं चिकित्सीय सेल आबादी 2 के प्रत्यारोपण पर अध्ययन को प्रेरित किया है। Syngenic या allogenic स्टेम कोशिकाओं को इन आवेदनों 2 के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया प्रकार की कोशिकाओं रहे हैं। हालांकि, इन उपचार के आरोपण के बाद भेदभाव और स्टेम कोशिकाओं के प्रवास के नियंत्रण की अनुमति नहीं है और कुशल खर्च नहीं कर रहे हैं। लाभकारी कार्यों के साथ आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं के प्रत्यारोपण कई बीमारियों के उपचार में सुधार की आशंका है। हालांकि, आनुवंशिक सेल संशोधनों के मेजबान की प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा मान्यता प्राप्त हैं, इसलिए, इन उपचार प्रतिरक्षादमन 3 की आवश्यकता होती है। इंसुलिन का उत्पादन कोशिकाओं के encapsulation डॉ चांग 4 द्वारा विकसित किया गया है। तकनीक एक कैल्शियम क्लोराइड समाधान में डूब रहे हैं कि alginate बूंदों में कोशिकाओं के encapsulation पर आधारित है। Alginate अणु (जी) (एम) mannuronic और guluronic एसिड से मिलकर बनता है और सीए द्वारा जोड़ा जा सकता है 2 +। जमाना बाद, मोती एक पाली एल Lysine (पीएलएल) समाधान निलंबित कर रहे हैं। इस चरण के दौरान, पीएलएल कैप्सूल की झिल्ली को स्थापित करता है जो alginate अणुओं में जी और एम को बांधता है। कैप्सूल की झिल्ली के porosity एम और पीएलएल सांद्रता, ऊष्मायन समय है, और तापमान बदलती द्वारा संग्राहक जा सकता है। पीएलएल के बंधन भी प्रकार और alginate की एकाग्रता पर निर्भर करता है। सीए 2 + आयनों के साथ crosslinked Alginate मेट्रिसेस, मनोवैज्ञानिक वातावरण में या फॉस्फेट और साइट्रेट आयनों के उच्च एकाग्रता के साथ आम बफर समाधान में अस्थिर कर रहे हैं। इन बफ़र्स alginate से सीए 2 + निकालने और कोर दव्र कर सकते हैं। Alginate कोर के द्रवीकरण सेलुलर आंदोलन और विकास के लिए कैप्सूल के अंदर जगह उपलब्ध कराता है। Polycationic पाली एल लाइसिन (एपीएल) के साथ polyanionic Alginate में समझाया प्रकोष्ठों इम्युनोग्लोबुलिन के लिए अभेद्य हैं, लेकिन विषाक्त पदार्थों के पोषक तत्वों की आमद और तपका है। ये गरीबी रेखा के ऊपर के गुण दीर्घकालिक सु सक्षमआनुवंशिक रूप से अलग मेजबान में प्रत्यारोपण के बाद समझाया कोशिकाओं के rvival। इलियट एट अल। नौ साल के आरोपण 5 के बाद एक मानव रोगी में समझाया सुअर का अग्नाशय कोशिकाओं से कार्य के अस्तित्व की सूचना दी।

इनकैप्सुलेशन तकनीक microencapsulation (3-800 माइक्रोन) और macroencapsulation (बड़ा 1,000 से माइक्रोन) में वर्गीकृत किया जा सकता है। Microcapsules macrocapsules 6 की तुलना में अधिक टिकाऊ होते हैं। डॉ चांग और 1964 में उनके सहयोगियों द्वारा अपनी खोज के बाद, microencapsulation व्यापक रूप से इंसुलिन का उत्पादन उपचय कोशिकाओं, अन्य हार्मोन, और bioactive अणुओं 7 की encapsulation के लिए इस्तेमाल किया गया है। इन उपचार फाइब्रोसिस और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 8 सहित मेजबान ऊतक में कई चुनौतियों का सामना करना पड़ा। प्रारंभ में, जैवपॉलिमरों की गुणवत्ता से संबंधित दुष्प्रभाव हल किया गया है। हालांकि, उपचय कोशिकाओं के प्रत्यारोपण अभी भी हार्मोन overpr का एक परिणाम के रूप में, इस तरह के फाइब्रोसिस के रूप में दुष्प्रभाव, शुरू कीएक विशेष ग्रंथि के बाहर oduction।

हाल के दशकों, मोटापा और टाइप 2 मधुमेह महामारी अनुपात 9 तक पहुँच गया है। वयस्क लोगों में से 30% से अधिक दुनिया भर में अधिक वजन और 10 मोटापे से ग्रस्त हैं। बढ़ी हुई अंतर पेट (आईएबी) वसा गठन जीर्ण सूजन की घटना बढ़ जाती है और टाइप 2 मधुमेह, हृदय रोग, कुछ तरह के कैंसर, और अन्य रुग्णता 11-13 बढ़ावा देता है। सबूत की कई लाइनों आईएबी वसा के साथ जुड़े रोगजनन विशिष्ट adipocytes से बचा जा सकता है कि सुझाव दिया। हाल के अध्ययनों से चयापचय में सुधार लाने और इन विवो 14 में कृन्तकों में मोटापा और इंसुलिन प्रतिरोध को कम कर सकते आईएबी क्षेत्र में चमड़े के नीचे adipocytes की है कि प्रत्यारोपण से पता चला है। मोटापा और इंसुलिन प्रतिरोध के प्रभावी कमी गर्मी 15,16 के रूप में ऊर्जा नष्ट करने में सक्षम तापजनक adipocytes के साथ संबद्ध किया गया है। Adipocytes की Thermogenic संशोधन स्थिर अभिकर्मक के द्वारा प्राप्त किया जा सकता हैऐसे uncoupling प्रोटीन 1 (Ucp1) के रूप में या Ucp1 और अन्य तापजनक जीन 15,16 की अभिव्यक्ति को विनियमित जीन की माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटॉन uncoupling, में भाग लेने वाले जीन की। हमारे हाल के अध्ययनों से एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज 1 A1 (Aldh1a1) में कमी इन चूहों 17,18 में मोटापा और इंसुलिन प्रतिरोध को कम कर देता है कि आईएबी वसा की तापजनक remodeling की ओर जाता है कि पता चला है। विशेष रूप से, तापजनक Aldh1a1 कमी के encapsulation (Aldh1a1 - / -) preadipocytes आईएबी वसा 18 के उपचार के लिए नई चिकित्सीय के अवसरों का सुझाव, मोटापे से ग्रस्त जंगली प्रकार चूहों में आईएबी वसा में एक ही उपचारात्मक प्रभाव मध्यस्थता करता है। प्रयोगात्मक सेटिंग्स में, समझाया कोशिकाओं को एक लागत प्रभावी ढंग से 19 में विशेष सेल आबादी के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सक्षम शोधकर्ताओं। यहाँ हम मोटापे की एक माउस मॉडल में एक thermogenic catabolic सेल लाइन के encapsulation और अपनी प्रयोगशाला और चिकित्सीय आवेदन की विधि पर चर्चा की। प्रोटोकॉल टी का वर्णनmicrocapsule उत्पादन (चित्रा 1) के लिए hree चरणों: alginate microbeads (चित्रा 1 ए), polycationic पाली एल लाइसिन (पीएलएल) microbeads की सतह (चित्रा 1 बी) पर झिल्ली, के गठन और हटाने का गठन alginate कोर (चित्रा 1C)।

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Protocol

अध्ययन प्रोटोकॉल ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी आचार समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया था। पशु प्रयोगों IACUC प्रोटोकॉल द्वारा अनुमोदित किया गया। सभी प्रक्रियाओं लामिना का प्रवाह के साथ स्तर 2 जैव सुरक्षा कैबिनेट के तहत प्रदर्शन किया गया। हम सभी मानक सुरक्षा आवश्यकताओं और प्रक्रियाओं का पालन किया। microcapsules की तैयारी के लिए microencapsulation तकनीक, 18, ​​17 के रूप में वर्णित किया गया है।

सामग्री 1. तैयारी

  1. Autoclaved शारीरिक खारा (पानी में 0.9% सोडियम क्लोराइड) में 2% सोडियम alginate समाधान के 10 एमएल तैयार करें। शारीरिक खारा में 0.05% पीएलएल समाधान तैयार है। पहले दिन इन समाधानों को तैयार है और रात भर हलचल। उपयोग करने से पहले 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ समाधान फ़िल्टर।
  2. 50 मिमी सोडियम साइट्रेट और 0.9% सोडियम क्लोराइड समाधान में 100 मिमी 2 CaCl तैयार करने और उन्हें आटोक्लेव।
  3. सभी समाधान, सुई, इलेक्ट्रोड, और बीकर आटोक्लेव। Clogging से बचने के लिए तारों के साथ अच्छी तरह से साफ सुइयों।
  4. (102 microcapsules अच्छी तरह से हर 2 सेमी के लिए की जरूरत है और कैप्सूल 18 प्रति 500 कोशिकाओं लगभग वहाँ रहे हैं) कैप्सूल के लिए उपयोग करने के लिए कोशिकाओं की उचित मात्रा का निर्धारण करते हैं। दो लाख कोशिकाओं प्रति सोडियम alginate के 1 मिलीलीटर का प्रयोग करें।
  5. एक उच्च ग्लूकोज में एक 'fibroblast वृद्धि मध्यम' युक्त 10% बछड़ा सीरम, और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन की तैयारी (4,500 मिलीग्राम / एल ग्लूकोज) Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM)।
    1. DMEM में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 10 माइक्रोग्राम / एमएल इंसुलिन, 1 माइक्रोन dexamethasone, 0.5 मिमी 3-Isobutyl-1-मिथाइल xanthine, और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त एक 'भेदभाव मध्यम मैं' तैयार करें।
    2. DMEM में एक 'भेदभाव मध्यम द्वितीय' युक्त 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 10 माइक्रोग्राम / एमएल इंसुलिन, और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन तैयार करें।
  6. (आरआई 10 मिलीलीटर रेडियो-immunoprecipitation परख बफर प्रति एक protease अवरोध करनेवाला गोली युक्त lysis बफर तैयार करेंपीए बफर)।

2. Alginate microbeads तैयारी (चित्रा 1 ए)

  1. सेल संस्कृति कुप्पी से पुराने मध्यम निकालें। पीबीएस के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं कुल्ला। 0.25% trypsin EDTA (एक मिला हुआ T175 कुप्पी प्रति 2 मिलीलीटर) के साथ निलंबन में कोशिकाओं को ले आओ।
  2. एक hemocytometer का उपयोग सेल निलंबन में कोशिकाओं की गणना। सेल निलंबन से 10 मिलीलीटर विभाज्य का प्रयोग करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार कोशिकाओं गिनती। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 480 XG पर centrifugation माध्यम में शेष कोशिकाओं अपकेंद्रित्र।
  3. 1.4 चरण में वर्णित के रूप में सोडियम alginate में सेल गोली निलंबित। 5 मिलीलीटर सिरिंज के लिए सोडियम alginate सेल समाधान स्थानांतरण।
  4. एक 23 गेज सुई जोड़ने के लिए, समाधान में हवा के बुलबुले निकालें और हवा के एक 1 मिलीलीटर जेब बनाने के लिए सिरिंज पलटना।
  5. Encapsulator की सुई टोंटी के तहत 100 मिमी 2 CaCl समाधान की 144 मिलीग्राम से युक्त एक छोटे से बीकर (180 मिलीलीटर) रखें। टिप approxim साथ encapsulator करने के लिए इलेक्ट्रोड संलग्न करें100 मिमी 2 CaCl समाधान की सतह से ऊपर ately 2.5 सेमी।
  6. कसकर सिरिंज पंप में सोडियम alginate सेल समाधान युक्त सिरिंज रखें। सिरिंज का उद्घाटन करने के लिए रबर ट्यूब संलग्न। सोडियम alginate-सेल समाधान ट्यूब के माध्यम से आधे रास्ते में प्रवेश करती है जब तक सवार धक्का। 5.4 केवी वोल्टेज समायोजित करें। सिरिंज पंप पर 12.06 मिमी व्यास सेट करें। 3 मिलीग्राम / घंटा की गति को समायोजित करें। पंप शुरू करो। Encapsulator पर मुड़ें और 5.4 केवी पर वोल्टेज बनाए।
  7. हुड के विंडो बंद करें और alginate microbeads के गठन के अंत तक किसी भी अनावश्यक कंपन से बचें। सभी समाधान सुई के माध्यम से गुजरता के बाद, पीएलएल के साथ कोटिंग से पहले अतिरिक्त 20 मिनट के लिए 100 मिमी 2 CaCl समाधान में alginate गेंद के आकार का microbeads जमना।

PLL के साथ 3. कोटिंग microbeads (चित्रा 1 बी)

  1. सोडियम alginate सेल गेंद के आकार का microbeads युक्त बीकर निकालें और इन microb हस्तांतरणएक 50 मिलीलीटर centrifugation के ट्यूब में ईएडीएस। Microbead गोली से 2 CaCl समाधान निकालें।
  2. 0.9% NaCl के 30 मिलीलीटर जोड़कर alginate सेल गेंद के आकार का microbeads धो लें। धीरे हाथ से ट्यूब हिला। Microbeads के गुरुत्वाकर्षण से उपजी करने के बाद 25 मिलीलीटर विंदुक के साथ 0.9% सोडियम क्लोराइड निकालें। 3 washes के एक कुल के लिए दो से अधिक बार दोहराएँ।
  3. सोडियम alginate समाधान के हर 1 मिलीलीटर के लिए 0.05% पीएलएल समाधान के 10 एमएल का प्रयोग करें। 10 मिनट के लिए प्रति मिनट 1,000 घुमाव पर 0.05% पीएलएल और भंवर जोड़ें।
    नोट: आमतौर पर, 10 मिनट पीएलएल कोटिंग के लिए पर्याप्त है।
  4. पीएलएल कोट का गठन किया है, के बाद पीएलएल समाधान निकालने और 3.2 में वर्णित के रूप में कैप्सूल 3 बार धोएं।

Alginate कोर 4. निकालना (चित्रा 1C)

  1. 50 मिमी सोडियम साइट्रेट समाधान के 30 मिलीलीटर जोड़ें। 5 मिनट या सभी सोडियम alginate भंग कर रहा है जब तक प्रतीक्षा करें। कदम 3.1.1 में वर्णित के रूप में धो तीन बार कैप्सूल।
  2. , 0.9% सोडियम क्लोराइड निकालें 50 मिलीलीटर ट्यूब के लिए संस्कृति के माध्यम से 20 मिलीलीटर जोड़नेऔर एक सेल संस्कृति फ्लास्क कोशिकाओं से युक्त सभी कैप्सूल हस्तांतरण। मानक सेल संस्कृति शर्तों 18 के तहत समझाया कोशिकाओं संभाल लेना।

इन विट्रो आवेदन 5. कोशिकाओं के बीच xenograft और मेजबान सेल बातचीत या metabolite बाढ़ की काइनेटिक्स / तपका अध्ययन करने के लिए (चित्रा 2)

  1. सह संस्कृतियों के लिए मिला हुआ जब तक 24 अच्छी तरह से थाली पर संस्कृति मेजबान कोशिकाओं। संवर्धन preadipocytes के लिए 'fibroblast वृद्धि मध्यम' का प्रयोग करें।
  2. 24 अच्छी तरह से थाली युक्त मिला हुआ मेजबान कोशिकाओं में स्थानांतरण microcapsules। एक monolayer प्राप्त करने के लिए microcapsules (102 microcapsules / अच्छी तरह से 2 सेमी) जोड़ें।
  3. छह दिनों के लिए भेदभाव मध्यम द्वितीय करने के लिए पूर्व adipocyte भेदभाव मध्यम आई के साथ भेदभाव हर 48 घंटा, परिवर्तन मीडिया प्रेरित। RIPA बफर में Lyse कोशिकाओं। पश्चिमी धब्बा का उपयोग कर प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने की शर्त के अनुसार 50 माइक्रोग्राम प्रोटीन का प्रयोग करें।

उपचार के लिए vivo आवेदन 6.मोटापे के ईएनटी (चित्रा 3)

  1. संज्ञाहरण के रखरखाव के लिए ऑक्सीजन के साथ संज्ञाहरण और 2% isoflurane की प्रेरण के लिए ऑक्सीजन के साथ 4 isoflurane% मिलाएं। पैर के अंगूठे चुटकी द्वारा पर्याप्त संवेदनाहारी गहराई की पुष्टि करें।
    1. बाहर सुखाने से कॉर्निया की रक्षा के लिए आंखों पर विरोधी खुजली मरहम लागू करें।
  2. ऐसे हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) के रूप में स्थायी रूप से कृत्रिम प्रतिदीप्ति प्रोटीन के साथ चिह्नित कर रहे हैं कि समझाया कोशिकाओं का उपयोग करें।
  3. एक 3 मिलीलीटर सिरिंज और समझाया कोशिकाओं इंजेक्षन करने के लिए एक 20 गेज सुई का प्रयोग करें।
    1. 0.5 x 10 6 कोशिकाओं 3 चित्र में दिखाया के रूप में एक जननपिंड और गुर्दे के बीच intraperitoneal क्षेत्र में स्थित है जो प्रत्येक आईएबी वसा डिपो में पीबीएस के 0.2 मिलीलीटर में निलंबित कर दिया इंजेक्षन। के एक औसत वजन के साथ चूहों के लिए इस पीबीएस की मात्रा और सेल नंबर का उपयोग करें 40 ग्राम। अलग वजन या खुराक पर निर्भर प्रभाव का निर्धारण करने के लिए है कि चूहों में कोशिका संख्या और मात्रा समायोजित करें।

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Representative Results

चित्रा 1 microbeads के उत्पादन के हर कदम माइक्रोस्कोप के तहत नियंत्रित किया जा सकता है कि पता चलता है। 2A चित्रा सह संस्कृति को कैसे adipocytes समझाया कोशिकाओं की एक monolayer के साथ दिखाता है। चित्रा 2B adipocyte / microcapsules सह संस्कृतियों का उपयोग कर एक मात्रात्मक अध्ययन के एक प्रतिनिधि उदाहरण है कि adipocytes पश्चिमी धब्बा का उपयोग कर विश्लेषण किया गया की धारा 5. lysates में वर्णित किया गया। समझाया कोशिकाओं इस प्रयोग में विश्लेषण नहीं कर रहे थे। 1,000 कमजोर पड़ने: प्राथमिक ATGL और β-actin के एंटीबॉडी एक 1 पर इस्तेमाल किया गया। ATGL के अनुपात β-actin के लिए तीन स्वतंत्र प्रयोगों के रूप में मतलब एसडी दिखाए जाते हैं। इसी प्रकार के सह संस्कृति दृष्टिकोण सह संस्कृतियों में समझाया सेल और adipocyte बातचीत के प्रभाव mRNA के विश्लेषण और अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। / - - Adipocytes encapsula की तुलना में adipocytes में ATGL लाइपेस और lipolysis 18 का काफी उच्च स्तर को प्रेरित तापजनक Aldh1a1 समझाया कि आंकड़ों से पता चलताटेड गुम्मट adipocytes।

चित्रा 3 GFP के स्थान और मेजबान वसा ऊतकों में कैप्सूल की अखंडता को इंगित करता है कि पता चलता है। GFP की अभिव्यक्ति भी सेल व्यवहार्यता का सूचक है।

गुणात्मक मूल्यांकन

encapsulation या समझाया कोशिकाओं का प्रत्यारोपण की गुणवत्ता माइक्रोस्कोपी, एमआरआई, और इलाज वसा ऊतकों 18 के immunohistochemical विश्लेषण का उपयोग करके मूल्यांकन किया जा सकता है।

मात्रात्मक दृष्टिकोण

18 .GFP वर्णित के रूप में प्रतिरोपित कोशिकाओं को जीवित में GFP की अनूठी अभिव्यक्ति दी, GFP अभिव्यक्ति के स्तर की माप की कोशिकाओं को समझाया की अनुमति के ऊतकों में मात्रा निर्धारित किया जा करने के लिए और अन्य प्रोटीन एक पूरी वसा ऊतकों की एक homogenate में विशिष्ट विरोधी GFP एंटीबॉडी का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है डिपो। इस homogenate में प्रोटीन की GFP के स्तर को व्यवहार्य प्रत्यारोपित कोशिकाओं की संख्या के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं।


चित्रा 1: microcapsule उत्पादन के लिए प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध। एक माइक्रोस्कोप (20x) के तहत (ए) alginate microbeads। (बी) पीएलएल (20x) के साथ कोटिंग के बाद बाहरी परत। (सी) alginate कोर (20X) को भंग करने के बाद अंतिम microcapsule। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: पक्षपाती सेल लाइन संस्कृतियों के साथ microcapsule सह संस्कृतियों पक्षपाती adipocytes साथ (मीडिया में चल हलकों) microcapsules के सह-संस्कृति की (ए) योजनाबद्ध (कम पैनल)।। (बी) ATGL की अभिव्यक्ति से की तुलना3T3-एल 1 adipocytes सह सुसंस्कृत अकोशिकीय, गुम्मट, या Aldh1a1 साथ - / - adipocyte युक्त microcapsules। महत्व पी मूल्य मान व्हिटनी यू परीक्षण का उपयोग निर्धारित किया गया था। अपर सम्मिलित करता है एक प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। समझाया कोशिकाओं के साथ एक अंतर पेट (आईएबी, आंत) वसा इंजेक्शन के योजनाबद्ध इंजेक्ट आईएबी वसा पैड की फोटो छवि 80 दिनों प्रत्यारोपण (त्रिकोण) के बाद समझाया कोशिकाओं का रंग उतरा समूहों से पता चलता है। ये आईएबी सनक पैड आयल में एम्बेडेड और विश्लेषण किया गया। Hematoxylin और eosin (एच एंड ई) धुंधला समझाया समझाया कोशिकाओं (तीर), प्रत्यारोपित microcapsules (सी), के समूहों से पता चलता हैकोशिकाओं (सीसी), मेजबान adipocytes (ए)। फ्लोरोसेंट रोशनी के तहत विश्लेषण किया वही छवि दौर बरकरार कैप्सूल के अंदर पर GFP लेबल प्रतिरोपित कोशिकाओं को दर्शाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

विभिन्न तरीकों सुखाने, बाहर निकालना, और पायस 19 सहित कोशिकाओं, encapsulate करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस विधि में, alginate मोती तो पीएलएल के साथ लेपित और alginate कोर encapsulation के पूरा करने के लिए भंग कर दिया जाएगा, एक सुई के माध्यम से निकाला जाता है। इस विधि के वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया है, इच्छित आकार और गोलाकार आकृति के साथ मोती के गठन अभी भी चुनौतीपूर्ण है। कैप्सूल के आकार सोडियम alginate समाधान, extruder के व्यास और सुई टिप और 2 CaCl समाधान 20 के बीच की दूरी का चिपचिपापन पर अत्यधिक निर्भर है। सुई की नोक और 2 CaCl समाधान की सतह के बीच कम दूरी की, छोटे मोती उत्पादन किया जाता है। वर्णित प्रोटोकॉल है pores (<32 केडी) के साथ गरीबी रेखा के ऊपर का उत्पादन होता है। छेद के आकार को प्रयोगात्मक रूप में पहले 18 में वर्णित के रूप में फ्लोरोसेंट इम्युनोग्लोबुलिन (> 32 केडी) और फ्लोरोसेंट छोटे पेप्टाइड का उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है। यह हैताकना की ize के 2 सप्ताह के लिए और कम से कम 80 दिनों में 18 के लिए वसा ऊतकों में इन विवो आरोपण के बाद इन विट्रो संस्कृतियों में कोशिकाओं के अस्तित्व का समर्थन करने के लिए पर्याप्त है। microbead आकार समझाया कोशिकाओं के अस्तित्व को प्रभावित करने में एक महत्वपूर्ण कारक है। कई उपग्रह microbeads के साथ फटा मोती कोशिकाओं 21 के फलाव वृद्धि हुई है। पूंछ के गठन की वजह से उच्च-जी alginate 23 करने के लिए है, जबकि कम एकाग्रता और कम चिपचिपापन मध्यवर्ती-जी alginate समाधान, 22 लागू कर रहे हैं, जब सैटेलाइट गठन हुआ। यह भी फटा मोतियों के लिए योगदान कर सकते हैं बाल काटना ताकत के रूप में, हम microbeads के लिए एक सौम्य धोने प्रक्रिया की सलाह देते हैं और vivo में ऊतकों में इन विट्रो सह संस्कृतियों और engrafting के लिए उपयुक्त मजबूत कैप्सूल के उत्पादन के लिए अनुकूलित शर्तों का प्रस्ताव।

Microcapsulation ऐसी कोशिकाओं के रूप में बायोलॉजिकल की रक्षा करने के लिए आरोपण के लिए एक प्रभावी तरीका होना सिद्ध किया गया है, साइटोकाइनपर्यावरण और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 24 से एस, एंजाइमों, हार्मोन, और bioabsorbents। हार्मोन या समझाया कोशिकाओं से साइटोकिन्स के नियंत्रित रिलीज मोटापा 18, मधुमेह हो सकता 5, जिगर की विफलता 25 और एनीमिया 26 सहित रोगों की एक विस्तृत विविधता में अपनी चिकित्सीय प्रभाव के लिए परीक्षण किया गया था। हालांकि, engrafted समझाया उपचय कोशिकाओं की प्रभावकारिता अक्सर फाइब्रोसिस की वजह से कम है। यहाँ हम मोटापा और इंसुलिन प्रतिरोध 18 के उपचार के लिए तापजनक catabolic कोशिकाओं के नए आवेदन का वर्णन। Aldh1a1 के encapsulation - / - adipocytes, और संभवतः अन्य catabolic कोशिकाओं, कई फायदे उपचय कोशिकाओं के encapsulation की तुलना में Aldh1a1 है -। / - Preadipocytes अनायास एपीएल झिल्ली 18 की भीतरी सतह का पालन करना और आईएबी वसा की adipogenic वातावरण में अंतर यह है कि कैप्सूल और कैप्सूल की तेजी टूटना में उनके अत्यधिक प्रसार को रोकता है। इसके अलावाएन, इन कोशिकाओं को भड़काऊ प्रतिक्रियाओं और catabolic गुण 27 कम है। Immunohistochemical डेटा एपीएल का आरोपण Aldh1a1 समझाया पता चलता है कि - / - 80 दिनों के लिए आईएबी वसा में adipocytes स्पष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और चूहों 18 में फाइब्रोसिस के साथ नहीं किया गया था; हालांकि, अधिक अध्ययन संभावित भड़काऊ प्रभाव का आकलन करने के लिए भविष्य में प्रदर्शन करने की जरूरत है। जाहिर है, Aldh1a1 कमी। Adipocytes में thermogenic Ucp1 की अभिव्यक्ति बढ़ जाती है Aldh1a1 कमी retinaldehyde 28 के स्तर को बढ़ाने retinoic एसिड की autocrine उत्पादन कम कर देता है। इस मार्ग में आंतरिक और पैराक्राइन तापजनक कारकों के उत्पादन में शामिल किया जा सकता है, जो कई ट्रांसक्रिप्शनल रास्ते 28,29, प्रभावित करती है। विशेष रूप से, Aldh1a1 समझाया - / - adipocytes कोशिकाओं मेजबान मोटापे से ग्रस्त WT चूहों में समान तापजनक प्रतिक्रिया पैदा करते हैं। Aldh1a1 समझाया - / - adipocytes मैं पैराक्राइन कारक (एस) का उत्पादन करने के लिए दिखाई देते हैंमेजबान गुम्मट वसा ऊतकों 18 में Ucp1 -positive कोशिकाओं की संख्या ncreasing। साथ में, इन तापजनक प्रतिक्रियाओं इंजेक्ट आईएबी वसा की एक तरजीही कमी के परिणामस्वरूप। / - - अमर Aldh1a1 की एक phenotype preadipocytes इस जीन संशोधन आहार प्रेरित मोटापे को कम करने के encapsulation प्रौद्योगिकी के लिए एक आशाजनक उम्मीदवार बनाने कि कई गुण डाल रही है।

साइटोकाइन irisin, मीर-133a 30, हार्मोन 31 तरह meteorin, 32 चमड़े के नीचे सफेद वसा ऊतकों के तापजनक remodeling के लागू करने के लिए सूचित किया गया है parathyroid हार्मोन से संबंधित प्रोटीन सहित हाल ही में कई अन्य बायोलॉजिकल। इन तापजनक कारकों चमड़े के नीचे और / या आईएबी वसा में मोटापे के खिलाफ encapsulation के प्रौद्योगिकियों और उपचार के लिए उपयुक्त हैं और अधिक अध्ययन निर्धारित करने के लिए आवश्यक हैं। Catabolic कोशिकाओं से युक्त microcapsules एक जहरीले वातावरण में हानिकारक चयापचयों की एक अतिरिक्त दूर करने के लिए संभावित उपयुक्त हो सकता है। उदाहरण के लिए, रोगीएस शराब या deoxyglucosone, मधुमेह के रोगियों में पहली बार एक प्रतिक्रियाशील मेटाबोलाइट की मदद की अपचय से लाभ हो सकता है। हालांकि, भविष्य के अध्ययनों से इन आवेदनों चिकित्सीय लाभ हो सकता है, तो यह निर्धारित करने के लिए आवश्यक हैं।

/ - - Preadipocytes सारांश में, इन अध्ययनों एक सबूत की अवधारणा आईएबी वसा में thermogenic प्रतिक्रिया के प्रवर्धन समझाया Aldh1a1 के एक छोटे सबसेट द्वारा शुरू किया जा सकता है कि प्रदान करते हैं। इसके अलावा, इन अध्ययनों से समझाया catabolic तापजनक कोशिकाओं के इंजेक्शन के प्रत्यारोपण के साथ ऊतक विशेष उपचार की व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया है।

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Acknowledgements

हम संपादकीय मदद के लिए जेनिफर Petrosino और डेविड DiSilvestro को धन्यवाद देना चाहूंगा। इस शोध अमेरिकन अंडा बोर्ड और नोवो नॉर्डिस्क फार्मास्यूटिकल्स से पुरस्कार नंबर 10040042 से और साथ ही OSU पर खाद्य अभिनव केन्द्र, कार्यालय अंतरराष्ट्रीय मामलों के लिए, उन्नत फंक्शनल फूड्स अनुसंधान के लिए केंद्र, और उद्यमिता के रूप में अच्छी तरह के रूप में पुरस्कार नंबर 20020728 द्वारा समर्थित किया गया राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ईईसी-0914790 (LJL) अनुदान। चिकित्सा अनुसंधान के लिए एनआईएच रोडमैप द्वारा स्वास्थ्य (ओवर ड्राफ्ट) के निदेशक, राष्ट्रीय संस्थानों के कार्यालय द्वारा वित्त पोषित और समर्थित अनुसंधान संसाधन के लिए राष्ट्रीय केन्द्र से पुरस्कार नंबर R21OD017244 (ऑउंस) और UL1RR025755 (OSUCCC) द्वारा समर्थित किया गया वर्णित परियोजना, NCI P30CA16058। सामग्री केवल लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी अनुसंधान संसाधन के लिए राष्ट्रीय केन्द्र या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व नहीं करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Encapsulation device (VAR V1) Nisco LIN-0042 None
KD scientific syringe pump KD scientific 780100Y None
Olympus microscope  Olympus Optical IX70-S8F2 None
Sodium alginate Sigma MKBP8122V None
Poly-L-lysine hydrobromide (PLL) Sigma 020M5006V None
Calcium chloride Sigma SLBJ2662V None
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma 030M0200 None
Sodium chloride Sigma SLBD2595V None
Mini-PROTEAN TGX Gels Bio-Rad 456-1093 None
ATGL primary antibody (from rabbit) Cell Signaling 2138S None
Secondary anti body (anti rabbit) LI-COR 926-68071 None
Radio-Immunoprecipitation Assay (RIPA) buffer Boston BioProducts D25Y6Z None
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma RNBD2893 None
Trypsin Gibco 25200-056 None
Cortizone 10 anti-itch ointment Cortizone 10 C4029138 None
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-092 None
Newborn calf serum (CS) Sigma N4762 None
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F4135 None
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) Sigma I0516 None
Dexamethasone Sigma D4902 None
Insulin (bovine) Sigma I5879 None
Protease inhibitor cocktail tablets Roche 4693159001 None

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References

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