移植のためのカプセル化サーモ前脂肪細胞の脂肪組織デポへ

1Department of Human Sciences, The Ohio State University, 2Department of Minimally Invasive Surgery, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 3NSF Nanoscale Science and Engineering Center for Affordable Nanoengineering of Polymeric Biomedical Devices, The Ohio State University
Published 6/02/2015
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Medicine

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Summary

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Xu, L., Shen, Q., Mao, Z., Lee, L. J., Ziouzenkova, O. Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots. J. Vis. Exp. (100), e52806, doi:10.3791/52806 (2015).

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Abstract

細胞カプセル化は、半透過性膜内に生存細胞を捕捉するために開発されました。移植カプセル化細胞は、長期生存を達成するために、処置される宿主の組織中に低分子量の代謝産物を交換することができます。半透膜は、移植されたカプセル化された細胞は、免疫系による拒絶反応を回避することができます。カプセル化手順は、例えば、インスリン、他のホルモン、およびサイトカインなどの生物活性化合物の制御放出を可能にするように設計されました。ここでは、肥満マウスの腹腔内脂肪組織における熱産生及びエネルギー散逸のための脂質を消費異化細胞、(熱発生)のカプセル化のための方法を説明します。サーモ異化細胞のカプセル化は、肥満の予防と治療に潜在的に適用可能であること、および2型糖尿病があります。異化細胞の別の潜在的なアプリケーションは、アルコールまたは他の毒性代謝物および環境汚染物質の解毒を含むことができます。

Introduction

慢性疾患の発生増加1は、治療用細胞集団2の移植に関する研究を刺激してきました。同系または同種異系幹細胞は、これらのアプリケーション2のために最も一般的に使用される細胞型です。しかし、これらの治療は、移植後の幹細胞の分化と移動の制御を可能にしないと、効率的なコストされていません。有益な機能を有する遺伝的に改変された細胞の移植は多くの疾患の治療を改善すると予想しています。しかし、遺伝子の細胞改変は宿主の免疫系によって認識され、したがって、これらの治療は、免疫抑制3が必要です。インスリン産生細胞のカプセル化は、チャン博士4によって開発されました。技術は、塩化カルシウム溶液中に浸漬されたアルギン酸塩の液滴中の細胞のカプセル化に基づいています。アルギン酸分子は、(M)マンヌロンとグルロン酸(G)で ​​構成され、CAによって接続することができ2+。ゲル化後、ビーズを、ポリ-L-リジン(PLL)溶液に懸濁させます。このステップの間、PLLは、カプセルの膜を確立アルギン酸分子中のGとMに結合します。カプセルの膜の多孔度は、MとPLLの濃度、インキュベーション時間、温度を変化させることによって調節することができます。 PLLの結合はまた、アルギン酸塩の種類と濃度に依存します。のCa 2+イオンで ​​架橋されたアルギン酸塩マトリックスは、生理的環境中またはリン酸とクエン酸イオン濃度の高い共通の緩衝溶液中で不安定です。これらのバッファは、アルギン酸からのCa 2+を抽出し、コアを液化することができます。アルギン酸塩コアの液状化は、細胞の移動および増殖のためのカプセルの内部の空間を提供します。ポリカチオン性ポリ-L-リジン(APL)とポリアニオンのアルギン酸に封入された細胞は、免疫グロブリンのために不浸透性であるが、毒素の栄養素の流入と流出を持っています。これらのAPLの特性は、長期のsuを有効に遺伝的に異なるホストへの移植後にカプセル化された細胞のrvival。エリオットらは、9年後の移植5人の患者にカプセル化されたブタの膵臓細胞を機能の生存を報告しました。

カプセル化技術は、マイクロカプセル化(3-800ミクロン)およびマクロカプセル(千ミクロンよりも大きい)に分類することができます。マイクロカプセルは、マクロカプセル6よりも耐久性があります。 1964年のチャン博士らによるその発見以来、マイクロカプセル化は広く、インスリン、他のホルモン、および生理活性分子7を製造同化細胞のカプセル化のために使用されてきました。これらの治療は、線維症、免疫応答8を含む宿主組織内のいくつかの課題に直面していました。最初は、バイオポリマーの品質に関連する副作用が解決されました。しかし、同化細胞の移植は、依然としてホルモンの結果として、そのような線維症などの副作用を開始overpr特殊な腺の外側oduction。

ここ数十年では、肥満や2型糖尿病は、大流行9に達しています。大人の人の30%以上は、世界中の過体重および肥満である10。増加腹腔内(IAB)脂肪形成は、慢性炎症の発生率を増加させ、2型糖尿病、心血管疾患、特定の癌および他の病的状態11-13を促進します。いくつかの証拠は、IABの脂肪に関連する病因が特定の脂肪細胞によって回避することができることを示唆しました。最近の研究では、IAB領域への皮下の脂肪細胞の移植は、代謝を改善し、インビボで 14げっ歯類の肥満およびインスリン抵抗性を減少させることができることを示しました。肥満とインスリン抵抗性の効果的な低減は、熱15,16の形でエネルギーを放散することが可能な熱発生、脂肪細胞と関連しています。脂肪細胞の産熱変性は、安定なトランスフェクションによって達成することができますこのような脱共役タンパク質1(UCP1)またはUCP1および他サーモ15,16遺伝子の発現を調節する遺伝子のミトコンドリアのプロトン脱共役に関与する遺伝子の。我々の最近の研究では、アルデヒドデヒドロゲナーゼの欠乏1 A1(ALDH1A1)が 17,18、これらのマウスにおいて、肥満およびインスリン抵抗性を減少させるIAB脂肪の熱発生リモデリングをもたらすことを示しました。なお、熱発生ALDH1A1欠損(ALDH1A1 - / - )のカプセル化前脂肪細胞は、IAB脂肪18の治療のための新規治療機会を示唆し、肥満の野生型マウスでIAB脂肪の同じ治療効果を媒介します。実験的な設定では、カプセル化された細胞は、費用対効果の高い方法19内の特定の細胞集団の効果を研究するために研究者を可能にします。ここでは、熱発生異化細胞株とその研究室のカプセル化と肥満のマウスモデルにおける治療的適用の方法について説明します。プロトコルは、Tを説明しますマイクロカプセルの製造( 図1)のためのHREE相:アルギン酸ビーズ( 図1A)、ポリカチオン性ポリ-L-リジン(PLL)マイクロビーズの表面( 図1B)上の膜の形成および除去の形成アルギン酸コア( 図1C)。

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Protocol

研究プロトコルは、オハイオ州立大学の倫理委員会によって承認されました。動物実験は、IACUCプロトコルによって承認されました。すべての手順は、層流とレベル2生物学的安全キャビネットの下で行いました。我々は、すべての標準的な安全要件と手順に従いました。 17、18に記載されているように、マイクロカプセルの製造のためのマイクロカプセル化技術が行われています。

材料の1の準備

  1. オートクレーブ処理生理食塩水(水中の0.9%NaCl)で2%アルギン酸ナトリウム溶液10mlを準備します。生理食塩水中の0.05%PLL溶液を調製します。前日これらのソリューションを用意し、一晩攪拌します。使用前に0.22μmフィルターでソリューションをフィルタリングします。
  2. 0.9%NaCl溶液に50 mMのクエン酸ナトリウム及び100mMのCaCl 2を用意し、それらをオートクレーブ。
  3. すべてのソリューション、針、電極、およびビーカーをオートクレーブ。目詰まりを回避するために、ワイヤで十分にきれいな針。
  4. (102マイクロカプセルがよく毎cm 2のために必要とされており、カプセル18あたり約500個の細胞がある)カプセルに使用する細胞の適切な量を決定します。 200万細胞あたりアルギン酸ナトリウムの1ミリリットルを使用してください。
  5. 「線維芽細胞増殖培地は、「10%ウシ血清を含む用意し、高グルコースで100 U / mlペニシリン/ストレプトマイシン(4,500 mg / Lのグルコース)ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)。
    1. DMEM、10%ウシ胎児血清、10μg/ mlインスリン、1μMのデキサメタゾン、0.5mMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン、および100 U / mlのペニシリン/ストレプトマイシンを含有する「分化培地I 'を準備します。
    2. DMEM中で「分化培地II 'を含む10%ウシ胎児血清、10μg/ mlのインスリン、および100 U / mlペニシリン/ストレプトマイシンを準備します。
  6. 10ミリリットルラジオ免疫沈降アッセイバッファごとにプロテアーゼ阻害剤錠剤を含む溶解緩衝液を調製する(RIPA緩衝液)。

2.アルギン酸マイクロビーズの調製(図1A)

  1. 細胞培養フラスコから古い培地を除去します。 10mlのPBSで細胞を洗浄します。 0.25%トリプシン-EDTA(1コンフルエントのT175フラスコ当たり2ml)で懸濁液中の細胞を持参してください。
  2. 血球計数器を用いて細胞懸濁液中の細胞をカウントします。細胞懸濁液から10ミリリットルのアリコートを使用し、製造業者の説明書に従って細胞をカウントします。室温で5分間480×gの遠心分離培地中に残存する細胞を遠心します。
  3. ステップ1.4で説明したようにアルギン酸ナトリウムで細胞ペレットを一時停止します。 5ミリリットル注射器にアルギン酸ナトリウム - 細胞溶液を移します。
  4. 23ゲージの針を追加し、溶液中の気泡を除去し、空気1mlのポケットを作成するための注射器を反転。
  5. カプセル化の針注ぎ口の下の100mMのCaCl 2溶液144ミリリットルを含む小さなビーカー(180ミリリットル)を配置します。先端approximでカプセル化に電極を取り付けately 2.5センチメートルの100mMのCaCl 2溶液の表面の上。
  6. しっかりとシリンジポンプでのアルギン酸ナトリウム - 細胞溶液を含む注射器を置きます。注射器の開口部にゴムチューブを取り付けます。アルギン酸ナトリウム - 細胞溶液がチューブの途中に入るまで、プランジャーを押してください。 5.4 kVのに電圧を調整します。シリンジポンプの12.06ミリメートルの直径を設定します。 3ミリリットル/時の速度を調整します。ポンプを起動します。カプセル化をオンにして、5.4 kVの電圧を維持します。
  7. フードのウィンドウを閉じ、アルギン酸マイクロビーズの形成が終了するまで、不要な振動を避けることができます。すべてのソリューションは、針を通過した後、PLLでコーティングする前に、追加の20分間の100mMのCaCl 2溶液中のアルギン酸ボール状のマイクロビーズを固めます。

PLL 3.コーティングマイクロビーズ(図1B)

  1. アルギン酸ナトリウムセルボール状のマイクロビーズを含むビーカーを削除し、これらがMicroBを転送50ミリリットルの遠心チューブにEADS。マイクロビーズペレットからのCaCl 2溶液を除去します。
  2. 0.9%NaClを30mlのを追加することにより、アルギン酸セルボール状のマイクロビーズを洗ってください。そっと手でチューブを振ります。マイクロビーズは、重力によって沈殿させた後、25ミリリットルピペットで0.9%のNaClを削除します。合計3回の洗浄のためにさらに2回繰り返します。
  3. アルギン酸ナトリウム溶液の各1ミリリットルのための0.05%PLL溶液10mlを使用してください。 10分間分1,000回転で0.05%のPLLと渦を追加します。
    注意:通常、10分PLLコーティングのために十分です。
  4. PLLコートを形成した後、PLL溶液を除去し、3.2に記載したように、カプセルを3回洗浄します。

アルギン酸コアの4除去(図1C)

  1. 50mMのクエン酸ナトリウム溶液30mlを加えます。 5分またはすべてのアルギン酸ナトリウムが溶解するまで待ってください。ステップ3.1.1で説明したように洗浄を3回カプセル。
  2. 0.9%のNaClを削除し、50mlチューブに培養液の20ミリリットルを追加します細胞培養フラスコに細胞を含むすべてのカプセルを転送します。標準的な細胞培養条件18歳未満のカプセル化された細胞を処理します。

異種移植と細胞間の代謝物の流入/流出の宿主細胞間相互作用やキネティクス(図2)を研究するためのインビトロ適用5.

  1. 共培養のためにコンフルエントになるまで24ウェルプレート上で培養された宿主細胞。脂肪前駆細胞を培養するため「線維芽細胞増殖培地 'を使用します。
  2. コンフルエント宿主細胞を含む24ウェルプレートにマイクロカプセルを転送します。単層(ウェルの102マイクロカプセル/ cm 2の達成するために、マイクロカプセルを追加します。
  3. 6日間分化培地IIへの前脂肪分化培地Iと分化48時間ごとに、変化媒体を誘導します。 RIPA緩衝液中で細胞を溶解します。ウエスタンブロットを用いて、タンパク質の発現を分析するために条件当たり50μgのタンパク質を使用してください。

Treatmためのインビボ応用6.肥満のENT(図3)

  1. 麻酔の麻酔の導入および維持のための酸素と2%のイソフルランのための酸素と4%のイソフルランを混ぜます。つま先のピンチにより十分な麻酔深度を確認してください。
    1. 乾燥から角膜を保護するために、目のかゆみ止め軟膏を適用します。
  2. このような緑色蛍光タンパク質(GFP)のような恒久的に人工蛍光タンパク質で標識されたカプセル化細胞を使用します。
  3. カプセル化された細胞を注入するために3ミリリットルの注射器と20ゲージの針を使用してください。
    1. 図3に示すように、生殖腺と腎臓の間腹腔内領域に配置されている各IAB脂肪デポに0.2mlのPBSに懸濁し、0.5×10 6個の細胞を注入します。の平均重量を有するマウスは、このPBSの容量とセル数を使用します40g添加しました。異なる重量または用量依存効果の決意のために持っているマウスでは細胞数と音量を調整します。

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Representative Results

図1は、マイクロビーズの生産の各ステップは、顕微鏡下で制御することができたことを示している。 図2(a)は、共培養する方法脂肪細胞をカプセル化された細胞の単層で示している。 図2Bは、脂肪細胞/マイクロカプセルの共培養を用いた定量的研究の代表例であること脂肪細胞の前記溶解物を、ウェスタンブロットを用いて分析したセクションで説明されました。カプセル化細胞は、この実験で分析されませんでした。千倍希釈プライマリATGLおよびβアクチン抗体を1で使用しました。アクチンβするATGLの割合は、3つの独立した実験の平均±SDとして示されています。同様の共培養アプローチは、mRNAを分析し、共培養中にカプセル化細胞と脂肪細胞の相互作用の効果を研究するために使用することができます。サーモALDH1A1をカプセル化されたデータが示す- / -脂肪細胞はencapsulaに比べて脂肪細胞におけるATGLリパーゼおよび脂肪分解18の有意に高いレベルを誘導しますテッドWT脂肪細胞。

図3は、GFPが位置し、ホスト脂肪組織におけるカプセルの完全性を示すことを示しています。 GFPの発現はまた、細胞生存率の指標です。

定性的評価

カプセル化またはカプセル化された細胞の注入の質を顕微鏡検査、MRI、および処理された脂肪組織18の免疫組織化学的分析を用いて評価することができます。

定量的アプローチ

移植された細胞生存におけるGFPのユニークな表現が与えられると、GFPの発現レベルの測定を説明18 .GFPおよび他のタンパク質のような組織で定量することがカプセル化された細胞は、全脂肪組織のホモジネートに特異的な抗GFP抗体を用いて検出することができる可能デポ。このホモジネート中のタンパク質のGFPレベルは、生存移植細胞の数に関する情報を提供します。


図1:マイクロカプセルの製造のための手順の概略図 。顕微鏡下で(A)アルギン酸マイクロビーズ(20X)。 (B)PLL(20X)で被覆した後、外層。 (C)アルギン酸塩コア(20X)を溶解した後、最終的なマイクロカプセル。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図2
図2:接着細胞株培養とマイクロカプセルの共培養付着脂肪細胞と(メディアで浮遊円)マイクロカプセルの共培養の(A)回路図(下のパネル)。 (B)ATGLの発現からの比較無細胞、WT、またはALDH1A1と共培養した3T3-L1脂肪細胞- / -マイクロカプセルを含む脂肪細胞。有意P値はマンホイットニーU検定を用いて決定しました。アッパーインサートが一つの代表ウエスタンブロットを示す。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図3
図3:カプセル化された細胞を用いた腹腔内(IAB、内臓)脂肪注入の概略注入IAB脂肪パッドの写真画像は、80日、移植(三角形)の後、カプセル化された細胞の変色クラスターを示しています。これらのIAB流行パッドがパラフィンに包埋し、分析しました。ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色は、カプセル化、カプセル化された細胞(矢印)、移植マイクロカプセル(C)のクラスターを示します細胞(CC)、ホスト脂肪細胞(A)。蛍光灯の下で分析同じ画像がラウンド無傷のカプセルの内部にGFP標識移植された細胞を示している。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

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Discussion

種々の方法は、乾燥、押出し、および乳剤19を含む細胞をカプセル化するために使用されてきました。この方法では、アルギネートビーズをPLLでコーティングし、アルギン酸塩コアをカプセル化を完了するために溶解され、針を通して押し出されます。この方法は、長年使用されているが、所望のサイズおよび形状の球形ビーズの形成は依然として困難です。カプセルのサイズは、アルギン酸ナトリウム溶液を、押出機の直径と針先端とのCaCl 2溶液20との間の距離の粘度に非常に依存します。針の先端とのCaCl 2溶液の表面との間のより短い距離は、より小さなビーズが生産されています。記載されているプロトコルは、細孔(<32 kD)のでAPLの産生をもたらします。孔径は、実験前に18に記載されているように、蛍光免疫グロブリン(> 32 kD)の蛍光小ペプチドを用いて試験することができます。このよ細孔のIZEを2週間、および少なくとも80日間で18脂肪組織へのin vivoでの移植後のin vitro培養物中の細胞の生存を支持するのに十分です。マイクロビーズの形状は、カプセル化細胞の生存に影響を与える重要な因子です。多くの衛星マイクロビーズとの割れたビーズは、セル21の突起部を増加させます。尾の形成は、高Gアルギン酸23に起因している、一方、より低い濃度および低粘度の中間-Gアルギン酸塩溶液を、22を印加した場合の衛星形成が発生しました。また、割れたビーズに寄与し得るせん断力として、我々はマイクロビーズのための穏やかな洗浄手順をお勧めしますし、in vivoでの組織へのin vitro共培養し、移植に適した強固なカプセルの製造のために最適化された条件を提案します。

マイクロカプセルは、細胞のような生物学的製剤を保護するための移植のための有効な方法であることが証明されている、サイトカイン環境および免疫応答から24秒、酵素、ホルモン、及びbioabsorbents。ホルモンまたはカプセル化された細胞からのサイトカインの放出制御は、肥満18、糖尿病5、肝不全25および貧血26を含む、様々な疾患におけるその治療効果について試験しました。しかし、カプセル化された移植細胞の同化効果は、多くの場合、線維症のために減少します。ここでは、肥満とインスリン抵抗性18の治療のためにサーモ異化細胞の新しいアプリケーションを記述します。 ALDH1A1のカプセル化- / -脂肪細胞、およびおそらく他の異化細胞、同化細胞のカプセル化と比較していくつかの利点を有するALDH1A1 - 。/ -前駆脂肪細胞は自発的にAPL膜18の内表面に付着し、IAB脂肪その脂肪生成環境の中で差別化カプセルとカプセルの高速破裂での過剰な増殖を防ぐことができます。 additioでnは、これらの細胞は、炎症反応と異化特性27を減少しました。 - / -免疫組織化学的データは、APLの注入がALDH1A1をカプセル化することを示している80日間のIAB脂肪に脂肪細胞をマウス18で顕著な免疫応答および線維症を伴っていませんでした。しかしながら、多くの研究は、潜在的な炎症作用を評価するために、将来的に実行する必要があります。主に、ALDH1A1欠乏が脂肪細胞に熱発生UCP1の発現を増加させる。ALDH1A1欠損がレチン28のレベルを増加させる、レチノイン酸の自己分泌産生を減少させます。この経路は、内因性およびパラクリンサーモ因子の産生に関与することができ、多数の転写経路28,29を 、影響を与えます。注目すべきは、ALDH1A1をカプセル化- / -脂肪細胞の細胞は、宿主肥満WTマウスで同様の熱反応を生成します。 ALDH1A1カプセル化- / -脂肪私のパラクリン因子を生成するように思われますホストWT脂肪組織におけるUCP1 18陽性細胞の数をncreasing。一緒に、これらの熱発生応答が注入されたIABの脂肪の優先的減少をもたらしました。不死化ALDH1A1の表現型- / -前駆脂肪細胞は、この遺伝子が改変食餌性肥満を減らすカプセル化技術のための有望な候補にする多くの特性を発揮します。

サイトカインirisin、のmiR-133A 30、ホルモンなど31 meteorinなど、最近多くの他の生物学的製剤は、副甲状腺ホルモン関連蛋白質32は、皮下白色脂肪組織の熱発生改造を発揮することが報告されました。これらの熱発生の要因は、皮下および/またはIAB脂肪の肥満に対するカプセル化技術および治療に適​​している場合はより多くの研究が決定するのに必要とされています。異化細胞を含有するマイクロカプセルは、毒性環境における有害な代謝物の過剰分を除去するために潜在的に適切であり得ます。例えば、患者Sは、アルコールまたはデオキシグルコソン、糖尿病患者における第一の反応性代謝物の促進異化から利益を得ることができます。しかし、今後の研究は、これらのアプリケーションは、治療効果を有し得るかどうかを決定するために必要とされます。

- / -前駆脂肪細胞要約すると、これらの研究は、概念実証IAB脂肪の熱反応の増幅は、カプセル化ALDH1A1の小さなサブセットによって開始することができます。さらに、これらの研究は、カプセル化された異化サーモ細胞の注射、インプラントと組織特異的な治療の実現可能性を実証しました。

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Acknowledgements

私たちは社説助けをジェニファーPetrosinoのとDavid DiSilvestroに感謝したいと思います。本研究では、アメリカの卵会およびノボノルディスクファーマから賞番号10040042からだけでなく、OSUでの食品イノベーションセンター、オフィス国際のための、高度な機能性食品研究センター、および起業家精神によってだけでなく、受賞番号20020728でサポートされていました全米科学財団は、EEC-0914790(LJL)を付与します。このプロジェクトは、ディレクターのオフィスによって資金を供給、研究資源のための国立センターから賞数R21OD017244(OZ)とUL1RR025755(OSUCCC)でサポートされている国立衛生研究所(OD)と医学研究のためのNIHロードマップによってサポートされていました説明とNCI P30CA16058。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも研究資源のための国立センターや国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Encapsulation device (VAR V1) Nisco LIN-0042 None
KD scientific syringe pump KD scientific 780100Y None
Olympus microscope  Olympus Optical IX70-S8F2 None
Sodium alginate Sigma MKBP8122V None
Poly-L-lysine hydrobromide (PLL) Sigma 020M5006V None
Calcium chloride Sigma SLBJ2662V None
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma 030M0200 None
Sodium chloride Sigma SLBD2595V None
Mini-PROTEAN TGX Gels Bio-Rad 456-1093 None
ATGL primary antibody (from rabbit) Cell Signaling 2138S None
Secondary anti body (anti rabbit) LI-COR 926-68071 None
Radio-Immunoprecipitation Assay (RIPA) buffer Boston BioProducts D25Y6Z None
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma RNBD2893 None
Trypsin Gibco 25200-056 None
Cortizone 10 anti-itch ointment Cortizone 10 C4029138 None
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-092 None
Newborn calf serum (CS) Sigma N4762 None
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F4135 None
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) Sigma I0516 None
Dexamethasone Sigma D4902 None
Insulin (bovine) Sigma I5879 None
Protease inhibitor cocktail tablets Roche 4693159001 None

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References

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