البروتين التسليم المباشر للخلايا الثدييات عن طريق خلية قابلة للاختراق السيستئين
1Departments of Chemistry and Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, 2Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University
* These authors contributed equally

Published 3/25/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

المجالات الزنك الاصبع هي في جوهرها خلايا قابلة للاختراق وقادرة على التوسط تسليم البروتين في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا الثديية. هنا، يتم تقديم خطوة بخطوة بروتوكول مفصلة لتنفيذ تكنولوجيا الزنك والإصبع للداخل الخلايا تسليم البروتين.

Cite this Article

Copy Citation

Gaj, T., Liu, J. Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains. J. Vis. Exp. (97), e52814, doi:10.3791/52814 (2015).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

استراتيجيات فعالة للغاية وتنوعا تسليم البروتين حاسمة بالنسبة لكثير من البحوث الأساسية والتطبيقات العلاجية. النقل المباشر لتنقية البروتينات في خلايا يمثل واحدة من أسلم وأسهل الطرق لتحقيق ذلك. وخلافا 1،2 الاستراتيجيات التي تعتمد على التعبير الجيني من الأحماض النووية، 3-5 تسليم البروتين يشكل أي خطر من الطفرات إقحامي، مستقلة عن الخلوية النسخ / الآلات الترجمة وتسمح لها تأثير فوري. ومع ذلك، فإن عدم وجود طرق بسيطة وللتعميم عن ومنح النشاط لاختراق الخلية على البروتينات يفند بشكل روتيني دخولهم المباشر في الخلايا. تستند الأساليب الحالية لتسهيل داخل الخلايا تسليم البروتين على استخدام تحدث بشكل طبيعي 6-8 أو تصميم الببتيد اختراق الخلية، 9-12 المجالات التنبيغ السوبر، 13،14 النانوية 15 والجسيمات الشحمية، 16 للفيروسات مثل الجزيئات 17،18 (19). لسوء الحظ، العديد من هذه الطرق ما يعرقل انخفاض معدلات امتصاص الخلوية، 20،21 الاستقرار الفقراء، 22 غير مقصودة الخلية من نوع خصوصية، 23 خصائص الهروب منخفض endosomal 24 وسمية. 25 وبالإضافة إلى ذلك، فإن العديد من البروتين تقنيات التنبيغ تقلل من النشاط الحيوي من البروتينات تسليمها. 14

لدينا مختبر أظهرت في وقت سابق ان نوكلياز الزنك الاصبع (ZFN) بروتينات - تقييد خيالية endonucleases تتألف من السيستئين 2 العاهل 2 الزنك والبروتين إصبع ملزم DNA للبرمجة والمجال انشقاق من FokI تقييد نوكلياز داخلية 26-28 - هم الخلوي بطبيعتها قابلة للاختراق. وقد أظهرت 29 هذا النشاط لاختراق الخلية من المستغرب أن تكون خاصية ذاتية للمجال الزنك إصبع مصمم خصيصا، منصة ملزم DNA التي برزت كأداة قوية لاستهداف الجينوم ENgineering، 30-32 والتي تعتبر نتيجة لكوكبة من ستة بقايا موجبة على سطح البروتين. في الواقع، وقد ثبت عدة البروتينات الحمض النووي ملزم، بما في ذلك ج يونيو وN-دك لامتلاك قدرة فطرية لعبور أغشية الخلايا. 33 وفي الآونة الأخيرة، توسع المختبر لدينا على هذه النتائج وأظهرت أن النشاط لاختراق الخلية من zinc- يمكن الاستدانة الإصبع (زيف) المجالات لداخل الخلايا تسليم البروتين. الانصهار الوراثي إما واحد أو بإصبعين المجالات زيف إلى البضائع البروتين محددة أدى إلى امتصاص الكفاءة التي تجاوزت العديد من أنظمة تسليم الببتيد اختراق الخلية التقليدية. 34 وأبرزها، زيف بوساطة تسليم لا تمس النشاط من البضائع الأنزيمية تنصهر وسهلت مستويات عالية من تسليم عصاري خلوي. بشكل جماعي، تؤكد هذه النتائج على إمكانات المجال زيف لتسهيل التنفيذ الفعال وسطحي من البروتينات، وأنواع يحتمل أن تكون أكثر تنوعا من ماكروالجزيئات، في الخلايا.

هنا، يتم تقديم خطوة بخطوة بروتوكول مفصلة حول كيفية تنفيذ تكنولوجيا زيف للتسليم البروتين في خلايا الثدييات. نحن شيدت من قبل مجموعة من واحد، اثنان، ثلاثة، وأربعة، خمس وستة أصابع المجالات زيف التي تفتقر إلى القدرة على ربط الحمض النووي، ويرجع ذلك إلى استبدال كل من المخلفات ملزم DNA-α حلزونية، ولكن هي قادرة على تقديم البروتينات في خلايا 34 (الشكل 1). يوصف إنتاج وتنبيغ الزمرد GFP (EmGFP) في خلايا هيلا باستخدام بإصبعين زيف المجال. هذا البروتوكول هو للمد إلى ما يقرب من أي بروتين قادر على التعبير القابلة للذوبان في القولونية وأي نوع من الخلايا الثدييات تقريبا. وتقدم النتائج المتوقعة وتناقش أيضا استراتيجيات لتحقيق أقصى قدر من الأداء لهذا النظام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الاستنساخ

  1. الحصول بإصبعين المجالات زيف-استبداله ألانين التي تم المستنسخة الفرعية في النظام ناقلات التعبير PET-28 وهي متاحة عند الطلب (PET-2F-زيف) (34).
  2. PCR تضخيم EmGFP من البلازميد الزمرد-pBAD مع الاشعال 5 "XmaI-EmGFP (5'-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3 '؛ XMA أنا الموقع بالخط العريض) و 3" ساسي-EmGFP (5'-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3 " ، ساك أنا الموقع بالخط العريض).
    1. استخدام 5 نانوغرام من الحمض النووي القالب، و 10 ميكرولتر من العازلة 10X البلمرة، 1 وحدات (U) من طق البلمرة DNA، 0.2 ملي كل dNTP و 0.2 ميكرومتر من كل التمهيدي في حل 100 ميكرولتر مع حجم المتبقية تتكون من الماء المقطر / منزوع الأيونات . استخدام الظروف ركوب الدراجات: 95 ° C لمدة 5 دقائق. 30 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تنقية المنتج PCR بواسطة هلام extractiوعلى تحديد تركيز الحمض النووي باستخدام معمل قياس القيمة المطلقة 260 × 50 ميكروغرام / مل.
  3. ملخص PET-2F-زيف وإدراج ترميز EmGFP مع تقييد الانزيمات XMA الأول وساك أنا في المخزن الموصى بها لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية باستخدام 10 U الانزيم لكل 1 ميكروغرام من الحمض النووي. تصور الحمض النووي عن طريق الاغاروز الكهربائي هلام باستخدام صبغة الفلورسنت الإقحام، مثل بروميد إيثيديوم.
  4. تنقية DNA هضمها من قبل هلام عدة استخراج وتحديد تركيز الحمض النووي عن طريق معمل قياس القيمة المطلقة 260 × 50 ميكروغرام / مل.
  5. Ligate الحمض النووي EmGFP ترميز تنقيته إلى 50-100 نانوغرام من PET-2F-زيف باستخدام 1 U من T4 DNA يغاز لا يقل عن 1 ساعة عند RT للحصول على أفضل النتائج، تنفيذ رد فعل ربط باستخدام 6: 1 نسبة المولي إدراج إلى النواقل.
  6. ذوبان الجليد 50 ميكرولتر من أي XL-1 الأزرق الإشريكية القولونية الخلايا المختصة كيميائيا على الجليد وتخلط بلطف مع 10-20 نانوغرام من و ligated PET-2F-زيف-EmGFP.
  7. الحفاظ على الجليد لمدة 30 دقيقة. الصدمة الحرارية الخليط في 42 درجة مئوية لمدة 90 ثانية واستعادة الخلايا في 2 مل من مرق سوبر الأمثل مع مقيضة القمع (SOC) لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية مع اهتزاز.
  8. نشر 100 ميكرولتر من ثقافة الاسترداد على مرق استذابة (LB) لوحة أجار مع 50 ميكروغرام / مل الكاناميسين واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
  9. في اليوم التالي، تطعيم 6 مل من سوبر مرق (SB) أو ثقافة LB يحتوي على 50 ميكروغرام / مل الكاناميسين مع مستعمرة واحدة من لوحة أجار LB والثقافة O / N عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: مستعمرة PCR باستخدام بادئات 5 "XmaI-EmGFP و3 'ساسي-EmGFP يمكن استخدامها لتحديد الحيوانات المستنسخة إيجابية قبل miniprep
  10. تنقية PET-2F-زيف-EmGFP التي كتبها miniprep وتأكيد البلازميد من تسلسل الحمض النووي باستخدام المروج T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ').

2. التعبير وتنقية

  1. ذوبان الجليد 50 ميكرولتر من المختصين كيميائيا BL21 E. القولونية الخلايا على الجليد وتخلط بلطف مع 100 نانوغرام من PET-2F-زيف-EmGFP ررasmid. تحويل كما هو موضح في الخطوات 1،7-1،8.
  2. في اليوم التالي، تطعيم 10 مل من LB المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل الكاناميسين مع مستعمرة واحدة وتنمو O / N عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز.
  3. في اليوم التالي، تمييع 10 مل من O / N الثقافة في 1 لتر من LB المتوسطة تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين، 0.2٪ جلوكوز و 100 ميكرومتر ZnCl 2. تنمو ثقافة في 37 درجة مئوية مع الهز إلى الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD 600) من 0.8 ولحث تعبير البروتين مع 2 ملي الآيزوبروبيل-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). بعد 6 ساعات من النمو عند 37 درجة مئوية، وخلايا الحصاد بواسطة الطرد المركزي عند 5،000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: شروط التعريفي تختلف اختلافا كبيرا وتعتمد على الاستقرار من البروتينات يجري التعبير عنها. مراقبة OD 600 كل 30 دقيقة حتى لOD يتم التوصل إلى 600 من 0.8.
  4. resuspend الكرية خلية في 5 مل من تحلل العازلة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 500 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 100 ميكرومتر ZnCl 1 مM dithiothreitol (DTT)، 1 ملم MgCl 1 ملم phenylmethylsulfonyl الفلورايد (PMSF) و 10 ملي إيميدازول، ودرجة الحموضة 8.0). ليز الخلايا على الجليد قبل صوتنة مع الإعداد التالي: 50٪ انتاج الطاقة، 4 دقائق وقت العملية مع 5 ثانية على / 10 ثانية قبالة فترات. تجنب الانهاك الحل.
  5. الطرد المركزي المحللة الخلية في 25،000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية، ونقل طاف في أنبوب جمع العذبة. للحصول على أفضل النتائج، تنفيذ كافة الخطوات التالية في 4 درجات مئوية.
  6. تشغيل طاف من خلال عمود معبأة مسبقا مع 1 مل من معايرتها ني NTA الطين. غسل الراتنج مع 20 مل من غسل العازلة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 500 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 100 ميكرومتر ZnCl 1 ملم DTT، 1 ملم MgCl 2 و 30 ملي إيميدازول، ودرجة الحموضة 8.0).
  7. أزل البروتين مع 5 مل من شطف العازلة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 500 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 100 ميكرومتر ZnCl 1 ملم DTT، 1 ملم MgCl و 300 ملي إيميدازول، ودرجة الحموضة 8.0).
  8. عازلة تبادل بروتين مزال مع العازلة التخزين (50 مليتريس، حمض الهيدروكلوريك، و 500 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 100 ميكرومتر ZnCl 1 ملم DTT، 1 ملم MgCl 2 و 10٪ الجلسرين، ودرجة الحموضة 8.0) وتركيز البروتين للا يقل عن 40 ميكرومتر باستخدام مكثف تدور بواسطة الطرد المركزي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  9. تحديد تركيز البروتين BCA أو برادفورد الفحص. خلط 2 ميكرولتر من البروتينات المنقى مع 2 ميكرولتر 2 × SDS-PAGE صبغ التحميل، يغلي في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ثم حل في 4٪ -20٪ تريس، جليكاين SDS-PAGE لتقييم البروتين النقاء (الشكل 2).

3. البروتين التخزين

  1. قسامة البروتين المركزة، وتجميد فلاش في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 ° C. لEmGFP البروتينات الانصهار، وتغطية الأنبوب بورق الألمنيوم من أجل حماية البروتين من الضوء.
  2. تجنب تكرار التجميد والذوبان من الحل البروتين. ملاحظة: البروتينات زيف تنصهر-مستقرة في ظل هذه الظروف لا يقل عن 1 في الشهر. غير لائق تخزين شهر أو> 4 قد يؤديلهطول البروتين أو photobleaching من من EmGFP.

تنبيغ 4. البروتين

  1. الحفاظ على خلايا هيلا في المتوسط ​​تعديل النسر Dulbecco لفي (DMEM) تحتوي على 10٪ (ت / ت) مصل الجنين البقري (FBS) و 1٪ للمضادات الحيوية مضاد فطري عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بشكل كامل مع 5٪ CO 2.
    ملاحظة: خلايا passaged لا ينصح أكثر من 30 مرة للبروتين تنبيغ.
  2. ما قبل معطف لوحة 24-جيدا مع 500 ميكرولتر من 50 ميكروغرام / مل من بولي يسين لمدة 30 إلى 60 دقيقة عند 25 درجة مئوية. خلايا البذور على طبق من ذهب 24-جيدا في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 5 خلايا لكل بئر. في 24 ساعة بعد البذر، أو مرة واحدة الخلايا هي ما بين 80٪ -90٪ متموجة، وإزالة وسائل الإعلام من كل بئر ويغسل مع 500 ميكرولتر من قبل تحسنت المصل خالية DMEM (SFM).
  3. إلى كل بئر، إضافة 250 ميكرولتر من SFM تحتوي على 2 ميكرومتر من البروتين زيف-EmGFP و 100 ميكرومتر ZnCl 2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ملاحظة: المجالات زيف تدخل خلايا العلاقات العامةimarily من خلال macropinocytosis، 34 وهي آلية تعتمد على الطاقة. لذلك، لا بد من الخلايا المحتضنة في 37 درجة مئوية لمدة كفاءة استيعاب البروتين.
  4. إزالة وسائل الاعلام من الخلايا ويغسل ثلاث مرات مع 500 ميكرولتر من الكالسيوم والمغنيسيوم خالية من الفوسفات مخزنة المالحة Dulbecco و(DPBS) تستكمل مع 0.5 ملغ / مل من الهيبارين. ملاحظة: الهيبارين هو ضروري لإزالة البروتين ملزمة السطحية التي قد تعقد تحليلات المصب.
  5. (اختياري) كرر العلاجات تصل إلى ثلاثة أضعاف لتعزيز التسليم.
  6. عزل الخلايا المعالجة مباشرة بعد غسل الهيبارين عن طريق الهضم مع 0.05٪ التربسين-EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. اعادة تعليق خلايا منفصلة في 0.5 مل من DPBS تستكمل مع 1٪ FBS.
  7. قياس كثافة مضان من كل عينة عن طريق التدفق الخلوي 35 باستخدام ثيوسيانات فلوريسئين (FITC) قناة (الشكل 3). ضبط مبعثر إلى الأمام (FSC) والتشرذم الجانب (SSC) لوضع سكانالفائدة على نطاق و، وضمان أن السكان مع خصائص مختلفة يتم حلها عن بعضها البعض.
  8. جمع 10،000 الأحداث الحية لكل عينة وتحليل البيانات باستخدام تحليل التدفق الخلوي البيانات البرمجيات. 36 تطبيع مضان من خلايا هيلا تعامل مع زيف-EmGFP لتلك الخلايا المعالجة فقط مع SFM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويمكن التعبير عن بإصبعين زيف-EmGFP البروتينات الانصهار في E. القولونية مع> 95٪ التجانس وعوائد عالية (> 25 ملغ / مل) (الشكل 2). بشكل عام، واحدة وبإصبعين يمكن أن تنتج زيف البروتينات الانصهار في كميات مماثلة تقريبا لتلك التي من النوع البري غير معدل البروتين. ومع ذلك، في بعض السياقات، مكونة من خمسة وستة أصابع البروتينات زيف الانصهار غير قادرة على أن تنتج في عوائد عالية بما فيه الكفاية لتطبيقات المصب.

التطبيق المباشر لبإصبعين البروتين زيف-EmGFP على خلايا هيلا لمدة 90 دقيقة عند 37 ° C يؤدي إلى زيادة تعتمد على الجرعة في EmGFP مضان (الشكل 3A). الأهم من ذلك، يتم احترام أي مضان في غياب المجال زيف. لاحظنا سابقا أن ما يقرب من 100٪ من الخلايا فلوري بعد العلاج مع فقط 2 ميكرومتر من بإصبعين البروتين زيف-EmGFP، وأن خلايا هيلا تعامل مع زيف انصهار بروتين إيجابية لEmGFP مضان في تركيزات البروتين ما يصل الى 0.25 ميكرومتر (الشكل 3B).

الشكل (1)
الشكل 1. هيكل وتسلسل البروتين والزنك الاصبع. هيكل (أعلى) كريستال من واحد الزنك الاصبع (زيف) المجال. وتظهر السلاسل الجانبية للالسيستئين حفظها وبقايا صاحب بالتنسيق مع الزنك 2+ ايون العصي (PDB ID: 2I13) 37 (القاع) تسلسل المجال زيف. السهام واسطوانات تشير Β ورقة وα-الحلزون الهياكل الثانوية، على التوالي. ويسلط الضوء على بقايا الحمض النووي ملزم-α حلزونية التي تم استبداله مع ألانين الوردي. ويسلط الضوء على بقايا موجبة الشحنة وتوقع للتوسط استيعاب خلية اللون الأزرق الفاتح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

"FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الشكل 2
الشكل 2. SDS-PAGE لتنقية واحد، اثنان، ثلاثة وأربعة أصابع زيف-EmGFP البروتينات الانصهار. وأعرب عن زيف-EmGFP البروتينات الانصهار في E. القولونية وتنقيته بواسطة ني NTA الراتنج الاغاروز. تم تحليل بروتين مزال للنقاء بواسطة SDS-PAGE باستخدام 4٪ -20٪ تريس، جليكاين هلام. ولم يلاحظ أي تدهور كبير أو truncations من زيف-EmGFP البروتينات الانصهار.

الشكل (3)
الشكل 3. زيف بوساطة تسليم البروتين في خلايا هيلا. (A) الإسفار كثافة خلايا هيلا تعامل مع كميات متزايدة من بإصبعين البروتين زيف-EmGFP. خلايا هيلا تعامل مع البروتين EmGFP وحدها تتداخل تماما مع الخلايا غير المعالجة. (ب) كثافة مضان تطبيع من خلايا هيلا تعامل على التوالي مع 2 ميكرومتر سو بإصبعين زيف-EmGFP البروتين. وتم تحديد كثافة مضان من قبل التدفق الخلوي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، يتم تقديم بروتوكول خطوة بخطوة لتسليم البروتين باستخدام الزنك الاصبع (زيف) نطاقات خلية قابلة للاختراق. المجال زيف لا يقلل من نشاط تنصهر البضائع الأنزيمية 34؛ يسمح لإنتاج وتنقية البروتينات في عائدات متطابقة تقريبا لتلك التي لوحظت مع البروتين معدلة. ويمكن نقل البروتينات والإنزيمات إلى مجموعة واسعة من أنواع الخلايا مع الكفاءات التي تتجاوز الببتيد أو البروتين أنظمة النطاق التنبيغ لاختراق الخلية التقليدية. معا، وهذه النتائج تشير إلى إمكانية واسعة من المجالات زيف للوساطة تسليم البروتين المباشر إلى خلايا لمجموعة واسعة من التطبيقات.

وقد تحقق أقصى تسليم البروتين سابقا فقط باستخدام بإصبعين زيف النطاق، على الرغم من أن تمتد صفوف من ثلاثة والمجالات زيف أربعة أصابع تحمل أكبر شحنة موجبة. وتشير هذه النتائج إلى أن إدخال خلية زيف بوساطة قد تتأثر بعوامل أخرى غير تهمة، المؤتمر الوطني العراقيluding الاستقرار البروتين أو صلابة بتكوين. تم العثور بوساطة المجال زيف تسليم البروتين أيضا أن تكون تعتمد على الطاقة، وبالتالي يتطلب من جميع الخلايا المعالجة مع بروتين يتم تحضين عند 37 درجة مئوية. من خلال استخدام مثبطات جزيء صغير من مختلف مسارات التقامي، macropinocytosis، وإلى حد أقل تعتمد على caveolin الإلتقام، كانت مصممة على أن تكون مسارات رئيسية لإدخال خلية زيف بوساطة. 34 والجدير بالذكر، على عكس أنظمة البروتين التنبيغ أخرى، هي المجالات زيف قادر على الهروب بكفاءة الإندوسومات للتوسط مستويات عالية من تسليم عصاري خلوي من البضائع الجزيئات تنصهر فيها، مع التشديد على أهمية هذه المجالات لتحقيق القوي تسليم البروتين.

في تجربتنا، وكثافة البذر من الخلايا هي خطوة حاسمة لتحقيق مستويات عالية من البروتين التنبيغ. ونحن نوصي علاج الخلايا بمجرد وصولها إلى 80٪ -90٪ confluency وسبق لوحظ أن الخلايا المصنفة في> 95٪ عرض confluency الفرعيةالقدرة التنبيغ الأمثل، في حين أن الخلايا المصنفة في كثافة منخفضة (<50٪) عرضة للتسمم الناجم عن البروتين. الأهم من ذلك، لأنواع الخلايا مع ميول مفرزة عالية، لوحات زراعة الخلايا ما قبل المغلفة مع البولي يسين الموصى بها. بولي يسين يسهل مرفق الخلية من خلال التفاعلات كهرباء مع مكونات سطح الخلية سالبة الشحنة. وعلى الرغم من إزالة بقايا الحمض النووي ملزم-α حلزونية من كل مجال زيف للقضاء على أي احتمال للاعتراف DNA، والسيستين والحامض الاميني المخلفات التي تنسق مع الزنك 2+ أيون لتحقيق الاستقرار في حظيرة للنطاق ΒΒα زيف لا تزال سليمة. وبالتالي، فإننا نوصي بأن أي عازلة التخزين أن تستكمل مع لا يقل عن 100 ميكرومتر من ZnCl 2 للحفاظ على سلامة البروتين.

على الرغم من أن المجال زيف سبق ان عرضه لتوصيل البروتينات والانزيمات في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، وكفاءة التسليم زيف قد يكون أيضا تعتمد على كل من macromoالبضائع lecular وتركيز البروتين. على سبيل المثال، الخلايا المعالجة مع اثنين من أصابع زيف luciferase المراسل انصهار بروتين لوحظت لعرضه الأقصى التلألؤ عندما تعامل مع 0.5 ميكرومتر البروتين، مع انخفاض النشاط في تركيزات أعلى، في حين أن الخلايا تعامل مع بإصبعين عرضت EmGFP زيادة تعتمد على الجرعة في مضان كثافة تصل إلى 8.0 ميكرومتر بروتين، وعلى العلاجات البروتين متتالية. ولذلك نوصي تقييم قدرة الخلايا اختراق كل فريد زيف الانصهار المجال عبر مجموعة من تركيزات.

وأخيرا، وإن لم يكن أثبتت حتى الآن، ونحن نتوقع أن تسليم نطاق زيف هو منصة مرنة للغاية، قادرة على تقديم مجموعة متنوعة من الجزيئات إلى الخلايا. على سبيل المثال، قد يكون من الممكن لكل من DNA و RNA أن يكون بين functionalized كيميائيا على سطح المجال زيف عبر رابط hydrolyzable، أو عابر transfected في الخلايا عن طريق تغليف من المجالات زيف. بالإضافة إلى ذلك، efficiency من زيف تسليم البروتين يمكن تعزيز الجهود التي بذلتها تصميم عقلانية تركز على تهمة سطح الأمثل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (DP1CA174426 لكارلوس F. BARBAS) وجامعة ShanghaiTech، شنغهاي، الصين (لJL). تم إنشاؤها باستخدام الرسومات الجزيئية PyMol.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
XmaI New England Biolabs R0180L
SacI New England Biolabs R0156L
Expand High Fidelity PCR system Roche 11759078001
dNTPs New England Biolabs N0446S
4%-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells Life Technologies EC6028BOX
2x Laemmli Sample Buffer BioRad 161-0737
T4 DNA Ligase Life Technologies 15224-017
BL21 (DE3) Competent E. coli New England Biolabs C2527I
IPTG Thermo Scientific R0391
Zinc Chloride Sigma-Aldrich 208086-5G
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific BP906-5
Glucose Sigma-Aldrich G8270-100G
Tris Base Fisher Scientific BP152-25
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888-25G
DTT Fisher Scientific PR-V3151 
PMSF Thermo Scientific 36978
Ni-NTA Agarose Resin QIAGEN 30210
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-500ML
Imidazole Sigma-Aldrich I5513-25G
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units EMO Millipore UFC900324
DMEM Life Technologies 11966-025
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10437-028
Antibiotic-Antimycotic  Life Technologies 15240-062
24-Well Flat Bottom Plate Sigma-Aldrich CLS3527-100EA
Poly-Lysine Sigma-Aldrich P7280
DPBS, No Calcium, No Magnesium Life Technologies 21600010
Heparan Sulfate Sigma-Aldrich H4777
Trypsin Life Technologies 25300054
HeLa cells ATCC CCL-2
Nano Drop ND-1000 spectrophotometer  Thermo Fisher Scientific
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berg, A., Dowdy, S. F. Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 888-893 (2011).
  2. Lindsay, M. A. Peptide-mediated cell delivery: application in protein target validation. Curr. Opin. Pharmacol. 2, 587-594 (2002).
  3. Luo, D., Saltzman, W. M. Synthetic DNA delivery systems. Nat. Biotechnol. 18, 33-37 (2000).
  4. Guo, X., Huang, L. Recent advances in nonviral vectors for gene delivery. Acc. Chem. Res. 45, 971-979 (2012).
  5. Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).
  6. Frankel, A. D., Pabo, C. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55, 1189-1193 (1988).
  7. Elliott, G., O'Hare, P. Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell. 88, 223-233 (1997).
  8. Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J. Biol. Chem. 269, 10444-10450 (1994).
  9. Smith, B. A., et al. Minimally cationic cell-permeable miniature proteins via alpha-helical arginine display. J. Am. Chem. Soc. 130, 2948-2949 (2008).
  10. Daniels, D. S., Schepartz, A. Intrinsically cell-permeable miniature proteins based on a minimal cationic PPII motif. J. Am. Chem. Soc. 129, 14578-14579 (2007).
  11. Karagiannis, E. D., et al. Rational design of a biomimetic cell penetrating peptide library. ACS Nan. 7, 8616-8626 (2013).
  12. Gao, S., Simon, M. J., Hue, C. D., Morrison, B., 3r,, Banta, S. An unusual cell penetrating peptide identified using a plasmid display-based functional selection platform. ACS Chem. Biol. 6, 484-491 (2011).
  13. Fuchs, S. M., Raines, R. T. Arginine grafting to endow cell permeability. ACS Chem. Biol. 2, 167-170 (2007).
  14. Cronican, J. J., et al. Potent delivery of functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo using a supercharged protein. ACS Chem. Biol. 5, 747-752 (2010).
  15. Panyam, J., Labhasetwar, V. Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue. Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 329-347 (2003).
  16. Zelphati, O., et al. Intracellular delivery of proteins with a new lipid-mediated delivery system. J. Biol. Chem. 276, 35103-35110 (2001).
  17. Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 16998-17003 (2011).
  18. Voelkel, C., et al. Protein transduction from retroviral Gag precursors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7805-7810 (2010).
  19. Sinha, V. R., Trehan, A. Biodegradable microspheres for protein delivery. J. Control Release. 90, 261-280 (2003).
  20. Liu, J., Gaj, T., Patterson, J. T., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd Cell-penetrating peptide-mediated delivery of TALEN proteins via bioconjugation for genome engineering. PLoS One. 9, e85755 (2014).
  21. Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Res. 24, 1020-1027 (2014).
  22. Fuchs, S. M., Raines, R. T. Polyarginine as a multifunctional fusion tag. Protein Sci. 14, 1538-1544 (2005).
  23. Mai, J. C., Shen, H., Watkins, S. C., Cheng, T., Robbins, P. D. Efficiency of protein transduction is cell type-dependent and is enhanced by dextran sulfate. J. Biol. Chem. 277, 30208-30218 (2002).
  24. Al-Taei, S., et al. Intracellular traffic and fate of protein transduction domains HIV-1 TAT peptide and octaarginine. Implications for their utilization as drug delivery vectors. Bioconjug. Chem. 17, 90-100 (2006).
  25. Jones, S. W., et al. Characterisation of cell-penetrating peptide-mediated peptide delivery. Br. J. Pharmacol. 145, 1093-1102 (2005).
  26. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010).
  27. Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188, 773-782 (2011).
  28. Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases. J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).
  29. Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins. Nat. Methods. 9, 805-807 (2012).
  30. Gersbach, C. A., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, Synthetic zinc finger proteins: the advent of targeted gene regulation and genome modification technologies. Acc. Chem. Res. 47, 2309-2318 (2014).
  31. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
  32. Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Gersbach, C. A. Advances in targeted genome editing. Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 268-277 (2012).
  33. Cronican, J. J., et al. A class of human proteins that deliver functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo. Chem. Biol. 18, 833-838 (2011).
  34. Gaj, T., Liu, J., Anderson, K. E., Sirk, S. J., Barbas, C. F., 3rd, Protein delivery using Cys2-His2 zinc-finger domains. ACS Chem. Biol. 9, 1662-1667 (2014).
  35. Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. Basics of flow cytometry. Methods Mol. Biol. 91, 1-24 (1998).
  36. Mercer, A. C., Gaj, T., Sirk, S. J., Lamb, B. M., Barbas, C. F. 3rd Regulation of endogenous human gene expression by ligand-inducible TALE transcription factors. ACS Synth. Biol. 3, 723-730 (2014).
  37. Segal, D. J., Crotty, J. W., Bhakta, M. S., Barbas, C. F. 3rd, Horton, N. C. Structure of Aart, a designed six-finger zinc finger peptide, bound to DNA. J. Mol. Biol. 363, 405-421 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats