Diretto Protein Consegna a cellule di mammifero Utilizzando Cell-permeabile Cys
1Departments of Chemistry and Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, 2Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University
* These authors contributed equally

Published 3/25/2015
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Biology

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Summary

Domini zinco-dita sono intrinsecamente cellula-permeabile e capace di mediare consegna proteine ​​in una vasta gamma di tipi di cellule di mammifero. Qui, un protocollo dettagliato passo-passo per l'attuazione tecnologia zinc finger-consegna proteina intracellulare è presentato.

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Gaj, T., Liu, J. Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains. J. Vis. Exp. (97), e52814, doi:10.3791/52814 (2015).

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Abstract

Introduction

Altamente strategie consegna proteine ​​efficienti e versatili sono fondamentali per molti la ricerca di base e applicazioni terapeutiche. La consegna diretta di proteine ​​purificate in cellule rappresenta uno dei metodi più sicuri e più semplici per raggiungere questo. 1,2 differenza strategie che si basano su espressione genica da acidi nucleici, proteine ​​3-5 consegna non comporta alcun rischio di mutagenesi inserzionale, è indipendente dal cellular trascrizione macchinari e / definizione permette un effetto immediato. Tuttavia, la mancanza di metodi semplici e generalizzabili per dotare l'attività delle cellule-penetrante su proteine ​​confonde regolarmente il loro ingresso diretto nelle cellule. Gli attuali metodi per facilitare la consegna proteina intracellulare si basano sull'uso di naturalmente 6-8 o progettati peptidi cellula-penetranti, 9-12 domini di trasduzione sovralimentati, 13,14 nanoparticelle 15 e liposomi, 16 particelle simili al virus 17,18 19 Purtroppo, molti di questi approcci sono ostacolati da bassi tassi di assorbimento cellulare, 20,21 scarsa stabilità, 22 involontaria tipo cellulare specificità, 23 basso endosomali proprietà di fuga di 24 e la tossicità. 25 Inoltre, molti proteine ​​e tecnologie di trasduzione riducono la bioattività delle proteine ​​consegnati. 14

Il nostro laboratorio in precedenza dimostrato che zinc-finger nucleasi (ZFN) proteine ​​- restrizione endonucleasi chimerico costituito da una Cys 2 -Il suo 2 zinc-finger proteina-DNA-binding programmabile e il dominio scissione del FokI endonucleasi di restrizione 26-28 - sono intrinsecamente cell- permeabile. 29 L'attività delle cellule-penetrante sorprendente ha dimostrato di essere una proprietà intrinseca del dominio zinc-finger design personalizzato, una piattaforma di legame al DNA che è emersa come un potente strumento per la mirata del genoma enEngineering, 30-32 e considerato il risultato della costellazione di sei residui carichi positivamente sulla superficie della proteina. Infatti, diverse proteine ​​che legano il DNA, tra cui c-Jun e N-DEK hanno dimostrato di possedere una capacità innata di attraversare le membrane cellulari. 33 Più recentemente, il nostro laboratorio espanso su questi risultati e dimostrato che l'attività delle cellule-penetrante di zinco finger (ZIF) domini potrebbero essere sfruttate per la consegna delle proteine ​​intracellulari. La fusione genetica di entrambi i domini ZIF uno o due dita per uno specifico carico di proteine ​​portato ad assorbimento di efficienza che hanno superato molti sistemi di consegna di peptidi cellula-penetranti convenzionali. 34 In particolare, la consegna Zif-mediata non ha compromesso l'attività di carico enzimatica fuso e facilitato alti livelli di consegna citosolico. Collettivamente, questi risultati dimostrano il potenziale del dominio ZIF per facilitare la consegna efficiente e facile delle proteine, e potenzialmente più diversi tipi di macromolecole, nelle cellule.

Qui, un protocollo dettagliato passo-passo su come implementare la tecnologia ZIF per la consegna delle proteine ​​in cellule di mammifero è presentato. Abbiamo già costruito una suite di uno, due, tre, quattro, cinque e sei dita domini ZIF che non hanno la capacità di legare il DNA, a causa della sostituzione di ciascuno dei DNA-binding residui α-elica, ma sono in grado di fornire proteine ​​in cellule 34 (Figura 1). La produzione e la trasduzione di Emerald GFP (EmGFP) in cellule HeLa utilizzando una Zif dominio a due dita è descritto. Questo protocollo è estensibile a quasi qualsiasi proteina in grado di espressione solubile in Escherichia coli e quasi ogni tipo di cellula di mammifero. I risultati attesi sono forniti e strategie per massimizzare le prestazioni di questo sistema vengono anche discussi.

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Protocol

1. Clonazione

  1. Ottenere domini Zif due dita alanina-sostituiti che sono stati sub-clonati nel sistema vettore di espressione pET-28 e sono disponibili su richiesta (PET-2F-ZIF). 34
  2. PCR amplifica EmGFP dal plasmide Emerald-pBAD con primer 5 'XmaI-EmGFP (5'-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3'; Xma sito ho in grassetto) e 3 'SacI-EmGFP (5'-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3' ; Sac sito che ho in grassetto).
    1. Utilizzare 5 ng di DNA stampo, 10 microlitri di tampone 10x polimerasi, 1 unità (U) di DNA polimerasi Taq, 0,2 mM ciascun dNTP e 0,2 mM di ciascun primer in una soluzione di 100 microlitri con il volume rimanente costituiti di acqua distillata / deionizzata . Utilizzare le condizioni di ciclismo: 95 ° C per 5 minuti; 30 cicli di 95 ° C per 30 sec, 55 ° C per 30 sec e 72 ° C per 1 min; 72 ° C per 10 min. Purificare il prodotto PCR gel extraction e determinare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro misura Abs 260 x 50 ug / ml.
  3. Digest pET-2F-ZIF e l'inserto codifica EmGFP con gli enzimi di restrizione Xma I e Sac I in tampone raccomandato per 3 ore a 37 ° C utilizzando 10 U di enzima per 1 mg di DNA. Visualizza DNA mediante elettroforesi su gel di agarosio utilizzando un colorante fluorescente intercalante, come bromuro di etidio.
  4. Purificare il DNA digerito dalla kit estrazione gel e determinare la concentrazione di DNA da uno spettrofotometro misurando Abs 260 x 50 mg / ml.
  5. Legare il DNA EmGFP-codifica purificato in 50-100 ng di PET-2F-ZIF con 1 U di T4 DNA Ligase per almeno 1 ora a temperatura ambiente. Per ottenere i migliori risultati, effettuare la reazione di ligazione utilizzando un 6: rapporto molare 1 inserto a vettoriale.
  6. Scongelare 50 ml di eventuali chimicamente competenti XL-1 blu Escherichia coli su ghiaccio e mescolare delicatamente con 10-20 ng di legatura PET-2F-ZIF-EmGFP.
  7. Tenere in ghiaccio per 30 min. Urti Riscaldare la miscela a 42 ° C per 90 sec e recuperare le cellule in 2 ml di brodo con Super Optimal Cataboliti rimozione (SOC) per 1 ora a 37 ° C con agitazione.
  8. Stendere 100 ml di cultura recupero su un brodo lisogenia (LB) piastra di agar con 50 mg / ml kanamicina e incubare O / N a 37 ° C.
  9. Il giorno seguente, inoculare 6 ml di Super Broth (SB) o di coltura LB contenente 50 ug / ml kanamicina con una colonia dalla piastra di agar LB e cultura O / N a 37 ° C.
    Nota: Colony PCR utilizzando i primer 5 'XmaI-EmGFP e 3' SacI-EmGFP potrebbe essere utilizzata per identificare cloni positivi prima miniprep
  10. Purificare pET-2F-ZIF-EmGFP da miniprep e confermare plasmide dal sequenziamento del DNA utilizzando promotore T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ').

2. Espressione e purificazione

  1. Scongelare 50 ml di chimicamente competente BL21 E. coli su ghiaccio e mescolare delicatamente con 100 ng di PET-2F-ZIF-EmGFP plasmid Trasforma come descritto nei passaggi 1,7-1,8.
  2. Il giorno seguente, inoculare 10 ml di terreno LB contenente 50 mg / ml kanamicina con una singola colonia e crescere O / N a 37 ° C con agitazione.
  3. Il giorno seguente, diluire i 10 ml di O / N cultura in 1 l di terreno LB integrata con 50 mg / ml kanamicina, 0,2% di glucosio e 100 micron ZnCl 2. Crescere la coltura a 37 ° C con agitazione ad una densità ottica a 600 nm (OD 600) di 0,8 e indurre l'espressione di proteine ​​con 2 mM isopropil-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Dopo 6 ore di crescita a 37 ° C, le cellule raccolto per centrifugazione a 5.000 xg per 10 min a 4 ° C.
    Nota: Le condizioni induzione sono molto variabili e dipendono dalla stabilità delle proteine ​​espressi. Monitorare l'OD 600 ogni 30 minuti fino a quando un OD 600 di 0,8 è raggiunto.
  4. Risospendere il pellet di cellule in 5 ml di tampone di lisi (50 mM Tris-HCl, NaCl 500 mM, 100 mM ZnCl 2, 1 mM ditiotreitolo (DTT), 1 mM MgCl 2, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF) e imidazolo 10 mM, pH 8,0). Lisare le cellule sul ghiaccio di ultrasuoni con la seguente impostazione: uscita di potenza del 50%, 4 min di tempo di processo con 5 sec su / 10 sec off intervalli. Evitare il surriscaldamento della soluzione.
  5. Centrifugare il lisato cellulare a 25.000 xg per 30 min a 4 ° C e trasferire il surnatante in una provetta di raccolta fresco. Per ottenere i migliori risultati, eseguire le seguenti operazioni a 4 ° C.
  6. Eseguire il surnatante con una colonna pre-compresso con 1 ml di equilibrata liquami Ni-NTA. Lavare la resina con 20 ml di tampone di lavaggio (50 mM Tris-HCl, NaCl 500 mM, 100 mM ZnCl 2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl 2 e imidazolo 30 mM, pH 8,0).
  7. Eluire la proteina con 5 ml di tampone di eluizione (50 mM Tris-HCl, NaCl 500 mM, 100 mM ZnCl 2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl 2, e imidazolo 300 mM, pH 8,0).
  8. Buffer scambiare la proteina eluita con tampone di stoccaggio (50 mMTris-HCl, NaCl 500 mM, 100 mM ZnCl 2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl 2 e 10% glicerolo, pH 8,0) e concentrare la proteina di almeno 40 mM usando un concentratore rotazione mediante centrifugazione secondo le istruzioni del produttore.
  9. Determinare la concentrazione di proteine ​​da BCA o saggio Bradford. Mescolare 2 ml di proteine ​​purificate con 2 ml 2 × SDS-PAGE loading dye, ebollizione a 95 ° C per 10 minuti e poi risolvere il 4% -20% Tris-Glycine SDS-PAGE per valutare la proteina purezza (Figura 2).

3. Protein bagagli

  1. Aliquota la proteina concentrata, flash congelare in azoto liquido e conservare a -80 ° C. Per proteine ​​di fusione EmGFP, coprire il tubo con un foglio di alluminio per proteggere la proteina dalla luce.
  2. Evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti della soluzione proteica. Nota: le proteine ​​Zif-fuse sono stabili in queste condizioni per almeno 1 mese. O> 4 stoccaggio inappropriato mese può portarealle proteine ​​precipitazione o photobleaching di EmGFP.

4. proteina di trasduzione

  1. Mantenere cellule HeLa in terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) contenente 10% (v / v) di siero fetale bovino (FBS) e 1% di antibiotico-antimicotico a 37 ° C in un ambiente completamente umidificata con 5% di CO 2.
    Nota: Le celle diversi passaggi più di 30 volte non sono raccomandati per la proteina di trasduzione.
  2. Pre-coat una piastra a 24 pozzetti con 500 ml di 50 mg / ml di poli-lisina per 30 a 60 minuti a 25 ° C. Cellule Seed su una piastra da 24 pozzetti ad una densità di 2 x 10 5 cellule per pozzetto. A 24 ore dopo la semina, o una volta cellule sono tra l'80% -90% confluenti, rimuovere i supporti da ciascun pozzetto e lavare con 500 ml di pre-riscaldato DMEM senza siero (SFM).
  3. Per ogni bene, aggiungere 250 ml di SFM contenente 2 mM di proteine ​​Zif-EmGFP e 100 micron ZnCl 2. Incubare le cellule a 37 ° C per 1 ora. Nota: i domini ZIF entrano nelle cellule primarily attraverso macropinocitosi, 34 che è un meccanismo di energia-dipendente. Pertanto, le cellule devono essere incubate a 37 ° C per un efficiente internalizzazione proteine.
  4. Rimuovere supporti dalle cellule e lavare tre volte con 500 ml di calcio-magnesio e senza tampone fosfato salino di Dulbecco (DPBS) supplementato con 0,5 mg / ml di eparina. Nota: L'eparina è necessario rimuovere legato alle proteine ​​di superficie che potrebbe complicare le analisi a valle.
  5. (Opzionale) Ripetere i trattamenti fino a tre volte per la consegna maggiore.
  6. Isolare cellule trattate immediatamente dopo eparina lavaggio mediante digestione con 0,05% tripsina-EDTA a 37 ° C per 2 min. Risospendere le cellule staccate in 0,5 ml di DPBS addizionato con 1% FBS.
  7. Misurare l'intensità di fluorescenza di ciascun campione mediante citometria di flusso 35 utilizzando il canale di isotiocianato di fluoresceina (FITC) (Figura 3). Regolare il forward scatter (FSC) e side scatter (SSC) per posizionare la popolazioneinteressi su scala, assicurando che le popolazioni con proprietà differenti vengono risolte tra loro.
  8. Raccogliere 10.000 eventi live per ogni campione e analizzare i dati in citometria a flusso di analisi dei dati del software. 36 Normalizzare fluorescenza da cellule HeLa trattate con ZIF EmGFP a quelle cellule trattate solo con SFM.

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Representative Results

Due dita proteine ​​di fusione Zif-EmGFP possono essere espressi in E. coli con> 95% omogeneità e rese elevate (> 25 mg / ml) (Figura 2). In generale, a uno o due dita proteine ​​di fusione ZIF possono essere prodotti in quantità quasi identiche a quelle del wild-type di proteine ​​non modificato. Tuttavia, in alcuni contesti, proteine ​​di fusione ZIF cinque e sei dita sono in grado di essere prodotti in rendimenti abbastanza elevati per applicazioni a valle.

Applicazione diretta di due dita proteina ZIF-EmGFP su cellule HeLa per 90 min a 37 ° C comporta un aumento dose-dipendente della EmGFP fluorescenza (Figura 3A). Critico, nessuna fluorescenza è osservata in assenza del dominio ZIF. Abbiamo già osservato che quasi il 100% delle cellule sono fluorescenti dopo il trattamento con il solo 2 mM di due dita della proteina Zif-EmGFP, e che le cellule HeLa trattate con proteine ​​di fusione ZIF sono positivi per EmGFP fluorescenza a concentrazioni di proteine a partire da 0,25 micron (Figura 3B).

Figura 1
Figura 1. Struttura e sequenza delle proteine ​​zinc-finger. Struttura (Top) Cristallo di un singolo dominio zinc-finger (ZIF). Le catene laterali della Cys conservati e suoi residui coordinati con il Zn 2+ ioni sono mostrati come bastoni (PDB ID: 2I13). 37 (in basso) Sequenza del dominio ZIF. Frecce e cilindri indicano Β fogli e α-elica strutture secondarie, rispettivamente. I DNA-binding residui α-elica che sono stati sostituiti con alanina sono evidenziati rosa. Residui carica positiva previsti per mediare internalizzazione cellulare sono evidenziate azzurro. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

"Fo: keep-together.within-page =" always "> Figura 2
Figura 2. SDS-PAGE di purificate uno, due, tre e quattro dita proteine ​​di fusione Zif-EmGFP. Proteine ​​di fusione Zif-EmGFP sono stati espressi in E. coli e purificato per Ni-NTA resina agarosio. Proteine ​​eluite è stato analizzato per la purezza mediante SDS-PAGE usando un -20% gel Tris-glicina 4%. Non è stata osservata un significativo deterioramento o troncamenti di proteine ​​di fusione Zif-EmGFP.

Figura 3
Figura 3. Zif-mediata consegna di proteine ​​in cellule HeLa. (A) fluorescenza intensità di cellule HeLa trattate con quantità crescenti di due dita della proteina ZIF-EmGFP. Cellule HeLa trattate con proteine ​​EmGFP solo sovrappongono interamente con cellule non trattate. (B) normalizzato intensità di fluorescenza delle cellule HeLa trattate consecutivamente con 2 micron of due dita proteine ​​ZIF-EmGFP. Intensità fluorescenza è stata determinata mediante citometria a flusso.

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Discussion

Qui, un protocollo di step-by-step per la consegna delle proteine ​​usando zinc-finger (ZIF) domini cellulari permeabili è presentato. Il dominio ZIF non riduce l'attività del fuso carico enzimatica 34; consente la produzione e purificazione di proteine ​​dei rendimenti quasi identici a quelli osservati con proteine ​​non modificato; e può trasportare proteine ​​ed enzimi in una vasta gamma di tipi di cellule con efficienze superiori peptide o proteina sistemi tradizionali dominio trasduzione cellula-penetranti. Insieme, questi risultati indicano l'ampio potenziale di domini ZIF per mediare consegna proteina diretta nelle cellule per una vasta gamma di applicazioni.

Consegna massima proteina è stato precedentemente ottenuta utilizzando soltanto un dominio ZIF due dita, nonostante il fatto che si estendeva array di tre e domini ZIF quattro dita portare maggiore carica positiva. Questi risultati indicano che l'ingresso delle cellule Zif-mediata potrebbe essere influenzata da fattori diversi carica, incLuding stabilità proteine ​​o rigidità conformazionale. Consegna proteina ZIF dominio-mediata è stata trovata essere anche energia-dipendente e quindi richiede che tutte le cellule trattate con proteine ​​incubate a 37 ° C. Attraverso l'utilizzo di piccole molecole inibitrici di vari percorsi endocitiche, macropinocitosi, e in misura minore di caveolina-dipendente endocitosi, erano determinati a essere le principali vie di ingresso delle cellule Zif-mediata. 34 In particolare, a differenza di altri sistemi di proteina di trasduzione, domini ZIF sono capace di sfuggire efficacemente endosomi per mediare elevati livelli di fornitura citosolico del carico macromolecolare fuso, sottolineando il potenziale di questi domini per ottenere la consegna di proteine ​​robusto.

Nella nostra esperienza, la densità di semina di cellule è un passaggio fondamentale per il raggiungimento di elevati livelli di proteina di trasduzione. Consigliamo di trattare le cellule una volta che raggiungono l'80% -90% di confluenza e precedentemente osservato che le cellule seminate a> 95% confluenza spettacolo sub-capacità ottimale trasduzione, mentre le cellule seminate a densità bassa (<50%) sono sensibili alla tossicità indotta da proteine. È importante sottolineare che, per i tipi di cellule con alti tendenze distacco, piastre di coltura di cellule pre-rivestiti con poli-lisina sono raccomandati. Poly-lisina favorisce l'adesione delle cellule attraverso interazioni elettrostatiche con componenti della superficie cellulare con carica negativa. Anche se le legano il DNA dei residui α-elica di ogni dominio ZIF sono state rimosse per eliminare qualsiasi possibilità di riconoscimento del DNA, i cisteina e istidina residui che coordinano con lo ione Zn 2+ per stabilizzare la piega dominio ΒΒα ZIF rimangono intatti. Pertanto, si raccomanda che qualsiasi soluzione per la conservazione essere integrato con almeno 100 micron di ZnCl 2 per mantenere l'integrità delle proteine.

Sebbene il dominio ZIF stato precedentemente mostrato per fornire proteine ​​ed enzimi in una varietà di tipi di cellule, l'efficienza di consegna ZIF potrebbe anche dipendere entrambi macromocargo lecular e concentrazione di proteine. Per esempio, le cellule trattate con due dita proteina di fusione ZIF-luciferasi sono stati osservati per visualizzare massima luminescenza quando trattati con 0,5 mM proteine, con ridotta attività a concentrazioni più elevate, mentre le cellule trattate con due dita EmGFP mostrato un aumento dose-dipendente della fluorescenza intensità fino a 8,0 mM proteine, e su trattamenti proteine ​​consecutivi. Si consiglia pertanto di valutare la capacità delle cellule di penetrazione di ciascuna unica ZIF fusione di dominio in una vasta gamma di concentrazioni.

Infine, anche se non ancora dimostrato, ci aspettiamo che la consegna di dominio ZIF è una piattaforma altamente flessibile, in grado di fornire una gamma diversificata di macromolecole nelle cellule. Ad esempio, può essere possibile sia per DNA e RNA da funzionalizzati chimicamente sulla superficie del dominio ZIF tramite un linker idrolizzabile, o trasfettate transientemente in cellule da incapsulamento di domini ZIF. Inoltre, il efficirenza di consegna proteine ​​ZIF potrebbe essere ulteriormente rafforzata da sforzi di progettazione razionale focalizzati sull'ottimizzazione carica superficiale.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (DP1CA174426 di Carlos F. Barbas) e ShanghaiTech University di Shanghai, in Cina (a JL). Grafici molecolari sono stati generati utilizzando PyMol.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
XmaI New England Biolabs R0180L
SacI New England Biolabs R0156L
Expand High Fidelity PCR system Roche 11759078001
dNTPs New England Biolabs N0446S
4%-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells Life Technologies EC6028BOX
2x Laemmli Sample Buffer BioRad 161-0737
T4 DNA Ligase Life Technologies 15224-017
BL21 (DE3) Competent E. coli New England Biolabs C2527I
IPTG Thermo Scientific R0391
Zinc Chloride Sigma-Aldrich 208086-5G
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific BP906-5
Glucose Sigma-Aldrich G8270-100G
Tris Base Fisher Scientific BP152-25
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888-25G
DTT Fisher Scientific PR-V3151 
PMSF Thermo Scientific 36978
Ni-NTA Agarose Resin QIAGEN 30210
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-500ML
Imidazole Sigma-Aldrich I5513-25G
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units EMO Millipore UFC900324
DMEM Life Technologies 11966-025
Fetal Bovine Serum Life Technologies 10437-028
Antibiotic-Antimycotic  Life Technologies 15240-062
24-Well Flat Bottom Plate Sigma-Aldrich CLS3527-100EA
Poly-Lysine Sigma-Aldrich P7280
DPBS, No Calcium, No Magnesium Life Technologies 21600010
Heparan Sulfate Sigma-Aldrich H4777
Trypsin Life Technologies 25300054
HeLa cells ATCC CCL-2
Nano Drop ND-1000 spectrophotometer  Thermo Fisher Scientific
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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