Водной Микробная Metaproteomics рабочего процесса: от клеток до триптической пептидов Подходит для тандемной масс-спектрометрии на основе анализа

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Colatriano, D., Walsh, D. A. An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis. J. Vis. Exp. (103), e52827, doi:10.3791/52827 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Микроорганизмы вездесущи и играют существенную роль в биогеохимических циклах Земли 1. В настоящее время существует множество подходов молекулярной доступные для характеристики структуры микробного сообщества и функции. Наиболее распространенным является анализ гена 16S рРНК ПЦР-амплифицировали из ДНК окружающей среды 2 - 4. Недостатком анализа генов 16S рРНК, что это только предоставляет информацию о филогенетического идентичности и структуры сообществ, с мало информации о метаболической функции. В отличие от этого, подходов, таких как метагеномика, metatranscriptomics и metaproteomics предоставить информацию о структуре и метаболизме сообщества. Метагеномика, или анализ содержания генов в сборке организмов, дает информацию о структуре и функциональным возможностям сообщества 5 - 8. Несмотря на то, мощный, это функциональный потенциал может не соответствовать метаболическихДеятельность организмов. Генотип организма представлена ​​его генов, каждый из которых может быть транскрибируется в РНК и затем переведены на белок, в результате чего фенотип. Таким образом, чтобы помочь в понимании микробной функциональной активности в среде, после геномный анализ должен быть выполнен 9. Metatranscriptomics или анализ РНК-транскриптов является полезным, поскольку он показывает, какие гены транскрибируются в любой среде. Тем не менее, уровни мРНК не всегда совпадают соответствующие их уровни белка за счет поступательного регулирования, РНК полураспада, и в том, что несколько белков копии могут быть сформированы для каждого мРНК 10.

По этим причинам metaproteomics в настоящее время признается в качестве важного инструмента для микробиологии окружающей среды. Общие metaproteomic анализирует использовать дробовик протеомный подход, при котором рядом с полным комплектом белков в комплексе образца очищают и проанализированы одновременно, как правило, через анzymatic пищеварения в пептиды и анализа на масс-спектрометре. После тандемной масс-спектрометрии (МС / МС) "пептид отпечатков пальцев" используется для определения пептидную последовательность и потенциальную белок происхождения по базе данных белков поиск (для обзора см 11). Протеомный работа долгий путь за последние 25 лет благодаря увеличению доступности данных геномной и увеличения чувствительности и точности масс-спектрометров, позволяющих идентификации белков с высокой пропускной и количественного 11,12. Так белки конечный продукт экспрессии гена, metaproteomic данные могут помочь определить, какие организмы являются активными в любой среде, и какие белки они выражают. Это выгодно, когда пытаются определить, как конкретный набор параметров окружающей среды влияет на фенотип организма или сообщества. Ранее, МС / МС на основе metaproteomic исследования в океане были использованы для выявления специфических белков в целевыхмикробные клоны, с первого исследования, посвященного света приводом протонного насоса proteorhodopsin в SAR11 морских бактерий. 13 Совсем недавно, сравнительные анализы metaproteomic выяснены дифференциальные паттерны экспрессии белка между сложными сообществами. Примеры включают в себя идентификацию временных сдвигов в обмене веществ в прибрежной Северо-Западного Атлантического океана 14 или Антарктического полуострова 5. Другие исследования описаны изменения в белковых паттернов экспрессии по пространственных масштабах, например, вдоль географического разреза от низкой питательной океана круговорота в высокопроизводительной системе прибрежного апвеллинга 15. Для дальнейших обзоров metaproteomics мы рекомендуем Шнайдер и др. (2010) 9 и Уильямс и др. (2014) 16. Целевые протеомики также использованы в последние годы для количественного экспрессии специфических метаболических путей в среде 17,18.

Therе три основные фазы в metaproteomic анализа. Первый этап подготовки образца, который включает в себя взятие проб, лизис клеток и концентрации белка. Сбор образцов в морской микробиологии часто влечет за собой фильтрацию морской воды через предварительный фильтр для удаления более крупных эукариотических клеток, частиц и частиц-ассоциированных бактерий, с последующей фильтрацией для захвата свободных живой микробных клеток, обычно с использованием картриджа 0,22 мкм Фильтрующий блок 19,20. Эти фильтры incased в пластиковом цилиндре и лизис клеток и протокол экстракции белка, который может быть выполнен в блоке фильтров будет ценным инструментом. После биомасса получена, клетки лизируют необходимо для обеспечения извлечения белка. Могут быть использованы различные способы, в том числе гуанидин-HCl лизиса 21 и натрия додецилсульфата (SDS) основе методов лизиса. Несмотря на то, моющие средства, такие как SDS являются очень эффективными на срыв мембраны и растворении многих типов белковых, КонцентрацONS цене 0,1% может помешать с выходным пищеварения белков и анализа MS 22. Серьезную озабоченность является негативное воздействие на SDS трипсина эффективности пищеварения, разрешающая способность обратной фазы жидкостной хроматографии и подавления ионов или накопления внутри источника ионов 23.

Вторая фаза фракционирования и анализ, в котором белки подвергают ферментативному расщеплению с последующим анализом ЖХ МС / МС, в результате чего AM / г структуры фрагментации, который может использоваться, чтобы установить первичный аминокислотную последовательность начальной трипсином пептида. Различные методы пищеварения могут быть выполнены в зависимости от типов используемых моющих средств, а также вниз по течению процесса массового спектрометрии. В нашем протокола, 1-D электрофореза PAGE с последующим удалением SDS из геля используется для удаления любых загрязнений моющего средства. Анализ белков, которые трудно растворить, например, мембранные белки, требует использования высокой концентратраций SDS или других моющих средств. Это приводит к проблемам совместимости с SDS-электрофореза в геле. Если цель исследования требует солюбилизации эти трудно растворить белки, система трубки-гель может быть использован 22,24. Способ трубки-гель включает белки в матрице геля без использования электрофореза. Впоследствии любые моющие средства, используемые для растворения удаляются перед переваривания белков.

Третий этап является биоинформатики анализ. На этом этапе данные пептидные MS / MS ищутся в базе данных переведенных нуклеотидных последовательностей для определения пептиды и белки присутствуют в образце. Идентификация пептидов зависит от базы данных оно искали против. Морские metaproteomic данные обычно искали с базами данных, состоящих из опорных геномов, метагеномных данных, таких как Global Ocean Sampling наборе 25, а также одноклеточные усиливается геномов из необработанной Lineages 26,27. Белки также идентификацию может быть увеличена за счет включения в метагеномных последовательностей из того же образца, как metaproteomic данные были получены 5.

Здесь мы предлагаем протокол для генерации пептидов, пригодных для МС / МС анализа на основе биомассы из микробных собирали фильтрованием и хранящихся в растворе стабилизации РНК. Протокол, описанный здесь, обеспечивает ДНК и белка, которые будут выделены из того же образца, так что все шаги, ведущей к белку и осадки ДНК идентичны. С практической точки зрения, менее фильтрации требуется, так как только один фильтр необходим для белка и экстракции ДНК. Мы также хотели бы отметить, что этот протокол был создан благодаря сочетанию, адаптации и модификации двух ранее опубликованных протоколов. Шаги лизиса клеток адаптированы из Саито и соавт. (2011) 28 и трипсина в геле переварить компонент приспособлен от ShevcheНКО и др. (2007) 29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовьте Реагенты

  1. Подготовьте SDS-экстракционного раствора: 0,1 М Трис-HCl, рН 7,5, 5% глицерин, 10 мМ ЭДТА и 1% SDS. Фильтр-стерилизовать с помощью фильтра и хранить 0,22 мкм при 4 ° С.
  2. Подготовка акции реагенты, необходимые для полиакриламидном геле.
    1. Готовят 1,5 М Трис-НСl рН 8,8. Фильтр-стерилизовать с помощью фильтра и хранить 0,22 мкм при комнатной температуре.
    2. 0,5 М Трис-НСl рН 6,8. Фильтр-стерилизовать с помощью фильтра и хранить 0,22 мкм при комнатной температуре.
    3. Подготовка 10% SDS. Фильтр стерилизуют, используя фильтр и хранить 0,22 мкм при комнатной температуре.
  3. Готовят растворы, необходимые для в геле трипсина переварить и добычи пептидов.
    1. Подготовьте 100 мМ бикарбоната аммония. Фильтр-стерилизовать с помощью фильтра и хранить 0,22 мкм при 4 ° С.
    2. Подготовьте 1 м DTT запасов. Суспендировали в 100 мМ бикарбоната аммония и хранить при температуре -80 ° С.
    3. Подготовьте 550 мм иодацетамидом запасов. Подвесные в100 мМ бикарбоната аммония и хранить при температуре -80 ° C.
    4. Подготовьте 100 нг / мкл трипсина запасов. Аликвоты по 60 мкл в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках и хранить при -80 ° С.
    5. Подготовьте экстракционного раствора: 1% муравьиной кислоты, 2% ацетонитрила.
    6. Готовят раствор ресуспендирования: 5% ацетонитрила и 0,1% муравьиной кислоты.

2. Выполните лизиса клеток в картридж фильтра блока с ячейками сохранились в РНК стабилизации решения

  1. Извергните стабилизации РНК раствор из блока фильтра картриджа (1,5 мл) и в 2 мл микроцентрифужных трубки с использованием 60 мл шприц, прикрепленный на Луера конце фильтра.
  2. Центрифуга микроцентрифужную пробирку 2 мл в течение 10 мин при 17000 х г для осаждения клеточного дебриса любой. Это делается для того, что фильтр в шаге 2.3 не закупоривает.
  3. Перевести супернатант в 10 К ultracentrifugal блока фильтра, чтобы захватить любые белки, происходящие из клеток, которые лизированных от замерзания / THAW образца. Не выбрасывайте осадок. Он будет использоваться в шаге 2.5. Выполните центрифугирование ultracentrifugal фильтрующего блока в 3270 мкг в течение 30 мин или до объема сократилось до примерно 600 мкл.
  4. Растопить кончик наконечника p10 и блокировать без сторону Луера блока фильтров патрон с открытым концом наконечника. Это будет гарантировать, что ни экстракционного буфера и биомасса не ускользает во время шагов 2,5-2,7.
  5. Приостановить осадок в 1 мл SDS-экстракционного раствора и пипеткой его в исходное блока фильтра картриджа. Самый простой способ пипетки в блок фильтра картридж укладывать чаевые P200 на кончике P1000 и использовать этот двойной наконечник для пипетки.
  6. Добавить 1 мл раствора SDS к экстракции блока фильтра картриджа так, общий объем составл ет примерно 2 мл и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре при вращении в гибридизации печи. Поместите 3 мятой лаборатории салфетки в нижней части 50 мл коническую пробирку. Парафильм оба конца блока фильтров Картридж закрытыи поставить блок фильтра картридж в 50 мл трубки. Закройте крышкой и поставить трубу в гибридизации духовке.
  7. После 10 мин месте Sterivex фильтр на поплавок пены и закрепите его на месте с 5 мл шприц на Луера конца. Поплавок и инкубировать в 95 ° C на водяной бане в течение 15 мин.
  8. Пусть блок фильтра картриджа круто поворачивать и при комнатной температуре в течение 1 часа (как на шаге 2.6).
  9. Выгнать SDS экстракционный раствор / клеточный лизат из фильтра с 60 мл шприца в то же ultracentrifugal блока фильтров, как и раньше (шаг 2.3). Добавить 1 мл свежей SDS экстракционного раствора с блоком фильтра картриджа и перемешивают в течение 30 сек вручную, а затем вытеснить в ultracentrifugal блока фильтров с использованием шприца 60 мл. Это для полоскания устройство патронный фильтр, чтобы обеспечить все белки были удалены.
  10. Выполнение центрифугирования на ultracentrifugal фильтрующего устройства в течение 45 мин при 3270 х г или до объема в блоке фильтров меньше 600 мкл,
  11. Отменить проточный и долейте ultracentrifugal блок фильтра свежим раствором SDS-экстракции.
  12. Центрифуга блок фильтра еще 45 мин при 3270 х г.
  13. Повторите шаги 2.11 и 2.12 раза больше. Обеспечить конечного объема в ultracentrifugal блока фильтра составляет не более 600 мкл на конце окончательного отжима.
  14. В этот момент, разделить на две части концентрата. Одну фракцию будет использоваться для осаждения ДНК, а другой для осаждения белка.
    Примечание: Количество фракционирования зависит от количества биомассы, которую затем фильтруют и предполагаемое использование продуктов. В нашем случае, мы разделили концентрата с 10% по отношению к осадков ДНК и 90% по отношению к осаждения белка.

3. Белки Осадки

  1. Добавить 4 объема метанола и ацетона (50:50) к одному объему концентрата и вихря в течение 10 сек. Инкубируют в течение ночи при -20 ° С.
  2. Спин вниз при 17000 мкг в течение 30 мин. Слейте супернатанти пусть осадок (может быть невидимым) в сухом виде в SpeedVac в течение 1 часа (или до сухой).
    Примечание: Не более сухой осадок, как это может сделать это трудно ресуспендирования.
  3. Приостановить осадок в 25 мкл SDS-экстракционного раствора. Дайте настояться в течение одного часа, затем ресуспендируют с помощью пипетки вверх и вниз.
  4. Количественно белок с использованием набора для анализа белка и инструкциям производителя.

4. ДНК Осадки

  1. Добавить в SDS-экстракционного раствора с фракцией концентрата, которые будут использоваться для осаждения ДНК, пока 500 мкл метки. Этот шаг просто увеличить объем раствора, что делает его легче работать.
  2. Добавить 0,583 объемы осаждения белков реагента (например, как MPC белка осадков реагента) и вихря в течение 10 сек. Вы должны увидеть белый осадок форму.
    Примечание: Мы также использовали фенол: хлороформ методы выделения ДНК, но это труднее из-за низких объемов. Мы получили лучшие выходы ДНК с использованиемПДК белка Осадки Реагент.
  3. Центрифуга при 17000 х г и 4 ° С в течение 10 мин.
  4. Перевести супернатант в другую 1,5 мл микроцентрифужных пробирку и добавляют 0,95 объемов изопропанола. Обратить 30-40 раз.
  5. Центрифуга в течение 10 мин при 4 ° С при максимальной скорости.
  6. Тщательно сцедить и отбросить супернатант.
  7. Промыть два раза с 750 мкл 70% этанола.
  8. Удалить столько этанола, как это возможно с помощью пипетки, то пусть воздушно-сухой.
    Примечание: Не более сухой ДНК, так как это может сделать это трудно ресуспендирования.
  9. Ресуспендируют в 25 мкл ТЕ-буфера низкой, рН 8 (10 мМ Трис-HCl, 0,1 мМ ЭДТА).
  10. Количественная ДНК с использованием набора для анализа двухцепочечной ДНК и инструкции производителей. Выполнение агарозном геле (1%) электрофореза на 3 мкл ДНК, чтобы проверить его качество.

5. SDS-PAGE гель белков

  1. Подготовка образца буфера (950 мкл буфера Лэммли образца и 50 мкл β-меркаптоэтанол). </ LI>
  2. Добавьте соответствующий объем для 15 мкг белка, или макс 20 мкл на равном объеме буфера для образца и варить в течение 4 мин. Образцы теперь могут быть хранили при -80 ° С до SDS-PAGE не может быть выполнена.
  3. Подготовка 10% акриламида разрешающую гель с 5% акриламида концентрирующего геля.
  4. Загрузка гель с образцами и 4 мкл белка лестницы. Бегите гель при постоянном 120 V до 250 кДа лестничной маркера только достиг разрешающую гель.
  5. Пятно гель с помощью Кумасси пятно основе в соответствии с инструкциями изготовителя.

6. В-гель Трипсин Дайджест и пептида Добыча

Примечание: Все шаги отсюда до 6.10 выполнены в кабинете биологической безопасности для минимизации загрязнения.

  1. Отрежьте лишний гель под 10 кДа лестничной знак для каждой полосы. Каждая дорожка будут проанализированы на MS / MS отдельно. Разрежьте каждый переулок в 1 мм х 1 мм квадратов для увеличения площади поверхности и поместите все squaРез из переулка в низкой связывания микро-трубки центрифуги. Повторите эту процедуру для всех полос. (1% уксусной кислоты может быть использован для предотвращения гель от высыхания и становится трудно вырезать).
    Примечание: Сведение к минимуму загрязнений важно на этом этапе, так гель нарезки выполняется в кабинете биологической безопасности на стеклянной SDS-PAGE гель формы, используемой, чтобы гель.
  2. Де-пятно
    1. Разлить по 50 мкл 100 мМ бикарбоната аммония в каждую низкого связывания трубки, рядом крышкой и инкубируют при 37 ° С в течение 10 мин.
    2. Разлить по 50 мкл ацетонитрила, недалеко крышкой и инкубируют при 37 ° С в течение 5 мин.
    3. Аспирируйте и выбросить 150 мкл.
    4. Повторите шаги 6.2.1 и 6.2.2.
    5. Аспирируйте и отбросить 95 мкл.
  3. Обезвоживание
    1. Разлить 50 мкл ацетонитрила, недалеко крышку и подождите 5 мин. Аспирируйте и отбросить 45 мкл и ждать 10 мин.
  4. Сокращение
    1. Разлить по 50 мкл DTT (10 мМ, разбавленного в 100 мМ АММониевая бикарбонат), недалеко колпачок и ждать 30 мин при 37 ° С.
  5. Алкилирование
    1. Разлить по 50 мкл иодацетамида (55 мм, разбавленный в 100 мМ бикарбоната аммония), близкий колпачок и ждать 20 мин при 37 ° С.
    2. Распределить 100 мкл ацетонитрила, недалеко крышкой и инкубируют в течение 5 мин при 37 ° С. Аспирируйте и выбросить 195 мкл.
  6. Мыть
    1. Разлить по 50 мкл бикарбонат аммония, близко колпачок и инкубируют в течение 10 мин при 37 ° С.
    2. Разлить по 50 мкл ацетонитрила, недалеко крышкой и инкубируют при 37 ° С в течение 5 мин. Аспирируйте и выбросить 120 мкл.
  7. Обезвоживание
    1. Разлить 50 мкл ацетонитрила, недалеко крышку и подождите 5 мин. Аспирируйте и отбросить 45 мкл.
    2. Разлить по 50 мкл ацетонитрила, подождите 5 мин.
    3. Аспирируйте и отбросить 75 мкл и ждать 5 мин.
  8. Пищеварение
    1. Разлить 25-30 мкл 6 нг / мкл трипсина (иntil все фрагменты гель покрыты). Закрыть колпачок и ждать 30 минут при комнатной температуре.
    2. Выдержите в течение ночи (4,5 ч минимум) при 37 ° С.
    3. Пусть сидят при комнатной температуре в течение 30 мин.
  9. Добыча и пептид Трансфер
    1. Разлить 30 мкл экстракционного раствора и накройте крышкой в ​​течение 30 мин на льду.
    2. Аспирируйте 30 мкл и обойтись атмосферный объем в новом надписью низкой связывания трубки.
    3. Разлить 12 мкл экстракционного раствора и 12 мкл ацетонитрила в исходное трубы (с гелем). Закрыть колпачок и инкубировать в течение 30 мин на льду.
    4. Аспирируйте 15 мкл и внести в новую пробирку.
    5. Повторите шаги (6.9.3 и 6.9.4).
  10. Поместите новые трубы в SpeedVac до сухой.
  11. Ресуспендируют в 50 мкл раствора ресуспендирования. Вихревой на среде в течение 10 мин для ресуспендирования.
  12. Пипетка пептидный раствор в любой нано / LC флаконах или 96-луночных планшетах, пригодных для нано / LCMS / MS работа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В качестве демонстрации, мы провели протокол на двух пробах морской воды, собранных с поверхности и хлорофилла максимум прибрежных районах океана в Северной Канаде. В то время как в море, 6-7 л морской воды, пропускали через GF / D префильтр 3 мкм, а затем микробные клетки собирали на единицу патронный фильтр 0,22 мкм в соответствии с протоколом Уолша и др., 20. Клетки немедленно сохраняются в стабилизации раствора РНК до дальнейшей обработки. По возвращении в лабораторию, мы провели протокол, как это представлено здесь. Концентрированный лизат клеток был разделен; Белок осаждали из 90% от объема, в то время как ДНК осаждали из оставшихся 10% от объема. Мы восстановлены 24-26 мкг белка и 250-308 нг ДНК высокого качества из этих образцов (рисунок 1). После в геле трипсина пищеварения и экстракции пептид, мы подвергли анализу пептидов MS / MS с использованием нано-LC, соединенный с Orbitrap Элите масс-спектрометр (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Из пептидов, мы получили более 23000 спектров МС / МС на выборку. Пептиды и белки затем определили путем поиска этих спектров против пользовательской базы данных в доме последовательности с помощью инструмента пиков биоинформатики (BSI, Ватерлоо, Онтарио, Канада). База данных состоит из предсказанных белков из морских опорных геномов и метагеномов. Поиск привел к идентификации около 1000 пептидов и белков 700-800 для каждого образца. Естественно, эти результаты зависят от микробного изобилии клеток, MS-измерительных приборов, а также белка базы данных поиска и алгоритмов. Тем не менее, эти результаты показывают, что этот протокол имеет потенциал для производства достаточных триптические пептиды, пригодные для идентификации белков сотни в окружающей среде. Кроме того, поскольку метагеномных библиотеки могут быть построены из всего как 100 нг ДНК 30, этот протокол также имеет потенциал, чтобы обеспечить достаточное количество ДНКдля создания подобранных метагеномных-metaproteomic наборов данных.

Таксономический и функциональный состав metaproteomes анализировали, используя комбинацию BLASTP и MEGAN (метагенома анализатора) пакет программного обеспечения 31,32 (Рисунок 2). Белки, назначенные Альфа-протеобактерий были наиболее широко представлена ​​в наборе данных, подавляющее большинство из которых были отнесены к SAR11 клады. Rhododobacterales клады Альфа-протеобактерий также широко представлена ​​и определены наиболее часто в поверхностных водах. Белки, назначенные Bacteroidetes были равномерно распределены между поверхностью и хлорофилла максимум, но Flavobacteria белки идентифицировали в большей степени в максимуме хлорофилла. Гамма-proteobacterial белки равномерно распределены по всей толще воды, а бета-proteobacterial белки были найдены преимущественно на поверхности , Изфункциональной точки зрения, широкий спектр метаболических путей были определены. Вертикальная структурирование этих метаболических путей было очевидно. Например, белки, ассоциированные с метаболизма аминокислот, углеводного обмена и фиксации путей прокариотической углерода были определены в первую очередь на поверхности, и метаболизм азота было найдено исключительно на поверхности. Фотосинтетической фиксации углерода белки были обнаружены в первую очередь на максимуме хлорофилла, а белки, участвующие в фотосинтезе были определены равномерно между поверхностью и хлорофилла максимума. Эти результаты показывают, что большое разнообразие белков из различных микробов таксонов могут быть обнаружены с использованием протокола, представленную здесь.

фигура 1
Рисунок 1:. Геномную ДНК от 2 глубины на станции Арктического S633 Первый переулок 4 мкл 1 кб ДНК лгадюка, дорожка 2 содержит 3 мкл геномной выделения ДНК из S633_2 м, полоса 3 содержит 3 мкл добычи геномной ДНК из S633_20 м и полосы 4-6 содержат 0,5 мкл (85 нг), 2 мкл (333 нг) и 4 мкл ( 667 нг) HindIII переваривается лямбда ДНК.

Рисунок 2
Рисунок 2:. Таксономический и функциональный анализ 2 глубины на станции Арктического S633 сравнение таксономическое разнообразие арктических станция 633 поверхности и хлорофилла максимальных вод (А) создана при помощи Меган. Функциональное сравнение разнообразие арктических станция 633 поверхности и хлорофилла максимальных вод (Б), созданных с помощью Меган запрос к базе данных KEGG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Образец сохранение является ключом к metaproteomic исследований и предыдущая работа показала, что раствор стабилизации РНК является полезным буфер хранения для хранения клеток до извлечения белка 28. В идеале, образцы будут сохранены на месте, чтобы свести на нет изменения в экспрессии белка во время обработки 33,34. На самом деле, на месте были разработаны для отбора проб и фиксации технологии, которые позволяют автономного сбора и сохранения образцов на корабле развернуты инструментов. Тем не менее, доступ к этим технологиям не всегда возможно. В общем случае, что это не образцы должны быть сохранены как можно скорее после сбора.

Здесь мы приводим протокол для извлечения белка из раствора РНК стабилизации хранятся клеток, собранных на блок фильтра картриджа, который обычно используется в водной микробиологии. Протокол включает лизис клеток с использованием раствора для лизиса в ДСН-и отопление, после чего прotein шаг концентрация помощью ultracentrifugal блоков фильтров, что в два раза, как необходимый шаг для обессоливания. Следует отметить, что концентрации и обессоливания шаги не могут быть пропущены. Мы обнаружили, что как минимум из трех этапов буфер обмена требуется опреснения наш концентрат. Из-за высокой концентрации соли в растворе стабилизации РНК, если надлежащее обессоливания не происходит, слишком много соли будут осаждаться во время ночной стадии осаждения белка и обессоливания и стадию осаждения должны быть повторены. Кроме того, если опреснения не правильно выполняется 1D-страница не будет работать, и образцы будут потеряны.

Затем, концентрированный лизат был разделен так, что оба осаждение белка и ДНК осадков может быть выполнена. Это полезно, поскольку это часто желательно, чтобы метагеномных и metaproteomic данные быть получены из одних и тех же образцов. Если белок не представлен в базе данных белковых последовательностей, то пептидНе быть идентифицированы. В том числе геномные данные от того же образца, как протеомный данных сокращает риск не будучи в состоянии идентифицировать белок из-за его отсутствия в базе данных.

Хотя этот протокол был оптимизирован для использования с блоками фильтров картридж и утверждена для работы на прибрежных океанских микробных сообществ, она может быть адаптирована для использования с другими типами проб окружающей среды и фильтров. Тем не менее, это должно быть четко указано, что успех этого протокола зависит от адекватного количества исходного биомассы. Поэтому в водных экосистемах, где биомасса может быть очень низкой, мы рекомендуем увеличение объема профильтрованной воды, соответственно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterivex -GP 0.22 μm filter unit Millipore SVGP01050 Sampling
RNAlater Stabilization Solution Ambion AM7021 Sampling
Tris  Bio Basic 77-86-1 or TB0196-500G Protein Extraction/ SDS PAGE gel
DTT Sigma-Aldrich D0632-1G Protein Extraction
SDS Bio Basic 15-21-3 Protein Extraction/ SDS PAGE gel
EDTA Bio Basic 6381-92-6 Protein Extraction
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5 Protein Extraction
10K Amicon Filter Millipore UFC801024 Protein Extraction
Methanol Sigma-Aldrich 179337-4L Protein Precipitation
Acetone Fisher Scientific 67-64-1 Protein Precipitation
MPC Protein Precipitation reagent Epicenter mmP03750 DNA Precipitation
2-Propanol Fisher Scientific 67-63-0 DNA Precipitation
Qubit dsDNA BR Assay kit Life Technologies Q32850 DNA Quantification
Qubit Protein Assay kit Life Technologies Q33211 Protein Quantification
Sucrose Bio Basic 57-50-1 SDS PAGE gel
TEMED Bio Rad 161-0800 SDS PAGE gel
APS Bio Rad 161-0700 SDS PAGE gel
30% Acrylamide Bio Rad 161-0158 SDS PAGE gel
SimplyBlue SafeStain Invitrogen LC6060 SDS PAGE gel
Glycine Bio Rad 161-0718 SDS PAGE gel
B-mercaptoethanol Bio Basic 60-24-2 SDS PAGE gel
Laemmli Sample Buffer Bio Rad 161-0737 SDS PAGE gel
Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder Bio Rad 161-0375EDU SDS PAGE gel
Acetonitrile VWR CABDH6044-4 In-gel Trypsin digest
NH4HCO3 Bio Basic 1066-33-7 In-gel Trypsin digest
DTT Sigma-Aldrich D0632-1G In-gel Trypsin digest
Formic Acid Sigma-Aldrich F0507-500ML In-gel Trypsin digest
HPLC grade H2O Sigma-Aldrich 270733-4L In-gel Trypsin digest
Iodoacetamide Bio Basic 144-48-9 In-gel Trypsin digest
Trypsin Promega V5111 In-gel Trypsin digest
Protein LoBind Tube 1.5 ml Eppendorf 22431081 In-gel Trypsin digest
2 ml ROBO vial 9 mm Candian Life Science VT009/C395SB In-gel Trypsin digest
PP BM insert, No spring Candian Life Science 4025P-631 In-gel Trypsin digest

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Madsen, E. L. Microorganisms and their roles in fundamental biogeochemical cycles. Current opinion in biotechnology. 22, (3), 456-464 (2011).
  2. El-Swais, H., Dunn, K. A., Bielawski, J. P., Li, W. K. W., Walsh, D. A. Seasonal assemblages and short-lived blooms in coastal northwest Atlantic Ocean bacterioplankton. Environmental microbiology. (2014).
  3. Galand, P. E., Potvin, M., Casamayor, E. O., Lovejoy, C. Hydrography shapes bacterial biogeography of the deep Arctic Ocean. The ISME journal. 4, (4), 564-576 (2010).
  4. Lane, D. J., Pace, B., Olsen, G. J., Stahlt, D. A., Sogint, M. L., Pace, N. R. Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4972 (1986).
  5. Williams, T. J., Long, E., et al. A metaproteomic assessment of winter and summer bacterioplankton from Antarctic Peninsula coastal surface waters. The ISME journal. 6, (10), (2012).
  6. Sheik, C. S., Jain, S., Dick, G. J. Metabolic flexibility of enigmatic SAR324 revealed through metagenomics and metatranscriptomics. Environmental microbiology. 16, (1), 304-317 (2014).
  7. Venter, J. C., Remington, K., et al. Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea. Science (New York, N.Y.). 304, 66-74 (2004).
  8. Tyson, G. W., Chapman, J., et al. Community structure and metabolism through reconstruction of microbial genomes from the environment. Nature. 428, 37-43 (2004).
  9. Schneider, T., Riedel, K. Environmental proteomics: analysis of structure and function of microbial communities. Proteomics. 10, (4), 785-798 (2010).
  10. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature reviews. Genetics. 13, (4), 227-232 (2012).
  11. Hettich, R. L., Pan, C., Chourey, K., Giannone, R. J. Metaproteomics: harnessing the power of high performance mass spectrometry to identify the suite of proteins that control metabolic activities in microbial communities. Analytical chemistry. 85, (9), 4203-4214 (2013).
  12. Von Bergen, M., Jehmlich, N., et al. Insights from quantitative metaproteomics and protein-stable isotope probing into microbial ecology. The ISME journal. 7, (10), 1877-1885 (2013).
  13. Giovannoni, S. J., Bibbs, L., et al. Proteorhodopsin in the ubiquitous marine bacterium SAR11. Nature. 438, (7064), 82-85 (2005).
  14. Georges, A. A., El-Swais, H., Craig, S. E., Li, W. K., Walsh, D. A. Metaproteomic analysis of a winter to spring succession in coastal northwest Atlantic Ocean microbial plankton. The ISME journal. 1-13 (2014).
  15. Morris, R. M., Nunn, B. L., Frazar, C., Goodlett, D. R., Ting, Y. S., Rocap, G. Comparative metaproteomics reveals ocean-scale shifts in microbial nutrient utilization and energy transduction. The ISME journal. 4, (5), 673-685 (2010).
  16. Williams, T. J., Cavicchioli, R. Marine metaproteomics: deciphering the microbial metabolic food web. Trends in microbiology. 22, (5), 248-260 (2014).
  17. Saito, M. a, McIlvin, M. R., et al. Multiple nutrient stresses at intersecting Pacific Ocean biomes detected by protein biomarkers. Science. 345, (6201), 1173-1177 (2014).
  18. Bertrand, E., Moran, D., McIlvin, M., Hoffman, J., Allen, A., Saito, M. Methionine synthase interreplacement in diatom cultures and communities: Implications for the persistence of B12 use by eukaryotic phytoplankton. Limnology and Oceanography. 58, (4), 1431-1450 (2013).
  19. Hawley, A. K., Kheirandish, S., et al. Molecular tools for investigating microbial community structure and function in oxygen-deficient marine waters. Methods in enzymology. 531, Elsevier Inc. 305-329 (2013).
  20. Da Walsh,, Zaikova, E., Hallam, S. J. Small volume (1-3L) filtration of coastal seawater samples. Journal of visualized experiments: JoVE. (28), 1-2 (2009).
  21. Thompson, M., Chourey, K. Experimental approach for deep proteome measurements from small-scale microbial biomass samples. Analytical. 80, (24), 9517-9525 (2008).
  22. Lu, X., Digestion Zhu, H. Tube-Gel. 1948-1958 (2005).
  23. Sharma, R., Dill, B. D., Chourey, K., Shah, M., VerBerkmoes, N. C., Hettich, R. L. Coupling a detergent lysis/cleanup methodology with intact protein fractionation for enhanced proteome characterization. Journal of proteome research. 11, (12), 6008-6018 (2012).
  24. Santoro, A. E., Dupont, C. L., et al. Genomic and proteomic characterization of "Candidatus Nitrosopelagicus brevis": An ammonia-oxidizing archaeon from the open ocean. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, (4), 1173-1178 (2015).
  25. Rusch, D. B., Halpern, A. L., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling expedition: northwest Atlantic through eastern tropical Pacific. PLoS biology. 5, (3), e77 (2007).
  26. Swan, B. K., Martinez-Garcia, M., et al. Potential for chemolithoautotrophy among ubiquitous bacteria lineages in the dark ocean. Science (New York, N.Y.). 333, (6047), 1296-1300 (2011).
  27. Rinke, C., Schwientek, P., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499, (7459), 431-437 (2013).
  28. Saito, M. A., Bulygin, V. V., Moran, D. M., Taylor, C., Scholin, C. Examination of microbial proteome preservation techniques applicable to autonomous environmental sample collection. Frontiers in microbiology. 2, 215 (2011).
  29. Shevchenko, A., Tomas, J. H., Olsen, J., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1, (6), 2856-2860 (2007).
  30. Thomas, T., Gilbert, J., Meyer, F. Metagenomics - a guide from sampling to data analysis. Microbial Informatics and Experimentation. 2, (1), 3 (2012).
  31. Huson, D. H., Auch, A. F., Qi, J., Schuster, S. C. MEGAN analysis of metagenomic data. Genome research. 17, (3), 377-3786 (2007).
  32. Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -J., Weber, N., Schuster, S. C. Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4. Genome research. 21, (9), 1552-1560 (2011).
  33. Ea Ottesen,, Marin, R., et al. Metatranscriptomic analysis of autonomously collected and preserved marine bacterioplankton. The ISME journal. 5, (12), 1881-1895 (2011).
  34. Feike, J., Jürgens, K., Hollibaugh, J. T., Krüger, S., Jost, G., Labrenz, M. Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system. The ISME journal. 6, (2), 461-470 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics