水生微生物Metaproteomicsワークフロー:細胞からのトリプシンペプチドのタンデム質量分析ベースの分析に適し

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Colatriano, D., Walsh, D. A. An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis. J. Vis. Exp. (103), e52827, doi:10.3791/52827 (2015).

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Abstract

Introduction

微生物は、ユビキタスであり、地球の物質循環1に重要な役割を果たしています。現在、微生物群集の構造と機能を特徴づけるために利用可能な多数の分子アプローチがあります。 4 -最も一般的な16S rRNA遺伝子配列の分析は、環境DNA 2からPCR増幅されます。 16S rRNA遺伝子解析の欠点は、それが唯一の代謝機能にはほとんどの情報を、系統発生的アイデンティティと社会構造についての情報を提供することです。これとは対照的に、このようなメタゲノミクス、metatranscriptomicsとmetaproteomicsとしてのアプローチは、コミュニティの構造と代謝に​​関する情報を提供しています。 8 -メタゲノミクス、または生物の集合体の遺伝子含有量の分析は、社会5の構造と機能の可能性についての情報を提供します。強力なものの、この機能の可能性は、代謝に対応しない場合があります生物の活動。生物の遺伝子型は、RNAに転写し、さらに表現型をもたらす、タンパク質に翻訳することができるそれらの各々は、その遺伝子によって表されます。従って、環境中の微生物の機能的活性の理解を助けるために、ポストゲノム解析は、9実行されるべきです。それは任意の環境で転写される遺伝子を明らかにするためMetatranscriptomics、またはRNA転写物の分析に便利です。しかし、mRNAのレベルは、常に翻訳調節、RNAの半減期、および複数のタンパク質コピーは、すべてのmRNAの10のために生成することができるという事実に起因し、それらの対応するタンパク質のレベルと一致しません。

これらの理由のmetaproteomicsのために今の環境微生物学のための重要なツールとして認識されています。共通metaproteomicは、複雑なサンプル中のタンパク質のほぼ完全な補完は、通常エンを通して、精製し、同時に分析されているショットガンプロテオミクスのアプローチを使用して分析します質量分析計のペプチドおよび分析にzymatic消化。続くタンデム質量分析(MS / MS)「ペプチドフィンガープリント」は、タンパク質データベース検索によって、ペプチド配列および起源の可能性タンパク質(概説については11を参照)を決定するために使用されます。プロテオミクスの研究は、過去25年間で、ゲノムデータの可用性の増加や高スループットのタンパク質の同定および定量11,12を可能にする質量分析計の感度および精度の向上のおかげで長い道のりを歩んできました。タンパク質は、遺伝子発現の最終産物であるので、metaproteomicデータは、任意の与えられた環境で活性である生物、それらが発現しているものタンパク質を判断するのに役立ちます。環境変数の特定のセットは、生物やコミュニティの表現型にどのように影響するかを決定しようとする場合に有利です。初期の段階では、海でのMS / MSベースmetaproteomic研究が対象となるの特定のタンパク質を同定するために使用されましたSAR11の海洋細菌13の光駆動プロトンポンプテオに焦点を当てた最初の研究で、微生物系統、。より最近では、比較metaproteomic分析が複雑な地域社会との差タンパク質発現パターンを解明しました。例としては、沿岸北西部大西洋14または南極半島5における代謝の時間的シフトの識別が含まれます。他の研究では、生産性の高い沿岸湧昇システム 15に低栄養環流から地理的トランセクトに沿って、例えば、空間スケールを越えタンパク質発現パターンの変化を説明しています。 metaproteomicsのさらなるレビューのために我々はシュナイダー (2010)9、ウィリアムズ (2014年)16をお勧めします。標的プロテオミクスはまた、環境17,18における特定の代謝経路の発現を定量するために近年使用されています。

THEReはmetaproteomic分析には、主な3つの相です。第一段階は、試料収集、細胞溶解及びタンパク質の濃度を含むサンプル調製です。海洋微生物のサンプルの収集は、多くの場合、一般に、0.22μmのカートリッジを使用して、自由生活微生物細胞の捕捉のためにろ過し、より大きな真核生物細胞、粒子と粒子に関連する細菌を除去するためにプレフィルターを通して海水の濾過を伴いますフィルタユニット19,20。これらのフィルタは、プラスチックシリンダーでincasedされ、フィルタユニット内で実行することができる細胞溶解及びタンパク質抽出プロトコルは、貴重なツールであろう。バイオマスが得られると、細胞は、タンパク質抽出を可能にするために溶解されなければなりません。いくつかの方法は、溶解法をベースグアニジン-HCl溶解21とドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む、使用することができます。 SDSのような界面活性剤は、膜を破壊し、多くのタンパク質の種類を可溶化でconcentrati非常に効率的であるが、下流タンパク質消化及びMS分析22に干渉することが0.1%と低く、ONS。主要な関心事のイオン源23内の逆相液体クロマトグラフィーとイオン抑制または蓄積の解像力、トリプシン消化効率にSDSの悪影響です。

第二段階は、タンパク質が、最初のトリプシンペプチドの一次アミノ酸配列を確認するために使用することができるAM / zの断片化パターンをもたらす、LC MS / MS分析に続いて酵素消化に供される分画及び分析です。さまざまな消化方法が使用される界面活性剤の種類、ならびに下流の質量分析ワークフローに応じて行うことができます。我々のプロトコルでは、ゲルのSDSを除去した1次元PAGE電気泳動は、任意の洗剤汚染を除去するために利用されています。このような膜タンパク質として、可溶化することが困難であるタンパク質の分析は、高いconcenの使用を必要としますSDSまたは他の界面活性剤のtrations。これは、SDSゲル電気泳動との互換性の問題につながります。研究の目的は、タンパク質を可溶化するために、これらの硬質の可溶化を必要とする場合、チューブゲルシステムは、22,24を使用することができます。チューブゲル法、電気泳動を使用することなく、ゲルマトリックス内のタンパク質を組み込みます。続いて可溶化するために使用される任意の界面活性剤は、タンパク質消化の前に削除されます。

第三段階は、バイオインフォマティクス解析です。この段階でMS / MSペプチドデータは、サンプル中に存在するペプチドおよびタンパク質を決定するために翻訳されたヌクレオチド配列データベースに対して検索されます。ペプチドの同定は、それがに対して検索されているデータベースに依存しています。マリンmetaproteomicデータは、一般的に参照ゲノムから成るデータベースに対して検索され、そのようなグローバル・オーシャン・サンプリングデータセット25、ならびに単一セルとメタゲノムのデータが未培養のLiからゲノムを増幅します26,27 neages。タンパク質同定はまたmetaproteomicデータ 5導出されたのと同じ試料からメタゲノム配列を含めることによって増加させることができます。

ここでは、微生物バイオマスからのMS / MSに基づく分析を濾過により回収し、RNA安定化溶液中で保存するのに適したペプチドを生成するためのプロトコルを提供します。 DNAとタンパク質は、同じ試料から単離するためのタンパク質およびDNAの沈殿に至るまでのすべてのステップが同じになるように、ここで説明されたプロトコルができます。唯一のフィルタは、タンパク質およびDNA抽出の両方のために必要とされるので、実用上の観点から、より少ない濾過が必要とされます。また、このプロトコルは2以前に公開されたプロトコルの組み合わせ、適応及び改変によって作成されたことを感謝したいです。細胞溶解工程は、斎藤。(2011)28、コンポーネントがShevcheから適応されるダイジェストゲル内トリプシンから適応されていますNKOら。 (2007年)29。

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Protocol

1.試薬を準備

  1. 0.1 MのTris-HCl pH7.5で、5%グリセロール、10mMのEDTA及び1%SDS:SDS抽出溶液を調製します。 4℃で0.22μmフィルターとストアを使用してフィルター滅菌します。
  2. ポリアクリルアミドゲルに必要な株式試薬を準備します。
    1. 1.5 Mトリス塩酸pHが8.8を準備します。室温で0.22μmフィルターとストアを使用してフィルター滅菌します。
    2. 0.5 Mトリス塩酸pHは6.8。室温で0.22μmフィルターとストアを使用してフィルター滅菌します。
    3. 10%SDSを準備します。フィルターは、室温で0.22μmフィルターとストアを使用して滅菌します。
  3. ゲル内トリプシン消化およびペプチド抽出に必要なソリューションを準備します。
    1. 100mMの重炭酸アンモニウムを準備します。 4℃で0.22μmフィルターとストアを使用してフィルター滅菌します。
    2. 1 M DTTストックを準備します。 -80℃で100mMの重炭酸アンモニウムとストアに懸濁しました。
    3. 550 mMのヨードアセトアミドストックを準備します。に懸濁100 mMの-80℃での重炭酸アンモニウムとストア。
    4. 100 ngの/μlのトリプシンストックを準備します。 -80℃で1.5 mlマイクロチューブに60μlのアリコートとストア。
    5. 1%ギ酸、2%アセトニトリル:抽出液を準備します。
    6. 5%アセトニトリルおよび0.1%ギ酸:再懸濁溶液を調製します。

2. RNA安定化策に保存された細胞とカートリッジフィルターユニットで細胞溶解を実行

  1. カートリッジフィルターユニット(1.5 ml)でのフィルタのルアーロック端部に取り付けられた60 mlの注射器を使用して、2 mlのマイクロ遠心チューブにRNA安定化溶液を追い出します。
  2. 任意の細胞破片をペレットに17000×gで10分間、2 mlのマイクロ遠心チューブを遠心。ステップ2.3でフィルターが目詰まりしないようにするためです。
  3. 凍結/ THAから溶解した細胞に由来する任意のタンパク質を捕捉するために、10K超遠心フィルターユニットに上清を移しますサンプルのワットペレットを廃棄しないでください。なお、ステップ2.5で使用されます。 30分間、または体積が約600μlに減少するまで、3,270×gで超遠心フィルターユニットの遠心分離を行います。
  4. P10チップの先端を溶融し、先端の開口端とカートリッジフィルターユニットの非ルアーロック側を遮断します。これには、抽出緩衝液とバイオマスがステップ2.5から2.7の間に脱出しないことを保証します。
  5. 1ミリリットルのSDS抽出液中にペレットを中断し、元のカートリッジフィルターユニットにそれをピペット。カートリッジフィルターユニットにピペットする最も簡単な方法は、P1000の先端にP200チップをスタックし、ピペッティングのために、この二重のヒントを使用することです。
  6. 総容積が約2mlとなるようにカートリッジフィルターユニットにSDS抽出液1mlを添加し、ハイブリダイゼーションオーブン中で回転させながら室温で10分間インキュベートします。 3しわくちゃラボを50mlコニカルチューブの底にワイプ置きます。閉じたカートリッジフィルター部の両端をパラフィルム50 mlのチューブにカートリッジフィルターユニットを置きます。蓋を閉じて、ハイブリダイゼーションオーブンにチューブを入れます。
  7. 10分の場所Sterivex後発泡フローターでフィルタとルアーロック端に5ミリリットルの注射器で固定します。フロート、15分間95℃の水浴中でインキュベートします。
  8. クールカートリッジフィルターユニットをしようとする(ステップ2.6のように)、室温で1時間回転します。
  9. (ステップ2.3)前と同じ超遠心フィルターユニットに60 mlシリンジにフィルタのうちSDS抽出液/細胞溶解物を放出します。カートリッジフィルターユニットに新鮮SDS抽出液1mlを加え、手で30秒間混合し、60 mlの注射器を用いて超遠心フィルターユニットに追い出します。これは、すべてのタンパク質が除去されていることを確認するためにカートリッジフィルターユニットを洗浄することです。
  10. 3,270×gでまたはフィルタユニット内の容積が600未満μLになるまで、45分間超遠心フィルターユニットに遠心分離を行い。
  11. フロースルーを捨て、新鮮なSDS抽出液を補充して超遠心フィルターユニットを。
  12. 遠心3270×gでさらに45分間、フィルタユニット。
  13. 繰り返し二回より2.11と2.12を繰り返します。超遠心フィルターユニット内の最終容量は、最終的なスピンの最後に最も600μlのであることを確認します。
  14. この時点で、二つに濃縮物を分割します。一つの画分は、DNA沈殿および他のタンパク質のための沈殿のために使用されます。
    注:分別量をろ過したバイオマス量や製品の使用目的によって異なります。私たちのケースでは、DNA沈殿に向かって10%とタンパク質沈殿に向かって90%に濃縮物を分割します。

3.タンパク質の沈殿

  1. 10秒のための濃縮物および渦の一冊にアセトン(50:50):4倍量のメタノールを追加します。 -20℃で一晩インキュベートします。
  2. 30分間17000×gでスピンダウン。上清を除去そしてペレットを1時間(または乾燥するまで)のためにスピードバックで乾燥(目に見えないかもしれない)しましょう​​。
    注意:これはそれが困難な再懸濁するために行うことができるようにオーバーペレットを乾燥させないでください。
  3. SDS抽出溶液25μlにペレットを一時停止します。その後、ピペッティングにより再懸濁一時間座ってみましょう。
  4. タンパク質アッセイキットおよび製造業者の指示に従って用いてタンパク質を定量化します。

4. DNAを沈殿

  1. 500μlのマークまで、DNA沈殿のために使用される濃縮液画分をSDS-抽出溶液を加えます。このステップは、単にそれが簡単で動作するようになって、溶液の体積を増加させることです。
  2. 10秒間ボルテックス(例えばMPCタンパク質沈殿試薬として)タンパク質沈殿試薬の0.583ボリュームを追加します。あなたは、白色の沈殿物フォームが表示されるはずです。
    注:我々はまた、フェノール使用している:クロロホルムDNA抽出法を、それが低いボリュームにより困難です。我々は、使用してより優れたDNA収量を得ましたMPCタンパク質沈殿試薬。
  3. 17000×gで遠心分離し、10分間、4℃。
  4. さらに1.5 mlのマイクロ遠心チューブに上清を移し、イソプロパノール0.95ボリュームを追加します。 30〜40回転倒。
  5. 最大速度で4℃で10分間遠心。
  6. 慎重にデカントし、上清を捨てます。
  7. 70%エタノール750μlので二回洗浄します。
  8. 空気乾燥をさせた後、ピペッティングによりできるだけ多くのエタノールを除去します。
    注意:これはそれが困難な再懸濁するために行うことができるようにオーバーするDNAを乾燥させないでください。
  9. 低TEバッファー、pH 8(10 mMトリス塩酸、0.1mMのEDTA)25μlの再懸濁。
  10. 二本鎖DNAアッセイキット及び製造業者の指示を用いてDNAを定量化します。その品質を確認するために、DNAの3μLにアガロースゲル(1%)電気泳動を行います。

5. SDS-PAGEタンパク質のゲル

  1. サンプルバッファー(950μlのレムリ試料緩衝液および50μlのβメルカプトエタノール)を準備します。</ LI>
  2. 15μgのタンパク質に対応する量、またはサンプル緩衝液の等体積の20μLの最大を追加し、4分間沸騰。 SDS-PAGEを行うことができるまで、サンプルは現在-80℃で保存することができます。
  3. 5%アクリルアミドスタッキングゲルを有する10%アクリルアミド分離ゲルを準備します。
  4. サンプルおよびタンパク質ラダーの4μlのゲルをロードします。 250 kDaのラダーマーカーはちょうど分離ゲルに達するまで一定の120 Vでゲルを実行します。
  5. 製造者の指示に従って染色ベースのクマシーを用いてゲルを染色。

6.ゲル内トリプシン消化し、ペプチドの抽出

注:6.10までここからすべてのステップは、汚染を最小限にするために生物学的安全キャビネット内で実行されます。

  1. 各レーンのための10 kDaのラダーマークの下に余分なゲルを切り取ります。各レーンは、個別MS / MSで分析します。表面積を増加させ、すべてのsquaを配置するために1ミリメートル×1ミリメートルの正方形の中に各レーンをカット低結合マイクロ遠心チューブにレーンからのres。全てのレーンのためにこれを繰り返します。 (1%酢酸を乾燥し、切断することが困難になってからゲルを防止するために使用することができます)。
    注:汚染を最小化することは、この段階で重要であるので、ゲルスライスを、ゲルを作るために使用されるガラスSDS-PAGEゲル上で金型生物学的安全キャビネットの中で行われます。
  2. 脱染色
    1. 各低結合管、近くにキャップ内に100mMの重炭酸アンモニウムの50μLを分注し、37℃で10分間インキュベートします。
    2. アセトニトリル、近いキャップの50μLを分注し、37℃で5分間インキュベートします。
    3. 吸引し、150μlのを捨てます。
    4. 繰り返しは6.2.1と6.2.2を繰り返します。
    5. 吸引し、95μLを破棄します。
  3. 脱水
    1. 50μlのアセトニトリル、近くにキャップを分注し、5分待ってください。吸引し、45μLを破棄し、10分待ってください。
  4. 削減
    1. 100 mMのAMMで希釈した50μlのDTT(10 mMのを、分注オニウム重炭酸塩)、近くにキャップし、37℃で30分を待ちます。
  5. アルキル化
    1. 50μlのヨードアセトアミド(100mMの重炭酸アンモニウムで希釈した55 mMの、)、近くにキャップを分注し、37℃で20分を待ちます。
    2. アセトニトリル、近いキャップの100μLを分注し、37℃で5分間インキュベートします。吸引し、195μ​​Lを破棄します。
  6. ウォッシュ
    1. 50μlの重炭酸アンモニウム、クローズキャップを分配し、37℃で10分間インキュベートします。
    2. アセトニトリル、近いキャップの50μLを分注し、37℃で5分間インキュベートします。吸引し、120μLを破棄します。
  7. 脱水
    1. 50μlのアセトニトリル、近くにキャップを分注し、5分待ってください。吸引し、45μLを破棄します。
    2. アセトニトリル50μLを分注し、5分待ってください。
    3. 吸引し、75μLを破棄し、5分待ってください。
  8. 消化
    1. 6 NG /μlのトリプシン(Uの25〜30μLを分注しntilすべてのゲル断片)が覆われています。閉じるキャップし、室温で30分待ちます。
    2. 37℃で一晩(4.5時間以上)インキュベートします。
    3. 室温で30分間座ってみましょう。
  9. 抽出およびペプチド転送
    1. 抽出溶液の30μLを分注し、氷上で30分間、蓋をカバーしています。
    2. 吸引し30μlの、新しいラベル低結合チューブで吸引量を分注します。
    3. (ゲルと)元の管に抽出溶液12μlのアセトニトリルの12μLを分注します。閉じるキャップと氷上で30分間インキュベートします。
    4. 吸引し、新しいチューブに15μlの預金。
    5. ステップ(6.9.3および6.9.4)を繰り返します。
  10. 乾燥するまでスピードバックで新しいチューブを置きます。
  11. 再懸濁溶液50μlで再懸濁します。再懸濁し、10分間培地上で渦。
  12. ナノナノ/ LCバイアルまたは適切な96ウェルプレートのいずれかにピペットペプチド溶液/ LCMS / MSの仕事。

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Representative Results

デモンストレーションとして、我々は、二つの表面から採取した海水サンプルとカナダ北部の沿岸海洋のクロロフィル最大でプロトコルを行いました。海で、海水の6-7 Lが3μmのGF / Dをプレフィルターに通したが、その後、微生物細胞は、ウォルシュ 20のプロトコルに従って、0.22μmのカートリッジフィルターユニットに収集しました。細胞はすぐにさらに処理されるまでRNA安定化溶液中で保存しました。それがここに提示されると研究室に戻ると、私たちはプロトコルを行いました。濃縮された細胞溶解物を分けました。 DNAは、ボリュームの残りの10%から沈殿させながら、タンパク質は、体積の90%から沈殿させました。我々は、タンパク質の24〜26μgのこれらのサンプルから高品質のDNAの250から308 ngの( 図1)を回収しました。ゲル内トリプシン消化とペプチド抽出した後、我々は、オービトラップエリに結合されたナノLCを用いてMS / MS分析に供したペプチドをテ質量分析計(サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国)。ペプチドから、我々はサンプルあたり23,000 MS / MSスペクトルを生成しました。ペプチドおよびタンパク質は、その後、ピークバイオインフォマティクスツール(BSI、ウォータールー、ON、カナダ)を使用してカスタムの社内配列データベースに対してこれらのスペクトルを検索することによって同定されました。データベースは、海洋参照ゲノムとmetagenomesからの予測タンパク質で構成されていました。検索は、約1,000のペプチドおよび各試料の700〜800のタンパク質が同定されました。当然のことながら、これらの結果は、微生物細胞の豊富さ、MS機器、およびタンパク質の検索データベースとアルゴリズムに依存しています。それにもかかわらず、これらの結果は、このプロトコルは、環境中のタンパク質の数百を同定するのに適した十分なトリプシンペプチドを産生する可能性を有することを示しています。メタゲノムライブラリーは、DNA 30のわずか100 ngのようにから構築することができるので、このプロトコルは、DNAの十分な量を提供する可能性を有しますマッチしたメタゲノム-metaproteomicデータセットを生成します。

metaproteomesの分類学的と機能性組成物は、BLASTpのとMEGAN(メタゲノムアナライザ)ソフトウェアパッケージ31,32の組み合わせを用いて分析しました 図2)。 アルファプロテオバクテリアに割り当てられたタンパク質は、最も高度のデータセットで表され、の大半はSAR11クレードに割り当てられていたました。 アルファプロテオバクテリアRhododobacteralesクレードも非常に表現され、地表水の中で最も頻繁に確認されました。 バクテロイデス門に割り当てられたタンパク質は、表面に均一とクロロフィル最大値の間に分布していたが、Flavobacteriaタンパク質がクロロフィル最大で大きな程度で同定された。 ガンマプロテオバクテリアのタンパク質は、均等に水柱全体に分散されたベータ-プロテオバクテリアのタンパク質が表面に主に発見された一方で。から機能的な観点は、代謝経路の広い範囲を同定しました。これらの代謝経路の垂直構造は明らかでした。例えば、アミノ酸代謝、炭水化物代謝および原核炭素固定経路に関連するタンパク質は、表面に主に同定された、及び窒素代謝は、表面でもっぱら見出されました。光合成に関与するタンパク質は、表面とクロロフィル最大の間で均等に同定された一方で、光合成、炭素固定タンパク質は、主にクロロフィル最大で観察されました。これらの結果は、微生物の分類群の多様性から、多種多様なタンパク質は、ここで提示されたプロトコルを用いて検出することができることを示しています。

図1
図1:北極駅S633で2深さからのゲノムDNAを最初のレーンは1 kbのDNAリットルの4μLを含んでいます加算器は、レーン2は、S633_2 mからのゲノムDNA抽出の3μLを含んで、レーン3はS633_20 mからのゲノムDNA抽出の3μLを含有し、レーン4-6(0.5μL(85 ngの)、2μL(333 NG)と4μLを含めますHindIIIでの667 ngの)ラムダDNAを消化しました。

図2
図2:北極駅S633北極駅633面とクロロフィル最大の海の分類学的多様性の比較(A)で2深さの分類学的と機能解析は MEGANを使用して作成しました。北極駅の機能的多様性の比較633面とクロロフィル最大の水(B)は 、KEGGデータベースに対してクエリを実行するMEGANを使用して作成した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

サンプル保存はmetaproteomic研究の鍵であると前作は、RNA安定化溶液は、前タンパク質抽出28に細胞を収納するのに便利記憶バッファであることを実証しました。理想的には、サンプルは33,34を取り扱い中のタンパク質発現の変化を打ち消すために、その場で保持されることになります。実際には、 その場でサンプリングし、固定技術が船配備楽器による自律的な収集とサンプルの保存を可能にする、開発されています。しかし、これらの技術へのアクセスは、常に現実的ではありません。そうでない一般的なケースでは、サンプルは採取後できるだけ早く保護されるべきです。

ここでは、一般的に水生微生物学で使用されたカートリッジフィルターユニット上に収集RNA安定化溶液格納されている細胞からタンパク質を抽出するためのプロトコルを提示します。プロトコルは、PRに続いて、SDS-溶解液および加熱を用いて細胞溶解を含みます必要に応じて脱塩工程として倍増超遠心フィルターユニットを使用してotein濃縮工程。これは、濃縮および脱塩ステップは見過ごすことができないことに注意しなければなりません。私たちは3バッファー交換ステップの最小値は、当社の濃縮物を脱塩するために必要とされたことがわかりました。適切な脱塩が行われない場合によるRNAの安定化溶液の高塩濃度に、あまりにも多くの塩は、一晩、タンパク質沈殿工程の間に沈殿され、脱塩及び沈殿工程を繰り返さなければなりません。淡水化が適切に行われていない場合はさらに、1D-PAGEが機能せず、サンプルが失われます。

タンパク質沈殿およびDNA沈殿の両方を行うことができるように、次に、濃縮した溶解物を分割しました。それはメタゲノムとmetaproteomicデータが同じサンプルから生成されることが望ましい場合が多いので、これは便利です。タンパク質は、タンパク質配列データベースに示されていない場合には、ペプチドは、意志特定されません。プロテオームデータがデータベースからその不在に起因するタンパク質を同定することができないリスクを低減するように、同じサンプルからのゲノムデータを含みます。

このプロトコルは、カートリッジフィルタユニットで使用するために最適化され、沿岸海洋微生物群集で動作するように検証されたが、それは、環境サンプル及び他のタイプのフィルタで使用するために適合させることができます。しかし、それは明らかに、このプロトコルの成功はバイオマスを開始するのに十分な量に依存することを記載すべき。したがって、バイオマスが非常に低いことがある水生生態系では、我々はそれに応じてろ過された水の量を増やすことをお勧めします。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterivex -GP 0.22 μm filter unit Millipore SVGP01050 Sampling
RNAlater Stabilization Solution Ambion AM7021 Sampling
Tris  Bio Basic 77-86-1 or TB0196-500G Protein Extraction/ SDS PAGE gel
DTT Sigma-Aldrich D0632-1G Protein Extraction
SDS Bio Basic 15-21-3 Protein Extraction/ SDS PAGE gel
EDTA Bio Basic 6381-92-6 Protein Extraction
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5 Protein Extraction
10K Amicon Filter Millipore UFC801024 Protein Extraction
Methanol Sigma-Aldrich 179337-4L Protein Precipitation
Acetone Fisher Scientific 67-64-1 Protein Precipitation
MPC Protein Precipitation reagent Epicenter mmP03750 DNA Precipitation
2-Propanol Fisher Scientific 67-63-0 DNA Precipitation
Qubit dsDNA BR Assay kit Life Technologies Q32850 DNA Quantification
Qubit Protein Assay kit Life Technologies Q33211 Protein Quantification
Sucrose Bio Basic 57-50-1 SDS PAGE gel
TEMED Bio Rad 161-0800 SDS PAGE gel
APS Bio Rad 161-0700 SDS PAGE gel
30% Acrylamide Bio Rad 161-0158 SDS PAGE gel
SimplyBlue SafeStain Invitrogen LC6060 SDS PAGE gel
Glycine Bio Rad 161-0718 SDS PAGE gel
B-mercaptoethanol Bio Basic 60-24-2 SDS PAGE gel
Laemmli Sample Buffer Bio Rad 161-0737 SDS PAGE gel
Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder Bio Rad 161-0375EDU SDS PAGE gel
Acetonitrile VWR CABDH6044-4 In-gel Trypsin digest
NH4HCO3 Bio Basic 1066-33-7 In-gel Trypsin digest
DTT Sigma-Aldrich D0632-1G In-gel Trypsin digest
Formic Acid Sigma-Aldrich F0507-500ML In-gel Trypsin digest
HPLC grade H2O Sigma-Aldrich 270733-4L In-gel Trypsin digest
Iodoacetamide Bio Basic 144-48-9 In-gel Trypsin digest
Trypsin Promega V5111 In-gel Trypsin digest
Protein LoBind Tube 1.5 ml Eppendorf 22431081 In-gel Trypsin digest
2 ml ROBO vial 9 mm Candian Life Science VT009/C395SB In-gel Trypsin digest
PP BM insert, No spring Candian Life Science 4025P-631 In-gel Trypsin digest

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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