Encapsulation alginate de cellules souches pluripotentes en utilisant une buse de co-axiale

1Center for International Research on Integrative Biomedical System, Institute of Industrial Science, The University of Tokyo
Developmental Biology

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Horiguchi, I., Sakai, Y. Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle. J. Vis. Exp. (101), e52835, doi:10.3791/52835 (2015).

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Abstract

Protocol

1. Matériaux Préparation

  1. Préparer tampon HEPES 10 mM. Ajuster le pH à 7,0 à température ambiante et ajouter du NaCl à 0,9%.
  2. Préparer la solution d'alginate à 5% et une solution 10 mM d'EDTA en mélangeant une solution saline tamponnée au HEPES préparé en 1.1. Ajuster le pH à 7,0 à température ambiante.
  3. Autoclave les réactifs (1.1, 1.2) pendant 20 min à 121 ° C.
  4. Préparer des plats 60 mm revêtues de gélatine en couches avec de 1,2 à 2,0 × 10 6 souris fibroblaste embryonnaire (MEF) des cellules, qui sont traités comme cellules nourricières par incubation à l'intérieur du DMEM contenant 10% de FBS ES-qualifiés, et 10 ug / ml de mitomycine C pendant 90 - 120 min.
  5. Maintenir la souris induit souches pluripotentes (iPS) cellules sur le plat avec les cellules nourricières en présence de 5 ml de DMEM riche en glucose contenant 20% d'ES qualifié FBS, 50 M de 2-mercaptoéthanol, acide aminé non essentiel, et des antibiotiques ( 100 unités / ml de pénicilline G sodique, 100 ug / ml de sulfate de streptomycine et 250 ng / ml de amphotericin B).
  6. Seed 4 × 10 5 cellules iPS sur une boîte de 60 mm revêtu de gélatine et les incuber à 37 ° C et 5% de CO 2. Changer le milieu de culture tous les jours pendant l'incubation. Après 3-4 jours de culture, les cellules trypsiniser pendant 1 min avec 500 pi de trypsine à 0,05% contenant 0,02% d'EDTA à 37 ° C et 5% de CO 2. Après cela, détacher les cellules en tapant sur la boîte de culture dix fois.
  7. Ajouter 2,5 ml de DMEM avec 10% de FBS et des antibiotiques ES-qualifié (après iPS dissociation de souris des cellules dans des cellules individuelles par pipetage avec 1000 ul micropipette trois fois) suspension de cellules de centrifugation à 160 g pendant 3 min et retirez surnageant et compter les cellules . Après le comptage des cellules, réensemencer les cellules recueillies sur un plat revêtu de gélatine et incuber pendant 30 min à isoler les cellules iPS à partir des cellules MEF. Après comptage des cellules (généralement de 1 - 3 × 10 6 cellules / boîte peut être recueillie), réensemencer 4 × 10 5 cellules iPS surle plat.

2. Encapsulation cellulaire dans Alginate hydrogel Capsules

  1. Recueillir les cellules par le même mode opératoire décrit dans 1.5 et 1.6. Après centrifugation à 160 x g pendant 3 min, laver le culot de cellules iPS avec une solution saline tamponnée au HEPES trois fois. Après remise en suspension des cellules dans une solution saline tamponnée de HEPES, filtrer la suspension de cellules à travers un tamis de 40 um de la cellule afin d'éliminer les gros agrégats, ce qui pourrait autrement obstruer la buse.
  2. Mélanger 2 ml de suspension de cellules au sein de la solution saline tamponnée de HEPES et 3 ml de solution à 5% Alg-Na. Enfin 5 ml de suspension cellulaire à moins de 3% de solution de Na-Alg est obtenu. La densité cellulaire est de préférence plus de 10 6 cellules / ml.
  3. Après avoir recueilli la suspension de cellules dans une seringue de 5 ml, installer une buse de co-axial (figure 1A, B) sur la seringue et les mettre sur la pompe à seringue. N 2 Emit écoulement de gaz (inférieure à 1 L / min) à travers l'aiguille extérieure de la buse de co-axial etexpulser la suspension de cellules à travers la buse intérieure.
  4. Recueillir gouttelettes dans 250 ml de solution à 0,5% de CaCl2 et attendez 10 - 20 min pour la gélification tout en agitant à 60-90 rpm.

3. Traitement des capsules d'alginate (facultatif)

  1. Incuber capsules Alg-Ca à 0,05% de poly-L-lysine (PLL) solution pendant 5 minutes à 37 ° C et 5% (p / v) de CO 2.
  2. Après lavage des capsules avec une solution saline tamponnée de HEPES, incuber dans du DMEM contenant 10% de FBS dans le but de neutraliser la charge électrique sur leur surface. Utiliser les capsules enrobées comme (figure 1c).
  3. Incuber les capsules dans une solution saline tamponnée au HEPES contenant 10 mM d'EDTA pendant 5 min. Les capsules traitées EDTA sont utilisés sous forme de capsules creuses (Figure 1C).

4. Culture et recueillir des cellules dans de l'alginate Capsules

  1. Incuber les cellules encapsulées à 75 tours par minute sous agitation à 37 ° C et 5% de CO 2pendant 10 jours.
  2. Recueillir et incuber les capsules dans 10 mM d'EDTA à 37 ° C et 5% de CO2 pendant 10 min. Recueillir les cellules des capsules d'alginate sans traitement PLL par centrifugation à 1 000 g pendant 3 min.
  3. Si les capsules d'alginate sont traités avec PLL, briser la membrane Alg-PLL par pipetage de haut en bas autour de dix fois avec une aiguille fixée à une seringue et centrifuger à 1,000 - 5,000 g pendant 5 min. diamètre de l'aiguille doit être inférieure à la taille de la capsule et G 25 (260 um) d'aiguilles sont utilisées dans cette expérience (600 um)
  4. Après centrifugation, recueillir culot cellulaire strictement cassés membranes Alg-PLL si vous voulez prélever des échantillons d'ARNm à partir de cellules. Restants membranes Alg-PLL éventuellement, de prévenir la purification de l'ARNm.

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Representative Results

Au protocole 2.5, la solution d'alginate expulsé forme une forme sphérique immédiatement après l'expulsion (Figure 2A - H). Si la suspension est expulsé avec une vitesse d'écoulement inférieure à 2 N 1L / min, la taille des gouttelettes est uniforme (figure 2I). Cependant, si le débit de N 2 est supérieur à 1 L / min, la gouttelette tombe en panne (figure 2G, repéré par une flèche blanche) et la taille des gouttelettes devient hétérogène (figure 2J). Compte tenu de cela, il est difficile de préparer des gouttelettes de taille inférieure à 500 um en utilisant cette méthode.

En processus de gélification (protocole 2.4), Alg-Na gouttelettes formées forme sphérique capsules Alg-Ca dans une solution de CaCl 2 si la concentration de Alg-Na (plus de 3%) est assez (Figure 3E-H, K, I). Cependant faible concentration de Alg-Na (inférieur à 3%) provoque non sphérique et la forme non lisse de capsules (figure 3A-D, I), quiavoir un problème dans le processus de revêtement. Même si la concentration Alg-Na ne suffit pas, capsules sphériques peuvent être formées en augmentant la concentration de CaCl 2 (figure 3J). Cependant, environ 50 mM de CaCl 2 est approprié pour l'encapsulation car trop forte concentration de CaCl 2 diminue la croissance et la viabilité cellulaire (données non présentées). Après avoir chuté en solution de CaCl 2, éventuellement vous pouvez attendre quelques minutes pour gélifiant mais nous recommandons ramasser des capsules de solution de CaCl 2 parce que trop longue période d'incubation dans le CaCl 2 affecte parfois la croissance cellulaire. Parfois, vous obtenez des capsules de forme non-sphériques, même si les concentrations sont assez. Cela est probablement dû laver culot cellulaire ne suffit pas avant la remise en suspension des cellules dans une solution Alg-Na. Réactifs résiduels tels que le sérum peut empêcher la gélification.

Cellules encapsulées peuvent se développer dans les capsules, mais les fuites cellulaire (indiquée par une flèche dans la figure4A) peut se produire dans des capsules sans revêtement Alg-PLL (figure 4A). Dans le cas des cellules iPS de souris, les cellules forment des agrégats en forme de disque dans chaque capsule Alg-Ca (figure 4B), tandis que les cellules agglutiner et forment des agrégats sphériques simples dans chaque capsule creuse (Figure 4C). Densité cellulaire initiale ne modifie pas la taille des agrégats dans des capsules, mais faible densité cellulaire (10 5 cellules / ml de gel) provoque l'échec de grandir (données non présentées). Ainsi, 10 6 cellules / ml de gel est souhaitable d'encapsuler.

Lors de la collecte des cellules à partir de capsules, Alg-Ca hydrogel peut être dissous avec lyase d'alginate ou chélatants réactifs, bien que le revêtement Alg-PLL est difficile à dissoudre avec des enzymes ou des produits chimiques. Alg-PLL doit donc être physiquement cassé avec pipetage, par exemple. Membranes brisés peuvent être dissociées des cellules par centrifugation.


Figure 1. Images de système d'encapsulation et de capsules. (A) une image du système d'encapsulation pour Alg-Ca encapsulation sur un banc propre. (B) de l'image schématique d'une buse de co-axial pour l'encapsulation. (C) Les trois types de capsules obtenues dans ce rapport différents. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Effet de N 2 Débit sur ​​la morphologie des capsules images en continu (A - H). Et l'apparence (I, J) de la formation de gouttelettes de solution à 3% Alg-Na à partir d'une buse de co-axial en N 2écouler à 1 L / min (A - D, I) et 2 L / min (E - H, J). Images continues ont été capturés par la caméra de salut-vitesse. Capsules d'hydrogel sont formés dans 0,5% de CaCl2. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Effet de Alg-Na et CaCl 2 Concentration sur la morphologie des capsules images en continu (A - H). Et l'apparence (I - L) de Na Alg-gélifiant dans les gouttelettes solution de CaCl 2. Dans images continues, des gouttelettes ayant une concentration différente de Alg-Na, 2% (A - D) et 3% (E - H), sont de gélification en mM CaCl 2 50 solution. Images continues sont capturés par salut-radar de vitesse. des images d'affichage d'afficher la différence morphologique des capsules Alg-Ca formés par différentes concentrations de Alg-Na, 2% (L, J) et 3% (K, L), et CaCl 2, 50 mM (L, K) et 500 mM (J, L). S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
. Figure 4. Morphologie des encapsulé souris iPS des agrégats de cellules dans les Capsules images de micrographie d'iPS cellules-agrégats cultivées pendant 4, 6, 8 et 10 jours (1 - respectivement 4) dans trois différents types de capsules: (A) nus, ( B) enduit, et (C) des capsules creuses. S'il vous plaît cliquer surici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

culture d'encapsulation peut être comparé à des cultures en suspension directe. Suspension de culture est un procédé plus simple d'obtenir de grandes quantités de cellules souches pluripotentes que les méthodes d'encapsulation. Toutefois, le contrôle de l'agrégation des cellules en culture en suspension est encore difficile. Dans le procédé d'encapsulation, l'agrégation cellulaire est limitée dans des capsules et peuvent donc être bien contrôlée. Une publication antérieure a montré que les cellules encapsulées formées agrégats de taille uniforme, tandis que les grands amas cellulaires sont apparus dans une culture libre-suspension 7. En outre, un rapport antérieur démontré que forte agitation provoque la mort cellulaire dans des cultures en suspension de cellules directs PS; nécessitant ainsi un taux d'agitation limitée. En revanche, l'encapsulation est capable de protéger les cellules de la contrainte de cisaillement, même dans des conditions de suspension. Le procédé d'encapsulation permet donc un niveau de souplesse dans les conditions de fonctionnement lors de la croissance des cellules en suspension.

ove_content "> encapsulation est un outil utile à la fois pour les cellules souches ainsi que la modification du processus de production de masse. L'encapsulation des cellules souches est utile dans la recherche de la niche de cellules souches, y compris les matrices et les facteurs de croissance extracellulaires. Certains chercheurs ont démontré que l'encapsulation de cellules ES de souris dans des hydrogels d'agarose VEGF conjugué promotion de la différenciation de cellules en cellules souches du sang 8.

Cet article montre comment encapsuler iPS de souris des cellules dans des capsules Alg-Ca taille contrôlée facilement en utilisant la buse de co-axial et N 2 flux. Bien qu'il existe un processus d'encapsulation avec divers outils tels que la pompe péristaltique 9 et 10 tension électrique, l'encapsulation en utilisant N 2 flux est une méthode plus simple et plus sûr que les autres méthodes. En outre, cette méthode est capable de former plus petit (approximativement plus grande que 600 um) capsules que la méthode de pompe péristaltique(Supérieure à environ 3 mm). Grandes capsules prennent plus de temps pour gélifier complètement et l'incubation de longue date dans le CaCl 2 affecte éventuellement caractéristiques cellulaires. En outre, de grandes capsules peut-être aussi ont un problème de transfert de masse des éléments nutritifs ou des déchets tels que le glucose et l'oxygène. Par conséquent, la taille des capsules formées par N 2 flux (600 -1000 um) est la taille idéale pour la culture de cellules à l'intérieur.

Cette méthode ne convient pas pour préparer de petites capsules et de contrôler précisément la taille. En raison de la répartition des gouttelettes, cette méthode ne convient pas pour préparer des capsules de taille inférieure à 500 um. En outre, l'observation visuelle ne peut déterminer la taille des capsules, donc il est difficile de contrôler la taille des capsules par ce procédé. Dans ce cas, l'utilisation de dispositifs microfluidiques peut éventuellement résoudre ces problèmes 11. Cependant, parfois, de bourrage au microdispositif parce gels Alg-Na immédiatement après avoir rencontré CaCl2 solution.

Bien que l'alginate ne convient pas à une modification chimique à cause de sa viscosité élevée, il est capable de former des capsules hybrides avec hydrogel, qui, comme le PEG, est également difficile à utiliser pour l'encapsulation. Une publication précédente a montré que l'encapsulation de cellules iPS de souris dans un PEG-Alg hybride capsule d'hydrogel de peptide RGD-conjugué amélioré la croissance cellulaire 12. Sans modification chimique, serait prévu l'encapsulation des cellules dans des capsules juste hydrogel de modifier la niche de cellules souches en conservant facteurs sécrétés. En effet, des recherches antérieures ont démontré que les facteurs de croissance sécrétés, retenus dans un microbioréacteur, étaient efficaces pour contrôler le destin des cellules souches 13,14.

La collection de cellules à partir de capsules est encore un problème non résolu concernant l'application de la méthode d'encapsulation à la production de masse de cellules souches pluripotentes. Un rapport précédent a montré que ce revêtement de PLL est nécessaire à kcellules iPS EEP souris à l'intérieur 7. Si capsules d'hydrogel Alg-Ca sont bien revêtues d'un polycation comme PLL (protocole 3.1 à 3.2), il sera difficile de briser les capsules soit par des réactifs enzymatiques ou chélateurs. Dans ce cas, un procédé mécanique, comme par l'aiguille de pipetage est nécessaire (protocole 4.3). Les cellules recueillies peuvent être isolés à partir de membranes cassées à centrifugation supérieure à 5000 × g, bien centrifugation pourrait éventuellement affecter la viabilité cellulaire en raison de la force G élevée. Ainsi, une technique d'enlever délicatement les débris de cellules ainsi que la rupture des capsules est important dans le développement de technologies d'encapsulation. Bien que certains développement est nécessaire pour appliquer cette méthode à la production de masse de cellules, l'encapsulation est une technique prometteuse pour la production de masse et de recherche en cellules souches.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse embryo fibroblast Cell Biolabs SNL 76/7
Mouse induced pluripotent stem cell RIKEN Bio resorce centre iPS-MEF-Ng-20D-17
DMEM high-glucose GIBCO 11995
ES qualified  FBS GIBCO 16141079
Antibacterial Antibiotics GIBCO 15240
Nonessential Amino Acid GIBCO 11140
2-mercaptoethanol GIBCO 21985-023
ESGRO Leukemia Inhibitory Factor Merck Millipore ESG1107
Trypsin/EDTA GIBCO 25300
26 G/16 G needle Hoshiseido
10 ml Syringe TERUMO SS-10ESZ
Sodium  Chloride Wako 191-01665
HEPES SIGMA H4034
Sodium Alginate Wako 194-09955
Calcium Chloride Wako 039-00475
Poly-L-lysine (MW = 15,000 - 30,000) SIGMA P7890
EDTA DOJINDO 345-01865
Sylinge pump AS ONE
Microscope Olympus IX71
Microscope Leica DM IRB
Hispeed camera nac image technology Memrecam HX-3

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References

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