Incapsulamento alginato di cellule staminali pluripotenti usando un ugello coassiale

1Center for International Research on Integrative Biomedical System, Institute of Industrial Science, The University of Tokyo
Developmental Biology

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Horiguchi, I., Sakai, Y. Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle. J. Vis. Exp. (101), e52835, doi:10.3791/52835 (2015).

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Abstract

Protocol

1. Materiali Preparazione

  1. Preparare 10 tampone HEPES mM. Portare il pH a 7,0 a RT e aggiungere NaCl allo 0,9%.
  2. Preparare la soluzione di alginato 5% e la soluzione di EDTA 10 mM mescolando salina tamponata HEPES preparato in 1.1. Portare il pH a 7,0 a RT.
  3. Autoclave i reagenti (1.1, 1.2) per 20 minuti a 121 ° C.
  4. Preparare 60 millimetri piatti di gelatina rivestite con strati 1,2-2,0 × 10 6 topo fibroblasti embrionali (MEF), le cellule, che sono trattati come cellule di alimentazione mediante incubazione all'interno DMEM contenente 10% FBS ES-qualificati e 10 mg / ml di mitomicina C per 90 - 120 min.
  5. Mantenere topo staminali pluripotenti indotte (iPS), le cellule sul piatto con le cellule di alimentazione in presenza di 5 ml di glucosio DMEM contenente il 20% di ES-qualificato FBS, 50 micron di 2-mercaptoetanolo, aminoacido non essenziale, e gli antibiotici ( 100 unità / ml di penicillina G sodio, 100 ug / ml di solfato di streptomicina, e 250 ng / ml di amphotericin B).
  6. Seed 4 × 10 5 cellule ips su 60 mm piatto gelatina rivestite e incubare a 37 ° C e 5% CO 2. Modificare il terreno di coltura ogni giorno durante l'incubazione. Dopo 3 - 4 giorni di coltura, trypsinize cellule per 1 min con 500 ml di 0,05% tripsina contenente 0,02% EDTA a 37 ° C e 5% CO 2. Dopo di che, staccare le cellule toccando il piatto cultura dieci volte.
  7. Aggiungere 2,5 ml di DMEM con 10% di FBS e antibiotici ES-qualificato (seguenti cellule iPS topo dissociazione in cellule singole pipettando con 1.000 microlitri micropipetta tre volte) sospensione cellulare centrifugare a 160 g per 3 minuti e rimuovere il surnatante e contare le cellule . Dopo il conteggio delle cellule, reseed le cellule raccolte su un piatto di gelatina a polvere e incubare per 30 minuti per isolare le cellule iPS dalle cellule MEF. Dopo il conteggio delle cellule (di solito 1-3 × 10 6 cellule / piatto può essere raccolto), reseed 4 × 10 5 cellule iPS suil piatto.

2. Cella incapsulamento in alginato Hydrogel Capsule

  1. Raccogliere le cellule con la stessa procedura descritta in 1.5 e 1.6. Dopo la centrifugazione a 160 g per 3 minuti, lavare il pellet di cellule iPS con soluzione salina HEPES-buffered tre volte. Dopo ri-sospensione le cellule in soluzione salina tamponata HEPES, filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro 40 micron cellula per rimuovere grandi aggregati, che potrebbero intasare l'ugello.
  2. Mescolare 2 ml di sospensione cellulare all'interno di soluzione salina tamponata HEPES e 3 ml di soluzione al 5% Alg-Na. Infine 5 ml di sospensione cellulare entro il 3% soluzione Alg-Na si ottiene. Densità cellulare è vantaggiosamente maggiore di 10 6 cellule / ml.
  3. Dopo aver raccolto la sospensione cellulare in una siringa da 5 ml, installare un ugello coassiale (Figura 1A, B) sulla siringa e disporli su pompa a siringa. Emit N 2 flusso di gas (inferiore 1L / min) attraverso l'ago esterna dell'ugello coassiali eespellere la sospensione cellulare attraverso l'ugello interno.
  4. Raccogliere gocce in 250 ml di soluzione allo 0,5% di CaCl 2 ed attendere 10 - 20 min per gelificazione mentre agitazione a 60-90 rpm.

3. Trattamento di alginato Capsule (opzionale)

  1. Incubare capsule Alg-Ca a 0,05% (w / v) di poli-L-lisina (PLL) soluzione per 5 min a 37 ° C e 5% CO 2.
  2. Dopo aver lavato le capsule con soluzione salina tamponata con HEPES-, incubare in DMEM contenente 10% FBS per neutralizzare la carica elettrica sulla loro superficie. Utilizzare loro sotto forma di capsule rivestite (Figura 1C).
  3. Incubare le capsule in soluzione salina tamponata HEPES contenente EDTA 10 mM per 5 min. Le capsule trattato con EDTA sono utilizzati sotto forma di capsule cavi (Figura 1C).

4. Cultura e raccogliere le cellule in alginato Capsule

  1. Incubare le cellule incapsulate a 75 rpm con agitazione a 37 ° C e 5% CO 2per 10 giorni.
  2. Raccogliere e incubare le capsule EDTA 10 mM a 37 ° C e 5% CO 2 per 10 min. Raccogliere le cellule dalle capsule alginato senza trattamento PLL per centrifugazione a 1000 g per 3 min.
  3. Se capsule di alginato sono trattati con PLL, rompere la membrana Alg-PLL pipettando su e giù intorno dieci volte con un ago attaccato ad una siringa e centrifugare a 1000 - 5000 xg per 5 min. Diametro ago deve essere inferiore formato di capsule e 25 g (260 micron) aghi sono utilizzati in questo esperimento (600 micron)
  4. Dopo la centrifugazione, raccogliere pellet cellulare rigorosamente da rotte membrane Alg-PLL, se si vuole raccogliere campioni di mRNA da cellule. Rimanenti membrane Alg-PLL eventualmente prevenire mRNA purificazione.

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Representative Results

Al protocollo 2.5, la soluzione di alginato espulso forma una forma sferica subito dopo l'espulsione (Figura 2A - H). Se la sospensione viene espulso con una portata N 2 inferiore 1L / min, la dimensione delle goccioline è uniforme (figura 2I). Tuttavia, se il flusso di N 2 è superiore a 1L / min, la goccia si rompe (figura 2G, a freccia bianca) e la dimensione delle goccioline diventa eterogenea (Figura 2J). Dato questo, è difficile preparare gocce più piccole di 500 micron con questo metodo.

Nel processo di gelificazione (protocollo 2.4), Alg-Na goccioline formato di forma sferica capsule Alg-Ca in CaCl soluzione 2 se la concentrazione di Alg-Na (oltre il 3%) è sufficiente (Figura 3E-H, K, I). Tuttavia bassa concentrazione di Alg-Na (inferiore al 3%) causa non sferica e forma non regolare di capsule (Figura 3A-D, I), cheavere un problema di processo di rivestimento. Anche se la concentrazione Alg-Na non è sufficiente, capsule sferiche possono essere formati aumentando CaCl 2 concentrazione (Figura 3J). Tuttavia, circa 50 mM di CaCl 2 è appropriata per l'incapsulamento perché troppo elevata concentrazione di CaCl 2 diminuisce la crescita cellulare e la vitalità (dati non mostrati). Dopo essere caduto in CaCl 2 soluzione, eventualmente è possibile attendere qualche minuto per gelificante ma si consiglia di raccogliere le capsule da CaCl 2 soluzione, perché troppo lungo di incubazione in CaCl 2 volte influisce sulla crescita cellulare. A volte si ottiene capsule forma non sferiche, anche se le concentrazioni sono abbastanza. Questo è probabilmente perché lavaggio pellet cellulare non è sufficiente prima di risospendere le cellule in soluzione Alg-Na. Reagenti residui quali siero eventualmente prevenire gelificazione.

Cellule incapsulate possono crescere nelle capsule, ma la perdita cellulare (freccia nella figura4A) può verificarsi in capsule senza rivestimento Alg-PLL (Figura 4A). Nel caso di cellule iPS topo, le cellule formano aggregati discoidali in ogni capsula Alg-Ca (Figura 4B), mentre le cellule si raggruppano e formano aggregati sferici singoli ciascuna capsula cavo (Figura 4C). Densità iniziale delle cellule non influisce sulle dimensioni degli aggregati in capsule ma bassa densità cellulare (10 5 cellule / ml-gel) causa l'errore di crescere (dati non mostrati). Così, 10 6 cellule / ml-gel è desiderabile per incapsulare.

Nella raccolta cellule da capsule, Alg-Ca idrogel può essere rimosso con liasi o chelanti reagenti alginato, anche se il rivestimento Alg-PLL è difficile da sciogliere con enzimi o prodotti chimici. Alg-PLL deve pertanto essere fisicamente rotto con pipettaggio, per esempio. Le membrane rotte possono essere dissociate dalle cellule per centrifugazione.


Figura 1. Immagini di Encapsulation Sistema e capsule. (A) L'immagine del sistema di incapsulamento per l'incapsulamento Alg-Ca su un banco pulito. (B) immagine schematica di un ugello coassiale per l'incapsulamento. (C) I tre diversi tipi di capsule ottenute in questo rapporto. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Effetto di N 2 flusso sulla morfologia delle capsule immagini continua (A - H). E l'aspetto (I, J) della formazione di goccioline di 3% di soluzione Alg-Na da un ugello coassiale in N 2scorrere a 1 L / min (A - D, I) e 2 L / min (E - H, J). Immagini continue sono state catturate dalla macchina fotografica ad alta velocità. Capsule di idrogel sono formate nello 0,5% CaCl 2. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Effetto di Alg-Na e CaCl 2 Concentrazione sulla morfologia delle capsule immagini continue (A - H). E l'aspetto (I - L) di Alg-Na goccioline gelificazione CaCl 2 soluzione. In immagini continue, goccioline aventi diversa concentrazione di Alg-Na, 2% (A - D) e il 3% (E - H), sono gelificante in 50 mM CaCl 2 soluzione. Immagini continue sono catturati da hifotocamera -speed. Aspetto immagini mostrano la differenza morfologica di capsule Alg-Ca formate da diverse concentrazioni di Alg-Na, 2% (L, J) e 3% (K, L), e CaCl 2, 50 mM (L, K) e 500 mM (J, L). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
. Figura 4. Morfologia Encapsulated topo iPS aggregati di cellule nelle capsule immagini al microscopio di cellule iPS-aggregati in coltura per 4, 6, 8 e 10 giorni (1-4 rispettivamente) in tre diversi tipi di capsule di: (A) nudo, ( B) rivestito, e (C) capsule vuote. Cliccatequi per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Cultura incapsulamento può essere confrontato con le culture diretti sospensione. Coltura in sospensione è un metodo semplice per ottenere grandi quantità di cellule staminali pluripotenti rispetto ai metodi di incapsulamento. Tuttavia, controllando l'aggregazione di cellule in coltura in sospensione è ancora impegnativo. Nel metodo di incapsulamento, aggregazione cellulare è limitata in capsule e può quindi essere ben controllata. Una pubblicazione precedente ha mostrato che le cellule incapsulate formano aggregati di dimensioni uniformi, mentre le grandi grumi di cellule apparivano in una cultura senza sospensione 7. Inoltre, una precedente relazione ha dimostrato che una forte agitazione provoca la morte cellulare in colture in sospensione diretta delle cellule PS; rendendo così necessario un tasso di agitazione limitata. Al contrario, l'incapsulamento è in grado di proteggere le cellule da sforzo di taglio anche in condizioni di sospensione. Il metodo di incapsulamento permette quindi un livello di flessibilità nelle condizioni operative quando cresce cellule in sospensione.

ove_content "> Encapsulation è uno strumento utile sia per la ricerca sulle cellule staminali e modifica del processo di produzione di massa. L'incapsulamento di cellule staminali è utile nella ricerca nicchia cellule staminali, anche i fattori di crescita e della matrice extracellulare. Alcuni ricercatori hanno dimostrato che l'incapsulamento di cellule ES di topo in idrogel agarosio VEGF coniugato promosso la differenziazione delle cellule in cellule progenitrici del sangue 8.

Questo articolo mostra come per incapsulare le cellule iPS topo in dimensioni controllato Alg-Ca capsule facilmente utilizzando ugello coassiale e N 2 flusso. Anche se ci sono alcuni processo di incapsulamento con vari strumenti quali la pompa peristaltica 9 e tensione elettrica 10, l'incapsulamento utilizzando N 2 flusso è un metodo più semplice e più sicuro rispetto ad altri metodi. Inoltre, questo metodo è in grado di formare più piccolo (circa maggiore di 600 micron) capsule che il metodo con pompa peristaltica(Circa più di 3 mm). Grandi capsule prendono più tempo per gelificazione completamente e l'incubazione lungo in CaCl 2 colpisce forse caratteristiche cellulari. Inoltre, grandi capsule eventualmente anche avere un problema di trasferimento di massa della sostanza nutriente o rifiuti come il glucosio e ossigeno. Pertanto, la dimensione di capsule formate da N 2 flow (600 -1000 micron) è la dimensione ideale per coltura cellulare all'interno.

Questo metodo non è adatto per preparare piccole capsule e controllare la dimensione preciso. A causa della ripartizione delle goccioline, questo metodo non è adatto per preparare capsule inferiori a 500 micron. Inoltre, solo l'osservazione visiva può determinare la dimensione delle capsule, quindi è difficile controllare la dimensione delle capsule con questo metodo. In questo caso, l'uso di dispositivi microfluidici eventualmente può risolvere questi problemi 11. Tuttavia, a volte l'intasamento si verifica in microdispositivi perché gel Alg-Na subito dopo l'incontro con CaCl 2 solution.

Sebbene alginato non è adatto per modificazione chimica a causa della sua elevata viscosità, è in grado di formare capsule ibridi con idrogel, che, come PEG, è anche difficile da utilizzare per l'incapsulamento. Una pubblicazione precedente ha mostrato che l'incapsulamento delle cellule iPS topo in un peptide coniugato RGD-PEG Alg idrogel ibrido capsula migliorato la crescita cellulare 12. Senza modificazione chimica, l'incapsulamento di celle in capsule appena idrogel sarebbe previsto per modificare la nicchia di cellule staminali mantenendo fattori secreti. In effetti, la ricerca precedente ha dimostrato che i fattori di crescita secreti, conservati in un microbioreactor, sono state efficaci nel controllare il destino delle cellule staminali 13,14.

La raccolta di cellule da capsule è ancora un problema irrisolto per quanto riguarda l'applicazione del metodo di incapsulamento per la produzione di massa di cellule staminali pluripotenti. Un rapporto precedente ha mostrato che tale rivestimento PLL è necessario kcellule eep topo iPS all'interno 7. Se Alg-Ca capsule idrogel sono ben rivestiti con un policatione come PLL (protocollo 3,1-3,2), sarà difficile per abbattere le capsule da una delle reagenti enzimatici o chelanti. In questo caso, un metodo meccanico come pipettaggio dall'ago è richiesto (protocollo 4.3). Le cellule raccolte possono essere isolate da membrane rotte a centrifugazione superiore a 5.000 × g, sebbene centrifugazione potrebbe avere effetti sulla vitalità cellulare a causa della forza G elevata. Così, una tecnica di rimozione delicatamente detriti dalle cellule così come la rottura delle capsule è importante nello sviluppo della tecnologia di incapsulamento. Anche se alcuni ulteriore sviluppo è tenuta ad applicare questo metodo per la produzione di massa di cellule, incapsulamento è una tecnica promettente sia per la produzione di massa e ricerca sulle cellule staminali.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse embryo fibroblast Cell Biolabs SNL 76/7
Mouse induced pluripotent stem cell RIKEN Bio resorce centre iPS-MEF-Ng-20D-17
DMEM high-glucose GIBCO 11995
ES qualified  FBS GIBCO 16141079
Antibacterial Antibiotics GIBCO 15240
Nonessential Amino Acid GIBCO 11140
2-mercaptoethanol GIBCO 21985-023
ESGRO Leukemia Inhibitory Factor Merck Millipore ESG1107
Trypsin/EDTA GIBCO 25300
26 G/16 G needle Hoshiseido
10 ml Syringe TERUMO SS-10ESZ
Sodium  Chloride Wako 191-01665
HEPES SIGMA H4034
Sodium Alginate Wako 194-09955
Calcium Chloride Wako 039-00475
Poly-L-lysine (MW = 15,000 - 30,000) SIGMA P7890
EDTA DOJINDO 345-01865
Sylinge pump AS ONE
Microscope Olympus IX71
Microscope Leica DM IRB
Hispeed camera nac image technology Memrecam HX-3

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References

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