डिजाइन और कृत्रिम बाह्य मैट्रिक्स का निर्माण (aECM) प्रोटीन से

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Low, P. S. J., Tjin, M. S., Fong, E. Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (100), e52845, doi:10.3791/52845 (2015).

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Abstract

Protocol

AECM प्रोटीन के लिए संयोजक प्लास्मिड एन्कोडिंग 1. क्लोनिंग

  1. कार्यात्मक डोमेन (उदाहरण के लिए, सेल बाध्यकारी डोमेन और इलास्टिन की तरह दोहराता) के अमीनो एसिड अनुक्रम डिज़ाइन करें। कार्यात्मक डोमेन के सिरों flanking डिजाइन प्रतिबंध साइटों उप क्लोनिंग सॉफ्टवेयर के निर्देशों के अनुसार मुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग (जैसे, http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/) की सुविधा के लिए। इधर, इरादा साइटों के लिए पाचन सीमित करने के लिए कार्यात्मक डोमेन में मौजूद नहीं हैं कि अद्वितीय प्रतिबंध साइटों का चयन करें। कई क्लोनिंग साइट होस्ट वेक्टर के (एमसीएस) में दिखाई देते हैं कि प्रतिबंध साइटों चुनें (जैसे, pET22b (+)) उप-क्लोनिंग के लिए।
  2. सॉफ्टवेयर के निर्देशों के अनुसार मुक्त वेबसाइटों का उपयोग न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम में अमीनो एसिड अनुक्रम का अनुवाद उल्टा। (जैसे, http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html)। सुनिश्चित करें codons के लिए अनुकूलित कर रहे हैं कोलाई होस्ट करता है।
  3. ब्याज की जीन purchas किया जा सकता हैएड व्यावसायिक रूप के रूप में एकल असहाय oligonucleotides और डीएनए annealing के प्रदर्शन (oligonucleotides के <100 आधार जोड़े (बीपी) अगर यानी,) (1.4 कदम देखें) लागत को कम करने के लिए। अन्यथा, 100 बीपी से बड़ा जीनों के लिए, वे वाणिज्यिक कंपनियों के माध्यम से खरीदा जा सकता है।
  4. Oligonucleotides के डीएनए में annealing
    1. वांछित जीन अनुक्रम प्राप्त करने के लिए डीएनए oligomers पानी रखना। 1 माइक्रोग्राम / μl के अंतिम एकाग्रता के लिए: (फ़िल्टर्ड 2-अमीनो-2- (hydroxymethyl) -propan-1,3-diol, पीएच 8.0, 10 मिमी Tris) एक डीएनए oligomer बफर में डीएनए oligonucleotides के भंग।
    2. कुल 40 μl मिश्रण प्राप्त करने के लिए डीएनए annealing के बफर के 32 μl (10 मिमी Tris, 100 मिमी NaCl और 100 एनएम 2 MgCl) के लिए प्रत्येक oligomer के 4 μl जोड़ें।
    3. एक hotplate का उपयोग करने के लिए पानी की एक बीकर उबाल लें और 5 मिनट, 95 डिग्री सेल्सियस के लिए मिश्रण को विसर्जित कर दिया। बीकर निकालें और धीरे-धीरे एक स्टायरोफोम बॉक्स हे / एन में स्थापित पूरे शांत करते हैं। oligomers annealed और पाचन के लिए तैयार कर रहे हैं।
    Annealed oligomers (यानी, डालने के रूप में करने के लिए कहा गया है) और मेजबान वेक्टर अलग से (यानी, pET22b (+)) को पचाने के लिए इसी प्रतिबंध एंजाइमों जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-4 घंटे के लिए निम्नलिखित नुस्खा (डीएनए के 1-2 माइक्रोग्राम, प्रत्येक प्रतिबंध एंजाइम के 2 μl, कुल 50 μl मिश्रण करने के लिए 10x प्रतिबंध एंजाइम बफर, और पानी के 5 μl) का प्रयोग करें।
    नोट: pET22b (+) प्लाज्मिड वेक्टर एम्पीसिलीन एंटीबायोटिक प्रतिरोधी है और सी टर्मिनस पर एक 6x-उनकी टैग शामिल है। PET22b (+) में मौजूद 6x-उनकी टैग चरण 7 में पश्चिमी सोख्ता के माध्यम से लक्ष्य प्रोटीन की पहचान के लिए उनकी टैग एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए हमें की अनुमति देता है।
  5. प्रत्येक पाचन मिश्रण करने के लिए 6x लोड हो रहा है डाई जोड़ें। अलग से 100 वी कल्पना एक यूवी प्रकाश प्रकाशक के साथ 1.2% डीएनए agarose जेल पर 1 घंटे के लिए एक यूवी फ्लोरोसेंट डीएनए दाग युक्त 1.2% डीएनए agarose जैल पर एक डीएनए सीढ़ी सहित पाचन मिश्रण चलाएँ।
  6. वाणिज्यिक जेल शुद्धि किट का उपयोग कर पचा डीएनए उत्पादों को निकालने के लिए जेल टुकड़ा। Elutई 50-100 एनजी / μl की एक न्यूनतम डीएनए एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए स्तंभ के लिए न्यूनतम मात्रा का उपयोग करते हुए।
  7. पचा डीएनए डालने ligating द्वारा ब्याज क्रमिक रूप से जीन का मिश्रण है (यानी, डीएनए annealing द्वारा प्राप्त elastin दोहराता है या सेल बंधन डोमेन) निम्नलिखित नुस्खा का उपयोग टी -4 ligase का उपयोग कर प्लाज्मिड वेक्टर में: (वेक्टर के 2 μl, टी -4 ligase का 1 μl, टी -4 बंधाव बफर, एक्स μl डालने की 1.5 μl, कुल 15 μl मिश्रण के लिए 10.5-एक्स μl पानी)। 2 घंटे के लिए आरटी पर बंधाव मिश्रण सेते हैं।
    नोट: सम्मिलित करने के लिए वेक्टर की दाढ़ एकाग्रता बंधाव दक्षता का अनुकूलन करने के लिए विविध किया जाना चाहिए। नुस्खा में एक्स के रूप में वर्णित डालने का आयतन कदम 1.7 से eluted डीएनए एकाग्रता पर निर्भर करता है।
  8. पिघलना ई कोलाई DH5α रासायनिक सक्षम कोशिकाओं (या किसी भी क्लोनिंग तनाव) बर्फ पर। गर्म 2xYT अगर प्लेट एम्पीसिलीन (25 माइक्रोग्राम / एमएल) युक्त (तालिका 1) 37 डिग्री सेल्सियस के लिए।
  9. का उपयोग कोशिकाओं रूपांतरणहीट शोक:
    1. विभाज्य साफ, पूर्व ठंडा सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूबों में सक्षम कोशिकाओं के 50 μl। पिपेट 5 μl कोशिकाओं में बंधाव मिश्रण की (100 पीजी एनजी से 100 के बीच), pipetting धीरे ऊपर और नीचे मिश्रण करने के लिए। 20 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण छोड़ दें।
    2. 2 मिनट के लिए एक 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेल मिश्रण युक्त सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब को विसर्जित कर दिया और 2 मिनट के लिए बर्फ पर लौट आए। कोशिकाओं को गर्मी नुकसान को कम करने के लिए विसर्जन अवधि का समय है।
    3. सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में समाज मीडिया (1 टेबल) के 500 μl जोड़ें और 1 घंटे के लिए झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    4. एम्पीसिलीन (25 माइक्रोग्राम / एमएल) युक्त, आरटी के लिए पूर्व गरम कर दिया गया है कि एक 2xYT अगर प्लेट पर सेल / बंधाव मिश्रण के 50 500 μl बिखरा हुआ है और प्लेटें 37 डिग्री सीओ पर ऊपर से नीचे सेते / एन (12-16 घंटा) ।
  10. अगले दिन, स्वच्छ पिपेट युक्तियों का उपयोग अगर थाली से डीएनए कालोनियों उठाओ। (तालिका 2YT मीडिया के 5 मिलीलीटर में कालोनियों बढ़ो1) युक्त एम्पीसिलीन (25 माइक्रोग्राम / एमएल) हे / एन) मिलाते (225 आरपीएम के साथ 37 डिग्री सीओ / एन (12-16 घंटा) पर।
  11. अगले दिन, निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार उठाया प्रत्येक कॉलोनी के लिए डीएनए plasmids निकालने के लिए एक प्लाज्मिड अलगाव किट का उपयोग करें। पानी की 50 μl के साथ डीएनए elute।
  12. 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते हैं, (5 μl डीएनए, प्रत्येक प्रतिबंध एंजाइम के 0.2 μl एक कुल 10 μl मिश्रण के लिए 1 μl 10x प्रतिबंध एंजाइम बफर और शीर्ष तक पानी): एक परीक्षण के बाद नुस्खा का उपयोग प्रतिबंध एंजाइमों के साथ पचाने सम्पन्न संभावना कदम 1.6 में के रूप में 1.2% डीएनए agarose जेल पर डालने और रन होते हैं कि कालोनियों के लिए स्क्रीन करने के लिए।
    नोट: पाचन होने पर, एक सफल बंधाव चाहिए दो बैंड, वेक्टर और उनके संबंधित आणविक भार के अनुरूप हैं जो डालने (चित्रा 1) के लिए एक-एक में परिणाम है।
  13. आगे T7 प्रमोटर का उपयोग डीएनए अनुक्रमण के लिए संभावना कालोनियों भेजें और वाणिज्यिक sequencers को प्राइमरों रिवर्स।

  1. अनुक्रमण परिणाम से, सफलतापूर्वक ligated किया गया है कि एक कॉलोनी का चयन करें और एक में परिवर्तन के लिए डीएनए प्लाज्मिड का उपयोग कोलाई अभिव्यक्ति मेजबान।
  2. पिघलना ई कोलाई अभिव्यक्ति तनाव बर्फ पर (BL21 (DE3) pLysS)। इस बीच, आरटी के लिए एम्पीसिलीन (25 माइक्रोग्राम / एमएल) और chloramphenicol (34 माइक्रोग्राम / एमएल) युक्त गर्म अगर प्लेटों।
    नोट: बैक्टीरिया में मौजूद pLysS प्लाज्मिड BL21 (DE3) pLysS एक chloramphenicol प्रतिरोध जीन होता तनाव। pLysS प्लाज्मिड रचनात्मक रूप aECM प्रोटीन की टपकाया अभिव्यक्ति सीमित करने के लिए व्यक्त की है जो एक T7 repressor जीन होता है। Chloramphenicol संस्कृति के दौरान pLysS जिसमें बैक्टीरिया की कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए आवश्यक है।
  3. दोहराएँ चरण 1.10 तब्दील प्राप्त करने के लिए कृत्रिम प्रोटीन व्यक्त करने के लिए तैयार कर रहे हैं कि कोलाई कोशिकाओं। Parafilm में अगर प्लेट लपेटें और 4 में ऊपर से नीचे की दुकान 6; अप करने के लिए एक महीने के लिए सी।

AECM प्रोटीन 3. बैक्टीरियल अभिव्यक्ति

  1. 2 चित्रा एक विंदुक टिप के साथ बदल अगर थाली से एक कॉलोनी उठाओ और बाँझ भयानक शोरबा (टीबी) मीडिया एक टेस्ट ट्यूब में एम्पीसिलीन और chloramphenicol एंटीबायोटिक दवाओं दोनों से युक्त (तालिका 1) के 10 मिलीलीटर में टीका लगाना का संदर्भ लें। 225 rpm पर झटकों के साथ 37 डिग्री सीओ / एन (12-16 घंटा) में इस स्टार्टर संस्कृति सेते हैं।
  2. स्थानांतरण एक 3 एल Erlenmeyer फ्लास्क में एक ही एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक 1 एल ताजा और बाँझ टीबी मीडिया में स्टार्टर संस्कृति के 10 मिलीलीटर। 2-3 घंटे के लिए 225 rpm पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति सेते हैं और संस्कृति (600 आयुध डिपो) की ऑप्टिकल घनत्व का निरीक्षण पढ़ने के लिए एक खाली क्युवेट में संस्कृति के 1 मिलीलीटर pipetting द्वारा 0.6-0.8 पर पहुंच गया। पूर्व एसडीएस पृष्ठ लक्षण वर्णन के लिए शामिल करने के लिए संस्कृति के 1 मिलीलीटर बचाओ।
    1. सेल संस्कृति के आयुध डिपो 600 मापने के लिए, एक क्युवेट में टीबी मीडिया के 1 शीशी को तैयारएक रिक्त माप के लिए। उधर, एक नया खाली क्युवेट में संस्कृति कुप्पी से संस्कृति के 1 मिलीलीटर हस्तांतरण। 600 एनएम के एक absorbance में रिक्त नियंत्रण के खिलाफ एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व को मापने।
    2. 2 मिनट के लिए 12,000 XG पर एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब, अपकेंद्रित्र में संस्कृति नमूना के 1 मिलीलीटर स्थानांतरित द्वारा (बाद में एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण के लिए) नमूना सहेजें, और सतह पर तैरनेवाला छानना।
  3. 1 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए isopropyl β-डी-1-thiogalactopyranoside (IPTG) के साथ संस्कृति प्रेरित और एक और 4 घंटे के लिए 225 rpm पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। एसडीएस पृष्ठ लक्षण वर्णन के लिए 4 घंटा में शामिल करने के अंत में संस्कृति के 1 मिलीलीटर बचाओ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 12,000 XG पर 1 एल सेंट्रीफ्यूज की बोतलें और सेंट्रीफ्यूज को संस्कृति के हस्तांतरण से कोशिकाओं फसल। ग्राम / मिलीलीटर 0.5 (पीएच = 8.0 1 एम Tris, 0.01 एम EDTA, 0.1 एम NaCl), सतह पर तैरनेवाला त्यागें दस बफर में सेल छर्रों और resuspend तौलना।

बैक्टीरियल संस्कृतियों 4. Lysis

  1. -80 डिग्री सीओ / एन पर फिर से निलंबित सेल संस्कृति रुक। कोशिकाओं lyse करने के लिए आरटी पर या बर्फ पर एक पानी के स्नान में जमे हुए सेल संस्कृति गला लें। विगलन, जबकि 10 माइक्रोग्राम / एमएल Deoxyribonuclease मैं (DNase मैं), 10 माइक्रोग्राम / एमएल Ribonuclease ए (RNase आई), और 50 माइक्रोग्राम / एमएल phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF) जोड़ें और धीमी गति से सरगर्मी के साथ समाधान homogenize।
  2. सभी resuspended कोशिकाओं thawed हैं, के बाद पानी 12 में प्रोटीन घुलनशीलता बढ़ाने के लिए पीएच 9.0 का हल समायोजित करें। एक समरूप स्थिरता प्राप्त करने के लिए बर्फ पर सरगर्मी के साथ बुद्धिमान 6 एन NaOH बूंद जोड़ें। एक 2 मिमी व्यास फ्लैट टिप, 5 सेकंड पल्स का उपयोग कर बर्फ पर 20 मिनट के लिए अल्ट्रासोनिक विघटन से Lyse।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 12,000 XG पर सेल समाधान अपकेंद्रित्र। बाद में शुद्धि के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक साफ, खाली बोतल और स्टोर करने के लिए सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण।
  4. इस बीच, -80 डिग्री सेल्सियस से कम दस बफर और फिर से फ्रीज के साथ फिर से सेल गोली resuspend। कोतीन बार करने के लिए पूरा सेल, दोहराने / फ्रीज पिघलना और sonication प्रक्रिया में तेजी। एसडीएस पृष्ठ लक्षण वर्णन के लिए 20 μl सेल lysate बचाओ।

उलटा संक्रमण साइकिलिंग का प्रयोग aECM प्रोटीन के 5. शुद्धीकरण

  1. कदम 4.3 से सेल lysate मिलान और elastin आधारित प्रोटीन 21 की शुद्धि के लिए प्रयोग किया जाता है कि इसी तरह आईटीसी, का उपयोग कर aECM प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए आगे बढ़ें। साइकिल 4 डिग्री सेल्सियस हैं जो अलग तापमान के साथ किया जाएगा और 37 डिग्री सेल्सियस ("ठंड" के रूप में करने के लिए कहा गया है) क्रमशः चक्र ("गर्म" के रूप में करने के लिए कहा गया है)।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 40,000 XG पर सेल 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र बोतलों में lysate, और अपकेंद्रित्र विभाजित। सेल गोली की शक्ल में गहरे भूरे रंग हो सकता है और बहने दिखना चाहिए।
  3. गोली से एक साफ जुदाई पाने के लिए pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला निकालें। साफ सेंट्रीफ्यूज की बोतलों में सतह पर तैरनेवाला लीजिए और (3 एम की एक अधिकतम करने के लिए) 1 मीटर की अंतिम एकाग्रता के लिए NaCl जोड़ें। गरम225 rpm पर झटकों के साथ 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस का हल।
    नोट: NaCl के अलावा aECM के कारण एकत्रीकरण के इलास्टिन घटक के संक्रमण ट्रिगर किया जाएगा। सतह पर तैरनेवाला परेशान हो जाएगा। प्रोटीन एकाग्रता काफी अधिक है, तो सफेद झागदार प्रोटीन अपकेंद्रित्र बोतल के पक्ष में देखा जा सकता है।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 40,000 XG पर 5.3 कदम से सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला छानना। एक धातु रंग का उपयोग कर गोली को कुचलने और एक चुंबकीय हलचल पट्टी और प्लेट का उपयोग कर 4 डिग्री सेल्सियस पर जोरदार सरगर्मी हे / एन के साथ ठंडा autoclaved आसुत जल में गोली बिट्स (50 मिलीग्राम / एमएल) resuspend। गोली पूरी तरह भंग कर दिया जाना चाहिए।
  5. दोहराएँ प्रोटीन के एक उच्च शुद्धता प्राप्त करने के लिए 5.2 एक और तीन से पांच बार के लिए 5.4 कदम।
  6. शुद्धि के अंतिम चक्र के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर आसुत जल के खिलाफ यह dialyzing द्वारा प्रोटीन समाधान फीका बनाना। पानी हर 4 में परिवर्तन के साथ 2-3 दिनों के लिए पानी के खिलाफ प्रोटीन समाधान Dialyzeमानव संसाधन या हे / N के लिए 8 घण्टे की। एसडीएस पृष्ठ के लिए शुद्ध प्रोटीन के 20 μl सहेजें और आगे उपयोग करें जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर शुद्ध प्रोटीन और दुकान के बाकी lyophilize।

एसडीएस पृष्ठ वैद्युतकणसंचलन का प्रयोग aECM प्रोटीन के 6. विशेषता

  1. (आणविक वजन बड़ी है, तो बेहतर जुदाई के लिए 8% एसडीएस पृष्ठ जैल का उपयोग करें) एक 12% एसडीएस पृष्ठ जेल तैयार करें। , प्रत्येक नमूने के लिए 2x एसडीएस लोड हो रहा है बफर जोड़ें गर्मी के नमूने 10 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर और चलाने के नमूने जेल पर 1 घंटे के लिए 100 वी पर या aECM प्रोटीन की आणविक वजन करने के लिए इसी प्रोटीन सीढ़ी के मध्य तक पहुँचता है जब तक जेल।
  2. सेट अप एसडीएस पृष्ठ से जेल निकालें और एक पेट्री डिश में 1 घंटे के लिए जेल डूब एक मात्रा के साथ Coomassie खूब ब्लू दाग (तालिका 2) जोड़ें। एक घुमाव पर 5 मिनट के लिए एक destaining समाधान (तालिका 2) में कुल्ला जेल। Destaining समाधान बदलें, और टी की पृष्ठभूमि तक का घोड़ा के साथ जेल destain करने के लिए जारीवह जेल स्पष्ट हो जाता है। प्रोटीन बैंड स्पष्ट रूप से दिखाई जानी चाहिए।
  3. लक्ष्य प्रोटीन की आणविक वजन का निर्धारण करने के लिए प्रोटीन की सीढ़ी के खिलाफ लक्ष्य प्रोटीन की स्थिति की तुलना करें।
  4. आगे लक्ष्य प्रोटीन की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए, चरण 7 में के रूप में पश्चिमी सोख्ता प्रदर्शन करते हैं।

पश्चिमी सोख्ता का प्रयोग aECM प्रोटीन के 7. विशेषता

  1. कोई धुंधला के साथ धारा 6 में के रूप में एक 12% एसडीएस पृष्ठ जेल पर नमूने चलाएँ।
  2. एसडीएस पृष्ठ जेल की तुलना में थोड़ा बड़ा आकार के लिए nitrocellulose झिल्ली कट। एक ही आकार के लिए फिल्टर पेपर के 4 टुकड़े काट लें।
  3. पश्चिमी स्थानांतरण बफर के साथ फिल्टर पेपर के गीले एक टुकड़ा (20% वी / वी मेथनॉल, 25 मिमी Tris, 190 मिमी ग्लाइसिन, पीएच 8.3), फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा द्वारा पीछा फिल्टर पेपर के शीर्ष पर एसडीएस पृष्ठ जेल, जगह , तो nitrocellulose झिल्ली और फिल्टर पेपर की एक अंतिम अन्य दो टुकड़े। सुनिश्चित करें कि पूरे सेट अप पर्याप्त पश्चिमी स्थानांतरण बफर के साथ डूबे हुए है।
    नोट: प्रोटीन से संपर्क करें पर झिल्ली के लिए बाध्य कर सकता है के रूप में जेल और झिल्ली समय के इस मोड़ पर संपर्क में नहीं होना चाहिए।
  4. Nitrocellulose झिल्ली के बाद पश्चिमी अर्ध-शुष्क हस्तांतरण इकाई, में दो फिल्टर कागजात रखकर nitrocellulose झिल्ली पर प्रोटीन स्थानांतरण, और ध्यान से भीतर और झिल्ली पर एसडीएस पृष्ठ जेल जगह है, अंत में पिछले दो गीला फिल्टर पेपर जगह एसडीएस पृष्ठ जेल। 45 एमए, 30 मिनट में पश्चिमी स्थानांतरण चलाएँ। वोल्टेज अधिक से अधिक 30 वी अगर बफर जोड़ें
    नोट: एक बेहतर प्रयास के साथ झिल्ली पर एसडीएस पृष्ठ जेल जगह है और प्रोटीन से संपर्क करें पर झिल्ली के लिए बाध्य कर सकता है के रूप में झिल्ली पर अनावश्यक रूप से जेल स्थानांतरण से बचें।
  5. निकालें और आरटी पर 2 घंटे के लिए (फिल्टर पेपर के साथ फ़िल्टर्ड पीबीएस 7.4 पीएच में 5% गैर वसा दूध) अवरुद्ध समाधान के साथ nitrocellulose झिल्ली ब्लॉक। बफर अवरुद्ध करने में निपटाने और कुल्ला करने के लिए पीबीएस जोड़ने।
    नोट: नए दस्ताने में बदलें अवांछित prote के साथ झिल्ली contaminating से बचने के लिएइन।
  6. 1 पर पीबीएस में कमजोर पड़ने के साथ प्राथमिक विरोधी उनकी एंटीबॉडी सेते हैं: 1,000 आरटी पर 1 घंटे के लिए कमाल के साथ। 1000 एंटीबॉडी के 1 μl (शेयर एकाग्रता: 1 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें: कमजोर पड़ने अनुपात 1 के साथ, उदाहरण के लिए, पूरे झिल्ली डूब सकता है एक मात्रा में एक मिश्रण तैयार 1 मिलीलीटर कुल मिश्रण के लिए 999 μl पीबीएस के लिए।
  7. (0.1% Tween20 साथ पीबीएस) PBST के 5 मिलीलीटर के साथ झिल्ली कुल्ला।
  8. 1 पर पीबीएस में कमजोर पड़ने के साथ घोड़े-मूली peroxidase (एचआरपी) संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं: 5,000 आरटी पर 1 घंटे के लिए कमाल के साथ। 5000 एंटीबॉडी के 1 μl (शेयर एकाग्रता: 1 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें: कमजोर पड़ने अनुपात 1 के साथ, उदाहरण के लिए, पूरे झिल्ली डूब सकता है एक मात्रा में एक मिश्रण तैयार एक 5 मिलीलीटर कुल मिश्रण के लिए 4,999 μl पीबीएस के लिए।
  9. PBST के 5 मिलीलीटर के साथ झिल्ली धो लें और दो बार दोहराएँ।
  10. झिल्ली को कवर किया और इस्तेमाल किया सब्सट्रेट के लिए निर्देशों का पालन करके सेते एक मात्रा के साथ झिल्ली को chemiluminescent सब्सट्रेट लागू करें।
    नोट: प्रोटीन का पता लगाने के लिए सब्सट्रेट की संवेदनशीलता अलग-अलग हो सकता है, हम संकेतों में वृद्धि नहीं करता एंटीबॉडी एकाग्रता बढ़ाने घटना में बहुत कम संकेतों के लिए अधिकतम संवेदनशीलता के साथ एक सब्सट्रेट सलाह देते हैं।
  11. एक सीसीडी कैमरा आधारित इमेजर का उपयोग कर chemiluminescent संकेतों पर कब्जा। संकेतों को कमजोर और गैर विशिष्ट हैं अगर प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के अनुपात को समायोजित करें। पृष्ठभूमि संकेत उच्च अगर अवरुद्ध समाधान में अब सेते हैं।

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Representative Results

इलास्टिन की तरह दोहराता युक्त संलयन प्रोटीन को डिजाइन करने में, यह एक समग्र इलास्टिन सामग्री, संलयन प्रोटीन 18 वर्ष की काफी बड़ी अंश बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। इस संलयन प्रोटीन का निर्माण शुद्धि के लिए आईटीसी का उपयोग करने के क्रम में अपने इलास्टिन की तरह विशेषताओं को बरकरार रखे हुए है कि यह सुनिश्चित करने के लिए है। aECM प्रोटीन डिजाइन और इस खंड में वर्णित दृश्यों विशेष रूप से Tjin एट अल। 14 से काम से लिया गया था। इस काम में, तीन aECM प्रोटीन सफलतापूर्वक pET22b (+) अभिव्यक्ति वेक्टर में क्लोन किया गया। अनुक्रमिक बंधाव पहले इलास्टिन दोहराता सेल बाध्यकारी डोमेन डालने से पीछा पीईटी वेक्टर, में डालने ligating के साथ शुरू हुआ। अंत में इलास्टिन दोहराता के अंतिम सेट में एक ही विधि का उपयोग कर सेल बाध्यकारी डोमेन के टर्मिनल अंत में डाला गया। पुनः संयोजक जीन सफलतापूर्वक निर्माण किया गया है, यदि सत्यापित करने के लिए, प्रत्येक पुनः संयोजक प्लाज्मिड परीक्षण 37 डिग्री पर 3 घंटे के लिए XhoI और साली के साथ पचा किया गया थासी चित्रा 1 परीक्षण पाचन के बाद डीएनए डालने और वेक्टर बैंड से पता चलता है। AECM प्रोटीन में से प्रत्येक के लिए, आवेषण के आकार क्लोनिंग वास्तव में सफल रहा था, पुष्टि है कि जीन के आकार के लिए corresponded। डीएनए अनुक्रमण के माध्यम से आगे सत्यापन भी परीक्षण पाचन परिणामों की पुष्टि की।

हम प्रत्येक aECM प्रोटीन में आईटीसी दी पर्याप्त इलास्टिन सामग्री वर्तमान के माध्यम से aECM प्रोटीन को शुद्ध करने में सक्षम थे। 2 समग्र शुद्धिकरण की प्रक्रिया के योजनाबद्ध पता चलता है। हे / एन संस्कृति एक ठेठ प्रारंभिक आयुध डिपो 0.01 के 600 के साथ 1 एल हिला फ्लास्क में inoculated किया गया था। संस्कृति 3-4 घंटे के बाद 0.6-0.8 के 600 आयुध डिपो की वृद्धि हुई। प्रोटीन अभिव्यक्ति IPTG की 1 मिमी का उपयोग करने के लिए प्रेरित किया गया था। 4 घंटे के बाद 1.5 की विशिष्ट आयुध डिपो हासिल की है। जीवाणु संस्कृति काटा और centrifugation के अधीन था। सतह पर तैरनेवाला खारिज कर दिया था और सेल गोली तौला गया। सेल गोली का औसत वजन के बारे में 3 जी / एल थासंस्कृति। गोली दस बफर में फिर से निलंबित कर दिया और -80 डिग्री सीओ / एन पर जम गया था।

/ फ्रीज पिघलना चक्र का एक श्रृंखला कोशिकाओं lyse करने के लिए इस्तेमाल किया गया। फ्रीज पिघलना कदम प्रफुल्लित और अंत में जमने की प्रक्रिया के दौरान गठित बर्फ क्रिस्टल की वजह से तोड़ने, हटना करने के लिए सेल का कारण बनता है। इसके बाद, DNase मैं और RNase मैं सभी डीएनए और आरएनए को पचाने के लिए सेल lysate के लिए जोड़ा गया था। PMSF भी प्रोटीन गिरावट को कम करने के लिए सेल lysate को जोड़ा गया है, जो एक protease अवरोध करनेवाला है। आगे पूरा सेल सुनिश्चित करने के लिए lysate आगे sonicated था, जबकि बर्फ पर रखा।

सेल lysate तो आईटीसी शुद्धि के 3 चक्र के अधीन था। 3 चक्र के अंत में, गर्म चक्र के अंत में गोली संगति में शहद मची और एक मामूली पीले रंग की थी। गोली पानी के साथ संपर्क पर पारदर्शी बदल गया, और आसानी से झटकों के साथ पूर्व ठंडा autoclaved पानी में भंग कर दिया। शुद्ध प्रोटीन किसी भी अवशिष्ट है दूर dialyzed हैAlt। अंतिम गर्म चक्र के अंत में प्राप्त प्रोटीन समाधान डायलिसिस टयूबिंग की एक छोटी लंबाई करने के लिए स्थानांतरित किया गया था (12 केडीए आणविक वजन के साथ काट दिया)। डायलिसिस के अंत में, प्रोटीन समाधान के लिए एक साफ 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए स्थानांतरित किया गया था और -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए। अगले दिन, स्थिर प्रोटीन समाधान पानी की सामग्री को हटाने के लिए lyophilized किया गया था। एक ठेठ ऊन की तरह उपस्थिति रही, 3 dialyzed प्रोटीन की एक छवि से पता चलता है।

प्रेरण एसडीएस पृष्ठ वैद्युतकणसंचलन द्वारा विश्लेषण किया गया बाद प्रोटीन अभिव्यक्ति वास्तव में प्रेरित किया गया था, तो यह निर्धारित करने के लिए, नमूने से पहले और एकत्र। इधर, 12% एसडीएस पृष्ठ जेल 20-150 केडीए की आणविक वजन के साथ प्रोटीन को अलग करने के लिए पर्याप्त था। आणविक वजन, यानी,> 100 केडीए, 8% एसडीएस पृष्ठ जैल बेहतर प्रोटीन अलग होने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है बड़ी है कि घटना में। 4 चित्रा प्रेरित एसए में भविष्यवाणी की आणविक वजन में एक गहन प्रोटीन बैंड से पता चलता हैmple (लेन) 2। शुद्धि शुरू होने से पहले आमतौर पर, एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण प्रोटीन अभिव्यक्ति के तुरंत बाद किया गया था। इसके बाद, नमूने हैं। यह भी लक्ष्य प्रोटीन के कुशल शुद्धि सुनिश्चित करने के लिए एसडीएस पृष्ठ वैद्युतकणसंचलन का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है शुद्धिकरण की प्रक्रिया के माध्यम से ले जाया 4 चित्रा भी 22 केडीए (4 लेन का एक आणविक वजन के साथ एक शुद्ध प्रोटीन नमूना युक्त एसडीएस पृष्ठ जेल से पता चलता है ), एलएन-5 aECM 14 करने के लिए इसी। aECM प्रोटीन की अनुमानित शुद्धता के बारे में 90% -95% थी; इस मान लक्ष्य प्रोटीन और एसडीएस जेल (चित्रा 4, 4 लेन) पर उपस्थित अन्य प्रोटीन बैंड के बैंड तीव्रता के अनुपात की तुलना द्वारा प्राप्त किया गया। शुद्ध प्रोटीन वास्तव में aECM प्रोटीन था अंत में, यदि निर्धारित करने के लिए, पश्चिमी सोख्ता प्रदर्शन किया था। बाद में, MALDI-TOF भी 5 चित्रा। सही रूप में शुद्ध सामग्री 14 की अशुद्धता सामग्री का निर्धारण किया वीं के प्रोटीन पवित्रता से पता चलता हैचित्रा 5 ए में एक एसडीएस पृष्ठ जेल के साथ और लक्ष्य प्रोटीन कर्नल-चतुर्थ aECM और एलएन-5 aECM, की उपस्थिति दिखा, चित्रा 5 ब में पश्चिमी सोख्ता के लिए nitrocellulose झिल्ली की एक छवि के खिलाफ तुलना करने के लिए ई तीन aECM प्रोटीन विरोधी का उपयोग कर में चिह्नित हॉर्स-मूली peroxidase (एचआरपी) के साथ संयुग्मित उनकी टैग एंटीबॉडी -6x। aECM प्रोटीन की अंतिम पैदावार 120 मिलीग्राम / एल से 60 मिलीग्राम / एल के बीच रहा।

चित्र 1
AECM प्रोटीन की चित्रा 1. डीएनए agarose जेल वैद्युतकणसंचलन। डीएनए प्रतिबंध के माध्यम से constructs सत्यापन अंतिम aECM प्रोटीन के पाचन 1.2% डीएनए agarose जेल पर दौड़ा एंजाइमों। AECM प्रोटीन से प्रत्येक के लिए एन्कोडिंग संयोजक प्लास्मिड डबल 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए XhoI और साली के साथ पचा गया आवेषण के आकार प्रत्येक aECM प्रोटीन जीन के आकार के अनुरूप (FN910: 1.8KBP, कर्नल-चतुर्थ: 696 बीपी, एलएन-5: 699 बीपी) और इस्तेमाल वेक्टर के आकार pET22b (+) 5.5 KBP है।

चित्र 2
AECM प्रोटीन की प्रोटीन अभिव्यक्ति, सेल और शुद्धि के लिए चित्रा 2. योजनाबद्ध प्रवाह। पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए बुनियादी गाइड, छोटे संस्कृति के लिए एक ही कॉलोनी की टीका से शुरू करने और 1 एल कोशिकाओं की संस्कृति, कटाई और resuspending ऊपर पैमाने पर, प्रोटीन सेल द्वारा पीछा किया। प्रोटीन शुद्धि कृत्रिम ईसीएम प्रोटीन में मौजूद इलास्टिन-जैसे डोमेन के LCST व्यवहार का उपयोग करके किया गया। aECM प्रोटीन आईटीसी के माध्यम से शुद्ध कर रहे हैं। एकाधिक ठंडे और गर्म चक्र लक्ष्य प्रोटीन का एक उच्च शुद्धता को प्राप्त करने के लिए प्रदर्शन किया गया। अंत में, लक्ष्य प्रोटीन पानी के साथ dialyzed और आगे उपयोग करें जब तक lyophilized गया। = रातोंरात "हे / n"। "एस / एन" = सतह पर तैरनेवाला।


उलटा संक्रमण साइकल चलाना। Lyophilized LN5-aECM द्वारा शुद्ध lyophilized aECM प्रोटीन की चित्रा 3. छवि एक ऊन की तरह प्रकट किया है।

चित्रा 4
AECM प्रोटीन (एल एन-5 aECM) चित्रा 4 एसडीएस पृष्ठ जेल वैद्युतकणसंचलन। लेन 1 और 2 के पहले और प्रोटीन प्रेरण के बाद संस्कृति को दर्शाता है। 22 केडीए के पास एक मोटी बैंड की उपस्थिति एलएन-5 aECM सफलतापूर्वक व्यक्त की गई थी कि पता चलता है। 4 लेन आईटीसी के 3 चक्र के बाद शुद्ध एलएन-5 aECM प्रोटीन से पता चलता है, जबकि 3 लेन पूर्ण सेल lysate से पता चलता है।

चित्रा 5
AECM प्रोटीन की चित्रा 5 (ए) एसडीएस पृष्ठ जेल। (बी) के कर्नल के लिए उनका टैग 6x के लिए जांच पश्चिमी धब्बा-IV और एलएन-5 aECM प्रोटीन। दोनों कर्नल-चतुर्थ और एलएन-5 aECM प्रोटीन सी टर्मिनस 6xHis टैग होते हैं। शुद्ध प्रोटीन में मौजूद 6x उनकी टैग का प्रतिनिधित्व नमूना कर्नल-चतुर्थ aECM के लिए नमूना एलएन-5 aECM और 24 केडीए के लिए 22 केडीए में भविष्यवाणी की आणविक वजन में मनाया सकारात्मक chemiluminescence।

<टीडी राउस्पान = "9"> 2xYT मीडिया
मीडिया / एल अवयव और निर्देश
समाज मीडिया 20 ग्राम Tryptone
5 ग्राम खमीर निकालने
0.6 ग्राम सोडियम क्लोराइड
0.2 ग्राम KCl
940 मिलीलीटर पानी में जोड़ें और आटोक्लेव,
फिर बाँझ (फिल्टर निष्फल) जोड़ने
10 एमएल 1 एम 2 MgCl
10 एमएल 1 एम MgSO 4
40 एमएल 20% ग्लूकोज
16 जी Tryptone
10 ग्राम खमीर निकालने
5 ग्राम सोडियम क्लोराइड
15 ग्राम Bacto अग्रवाल (केवल अगर प्लेट के लिए इसके अलावा)
पानी में भंग और 1 एल और आटोक्लेव करने के लिए ऊपर।
55 शांत करने के लिए अगर प्लेट तैयार करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के अलावा पहले सी °।
पेट्री डिश में डालने का कार्य करने के लिए अच्छी तरह से पहले से मिलाएं।
अगर जम जाता है जब तक प्लेटों शांत।
Parafilm में प्लेटें लपेटें और 4 में ऊपर से नीचे की दुकान सी।
बहुत खूब शोरबा (टीबी) 12 ग्राम Tryptone
24 छ खमीर निकालने
4 मिलीलीटर ग्लिसरॉल
700 मिलीलीटर पानी और आटोक्लेव में भंग।
16.42 छ कश्मीर 2 HPO 4(मर्क)
2.31 छ के.एच. 2 पीओ 4 (मर्क)
यह सुनिश्चित करने के लिए, 300 मिलीलीटर पानी में भंग और अलग से आटोक्लेव लवण पूरी तरह से भंग कर रहे हैं।
ठंडा करने के बाद मध्यम और नमक दोनों का मिश्रण है।

टेबल के लिए समाज मीडिया, 2xYT मीडिया / अगर और भयानक शोरबा। मीडिया के लिए 1. व्यंजनों कोलाई संस्कृति आणविक क्लोनिंग और प्रोटीन अभिव्यक्ति में इस्तेमाल किया।

समाधान / एल अवयव और निर्देश
Coomassie खूब ब्लू दाग 0.25 छ Coomassie blueR250
100 मिलीलीटर हिमनदों एसिटिक एसिड
450 मिलीलीटर मिथाइल अल्कोहल
450 मिलीलीटर पानी
100 मिलीलीटर हिमनदों एसिटिक एसिड
400 मिलीलीटर मिथाइल अल्कोहल
500 मिलीलीटर पानी

टेबल दाग के समाधान के लिए और एसडीएस पृष्ठ जेल destain 2. व्यंजनों। धुंधला हो जाना और एसडीएस पृष्ठ का उपयोग लक्षण वर्णन के लिए एक destaining समाधान के लिए Coomassie खूब ब्लू R250।

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Discussion

पुनः संयोजक प्रोटीन इंजीनियरिंग एक नीचे अप दृष्टिकोण का उपयोग उपन्यास प्रोटीन सामग्री बनाने के लिए एक बहुमुखी तकनीक है। प्रोटीन आधारित सामग्री हित के आवेदन के अनुसार, कई functionalities है डिज़ाइन आधार पर किया जा सकता है। कारण क्लोनिंग और प्रोटीन अभिव्यक्ति टेक्नोलॉजीज में वृद्धि हो रही प्रगति के लिए, यह एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और स्केलेबल ढंग से कृत्रिम प्रोटीन की एक किस्म बनाने के लिए अपेक्षाकृत आसान है (और लागत प्रभावी) बन गया है। इलास्टिन-जैसे डोमेन एक शुद्धि टैग के रूप में सेवा करने के लिए, साथ ही साथ यांत्रिक गुणों प्रदान करने के लिए, कृत्रिम प्रोटीन की एक संख्या में शामिल किया गया है। एक इलास्टिन-तरह के अनुक्रम में होते हैं कि कृत्रिम प्रोटीन आसानी से महंगा शुद्धि कॉलम और एंटीबॉडी के लिए की आवश्यकता समाप्त जो आईटीसी, का उपयोग कर शुद्ध किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल aECM प्रोटीन के लिए एन्कोडिंग पुनः संयोजक प्लास्मिड निर्माण कदम का वर्णन है। इलास्टिन की तरह दोहराता के लिए कूटबद्ध करने वाले जीन खरीदे गए थे। के लिएpolypeptides तरह elastin जैसे अत्यधिक दोहराए पेप्टाइड अनुक्रम, यह पुनरावर्ती दिशात्मक बंधाव (RDL) रणनीतियों 22 का इस्तेमाल किया जा सकता है कि इस तरह की क्लोनिंग की रणनीति डिजाइन करने के लिए सिफारिश की है। RDL का उपयोग करके, एक विशिष्ट श्रृंखला लंबाई के साथ दोहराए polypeptides संश्लेषित किया जा सकता है और इसलिए ब्याज की जीन कम मोनोमर्स के रूप में खरीदा जा सकता है।

दोनों केंद्रीय सेल बाध्यकारी डोमेन के मॉड्यूलर अदला-बदली की अनुमति देने के सिरों पर हमारे काम में, सेल बाध्यकारी डोमेन के flanking NheI प्रतिबंध साइटों को शामिल करने के लिए डिजाइन किए गए थे। यह अद्वितीय हैं और कार्यात्मक डोमेन में मौजूद या कहीं और मेजबान वेक्टर के कई क्लोनिंग साइट (एमसीएस) के बाहर नहीं कर रहे हैं कि प्रतिबंध साइटों का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह इरादा साइटों पर डालने या वेक्टर के पाचन सीमित करने के लिए है। कुछ मामलों में, यह पूर्व कार्यात्मक डोमेन की प्रविष्टि को उत्परिवर्तजनन का उपयोग करते हुए मेजबान वेक्टर में नए प्रतिबंध साइटों को पेश करने के लिए आवश्यक हो सकता है।

हमारीक्लोनिंग रणनीति हमें आसानी से aECM प्रोटीन के तीन वेरिएंट प्राप्त करने के लिए केंद्रीय सेल बाध्यकारी डोमेन को बदलने की अनुमति दी। हम यह भी एक लाइसिन अवशेषों डालने शुरू कर Methionine अधिक से अधिक 10 गुना से प्रोटीन उपज में वृद्धि हुई के बाद उस पर गौर किया। प्रोटीन उपज में इस नाटकीय वृद्धि अंतिम प्रोटीन उपज 60 मिलीग्राम / एल से 5 मिलीग्राम / एल से बढ़ाकर जहां एलएन-5 aECM प्रोटीन, के साथ सबसे अधिक स्पष्ट किया गया था।

विभिन्न ई कोलाई अभिव्यक्ति मेजबान टीम BL21 (DE3) pLysS तुलना में थे, और कोलाई तनाव सबसे अच्छा प्रोटीन की पैदावार दे दी है। प्रोटीन अभिव्यक्ति अब से 4 घंटे के लिए IPTG साथ प्रेरित किया गया था जब प्रोटीन उपज में सुधार कम से कम था। 1 मिमी से अधिक IPTG सांद्रता में प्रोटीन अभिव्यक्ति में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। करीब 0.6 ओवर ड्राफ्ट पर प्रेरित हालांकि, जब प्रोटीन अभिव्यक्ति सबसे ज्यादा था।

आईटीसी का उपयोग कर aECM प्रोटीन की प्रभावी वसूली के लिए, यह सेंट्रीफ्यूज उपकरण का तापमान नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है। परीक्षा के लिएमिसाल, शुद्धि चरणों के सबसे aECM प्रोटीन की अधिक से अधिक घुलनशीलता सुनिश्चित करने के लिए एक ठंडे कमरे (4 डिग्री सेल्सियस) में प्रदर्शन किया गया। यह भी आवश्यक हो सकता है (4 डिग्री सेल्सियस) के लिए पूर्व ठंडा करने के लिए अपकेंद्रित्र रोटर हे / एन से पहले ठंड चक्र करने के लिए। इसी तरह, अपकेंद्रित्र रोटर प्रोटीन समाधान का तापमान अपने टी टी से ऊपर बनाए रखा गया था कि यह सुनिश्चित करने के लिए गर्म चक्र करने से पहले (37 डिग्री सेल्सियस) के लिए पूर्व गर्म था।

सारांश में, प्रक्रियाओं डिजाइन करने के लिए और कृत्रिम ईसीएम प्रोटीन एन्कोडिंग क्लोन पुनः संयोजक प्लास्मिड वर्णित हैं। विशेष रूप से, आईटीसी का उपयोग कर aECM प्रोटीन की अभिव्यक्ति और शुद्धि रेखांकित कर रहे हैं। अंत में, एसडीएस पृष्ठ वैद्युतकणसंचलन और पश्चिमी सोख्ता का उपयोग कर aECM प्रोटीन के लक्षण वर्णन वर्णित किया गया।

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।

Acknowledgments

लेखकों के शिक्षा मंत्रालय AcRF टीयर 1 (RG41) से धन स्वीकार करते हैं और नानयांग प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालय से अनुदान शुरू करने के लिए करना चाहते हैं। नीची और Tjin नानयांग प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालय, सिंगापुर से शोध छात्र छात्रवृत्ति (आरएसएस) द्वारा वित्त पोषित कर रहे हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET22b (+) Novagen 69744 T7 expression vectors with resistance to ampicillin 
BL21(DE3)pLysS  Invitrogen C6060-03 additional antibiotics - chloramphenicol
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) Gold Biotechnology I2481C 1 M stock solution with autoclaved water, make fresh prior to induction.
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 plasmid isolation kit
T4 ligase New England Biolabs M0202S
Ampicillin Affymetrix 11259
Chloramphenicol Affymetrix 23660
Zymoclean™ gel DNA recovery kit Zymo Research D4001
XL10-gold strain Agilent Technologies 200315

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References

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