Проектирование и строительство искусственного внеклеточного матрикса (aECM) Белки

JoVE Journal
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Low, P. S. J., Tjin, M. S., Fong, E. Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (100), e52845, doi:10.3791/52845 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Клонирование рекомбинантных плазмид, кодирующих белки aECM

  1. Дизайн аминокислотную последовательность функционального домена (например, клеток-связывающий домен и эластин-подобных повторов). Ограничение Дизайн сайтов фланговые концы функциональных областей, чтобы облегчить к югу от клонирования с помощью бесплатного программного обеспечения в соответствии с инструкциями программного обеспечения (например, http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). Здесь выбирать уникальные сайты рестрикции, которых нет в функциональном домене ограничить пищеварение, предназначенных для сайтов. Выберите сайты рестрикции, которые появляются в сайт множественного клонирования (MCS) принимающей вектора (например, pET22b (+)) к югу от клонирования.
  2. Обратный перевод последовательность аминокислот в последовательности нуклеотидов с использованием бесплатные сайты в соответствии с инструкциями программного обеспечения. (Например, http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). Обеспечить кодоны оптимизированы для E. палочки хозяева.
  3. Джин интерес может быть контрактаред коммерчески как одноцепочечные олигонуклеотиды (т.е., если олигонуклеотиды <100 пар оснований (п.о.)) и выполнить отжиг ДНК (см шаг 1,4), чтобы уменьшить стоимость. В противном случае, для генов больше, чем 100 б.п., они могут быть приобретены через коммерческие компании.
  4. ДНК отжига олигонуклеотидов
    1. Отжиг олигомеры ДНК с получением желаемого последовательность гена. Растворите ДНК-олигонуклеотидов в буфере олигомера ДНК (10 мМ Трис-2-амино-2- (гидроксиметил) пропан-1,3-диол, рН 8,0, фильтруют) до конечной концентрации 1 мкг / мкл.
    2. Добавить 4 мкл каждого олигомера с 32 мкл буфера для отжига ДНК (10 мМ Трис, 100 мМ NaCl и 100 нм MgCl 2) для достижения общей 40 мкл смеси.
    3. Отварить стакан воды, используя конфорку и погрузиться смесь в течение 5 мин, 95 ° С. Снимите стакан и постепенно охладить весь набор в пенопластовый ящик O / N. Олигомеры были отжигают и готовы для пищеварения.
    Добавить соответствующие ферменты рестрикции, чтобы переварить Отожженном олигомеры (т.е., называют вставкой) и хост-вектор (т.е., pET22b (+)) отдельно. Используйте следующий рецепт (1-2 мкг ДНК, 2 мкл каждого фермента рестрикции, 5 мкл 10x фермента рестрикции буфера, и вода до 50 мкл общего смеси) для 3-4 ч при 37 ° С.
    Примечание: pET22b (+) плазмидный вектор является ампициллина устойчивыми к антибиотикам, и содержит 6x-His метку в С-конце. 6x-тег Его присутствует в pET22b (+) позволяет использовать его с метками антител для выявления белка-мишени с помощью вестерн-блоттинга в шаге 7.
  5. Добавить 6x красителем каждой обрабатываемой смеси. Запуск переваривания смеси отдельно в том числе лестницы ДНК на 1,2% агарозном геле, содержащем ДНК УФ-флуоресцентным красителем ДНК в течение 1 ч при 100 В. визуализировать 1,2% агарозном геле ДНК с УФ осветитель.
  6. Нарежьте гель для извлечения переваривается продукты ДНК, используя коммерческий гель наборы очистки. Elutе с использованием минимального объема для столбца для достижения минимальной концентрации ДНК 50-100 нг / мкл.
  7. Смешайте интерес ген последовательно путем лигирования вставки расщепленной ДНК (т.е., эластин или клеточные повторы связывающие домены, полученные путем отжига ДНК) в плазмидный вектор с использованием лигазы Т4 с использованием следующей рецепт: (2 мкл вектора, 1 мкл Т4-лигазы, 1,5 мкл буфера для лигирования Т4, X мкл вставки, 10,5 х мкл воды в течение всего 15 мкл смеси). Инкубируйте лигирования смеси при комнатной температуре в течение 2 ч.
    Примечание: молярная концентрация вектора вставки должны быть изменены, чтобы оптимизировать эффективность лигирования. Объем вставки описывается как х в рецепте зависит от концентрации элюированного ДНК из стадии 1.7.
  8. Оттепель Е. палочка DH5 & химически компетентные клетки (или любой клонирование деформации) на льду. Теплый агаром 2xYT (Таблица 1), содержащей ампициллин (25 мкг / мл) до 37 ° С.
  9. Трансформации клеток, используятеплового шока:
    1. Аликвоты 50 мкл компетентных клеток в чистую, предварительно охлажденной микро-центрифужные пробирки. Пипетка 5 мкл (от 100 пг до 100 нг) смеси лигировани в клетки, пипетки осторожно вверх и вниз, чтобы перемешать. Оставьте смесь на льду в течение 20 мин.
    2. Опустить микро-центрифужной пробирки, содержащей смесь клеток в водяной бане при 42 ° С в течение 2 мин и возвращается на льду в течение 2 мин. Время продолжительности погружения, чтобы минимизировать ущерб тепла в клетках.
    3. Добавить 500 мкл SOC информации (таблица 1) в микро-центрифужную пробирку и инкубируют при 37 ° С при встряхивании в течение 1 ч.
    4. Распространение 50 500 мкл клеток / лигирования смеси на чашку с агаром 2xYT, который был предварительно нагревают до комнатной температуры, содержащей ампициллин (25 мкг / мл) и инкубируют пластины вверх-вниз при температуре 37 ° CO / N (12-16 ч) ,
  10. На следующий день, забрать колонии ДНК из агар пластины с использованием чистых наконечников. Выращивают колонии в 5 мл 2 х УТ среды (табл1), содержащей ампициллин (25 мкг / мл) O / N при 37 ° CO / N (12-16 ч) при встряхивании (225 оборотов в минуту).
  11. На следующий день использовать набор для выделения плазмидной для извлечения плазмиды ДНК каждой колонии выбрал в соответствии с протоколом производителя. Элюции ДНК с 50 мкл воды.
  12. Выполнение испытаний переварить с помощью ферментов рестрикции следующий рецепт: (5 мкл ДНК, 0,2 мкл каждого фермента рестрикции, 1 мкл 10х буфера ограничение фермента и долить воды на общую 10 мкл смеси), инкубируют в течение 2 ч при 37 ° С для экрана для колоний, которые, вероятно, содержат вставку и работать на 1.2% агарозном геле ДНК, как в шаге 1.6.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При пищеварения, успешно перевязки должны Результаты в двух диапазонах, по одному для вектора и вставки, которые соответствуют их соответствующей молекулярной массой (рис 1).
  13. Отправить вероятные колонии для секвенирования ДНК с использованием Т7 промотор прямого и обратного праймеров для коммерческих секвенсоров.

  1. Из результата секвенирования, выберите колонию, которая была успешно лигированный и использовать плазмиды ДНК для трансформации в E. палочка хозяин экспрессии.
  2. Оттепель Е. Штамм выражение (BL21 (DE3) pLysS) на льду. Между тем, теплые агаром, содержащих ампициллин (25 мкг / мл) и хлорамфеникол (34 мкг / мл) до комнатной температуры.
    Примечание: pLysS плазмиду присутствуют в бактерий штамма BL21 (DE3) pLysS содержит ген устойчивости к хлорамфениколу. PLysS плазмида содержит ген репрессора Т7, которые конститутивно экспрессируется на ограничение вытекающей экспрессию белка aECM. Хлорамфеникол необходимо выбрать для клеток бактерий, который содержит pLysS во культуры.
  3. Повторите шаг 1.10, чтобы получить превращается Е. палочки клетки, которые готовы высказать искусственные белки. Оберните агаром в парафильмом и хранить в перевернутом в 4 6 С в течение до одного месяца.

3. Бактериальные Выражение aECM белков

  1. На рисунке 2, выбрать колонию из трансформированной агаром с кончика пипетки и инокуляции в 10 мл стерильной Terrific Broth (ТБ) сред (таблица 1), содержащий как ампициллин и хлорамфеникол антибиотики в пробирке. Выдержите эту закваски на 37 ° CO / N (12-16 ч) при встряхивании на 225 оборотов в минуту.
  2. Передача 10 мл стартовой культуры в 1 л свежей и стерильных средах ТБ с добавлением тех же антибиотиков в колбу Эрленмейера 3 л. Инкубируйте культуру при 37 ° С при встряхивании при 225 оборотах в минуту в течение 2-3 ч и наблюдать оптической плотности культуры (OD 600) достиг 0,6-0,8 с помощью пипетки 1 мл культуры в пустую кювету для чтения. Сохранить 1 мл культуры перед индукцией по SDS-PAGE характеристики.
    1. Для измерения OD 600 клеточной культуры, подготовить 1 флакон СМИ туберкулезом в кюветедля пустой измерения. Отдельно передачи 1 мл культуры из культуральной колбы в новую пустую кювету. Измерение оптической плотности культуры с использованием спектрофотометра по отношению к пустой контроль при поглощении 600 нм.
    2. Сохранить образец (для последующего анализа SDS-PAGE) путем переноса 1 мл образца культуры в 1,5 мл микроцентрифужных трубки, центрифуге при 12000 х г в течение 2 мин, и декантируют супернатант.
  3. Индуцируют культуру изопропиловым β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) до конечной концентрации 1 мМ и инкубируют при 37 ° С при встряхивании при 225 оборотах в минуту в течение еще 4 ч. Сохранить 1 мл культуры в конце индукции в течение 4 ч SDS-PAGE характеристики.
  4. Сбора клеток путем переноса культуры до 1 л бутылок и центрифуги центрифуге при 12000 х г в течение 30 мин при 4 ° С. Жидкость над осадком сливают, вес ячейки гранул и ресуспендируют в TEN буфера (1 М Трис, 0,01 М ЭДТА, 0,1 М NaCl, рН = 8,0) при 0,5 г / мл.

4. Лизис бактериальных культур

  1. Замораживание ресуспендировали культуру клеток при -80 ° CO / N. Разморозить замороженную культуру клеток в водяной бане при комнатной температуре или на льду, чтобы лизировать клетки. Добавить 10 мкг / мл Дезоксирибонуклеаза I (ДНКазы I), 10 мкг / мл рибонуклеазы А (РНКазы I), и 50 мкг / мл фенилметилсульфонилфторида (PMSF) в то время оттаивания и гомогенизации раствора при медленном перемешивании.
  2. После того как все ресуспендировали Клетки оттаивают, регулировать рН раствора до 9,0, чтобы увеличить растворимость белка в воде 12. Добавить 6 N NaOH по каплям при перемешивании на льду, чтобы достичь однородной консистенции. Lyse ультразвуковой нарушения в течение 20 мин на льду с использованием диаметром 2 мм плоский наконечник, 5 сек импульс.
  3. Центрифуга клеток раствора при 12000 х г в течение 30 мин при 4 ° С. Передача супернатант на чистую, пустую бутылку и хранят при температуре 4 ° С для очистки позже.
  4. Между тем, снова ресуспендируют осадок клеток с TEN буфера и повторного замораживания при -80 ° С. ВПолный лизис клеток, повторите замораживания / оттаивания и ультразвуком процесс до трех раз. Сэкономьте 20 мкл лизата клеток для SDS-PAGE характеристики.

5. Очистка aECM белков, используя обратный переход Велоспорт

  1. Подборка клеточного лизата из стадии 4.3, и приступить к очистке белков aECM используя МТЦ, аналогичный тому, который используется для очистки эластина основе белков 21. Циклы будет сделано с разных температурах, которые 4 ° С (упоминается как "холодный") и 37 ° C (именуемые "теплых") циклов соответственно.
  2. Разделение клеточного лизата в 50 мл центрифужные флаконы и центрифугируют при 40000 х г в течение 2 ч при 4 ° С. Появление осадка клеток должны быть темно-коричневого цвета и выглядеть насморк.
  3. Удалить супернатант с помощью пипетки, чтобы получить четкое разделение от осадка. Собирают супернатант в чистые бутылки центрифуги и добавить NaCl до конечной концентрации 1 M (максимум 3 м). Теплыйраствора до 37 ° С в течение 2 ч при встряхивании при 225 оборотах в минуту.
    Примечание: Добавление NaCl вызовет переход эластина компонента, вызывающего агрегирование aECM. Супернатант станет мутным. Если концентрация белка достаточно высоко, белый пенистый белок можно увидеть по бокам бутылки центрифуги.
  4. Центрифуга супернатант из шага 5.3 при 40000 х г в течение 2 ч при 37 ° С. Декантировать супернатант. Измельчите таблетку с помощью металлического шпателя и ресуспендируют осадок биты в ледяной автоклавного дистиллированной воде (50 мг / мл) при энергичном перемешивании O / N при 4 ° С с использованием магнитной мешалкой и пластину. Осадок должен быть полностью растворен.
  5. Повторите этапы 5,2 до 5,4 в течение еще трех до пяти раз, чтобы получить более высокую чистоту белка.
  6. После последнего цикла очистки, обессоливания раствора белка диализом его против дистиллированной воды при 4 ° С. Диализировать белкового раствора от воды в течение 2-3 дней с изменениями в воде каждый 4ч или 8 ч в течение O / N. Сохранить 20 мкл очищенного белка на SDS-PAGE и лиофилизации остаток очищенного белка и хранить при температуре -80 ° С до дальнейшего использования.

6. Характеристика aECM белков, используя SDS-PAGE Электрофорез

  1. Приготовьте 12% геля ДСН-ПААГ (если молекулярная масса велика, используют 8% ПААГ с ДСН для лучшего разделения). Добавить 2x SDS загрузки буфера для каждого образца, нагрева образцов в течение 10 мин при 100 ° С и запустить образцы на геле в течение 1 ч при 100 V или пока белок лестницы, соответствующих молекулярной массе белка aECM не достигнет середины гель.
  2. Получение геля с ДСН-ПААГ, созданной и добавить кумасси бриллиантовый синий краситель (таблица 2) с объемом, чтобы погрузить гель в течение 1 часа в чашке Петри. Промыть гель в растворе Обесцвечивание (таблица 2) в течение 5 мин на качалке. Изменение Обесцвечивание раствора и продолжают destain гель с не-качалка до фоне тон гель становится ясно. Белковые полосы должны быть четко видны.
  3. Сравнение позиции целевого белка против белка лестницы, чтобы определить молекулярную массу белка-мишени.
  4. Чтобы дополнительно подтвердить наличие целевого белка, вестерн-блоттинга выполнения, как и в шаге 7.

7. Характеристика aECM белков, используя Вестерн-блоттинга

  1. Запуск образцов на 12% SDS-PAGE геля, в разделе 6, без окрашивания.
  2. Сокращение нитроцеллюлозную мембрану с размером, слегка превышающим геля ДСН-ПААГ. Вырезать 4 куска фильтровальной бумаги того же размера.
  3. Влажные один кусок фильтровальной бумаги с западного переноса буфера (20% об / об метанол, 25 мМ Трис, 190 мМ глицина, рН 8,3), поместить гель SDS-PAGE на верхней части фильтровальной бумаги, а затем еще один кусок фильтровальной бумаги , то нитроцеллюлозные мембраны, а окончательный другие два куска фильтровальной бумаги. Убедитесь, вся настройка погружен с достаточной западной буфера передачи.
    Примечание: гель и мембрана не должна находиться в контакте в данный момент времени, как белки могут связываться с мембраной при контакте.
  4. Передача белки на нитроцеллюлозную мембрану путем размещения двух фильтровальную бумагу в западной полусухого устройства передачи, после чего нитроцеллюлозной мембране, и тщательно поместить гель SDS-PAGE в пределах и на мембране, наконец, место два последних влажную фильтровальную бумагу на SDS-PAGE гель. Запустите западный перенос на 45 мА, 30 мин. Добавить буфер, если напряжение выше 30 В.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно размещать гель SDS-PAGE на мембране с одной попытки и избежать перехода гель излишне на мембране, как белки могут связываться с мембраной при контакте.
  5. Получение и блокировать нитроцеллюлозную мембрану с блокирующем растворе (5% обезжиренное молоко в PBS, рН 7,4, фильтруют через фильтровальную бумагу) в течение 2 ч при комнатной температуре. Утилизировать блокирующий буфер и добавьте PBS полоскать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Переход на новые перчатки, чтобы избежать загрязнения мембраны с нежелательной защдюймы
  6. Выдержите основной анти-антитела с Его разведения в PBS 1: 1000 при комнатной температуре в течение 1 часа с качалки. Приготовить смесь в объеме, который может погрузить весь мембрану, например, с коэффициент разбавления 1: 1000, добавить 1 мкл антител (концентрация наличии: 1 мг / мл) в 999 мкл PBS в течение 1 мл общей смеси.
  7. Промыть мембрану с 5 мл PBST (PBS с 0,1% Tween 20).
  8. Инкубируйте с вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) с разбавлением в PBS в соотношении 1: 5000 при комнатной температуре в течение 1 ч с качалки. Приготовить смесь в объеме, который может погрузить весь мембрану, например, с коэффициент разбавления 1: 5000, добавить 1 мкл антител (концентрация наличии: 1 мг / мл) в 4999 мкл PBS в течение 5 мл общей смеси.
  9. Промыть мембрану 5 мл PBST и повторить два раза.
  10. Применение хемилюминесцентного субстрата с мембраной с объемом, чтобы покрыть мембрану и инкубируют в соответствии с инструкциями для используемого субстрата.
    Примечание: чувствительности субстрата к обнаружению белка может изменяться, мы рекомендуем подложку с максимальной чувствительности при очень низких сигналов в случае повышения концентрации антител не приводит к увеличению сигналы.
  11. Захват хемилюминесцентные сигналов с использованием тепловизора на основе ПЗС-камеры. Отрегулируйте соотношение первичного и вторичного разбавления антитела, если сигналы слабы и неспецифичны. Выдержите больше в блокировании решения, если сигнал фона высока.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

При проектировании слитые белки, содержащие эластин, как повторы, важно поддерживать общее содержание эластина, достаточно большую долю слитого белка 18. Это делается для того, что слитый белок конструкция сохраняет свои эластина, как характеристики, чтобы использовать для очистки ITC. AECM белки дизайн и последовательности, описанные в этом разделе, были специально взяты из работы по Tjin др. 14. В этой работе, три aECM белки были успешно клонированы в pET22b (+) вектора экспрессии. Последовательное перевязки начал с перевязкой эластина повторяется вставить в вектор домашним животным, следует, вставив связывающий домен клеток. Наконец последний набор эластина повторов были вставлены на конце связывающего домена клеток с помощью того же метода. Чтобы проверить, если рекомбинантные гены успешно построены, каждый рекомбинантной плазмиды был испытан расщепляли XhoI и SalI в течение 3 ч при 37 °С. На рисунке 1 показана вставка ДНК и вектор полосы после испытания пищеварения. Для каждого из белков aECM, размер вставок соответствует размеру гена, подтверждающие, что клонирование действительно успешным. Кроме того проверка через секвенирования ДНК также подтвердили результаты испытаний с пищеварением.

Мы были в состоянии очистить белки aECM через ИТЦ данной достаточное содержание эластина в каждой белка aECM. Рисунок 2 показывает схему процесса в целом очистки. O / N культуру засевают в 1 л колбу встряски с типичной начальной OD 600 0,01. Культура выросла до OD 600 из 0,6-0,8 после 3-4 часов. Экспрессию белка индуцировали с помощью 1 мМ IPTG в. Через 4 часа, типичный OD 1,5 достигается. Бактериальную культуру собирали и подвергали центрифугированию. Супернатант отбрасывают, а осадок клеток взвесили. Средний вес Осадок клеток около 3 г / лкультура. Осадок ресуспендировали в TEN буфере и замораживали при -80 ° CO / N.

Серии циклов замораживания / оттаивания, были использованы для лизиса клеток. Шаг замораживания-оттаивания заставляет клетку набухать и сжиматься, в конечном счете, из-за нарушения кристаллов льда, образующихся в процессе замораживания. Впоследствии, ДНКазы I и РНКазы я были добавлены к клеточного лизата переварить все ДНК и РНК. ФМСФ является ингибитор протеазы, который был также добавлен к клеточного лизата, чтобы минимизировать деградацию белков. Для дальнейшего обеспечения полного лизиса клеток, лизат дополнительно обрабатывают ультразвуком в то время держали на льду.

Клеточный лизат затем подвергают 3 циклов очистки ITC. В конце 3-циклов, осадок в конце цикла теплом напоминала мед по консистенции и имел небольшое желтое окрашивание. Осадок становился прозрачным при контакте с водой и легко растворяется в предварительно охлажденный автоклавного воды при встряхивании. Очищенный белок диализовали, чтобы удалить любые остаточные Sпеременный Раствор белка, полученный в конце последнего цикла теплой был переведен в короткой длины диализной трубке (с 12 кДа молекулярной массой отрезать). В конце диализа, белковый раствор переносили в чистую 50 мл центрифужную пробирку и замораживают при температуре -20 ° С. На следующий день, замороженный раствор белка лиофилизуют для удаления содержания воды. Фиг.3 показывает изображение диализу белка, имеющего типичную шерсть, как внешний вид.

Чтобы определить, является ли экспрессия белка действительно индуцированной образцы, собранные до и после индукции анализировали с помощью SDS-PAGE электрофорезом. Здесь, 12% SDS-PAGE гель был достаточным, чтобы отделить белки с молекулярной массой 20-150 кДа. В том случае, молекулярная масса велика, то есть,> 100 кДа, 8% ПААГ с ДСН могут быть использованы для лучшего разделения белков. Фиг.4 показывает интенсивную полосу белка предсказанной молекулярной массой в индуцированной SAmple (дорожка 2). Как правило, анализ SDS-PAGE проводили сразу же после экспрессии белка до очистки начинает. Впоследствии, образцы, отобранные в процессе очистки может быть также проанализированы с помощью SDS-PAGE электрофореза, чтобы обеспечить эффективную очистку целевого белка. Рисунок 4 также показывает гель SDS-PAGE, содержащую очищенный образец белка с молекулярной массой 22 кДа (дорожка 4 ), соответствующий LN-5 aECM 14. Оценивается чистота белков aECM около 90% -95%; это значение было получено путем сравнения отношения интенсивностей полос белка-мишени и других белковых полос, присутствующих на геле SDS (фиг.4, дорожка 4). Наконец, чтобы определить, является ли очищенный белок был действительно белки aECM, Вестерн-блоттинг проводили. Впоследствии, MALDI-TOF также была проведена точно определить содержание примесей в очищенном материале 14. Рисунок 5 показывает чистоту белка гое три aECM белки с геля SDS-PAGE на рисунке 5А и для сравнения против образа нитроцеллюлозную мембрану для вестерн-блоттинга на рисунке 5В, показывая присутствие белков-мишеней Кол-IV aECM и LN-5 aECM, помечены с помощью анти -6x Его-теги антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP). Окончательные выходы белков aECM колебалась от 60 мг / л до 120 мг / л.

Фигура 1
Рисунок 1. ДНК в агарозном геле из aECM белков. Проверка окончательной белка aECM конструкции ДНК через рестриктазами пищеварения побежал на 1,2% агарозном геле ДНК. Рекомбинантные плазмиды, кодирующие для каждого из белков aECM были дважды расщепляли XhoI и SalI в течение 3 ч при 37 ° С Размеры вставок соответствовать размеру каждого гена белка aECM (FN910: 1,8т.п.н., Col-IV: 696 п.н., LN-5: 699 п.н.) и размер вектора pET22b (+) используется 5,5 т.п.н..

Рисунок 2
Рисунок 2. Схема потока для экспрессии белка, лизиса и очистки белков aECM. Основное руководство для экспрессии рекомбинантного белка, начиная с прививки одной колонии в культуре малого и масштабировать до 1 л культуры, сбор и повторное суспендирование клеток, с последующим лизисом белков. Очистки белка проводили с помощью НКТР поведение эластина-подобных доменов, присутствующих в искусственных белков ЕСМ. Белки aECM очищают с помощью ИТЦ. Были выполнены несколько холодных и теплых циклов, чтобы достичь высокой чистоты целевого белка. Наконец, целевой белок диализовали водой и не лиофилизировали до дальнейшего использования. "O / N" = ночь. "S / N" = супернатант.


Рисунок 3. Изображение лиофилизации aECM белка, очищенного от обратного перехода на велосипеде. Лиофилизированных LN5-aECM имеет шерсть, как внешний вид.

Рисунок 4
Рисунок 4. SDS-PAGE гель-электрофорез в aECM белка (LN-5 aECM). Полоса 1 и 2 показывает культуру до и после индукции белка. Наличие толстой полосы вблизи 22 кДа показывает, что успешно выразил LN-5 aECM. Дорожка 3 показывает полную клеточный лизат, а дорожка 4 показывает очищенного LN-5 aECM белок после 3 циклов ITC.

Рисунок 5
Рисунок 5. () SDS-PAGE гель белков aECM. (Б) Вестерн-блот зондируют в течение 6x Его-тег для Col-IV И LN-5 aECM белки. Оба белка Col-IV и LN-5 aECM содержать С-концевой 6xHis-тег. Положительный ХЛ наблюдается при прогнозируемой молекулярной массой в 22 кДа для образца LN-5 aECM и 24 кДа для образца Col-IV aECM представляющих 6x Его-тег, присутствующих в очищенного белка.

<TD RowSpan = "9"> 2xYT СМИ
Медиа / л Компоненты и инструкции
SOC СМИ 20 г Триптон
5 г Дрожжевой экстракт
0,6 г NaCl,
0,2 г KCl
Добавить в автоклав и 940 мл воды,
затем добавить стерильную (стерилизуют)
10 мл 1 М MgCl 2
10 мл 1 М MgSO 4
40 мл 20% глюкозы
16 г Триптон
10 г Дрожжевой экстракт
5 г NaCl,
15 г Агар Бакто (дополнение только для агаром)
Растворите в воде и пополнить до 1 л и автоклав.
Для подготовки агаром, охладить до 55 ° C перед добавлением антибиотиков.
Все хорошо перемешать перед заливкой в ​​чашке Петри.
Охлаждают до пластин агара не затвердевает.
Оберните пластин в парафильмом и хранить в перевернутом в 4 ° С.
Потрясающе Отвар (ТБ) 12 г Триптон
24 г Дрожжевой экстракт
4 мл глицерина
Растворить в 700 мл воды и автоклав.
16.42 г К 2 НРО 4(Мерк)
2,31 г KH 2 PO 4 (Merck)
Растворить в 300 мл воды и автоклав отдельно, чтобы гарантировать соли полностью не растворится.
Объединить оба среду и соли после охлаждения.

Таблица 1. Рецепты для SOC СМИ, 2xYT СМИ / агар и бульон. Потрясающий СМИ для E. палочка культура используется в молекулярной клонирования и экспрессии белка.

Решение / л Компоненты и инструкции
Кумасси Brilliant Blue пятно 0,25 г Кумасси blueR250
100 мл ледяной уксусной кислоты
450 мл Метиловый спирт
450 мл воды
100 мл ледяной уксусной кислоты
400 мл Метиловый спирт
500 мл воды

Таблица 2. Рецепты для решений пятно и destain SDS-ПААГ. Кумасси бриллиантовым голубым R250 для окрашивания и Обесцвечивание раствора для характеризации с помощью SDS-PAGE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Рекомбинантный белок инженерных универсальный метод для создания новых белковых материалов с использованием восходящего подхода. Материалы на основе белка могут быть разработаны, чтобы иметь несколько функций, с учетом существующих в применении интерес. В связи с увеличением продвижения в клонирования и экспрессии белка технологий, стало относительно просто (и экономически эффективным), чтобы создать различные искусственные белки, воспроизводимым и масштабируемым образом. Эластин-подобный домен был включен в ряде искусственных белков, чтобы служить в качестве метки очистки, а также для придания механических свойств. Искусственные белки, которые содержат последовательность эластина, как можно легко очищать с помощью МТЦ, который устраняет необходимость в дорогостоящих очистных колонн и антител.

Этот протокол описывает шаги, чтобы построить рекомбинантные плазмиды, кодирующие белки aECM. Гены, кодирующие эластина, как повторов были приобретены. Длявысоко повторяющаяся последовательность пептида, как эластин, как полипептидов, рекомендуется разрабатывать стратегию клонирования, так что рекурсивные направленного лигирования (RDL) стратегии могут быть использованы 22. При использовании RDL, повторяющиеся полипептиды с определенной длиной цепи могут быть синтезированы и, следовательно, представляющих интерес генов могут быть приобретены в виде коротких мономеров.

В нашей работе, домены связывания клеток были разработаны, чтобы содержать сайты рестрикции, фланкирующие NheI на обоих концах, чтобы модульную замену связывающего домена центральной ячейки. Важно, чтобы выбрать сайты рестрикции, которые являются уникальными и которые не присутствуют в функциональной области или в другом месте за пределами сайта множественного клонирования (MCS) принимающей вектора. Это должно ограничиваться переваривание вставки или вектора с запланированными сайтов. В некоторых случаях это может быть необходимо вводить новые сайты рестрикции в принимающей вектор с использованием мутагенеза перед введением функциональной области.

Нашстратегией клонирования позволило легко изменить центральную связывающий домен клеток, чтобы получить три варианта aECM белков. Мы также отметили, что вставка остаток лизина после начала Метионин повышенный выход белка более чем в 10 раз. Это резкое увеличение урожайности белка было самым очевидным с LN-5 aECM белка, где конечный выход белка увеличился с 5 мг / л до 60 мг / л.

Различные Е. палочки экспрессирующими хозяевами были сравнены, и BL21 (DE3) pLysS Е. штамм дает наилучшие урожаи белка. Повышение выхода белка было минимальным, когда экспрессия белка индуцировали с помощью IPTG в течение более 4 часов. Там не было никакого существенного различия в экспрессии белка в концентрациях IPTG более 1 мм. Тем не менее, экспрессия белка была самой высокой при индуцированной на OD ближе к 0,6.

Для эффективного восстановления aECM белков с использованием ITC, важно отметить, температуру центрифуги аппарата. На экзаменPLE, большинство из стадий очистки проводили в холодной комнате (4 ° C), чтобы обеспечить максимальную растворимость белков aECM. Он также может быть необходимо предварительно холод (4 ° С) ротора центрифуги O / N до холодной цикла. Кроме того, центрифуга ротора предварительно нагревается до температуры (37 ° С) до теплой цикла, чтобы гарантировать, что температура раствора белка поддерживалась выше его T T.

Таким образом, процедуры для разработки и клоны рекомбинантных плазмид, кодирующих белки, искусственные ECM описаны. В частности, экспрессия и очистка белков с использованием aECM ITC изложены. Наконец, характеристика белков aECM использованием электрофореза в ДСН-ПААГ и Вестерн-блоттинга были описаны.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить финансирование от Министерства образования ACRF Tier 1 (RG41) и запуска грант от Наньян технологический университет. Низкий и Tjin финансируются исследования студенческой стипендии (RSS) от Технологического университета Наньян в Сингапуре.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET22b (+) Novagen 69744 T7 expression vectors with resistance to ampicillin 
BL21(DE3)pLysS  Invitrogen C6060-03 additional antibiotics - chloramphenicol
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) Gold Biotechnology I2481C 1 M stock solution with autoclaved water, make fresh prior to induction.
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 plasmid isolation kit
T4 ligase New England Biolabs M0202S
Ampicillin Affymetrix 11259
Chloramphenicol Affymetrix 23660
Zymoclean™ gel DNA recovery kit Zymo Research D4001
XL10-gold strain Agilent Technologies 200315

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, Q., Liang, S., Thouas, G. A. Elastomeric biomaterials for tissue engineering. Prog Polym Sci. 38, (3-4), 584-671 (2013).
  2. Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering - In vivo and in vitro applications. Adv Drug Deliv Rev. 63, (4-5), 352-366 (2011).
  3. Kushner, A. M., Guan, Z. Modular Design in Natural and Biomimetic Soft Materials. Angewandte Chemie International Edition. 50, (39), 9026-9057 (2011).
  4. Gagner, J. E., Kim, W., Chaikof, E. L. Designing protein-based biomaterials for medical applications. Acta Biomater. 10, (4), 1542-1557 (2014).
  5. Gomes, S., Leonor, I. B., Mano, J. F., Reis, R. L., Kaplan, D. L. Natural and genetically engineered proteins for tissue engineering. Prog Polym Sci. 37, (1), 1-17 (2012).
  6. Werkmeister, J. A., Ramshaw, J. A. M. Recombinant protein scaffolds for tissue engineering. Biomedical Materials. 7, (1), 012002 (2012).
  7. MacNeil, S. Biomaterials for tissue engineering of skin. Materials Today. 11, (5), 26-35 (2008).
  8. Fong, E., Tirrell, D. A. Collective Cell Migration on Artificial Extracellular Matrix Proteins Containing Full-Length Fibronectin Domains. Advanced Materials. 22, (46), 5271-5275 (2010).
  9. Ratner, B. D., Bryant, S. J. BIOMATERIALS: Where We Have Been and Where We are Going. Annual Review of Biomedical Engineering. 6, (1), 41-75 (2004).
  10. Cai, L., Heilshorn, S. C. Designing ECM-mimetic materials using protein engineering. Acta Biomater. 10, (4), 1751-1760 (2014).
  11. Annabi, N., et al. Elastomeric recombinant protein-based biomaterials. Biochemical Engineering Journal. 77, (0), 110-118 (2013).
  12. Heilshorn, S. C., DiZio, K. A., Welsh, E. R., Tirrell, D. A. Endothelial cell adhesion to the fibronectin CS5 domain in artificial extracellular matrix proteins. Biomaterials. 24, (23), 4245-4252 (2003).
  13. Simnick, A. J., Lim, D. W., Chow, D., Chilkoti, A. Biomedical and Biotechnological Applications of Elastin-Like Polypeptides. Polymer Reviews. 47, (1), 121-154 (2007).
  14. Tjin, M. S., Chua, A. W. C., Ma, D. R., Lee, S. T., Fong, E. Human Epidermal Keratinocyte Cell Response on Integrin-Specific Artificial Extracellular Matrix Proteins. Macromolecular Bioscience. 14, (8), 1125-1134 (2014).
  15. MacNeil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445, (7130), 874-880 (2007).
  16. Kariya, Y., et al. Differential regulation of cellular adhesion and migration by recombinant laminin-5 forms with partial deletion or mutation within the G3 domain of α3 chain. J Cell Biochem. 88, (3), 506-520 (2003).
  17. Shang, M., Koshikawa, N., Schenk, S., Quaranta, V. The LG3 module of laminin-5 harbors a binding site for integrin α3Β1 that promotes cell adhesion, spreading, and migration. J Biol Chem. 276, (35), 33045-33053 (2001).
  18. Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Current Protocols in Protein Science. 6.11.1-6.11.16 (2010).
  19. Keeley, F. Ch. 4. Evolution of Extracellular Matrix.Biology of Extracellular Matrix. Springer. Berlin Heidelberg. 73-119 (2013).
  20. Le, D. H. T., et al. Self-Assembly of Elastin-Mimetic Double Hydrophobic Polypeptides. Biomacromolecules. 14, (4), 1028-1034 (2013).
  21. MacEwan, S. R., Hassouneh, W., Chilkoti, A. Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), e51583 (2014).
  22. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3, (2), 357-367 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics