Design e Construção de Matriz Extracelular Artificial (MECa) Proteínas de

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Low, P. S. J., Tjin, M. S., Fong, E. Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (100), e52845, doi:10.3791/52845 (2015).

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Abstract

Protocol

1. Clonagem de plasmídeos que codificam para Recombinante AECM Proteínas

  1. Desenhar a sequência de aminoácidos do domínio funcional (por exemplo, o domínio de ligação celular e repete-elastina semelhantes). Locais de restrição que flanqueiam as extremidades desenho dos domínios funcionais para facilitar a sub-clonagem utilizando software livre de acordo com as instruções de software (por exemplo, http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). Aqui, seleccionar locais de restrição únicos que não estão presentes no domínio funcional para confinar a digestão para os locais pretendidos. Escolha locais de restrição que aparecem no local de clonagem múltipla (MCS) do vector hospedeiro (por exemplo, pET22b (+)) para a sub-clonagem.
  2. Inverter traduzir a sequência de aminoácidos para a sequência de nucleótidos utilizando sítios livres de acordo com as instruções de software. (Por exemplo, http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). Garantir códons são otimizados para E. anfitriões coli.
  3. Gene de interesse pode ser purchasoligonucleótidos de cadeia ed comercialmente como simples (isto é, se os oligonucleótidos <100 pares de bases (pb)) e efectuar o recozimento de ADN (ver passo 1.4), para reduzir o custo. Caso contrário, para genes maiores que 100 pb, eles poderiam ser comprados por intermédio de empresas comerciais.
  4. ADN recozimento dos oligonucleótidos
    1. Recozer os oligómeros de ADN para se obter a sequência de gene pretendida. Dissolve-se oligonucleótidos de ADN num tampão de oligómero de ADN (10 mM de Tris: 2-amino-2- (hidroximetil) -propan-1,3-diol, pH 8,0, filtrada) para uma concentração final de 1 ug / uL.
    2. Adicionar 4 mL de cada oligómero com 32 ul de tampão de hibridação de ADN (Tris 10 mM, NaCl 100 mM e MgCl2 100 nm) para se obter uma mistura total de 40 ul.
    3. Ferver num copo de água utilizando uma placa de aquecimento e imergir a mistura durante 5 min, 95 ° C. Retirar o copo e gradualmente resfriar todo o conjunto em uma caixa de isopor O / N. Os oligômeros foram recozido e está pronto para a digestão.
    Adicionar as enzimas de restrição correspondentes de digerir os oligómeros hibridados (ou seja, designado por inserção) e vector hospedeiro (ou seja, pET22b (+)) separadamente. Utilize a seguinte receita (1-2 ug de ADN, 2 ul de cada uma das enzimas de restrição, 5 uL de tampão de enzima de restrição 10x, e água até um total de mistura de 50 ul) durante 3-4 h a 37 ° C.
    NOTA: O pET22b (+) vector plasmídico é resistente aos antibióticos ampicilina e contem um 6x-His no C-terminus. A-Sua 6x tag presente em pET22b (+) nos permite usar anticorpos marcada com His para identificar a proteína alvo via transferência de western na etapa 7.
  5. Adicionar corante 6x a cada mistura de digestão. Executar as misturas de digestão incluindo separadamente uma escada de ADN em géis de agarose a 1,2% contendo ADN de um corante de ADN fluorescente à luz ultravioleta durante 1 h a 100 V. visualizar o DNA em gel de agarose a 1,2% com um iluminador de luz UV.
  6. Cortar o gel para extrair produtos de ADN digeridos, utilizando kits de purificação de gel comercial. Elute utilizando o volume mínimo para a coluna para atingir uma concentração mínima de ADN de 50-100 ng / mL.
  7. Combinar o gene de interesse sequencialmente por ligação da inserção de ADN digerido (ou seja, repete elastina ou domínios de ligação de células obtidas por hibridação de ADN) no vector de plasmídeo usando ligase de T4 usando a seguinte receita: (2 jil de vector, 1 ul de ligase de T4, 1,5 ul de tampão de ligação de T4, x ul de inserção, 10,5 x ul de água para um total de mistura de 15 uL). Incubar a mistura de ligação à temperatura ambiente durante 2 h.
    NOTA: A concentração molar de vector para inserção deve ser variada para optimizar a eficiência da ligação. Volume de inserção descrita como x na receita depende da concentração de ADN eluído a partir do passo 1.7.
  8. Thaw E. coli DH5a células quimicamente competentes (ou qualquer estirpe de clonagem) em gelo. Placas de agar 2xYT Quente (Tabela 1) contendo ampicilina (25 ug / ml) a 37 ° C.
  9. Transformar as células usandochoque térmico:
    1. Alíquota de 50 ul de células competentes para, pré-refrigerada micro-tubos de centrífuga limpo. Pipetar 5 ul (entre 100 pg e 100 ng) da mistura de ligação para as células, pipetar suavemente para cima e para baixo para misturar. Deixar a mistura em gelo durante 20 min.
    2. Imergir o tubo de micro-centrifugadora contendo a mistura de células num banho de água a 42 C ° durante 2 minutos e voltou para em gelo durante 2 min. Tempo a duração de imersão para minimizar os danos do calor para as células.
    3. Adicionar 500 ul de meio SOC (Tabela 1) para dentro do tubo de micro-centrífuga e incuba-se a 37 ° C com agitação durante 1 h.
    4. Espalhe 50 500 uL da mistura de célula / ligadura numa placa de agar 2xYT que foi pré-aquecida até à TA, contendo ampicilina (25 ug / ml) e incubar as placas de cabeça para baixo, a 37 ° CO / N (12-16 h) .
  10. No dia seguinte, escolha colônias de DNA da placa de agar utilizando pontas de pipeta limpas. Crescer as colônias em 5 ml de meio 2YT (Tabela1) contendo ampicilina (25 ug / ml) O / N a 37 ° CO / N (12-16 h) com agitação (225 rpm).
  11. No dia seguinte, utilizar um kit de isolamento de plasmídeo para extrair os plasmídeos de ADN para cada colónia escolhido de acordo com o protocolo do fabricante. Elui-se o ADN com 50 ul de água.
  12. Executar um teste de digest com enzimas de restrição usando a seguinte receita: (5 uL de ADN, 0,2 ul de cada uma das enzimas de restrição, 1 ul de tampão de enzima de restrição e 10x superior para cima de água para um total de mistura de 10 ul), incubar durante 2 horas a 37 ° C a tela de colônias que provavelmente contêm a inserção e correr em 1,2% em gel de agarose DNA como no passo 1.6.
    NOTA: Após a digestão, uma ligação bem sucedida deve resulta em duas bandas, uma para cada vector e inserção que correspondem ao respectivo peso molecular (Figura 1).
  13. Envie as colônias prováveis ​​para a sequenciação de ADN utilizando o promotor T7 para a frente e primers para sequenciadores comerciais reverter.

  1. A partir do resultado de sequenciação, seleccionar uma colónia que foi ligado com êxito e usar o plasmídeo de ADN para transformação em E. hospedeiro de expressão E. coli.
  2. Thaw E. coli estirpe de expressão (células BL21 (DE3) pLysS) em gelo. Enquanto isso, as placas quentes de agar contendo ampicilina (25 ug / ml) e cloranfenicol (34? G / ml) à temperatura ambiente.
    NOTA: O plasmídeo pLysS presente em bactérias estirpe BL21 (DE3) pLysS contém um gene de resistência ao cloranfenicol. O plasmídeo pLysS contém um gene repressor de T7, que é expresso constitutivamente para limitar a expressão da proteína gotejante MECa. O cloranfenicol é necessário seleccionar as bactérias células que contém pLysS durante a cultura.
  3. Repita o passo 1.10 para obter transformada E. coli que estão prontos para expressar as proteínas artificiais. Enrole placas de agar em Parafilm e armazenar de cabeça para baixo em 4 6; C, durante até um mês.

3. Expressão Bacteriana de AECM Proteínas

  1. Consultar a Figura 2, escolher uma colónia da placa de agar transformada com uma ponta de pipeta e inocular em 10 ml de Terrific Broth estéril (TB) meios (Tabela 1) contendo ampicilina e cloranfenicol antibióticos num tubo de ensaio. Incubar na cultura inicial a 37 ° CO / N (12-16 h) com agitação a 225 rpm.
  2. Transferir 10 ml da cultura de arranque em 1 L de TB fresco meios estéreis e suplementadas com os mesmos antibióticos num balão de Erlenmeyer de 3 L. Incubar a cultura a 37 ° C com agitação a 225 rpm durante 2-3 h e observar a densidade óptica da cultura (OD 600) atingiu 0,6-0,8 pipetando 1 ml de cultura para uma cuvete vazio para leitura. Guardar a 1 ml de cultura antes da indução para a caracterização por SDS-PAGE.
    1. Para medir DO600 da cultura de células, preparar um frasco de meios TB numa cuvetepara uma medição em branco. Separadamente, transferir 1 mL de cultura do frasco de cultura em um novo cuvete vazio. Medir a densidade óptica da cultura utilizando um espectrofotómetro contra o branco de controlo a uma absorvância de 600 nm.
    2. Guardar a amostra (para subsequente análise de SDS-PAGE), transferindo as amostras de 1 ml da cultura para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, de centrifugação a 12.000 xg durante 2 minutos, e decantar o sobrenadante.
  3. Induzir a cultura com isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) para uma concentração final de 1 mM e incuba-se a 37 ° C com agitação a 225 rpm durante mais 4 h. Guardar a 1 ml da cultura no final da indução a 4 horas para a caracterização por SDS-PAGE.
  4. Colher as células por transferência da cultura para frascos de centrífuga de 1 L e centrifugar a 12000 xg durante 30 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante, os sedimentos celulares pesar e ressuspender em tampão TEN (Tris 1 M, EDTA 0,01 M, NaCl 0,1 M, pH = 8,0) a 0,5 g / ml.

4. A lise das culturas bacterianas

  1. Congelar a cultura de células re-suspensas a -80 ° CO / N. Descongelar a cultura de células congelado num banho de água à temperatura ambiente ou em gelo para lisar as células. Adiciona-se 10 ug / ml de desoxirribonuclease I (ADNase I), 10 ug / ml de ribonuclease A (RNase I), e 50 ug / ml de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante a descongelação e homogeneizar a solução, com agitação lenta.
  2. Depois de todas as células ressuspensas foram descongeladas, ajustar a solução para pH 9,0 para aumentar a solubilidade da proteína em água 12. Adicionar NaOH 6 N gota a gota com agitação sobre gelo para obter uma consistência homogénea. Lyse pela ruptura de ultra-sons durante 20 minutos em gelo usando um ponta plana de diâmetro 2 mm, 5 seg pulso.
  3. Centrifugar a solução de células a 12.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Transfira o sobrenadante para um ambiente limpo, garrafa vazia e armazenar a 4 ° C para posterior purificação.
  4. Enquanto isso, ressuspender o sedimento de células com tampão TEN novamente e re-congelamento a -80 ° C. Paralise celular completo, repita congelamento / descongelamento e de ultra-sons processo até três vezes. Economize 20 ligado celular ul para caracterização SDS-PAGE.

5. Purificação de Proteínas AECM Usando inversa Transição Bicicleta

  1. Agrupar o ligado celular a partir do passo 4.3 e prossiga para purificar as proteínas AECM usando ITC, semelhante ao utilizado para a purificação de proteínas à base de elastina 21. Ciclos vai ser feito com as diferentes temperaturas que são 4 ° C (referido como "fria") e 37 ° C (referido como "quentes") ciclos, respectivamente.
  2. Dividir o lisado celular em 50 ml de frascos de centrifugação, e centrifugar a 40000 xg durante 2 horas a 4 ° C. A aparência do sedimento celular deve ser marrom escuro e procurar a pingar.
  3. Remover o sobrenadante por pipetagem para obter uma separação limpa a partir do sedimento. Recolhe-se o sobrenadante em frascos de centrífuga limpo e adicionar NaCl para uma concentração final de 1 M (até um máximo de 3 M). Quentea solução para 37 ° C durante 2 horas com agitação a 225 rpm.
    NOTA: A adição de NaCl irá disparar a transição do componente de elastina da MECa causando agregação. O sobrenadante ficará turva. Se a concentração de proteína é suficientemente elevada, a proteína espumoso branco pode ser visto com os lados da garrafa centrífuga.
  4. Centrifugar o sobrenadante do passo de 5,3 a 40000 xg durante 2 horas a 37 ° C. Decantar o sobrenadante. Triturar o sedimento utilizando uma espátula de metal e ressuspender o pellet em pedaços autoclavado água destilada gelada (50 mg / mL) com agitação vigorosa O / N a 4 ° C utilizando uma barra de agitação magnética e placa. O sedimento deve ser completamente dissolvido.
  5. Repita os passos 5,2-5,4 por mais três a cinco vezes para se obter um grau de pureza mais elevada da proteína.
  6. Após o ciclo final de purificação, dessalinizar a solução de proteína por diálise contra água destilada a 4 ° C. Dialisar solução de proteína contra a água durante 2-3 dias com as mudanças na água a cada 4hr ou 8 horas para O / N. Guardar a 20 ul da proteína purificada por SDS-PAGE e liofilizar o resto da proteína purificada e armazenar a -80 ° C até à sua utilização.

6. Caracterização de Proteínas AECM utilizando SDS-PAGE A electroforese

  1. Preparar um gel de 12% SDS-PAGE (se o peso molecular é grande, utilizam 8% de gel SDS-PAGE para uma melhor separação). Adicionar tampão de carga de SDS 2x a cada amostra, aquecer as amostras durante 10 min a 100 ° C e processar as amostras no gel durante 1 hora a 100 V ou até que a escada proteína correspondendo ao peso molecular da proteína MECa atinge o meio da gel.
  2. Recuperar o gel da SDS-PAGE configurar e adicionar Coomassie Brilliant mancha azul (Tabela 2), com um volume de submergir o gel durante 1 hora em uma placa de Petri. Enxaguar em gel de uma solução de descoloração (Tabela 2) durante 5 min num agitador rotativo. Mude a solução de descoloração, e continuar a destain o gel com balanço até que o fundo de tele gel torna-se clara. As bandas de proteína deve ser claramente visível.
  3. Comparar a posição da proteína alvo contra a escada proteína para determinar o peso molecular da proteína alvo.
  4. Para confirmar ainda mais a presença da proteína alvo, efectuar transferência de western como no passo 7.

7. Caracterização de proteínas utilizando AECM Western Blotting

  1. Executar as amostras sobre um gel de 12% SDS-PAGE como na secção 6 com nenhuma coloração.
  2. Cortar membrana de nitrocelulose para um tamanho ligeiramente maior do que o gel de SDS-PAGE. Cortar quatro peças de papel de filtro para o mesmo tamanho.
  3. Wet um pedaço de papel de filtro com tampão de transferência Ocidental (20% v / v de metanol, Tris 25 mM, Glicina 190 mM, pH 8,3), colocar o gel de SDS-PAGE no topo do papel de filtro, seguida de uma outra peça de papel de filtro , em seguida, a membrana de nitrocelulose e um final de outros dois pedaços de papel de filtro. Certifique-se de todo o set-up está submersa com tampão de transferência western suficiente.
    NOTA: O gel e a membrana não deverá estar em contacto neste ponto de tempo como se podia ligar a proteínas da membrana quando em contacto.
  4. Transferir as proteínas para a membrana de nitrocelulose colocando dois filtros de papel para uma unidade de transferência semi-seca ocidental, seguindo-se a membrana de nitrocelulose, e colocar cuidadosamente o gel de SDS-PAGE dentro e sobre a membrana, por fim, colocar os dois últimos papel de filtro molhado sobre o gel de SDS-PAGE. Executar a transferência ocidental a 45 mA, 30 min. Adicionar tampão se a tensão é maior do que 30 V.
    NOTA: De um modo preferido colocar o gel de SDS-PAGE sobre a membrana com uma tentativa e evitar a transferência do gel desnecessariamente na membrana como proteínas poderiam ligar-se à membrana quando em contacto.
  5. Recuperar e bloquear a membrana de nitrocelulose com solução de bloqueio (5% de leite desnatado em PBS pH 7,4, filtrada com papel de filtro) durante 2 h à TA. Descarte de tampão de bloqueio e adicionar PBS para lavar.
    NOTA: Mudança para novas luvas para evitar a contaminação da membrana com prote indesejadoins.
  6. Incubar anti His-anticorpo primário com diluição em PBS a 1: 1000 em TA durante 1 h com agitação. Prepara-se uma mistura em um volume que pode submergir toda a membrana, por exemplo, com a razão de diluição 1: 1000, adicionar 1 ml de anticorpo (concentração: 1 mg / ml) a 999 ul de PBS para uma mistura total de 1 ml.
  7. Lavar a membrana com 5 mL de PBST (PBS com 0,1% de Tween 20).
  8. Incubar com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (HRP) com diluição em PBS a 1: 5000 em TA durante 1 h com agitação. Prepara-se uma mistura em um volume que pode submergir toda a membrana, por exemplo, com a razão de diluição 1: 5000, adicionar 1 ml de anticorpo (concentração: 1 mg / ml) para 4999 uL de PBS para uma mistura total de 5 ml.
  9. Lava-se a membrana com 5 mL de PBST e repetir duas vezes.
  10. Aplicar o substrato quimioluminescente para a membrana com um volume para cobrir a membrana e incubar, seguindo as instruções para o substrato utilizado.
    NOTA: A sensibilidade da substrato para detecção de proteína pode variar, recomendamos um substrato com sensibilidade máxima para sinais muito baixos, no caso o aumento da concentração de anticorpos não aumenta sinais.
  11. Capturar os sinais quimioluminescentes que utilizam um gerador de imagens CCD com base. Ajuste a razão de diluição de anticorpo primário e secundário, se os sinais são fracos e não-específica. Incubar mais em solução de bloqueio se o sinal de fundo é elevado.

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Representative Results

Na concepção de proteínas de fusão que contêm repetições de elastina semelhante, é importante para manter um teor de elastina geral, bastante grande fracção da proteína de fusão 18. Isto é para assegurar que a construção de proteína de fusão retém as suas características elásticas do tipo, a fim de utilizar CIT para purificação. A concepção e as sequências descritas nesta secção foram especificamente proteínas MECa retirado do trabalho por Tjin et ai. 14. Neste trabalho, três proteínas AECM foram clonados com êxito no pET22b (+) vector de expressão. Ligação sequencial, primeiro começou com ligando as repetições elastina inserir no vector pET, seguido pela inserção do domínio de ligação celular. Finalmente, o último conjunto de repetições de elastina foram inseridos na extremidade terminal do domínio de ligação de células, utilizando o mesmo método. Para verificar se os genes recombinantes foram construídos com sucesso, cada plasmídeo recombinante foi digerido com XhoI teste e Sall durante 3 horas a 37 °C. A Figura 1 mostra a inserção de DNA e as bandas vector após digestão do teste. Para cada uma das proteínas AECM, o tamanho das inserções correspondia ao tamanho do gene, o que confirma que a clonagem foi realmente bem sucedido. Além disso verificação através de seqüenciamento de DNA também confirmaram os resultados da digestão de teste.

Fomos capazes de purificar as proteínas AECM através ITC dado teor de elastina suficiente presentes em cada proteína MECa. A Figura 2 mostra o diagrama esquemático do processo global de purificação. A cultura D / N O foi inoculado em balão de agitação de 1 L, com um diâmetro externo de partida típico 600 de 0,01. A cultura cresceu até DO600 de 0,6-0,8 após 3-4 h. A expressão da proteína foi induzida utilizando 1 mM de IPTG. Após 4 horas, o OD típico de 1,5 seja alcançado. A cultura bacteriana foi recolhido e submetido a centrifugação. O sobrenadante foi rejeitado e o sedimento de células foi pesado. O peso médio do pelete de células foi cerca de 3 g / L decultura. O pelete foi re-suspenso em tampão TEN e congeladas a -80 ° CO / N.

Uma série de ciclos de congelamento / descongelamento foram utilizados para lisar as células. O passo de congelamento-descongelamento faz com que a célula a inchar e encolher, em última análise, devido à quebra de cristais de gelo formados durante o processo de congelação. Subsequentemente, a ADNase I e ARNase I foram adicionadas ao lisado celular para digerir todos os ADN e ARN. PMSF é um inibidor de protease, o qual também foi adicionado ao lisado celular para minimizar a degradação de proteína. Enquanto Para garantir ainda mais a lise celular completa, o lisado foi ainda ultra-sons mantido no gelo.

O lisado celular foi, em seguida, submetido a três ciclos de purificação de ITC. No final dos três ciclos, o sedimento no final do ciclo de aquecimento se assemelhava mel em consistência e uma ligeira coloração amarela. O sedimento virou transparente em contacto com a água, e prontamente dissolvido em água autoclavada pré-gelada com agitação. A proteína purificada é dialisado para remover quaisquer s residuaisalt. A solução de proteína obtido no final do ciclo de aquecimento final foi transferida para um comprimento curto de tubo de diálise (peso molecular de 12 kDa cortadas). No final da diálise, a solução de proteína foi transferida para um tubo de centrífuga de 50 ml limpos e congelaram-se a -20 ° C. No dia seguinte, a solução de proteína congelada foi liofilizada para remover o conteúdo de água. A Figura 3 mostra uma imagem da proteína dialisada, tendo uma aparência típica de lã-like.

Para determinar se a expressão da proteína foi induzida, de facto, as amostras recolhidas antes e depois da indução foram analisados ​​por electroforese SDS-PAGE. Aqui, 12% de gel SDS-PAGE foi suficiente para separar proteínas com pesos moleculares de 20-150 kDa. No caso em que o peso molecular é grande, isto é,> 100 kDa, 8% de gel de SDS-PAGE podem ser usadas para uma melhor separação da proteína. A Figura 4 mostra uma intensa banda de proteína com o peso molecular previsto no sa induzidample (pista 2). Tipicamente, a análise de SDS-PAGE foi realizada imediatamente após a expressão da proteína antes da depuração. Subsequentemente, as amostras tomadas durante o processo de purificação pode também ser analisados ​​por meio de electroforese de SDS-PAGE para assegurar a purificação eficiente da proteína alvo. A Figura 4 também mostra um gel de SDS-PAGE contendo uma amostra de proteína purificada com um peso molecular de 22 kDa (pista 4 ), correspondente ao LN-5 MECa 14. A pureza estimada das proteínas AECM foi cerca de 90% -95%; este valor foi obtido por comparação dos índices de intensidades de bandas da proteína alvo e de outras bandas de proteínas presentes no gel de SDS (Figura 4, pista 4). Por fim, para determinar se a proteína purificada era de facto as proteínas AECM, Western blotting foi realizado. Subsequentemente, MALDI-TOF também foi realizado para determinar com precisão o teor de impurezas do material purificado 14. A Figura 5 mostra a pureza da proteína de the AECM três proteínas com um gel de SDS-PAGE na Figura 5A e para comparar contra uma imagem da membrana de nitrocelulose por transferência de Western na Figura 5B, que mostra a presença das proteínas alvo Col-IV AECM e LN-5 AECM, etiquetado usando anti -6x anticorpos His-tag conjugados com peroxidase de rábano (HRP). Os rendimentos finais das proteínas AECM variou entre 60 mg / L a 120 mg / L.

Figura 1
Figura 1. ADN de electroforese em gel de agarose de proteínas AECM. Verificação de final de proteína MECa construções de ADN por meio de digestão com enzimas de restrição correu em gel de agarose a 1,2% de ADN. Os plasmídeos recombinantes que codificam para cada uma das proteínas AECM foram duplamente digeridos com Xhol e Sall durante 3 horas a 37 ° C. Os tamanhos das inserções correspondem ao tamanho de cada gene da proteína MECa (FN910: 1,8kpb, Col-IV: 696 pb, LN-5: 699 pb) e o tamanho do vector pET22b (+) utilizado é de 5,5 kpb.

Figura 2
Figura 2. Diagrama esquemático de fluxo para a expressão da proteína, a lise e purificação de proteínas AECM. A guia de base para a expressão da proteína recombinante, a partir da inoculação de uma única colónia de cultura e pequena escala até 1 L de cultura, colheita e ressuspensão das células, seguido por lise proteína. Purificação da proteína foi realizada utilizando-se o comportamento da TCIS domínios semelhantes a elastina presentes nas proteínas da MEC artificiais. As proteínas são purificadas por meio de AECM ITC. Múltiplos ciclos quentes e frios foram realizados para atingir um elevado grau de pureza da proteína alvo. Finalmente, a proteína alvo foram dialisadas com água e liofilizado até posterior utilização. "S / N" = dia para o outro. "S / N" = sobrenadante.


Figura 3. Imagem da proteína MECa liofilizado purificado por Inverso Transição Ciclismo. Lyophilized LN5-MECa tem uma aparência de lã-like.

Figura 4
Figura 4. electroforese em gel de SDS-PAGE da proteína MECa (LN-5 MECa). Pista 1 e 2 mostra cultura antes e após a indução da proteína. A presença de uma banda de espessura cerca de 22 kDa que mostra o LN-5 MECa foi expresso com sucesso. A pista 3 mostra o ligado celular completo, enquanto a pista 4 mostra o LN-5 purificada proteína MECa após 3 ciclos de ITC.

Figura 5
Figura 5. (A) SDS-PAGE em gel das proteínas AECM. (B) Western blot sondado para 6x His-tag para Col-iv Proteínas e LN-5 MECa. Ambas as proteínas Col-IV e LN-5 MECa conter C-terminal 6xHis-tag. Quimioluminescência positivo observado no peso molecular previsto de 22 kDa para a amostra LN-5 MECa e 24 kDa para amostras Col-IV MECa representando 6x His-marcador presente na proteína purificada.

<td rowspan = "9"> media 2XYT
Mídia / L Componentes e instruções
Mídia SOC 20 g de triptona
5 g de extracto de levedura
0,6 g de NaCl
0,2 g de KCl
Adicionar e autoclave em 940 ml de água,
em seguida, adicionar estéril (esterilizado por filtração)
10 ml de 1 M MgCl2
10 ml 1 M MgSO4
40 ml de 20% de glicose
16 g de triptona
10 g de extracto de levedura
5 g de NaCl
15 g de Bacto Agar (adição apenas para placa de agar)
Dissolver em água e completar a 1 L e autoclave.
Para preparar placas de agar, legal para 55 ° C antes da adição de antibióticos.
Misture bem antes do vazamento em uma placa de Petri.
Arrefecer as placas até ágar é solidificada.
Enrole as placas em Parafilm e armazenar de cabeça para baixo em 4 ° C.
Terrific Broth (TB) 12 g de triptona
24 g de extracto de levedura
4 ml Glicerol
Dissolve-se em 700 ml de água e autoclave.
16.42 g de K 2 HPO 4(Merck)
2,31 g de KH 2 PO 4 (Merck)
Dissolve-se em 300 ml de água e autoclave separadamente, para assegurar sais são completamente dissolvido.
Combine ambos médio e sais após arrefecimento.

Tabela 1. Receitas para mídia SOC, 2xYT media / agar e caldo Terrific. Mídia para E. cultura coli utilizado na clonagem molecular e expressão da proteína.

Solução / L Componentes e instruções
Coomassie Brilliant mancha azul 0,25 g de Coomassie blueR250
100 ml de ácido acético glacial
450 ml de álcool metilo
450 ml de água
100 ml de ácido acético glacial
400 ml de álcool metilo
500 ml de água

Tabela 2. Receitas para soluções para manchar e destain gel SDS-PAGE. Azul Brilhante de Coomassie R250 para a coloração e uma solução de descoloração para caracterização utilizando SDS-PAGE.

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Discussion

Engenharia de proteína recombinante é uma técnica versátil para criar novos materiais de proteína usando uma abordagem bottom-up. Os materiais à base de proteínas podem ser concebidos para ter várias funcionalidades, adaptado de acordo com a aplicação de interesse. Devido ao aumento do avanço nas tecnologias de clonagem e de expressão de proteínas, tornou-se relativamente simples (e de baixo custo) para criar uma variedade de proteínas artificiais de uma maneira reprodutível e escalonável. O domínio semelhante a elastina tem sido incorporada em uma série de proteínas artificiais, para servir como um marcador de purificação, bem como para conferir propriedades mecânicas. Proteínas artificiais que contêm uma sequência de elastina semelhante pode ser facilmente purificado usando ITC, o que elimina a necessidade de colunas de purificação dispendiosos e anticorpos.

Este protocolo descreve os passos para a construção de plasmídeos recombinantes que codificam para proteínas AECM. Os genes que codificam para as repetições de elastina-como foram adquiridos. Parasequência do péptido altamente repetitiva como elastina como polipeptídeos, recomenda-se a projetar a estratégia de clonagem de tal forma que a ligação direccional recursiva (RDL) estratégias podem ser utilizadas 22. Ao utilizar RDL, polipéptidos repetitivas com um comprimento de cadeia específico pode ser sintetizado e, por conseguinte, os genes de interesse pode ser adquirido como monómeros curtos.

No nosso trabalho, os domínios de ligação de células foram concebidas para conter locais de restrição NheI flanqueando em ambas as extremidades para permitir a troca modular do domínio de ligação de célula central. É importante seleccionar locais de restrição que são únicas e não estão presentes no domínio funcional ou noutro local fora do local de clonagem múltipla (MCS) do vector hospedeiro. Isto é para limitar a digestão da inserção ou vector para os locais pretendidos. Em alguns casos, pode ser necessário introduzir novos locais de restrição no vector hospedeiro usando mutagénese antes da inserção do domínio funcional.

Nossoestratégia de clonagem nos permitiu mudar facilmente o domínio central da célula de ligação para obter três variantes de proteínas MECa. Observamos, também, que a inserção de um resíduo de lisina após a metionina de partida aumentou o rendimento de proteína em mais do que 10 vezes. Este aumento dramático no rendimento de proteína era mais aparente com LN-5 MECa proteína, em que o rendimento final de proteína aumentou de 5 mg / L até 60 mg / L.

Vários E. coli hospedeiros de expressão foram comparados, e a estirpe BL21 (DE3) pLysS de E. coli deu os melhores rendimentos de proteína. A melhoria no rendimento da proteína foi mínima quando a expressão da proteína foi induzida com IPTG durante mais de 4 horas. Não houve diferença significativa na expressão da proteína em concentrações superiores a IPTG 1 mM. No entanto, a expressão da proteína foi o mais elevado, quando induzida pelo OD mais perto de 0,6.

Para a recuperação eficiente de proteínas AECM usando ITC, é importante notar que a temperatura do aparelho de centrifugação. Para o exameplo, a maior parte dos passos de purificação foram realizadas numa sala fria (4 ° C) para assegurar a solubilidade máxima das proteínas AECM. Também pode ser necessário pré-frio de (4 ° C), o rotor da centrifugadora O / N antes do ciclo de frio. Do mesmo modo, o rotor de centrifugadora foi pré-aquecido a (37 ° C) antes do ciclo de aquecimento para assegurar que a temperatura da solução de proteína foi mantido acima do seu T t.

Em resumo, os procedimentos para a concepção e os plasmídeos recombinantes de clones que codificam proteínas ECM artificiais são descritos. Em particular, a expressão e purificação das proteínas AECM usando ITC são descritas. Finalmente, a caracterização das proteínas AECM usando electroforese de SDS-PAGE e Western blot foram descritos.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer financiamento do Ministério da Educação ACRF Tier 1 (RG41) e start-up bolsa da Universidade Tecnológica de Nanyang. Baixo e Tjin são financiados pelo Bolsista de Investigação (RSS) a partir de Nanyang Technological University, Cingapura.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET22b (+) Novagen 69744 T7 expression vectors with resistance to ampicillin 
BL21(DE3)pLysS  Invitrogen C6060-03 additional antibiotics - chloramphenicol
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) Gold Biotechnology I2481C 1 M stock solution with autoclaved water, make fresh prior to induction.
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 plasmid isolation kit
T4 ligase New England Biolabs M0202S
Ampicillin Affymetrix 11259
Chloramphenicol Affymetrix 23660
Zymoclean™ gel DNA recovery kit Zymo Research D4001
XL10-gold strain Agilent Technologies 200315

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