Design och konstruktion av artificiell Extracellular Matrix (AECM) Proteiner från

JoVE Journal
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Low, P. S. J., Tjin, M. S., Fong, E. Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (100), e52845, doi:10.3791/52845 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Kloning av rekombinanta plasmider som kodar för AECM Proteiner

  1. Planaminosyrasekvensen för den funktionella domänen (t.ex. cellbindande domänen och elastin-lika upprepningar). Design restriktionsställen som flankerar ändarna av de funktionella domänerna för att underlätta sub-kloning med hjälp av fri programvara enligt mjukvaruinstruktioner (t.ex. http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). Här väljer unika restriktionsställen som inte är närvarande i den funktionella domänen för att begränsa digerering för att de avsedda platserna. Välj restriktionsställen som visas i det multipla kloningsstället (MCS) i värdvektorn (t.ex. pET22b (+)) för under kloning.
  2. Omvänd översätta aminosyrasekvensen i nukleotidsekvensen med användning av fria webbplatser enligt mjukvaruinstruktioner. (T.ex. http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). Se till kodon optimerade för E. coli-värdar.
  3. Gen av intresse kan vara Purchased kommersiellt som enkelsträngade oligonukleotider (dvs om oligonukleotider <100 baspar (bp)) och utför DNA glödgning (se steg 1,4) för att minska kostnaderna. Annars, för gener som är större än 100 bp, de kan köpas genom kommersiella företag.
  4. DNA-hybridisering av oligonukleotiderna
    1. Glödga de DNA-oligomerer för att erhålla den önskade gensekvensen. Lös DNA-oligonukleotider i en DNA-oligomer-buffert (10 mM Tris: 2-amino-2- (hydroximetyl) -propan-1,3-diol, pH 8,0, filtrerades) till en slutlig koncentration av 1 ug / ul.
    2. Lägg 4 pl av varje oligomer till 32 | il DNA-pamingsbuffert (10 mM Tris, 100 mM NaCl och 100 nM MgCb 2) för att uppnå en total 40 | il blandning.
    3. Koka en bägare med vatten med användning av en värmeplatta och sänk ned blandningen under 5 min, 95 ° C. Ta bort bägaren och gradvis kyla hela inrättades en frigolitlåda O / N. Oligomererna har glödgats och är redo för matsmältningen.
    Lägg de motsvarande restriktionsenzymer för att smälta de hybridiserade oligomererna (dvs kallad insats) och värdvektor (dvs pET22b (+)) separat. Använd följande recept (1-2 | j, g av DNA, 2 | il av varje restriktionsenzym, 5 ul av 10 x restriktionsenzymbuffert och vatten upp till totalt 50 | il blandning) under 3-4 h vid 37 ° C.
    OBS: pET22b (+) plasmidvektor är ampicillin- antibiotikaresistenta och innehåller en 6x-His-markör vid C-terminalen. Den 6x-His tag närvarande i pET22b (+) tillåter oss att använda hans-märkta antikroppar för att identifiera målproteinet via western blotting i steg 7.
  5. Lägg 6x laddningsfärg till varje digereringsblandningen. Kör uppslutnings blandningarna separat fattande en DNA-stege på 1,2% DNA-agarosgeler innehållande en UV-fluorescerande DNA-färgning för en timme vid 100 V. visualisera 1,2% DNA-agarosgel med ett UV-ljus illuminator.
  6. Skiva gelen att utvinna spjälkade DNA-produkter med hjälp av kommersiell gelrening kit. Elute med användning av minsta volymen för kolonnen för att uppnå en minsta DNA-koncentration av 50-100 ng / ul.
  7. Kombinera genen av intresse sekventiellt genom ligering av digere DNA-insättningen (dvs. elastin upprepningar eller cellbindande domäner som erhållits genom DNA-glödgning) i plasmidvektorn med användning av T4-ligas med användning av följande recept: (2 ^ il vektor, 1 pl T4-ligas, 1,5 ^ il T4-ligeringsbuffert, x ^ il av insatsen, 10,5-x | il vatten för en total 15 | il blandning). Inkubera ligeringsblandningen vid RT under 2 h.
    OBS: Molär koncentration av vektor för att infoga bör varieras för att optimera ligering effektivitet. Volymen av insatsen som beskrivs som x i receptet beror på den eluerade DNA-koncentration från steg 1,7.
  8. Thaw E. coli DH5a kemiskt kompetenta celler (eller någon kloning stam) på is. Varm 2 x YT-agarplattor (Tabell 1) innehållande ampicillin (25 | ig / ml) till 37 ° C.
  9. Omvandla cellerna med hjälp avvärmechock:
    1. Alikvotera 50 pl kompetenta celler i rena, pre-kylda mikro-centrifugrör. Pipettera 5 ul (mellan 100 pg till 100 ng) av ligeringsblandningen in i cellerna, pipettering försiktigt upp och ned för att blanda. Låt blandningen på is under 20 minuter.
    2. Sänk ned mikro-centrifugrör innehållande cellblandningen i en 42 ° C vattenbad i 2 min och återvände till på is under 2 minuter. Tid nedsänkningen varaktighet för att minimera värme skada på cellerna.
    3. Lägg 500 | il SOC-medium (tabell 1) in i den mikro-centrifugrör och inkubera vid 37 ° C med skakning under en timme.
    4. Sprid 50 500 pl av cell / ligeringsblandningen på en 2xYT agarplatta som har förvärmas till RT, innehållande ampicillin (25 | ig / ml) och inkubera plattorna upp och ner vid 37 ° CO / N (12-16 h) .
  10. Nästa dag, plocka DNA-kolonier från agarplattan med rent pipettspetsar. Odla kolonierna i 5 ml 2YT-medium (tabell1) innehållande ampicillin (25 | ig / ml) O / N vid 37 ° CO / N (12-16 h) med skakning (225 rpm).
  11. Följande dag, använd en plasmidisolering kit för att extrahera DNA-plasmider för varje koloni plockas enligt tillverkarens protokoll. Eluera DNA med 50 | il vatten.
  12. Gör ett test smälta med restriktionsenzymer enligt följande recept: (5 l DNA, 0,2 pl av varje restriktionsenzym, 1 pl 10x restriktionsenzymbuffert och fyll på vatten för en total 10 il blandning), inkubera i 2 timmar vid 37 ° C till skärmen för kolonier som sannolikt innehåller insatsen och kör på 1,2% DNA agarosgel som i steg 1.6.
    OBS: Vid rötning, en framgångsrik ligering bör resulterar i två band, ett vardera för vektor och insats som motsvarar deras respektive molekylvikt (Figur 1).
  13. Skicka sann kolonierna för DNA-sekvensering med användning av T7-promotorn framåt och bakåt primers till kommersiella sequencers.

  1. Från sekvenseringsresultatet väljer en koloni som har framgångsrikt ligeras och använda DNA-plasmid för transformation in i en E. coli-uttrycksvärden.
  2. Thaw E. coli-expressionsstam (BL21 (DE3) pLysS) på is. Samtidigt varma agarplattor innehållande ampicillin (25 | ig / ml) och kloramfenikol (34 | ig / ml) till RT.
    OBS: pLysS-plasmiden närvarande i bakteriestam BL21 (DE3) pLysS innehåller en kloramfenikol resistensgen. Den pLysS-plasmiden innehåller en T7-repressorgen som konstitutivt uttrycks att begränsa läckande uttryck för AECM proteinet. Kloramfenikol är nödvändigt att välja för bakterieceller som innehåller pLysS under odling.
  3. Upprepa steg 1,10 för att erhålla transformerade E. coli-celler som är redo att uttrycka artificiella proteiner. Linda agarplattor i Parafilm och lagra upp och ner i 4 6, C i upp till en månad.

3. Bakteriell expression av AECM proteiner

  1. Se Figur 2, plocka en koloni från den transforme agarplatta med en pipettspets och inokulera i 10 ml sterila Terrific Broth (TB) media (tabell 1) innehållande både ampicillin och kloramfenikol antibiotika i ett provrör. Inkubera denna startkultur vid 37 ° CO / N (12-16 timmar) med skakning vid 225 rpm.
  2. Överföring 10 ml av startkulturen i en L färska och sterila TB medium kompletterat med samma antibiotika i en 3 L Erlenmeyerkolv. Inkubera kulturen vid 37 ° C med skakning vid 225 rpm under 2-3 h och observera den optiska densiteten av odlingen (OD600) nådde 0,6-0,8 genom att pipettera 1 ml av kulturen i en tom kyvett för läsning. Spara 1 ml odlings före induktion för SDS-PAGE karakterisering.
    1. För att mäta OD 600 av cellkulturen, förbereda en flaska med TB media i en kyvettför en tom mätning. Separat överföra 1 ml av kultur från odlingskolven i en ny tom kyvett. Mät den optiska tätheten av kulturen med hjälp av en spektrofotometer mot ämnet kontroll vid en absorbans av 600 nm.
    2. Spara provet (för efterföljande SDS-PAGE-analys) genom överföring av en ml odlings provet i en 1,5 ml mikrocentrifugrör, centrifugera vid 12.000 xg under 2 min och dekantera supernatanten.
  3. Inducera kulturen med isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) till en slutlig koncentration av 1 mM och inkubera vid 37 ° C med skakning vid 225 varv per minut under ytterligare 4 timmar. Spara 1 ml kultur i slutet av induktion vid 4 h under SDS-PAGE-karakterisering.
  4. Skörda cellerna genom överföring av kulturen till en L centrifugflaskor och centrifugera vid 12.000 xg under 30 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten, väga cellpelletar och återsuspendera i TEN-buffert (1 M Tris, 0,01 M EDTA, 0,1 M NaCl, pH = 8,0) vid 0,5 g / ml.

4. Lys av bakteriekulturer

  1. Frys resuspenderas cellkultur vid -80 ° CO / N. Tina frysta cellkultur i ett vattenbad vid rumstemperatur eller på is för att lysera cellerna. Lägg 10 | ig / ml deoxiribonukleas I (DNas I), 10 | ig / ml ribonukleas A (RNas I), och 50 | ig / ml fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) medan upptining och homogenisera lösningen under långsam omröring.
  2. Efter alla resuspenderade cellerna tinas, justera lösningen till pH 9,0 för att öka protein löslighet i vatten 12. Lägg 6 N NaOH droppvis under omröring på is för att åstadkomma en homogen konsistens. Lyse genom ultraljuds avbrott under 20 minuter på is med en 2 mm diameter platt spets, 5 sek puls.
  3. Centrifugera cellen lösningen vid 12.000 xg under 30 minuter vid 4 ° C. Överför supernatanten till en ren, tom flaska och förvara vid 4 ° C för rening senare.
  4. Under tiden, resuspendera cellpelleten igen med TEN-buffert och återfrys vid -80 ° C. Tillfullständig cellysering, upprepa frysning / upptining och sonikering processen upp till tre gånger. Spara 20 | il cellysat för SDS-PAGE-karakterisering.

5. Rening av AECM proteiner Använda Inverse Transition Cykling

  1. Sortera cellysatet från steg 4,3 och fortsätt att rena AECM proteiner med användning av ITC, liknande den som används för rening av elastin baserade proteiner 21. Cyklar kommer att ske med de olika temperaturer som är 4 ° C (kallad "kall") och 37 ° C (kallad "varma") omgångarna.
  2. Split cellysatet i 50 ml centrifugflaskor, och centrifugera vid 40.000 xg under 2 h vid 4 ° C. Utseendet på cellpelleten bör vara mörkbrun och ser rinnande.
  3. Avlägsna supernatanten genom pipettering för att få en ren separation från pelleten. Samla upp supernatanten i rena centrifugflaskor och tillsätt NaCl till en slutlig koncentration av 1 M (till ett maximum av 3 M). Varmlösningen till 37 ° C under 2 h med skakning vid 225 varv per minut.
    OBS: Tillsats av NaCl utlöser övergången av elastin del av AECM orsakar aggregering. Supernatanten blir grumlig. Om proteinkoncentrationen är tillräckligt hög, kan vit skummig protein ses vid sidorna av centrifugflaska.
  4. Centrifugera supernatanten från steg 5,3 vid 40.000 xg under 2 h vid 37 ° C. Dekantera supernatanten. Krossa pelleten med användning av en metallspatel och resuspendera pellet bitarna i iskallt autoklaveras destillerat vatten (50 mg / ml) med kraftig omröring O / N vid 4 ° C med användning av en magnetisk omrörarstav och plattan. Pelleten bör helt upplöst.
  5. Upprepa steg 5,2-5,4 under ytterligare tre till fem gånger för att erhålla en högre renhet av proteinet.
  6. Efter den sista cykeln av rening, avsalta proteinlösningen genom att dialysera det mot destillerat vatten vid 4 ° C. Dialysera proteinlösning mot vatten i 2-3 dagar med förändringar i vatten var 4tim eller 8 timmar för O / N. Spara 20 | il av det renade proteinet för SDS-PAGE och lyofilisera resten av det renade proteinet och förvara vid -80 ° C tills vidare användning.

6. Karakterisering av AECM proteiner med användning av SDS-PAGE-elektrofores

  1. Bered en 12% SDS-PAGE-gel (om molekylvikten är stor, använda 8% SDS-PAGE-geler för bättre separation). Lägg 2x SDS laddningsbuffert till varje prov, värma proven under 10 min vid 100 ° C och köra prover på gelén under 1 timme vid 100 V eller tills proteinet stege som motsvarar molekylvikten av AECM-proteinet når mitten av den gel.
  2. Hämta gel från SDS-PAGE som inrättats och lägg Coomassie Brilliant Blue-färgning (tabell 2) med en volym för att dränka gelén under 1 h i en petriskål. Skölj gel i en avfärgningslösning (tabell 2) under 5 min på en vippa. Ändra avfärgningslösningen, och fortsätter att avfärgning gelén med gungande tills bakgrunden than gel blir tydlig. Proteinband ska vara klart synliga.
  3. Jämför läget för målproteinet mot proteinet stege för att bestämma molekylvikten för målproteinet.
  4. För att ytterligare bekräfta närvaron av målproteinet, utför western blotting som i steg 7.

7. Karakterisering av AECM proteiner med användning av Western blotting

  1. Kör proverna på en 12% SDS-PAGE-gel som i avsnitt 6 utan färgning.
  2. Skär nitrocellulosamembran till en storlek något större än SDS-PAGE-gel. Skär fyra bitar av filterpapper med samma storlek.
  3. Våt ett stycke filterpapper med Western överföringsbuffert (20% volym / volym metanol, 25 mM Tris, 190 mM glycin, pH 8,3), placera SDS-PAGE-gel på toppen av filterpapper, följt av ett annat stycke filterpapper , sedan nitrocellulosamembranet och en slutlig andra två bitar av filterpapper. Se till att hela upplägget är nedsänkt med tillräcklig västra överföringsbuffert.
    OBS: gelén och membranet bör inte vara i kontakt vid denna tidpunkt som proteiner kunde binda till membranet vid kontakt.
  4. Överför proteiner på nitrocellulosamembranet genom att placera två filterpapper in i en västra halvtorr överföringsenhet, följt av nitrocellulosamembranet, och placera försiktigt SDS-PAGE-gel i och på membranet slutligen placera de två sista vått filterpapper på SDS-PAGE-gel. Kör västra överföring vid 45 mA, 30 min. Lägg buffert om spänningen är högre än 30 V.
    OBS: placera Företrädesvis SDS-PAGE-gel på membranet med ett försök och undvika skiftning av gelén i onödan på membranet som proteiner kunde binda till membranet vid kontakt.
  5. Hämta och blockera nitrocellulosamembranet med blockeringslösning (5% fettfri mjölk i PBS, pH 7,4, filtrerades med filterpapper) under 2 h vid RT. Gör dig av med blockerande buffert och tillsätt PBS för att skölja.
    OBS: Byt till nya handskar för att undvika kontaminering av membranet med oönskade proteins.
  6. Inkubera primära anti-His antikropp med utspädning i PBS vid 1: 1000 vid RT under 1 timme med gunga. Blanda i en volym som kan dränka hela membranet, till exempel, med utspädningsförhållandet 1: 1000, tillsätt 1 | il antikropp (stamkoncentration: 1 mg / ml) till 999 | il PBS under en 1 ml totala blandningen.
  7. Skölj membranet med 5 ml PBST (PBS med 0,1% Tween 20).
  8. Inkubera med sekundär antikropp konjugerad till pepparrotsperoxidas (HRP) med spädning i PBS vid 1: 5000 vid RT i 1 h med gungning. Blanda i en volym som kan dränka hela membranet, till exempel, med utspädningsförhållandet 1: 5000, tillsätt 1 | il antikropp (stamkoncentration: 1 mg / ml) till 4999 | j, l PBS under en 5 ml totala blandningen.
  9. Tvätta membranet med 5 ml PBST och upprepa två gånger.
  10. Applicera kemiluminiscent substrat till membranet med en volym för att täcka membranet och inkubera genom att följa instruktionerna för det använda substratet.
    OBS: Underlaget känslighet för proteindetektion kan variera, vi rekommenderar ett substrat med maximal känslighet för mycket låga signaler vid ökande koncentration antikropp ökar inte signaler.
  11. Fånga kemiluminiscenta signaler med hjälp av en CCD-kamera baserad avbildare. Justera primära och sekundära utspädningsantikroppsförhållande om signalerna är svaga och ospecifik. Inkubera längre i blockerande lösningen om bakgrundssignal är hög.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vid utformning av fusionsproteiner innehållande elastin-liknande upprepningar, är det viktigt att upprätthålla en övergripande elastin innehåll, tillräckligt stor fraktion av fusionsproteinet 18. Detta för att säkerställa att fusionsproteinkonstruktionen bibehåller sina elastin liknande egenskaper, för att kunna använda ITC för rening. Den AECM proteiner design och sekvenser som beskrivs i detta avsnitt specifikt tas från arbetet av Tjin et al. 14. I detta arbete har tre AECM proteiner framgångsrikt klonat i pET22b (+) expressionsvektor. Sekventiell ligering först började med ligering av elastin upprepning infoga i pET vektorn, följt av att sätta in cellbindande domänen. Slutligen den sista uppsättningen av elastin upprepningar infogades vid den terminala änden av cellen bindande domän genom att använda samma metod. För att verifiera om de rekombinanta gener har framgångsrikt konstruerats, varje rekombinant plasmid testdigererades med Xhol och Sall under 3 h vid 37 °C. Figur 1 visar DNA-insättningen och vektorbanden efter testet matsmältningen. För var och en av AECM-proteinerna, storleken av skären motsvarade storleken av genen, vilket bekräftar att kloning verkligen var framgångsrik. Ytterligare kontroll genom DNA-sekvensering bekräftade också test matsmältningen resultat.

Vi kunde rena AECM proteiner genom ITC ges tillräcklig elastin innehåll som finns i varje AECM protein. Figur 2 visar schematisk bild av den övergripande processen rening. O / N-kulturen inokulerades i ett L skakkolv med en typisk start OD 600 av 0,01. Odlingen växte till OD 600 av 0,6 till 0,8 efter 3-4 h. Proteinexpression inducerades med användning av 1 mM IPTG. Efter 4 timmar, är den typiska OD av 1,5 uppnåtts. Bakteriekulturen skördades och utsattes för centrifugering. Supernatanten kasserades och cellpelleten vägdes. Den genomsnittliga vikten för cellpelleten var ca 3 g / Lkultur. Pelleten återsuspenderades i TEN-buffert och frystes vid -80 ° CO / N.

En serie av frysnings / upptiningscykler användes för att lysera cellerna. Den frysnings-upptiningssteg bringar cellen att svälla och krympa, slutligen brott till följd av iskristaller som bildas under frysprocessen. Därefter DNas I och RNas sattes till cellysatet för att smälta allt DNA och RNA. PMSF är en proteashämmare, som också sattes till cellysatet för att minimera proteinnedbrytning. För att ytterligare säkerställa fullständig cellys ades lysatet ytterligare sonikerat medan hålls på is.

Cellysatet utsattes sedan för tre cykler av ITC rening. Vid slutet av de tre cyklerna, pelleten vid slutet av den varma cykeln liknade honung i konsistens och hade en svag gul färg. Pelleten vände transparent vid kontakt med vatten och upplöstes lätt i förväg kylt autoklaveras vatten med skakning. Det renade proteinet dialyseras för att avlägsna eventuellt kvarvarande salt. Proteinlösningen som erhålles vid slutet av den sista varma cykeln överfördes till en kort längd av dialysslang (med 12 kDa molekylviktsgräns). Vid slutet av dialysen ades proteinlösningen överfördes till en ren 50 ml centrifugrör och frystes vid -20 ° C. Nästa dag var den frysta proteinlösningen lyofiliserades för att avlägsna vatteninnehållet. Figur 3 visar en bild av det dialyserade proteinet, som har en typisk ull-liknande utseende.

För att bestämma om proteinexpression verkligen var inducerades, prover före och efter induktion analyserades med SDS-PAGE-elektrofores. Här, var 12% SDS-PAGE-gel tillräcklig för att separera proteiner med molekylvikter av 20 till 150 kDa. I händelse av att molekylvikten är stort, det vill säga,> 100 kDa, 8% SDS-PAGE-geler kan användas för bättre proteinseparation. Figur 4 visar ett intensivt proteinband vid den förutsagda molekylvikten i den inducerade sample (spår 2). Typiskt var SDS-PAGE-analys utförs omedelbart efter proteinuttryck innan reningen påbörjas. Därefter prover genom reningsprocessen kan också analyseras med användning av SDS-PAGE-elektrofores för att säkerställa en effektiv rening av målproteinet. Figur 4 visar också en SDS-PAGE-gel innehållande ett renat proteinprov med en molekylvikt av 22 kDa (bana 4 ), motsvarande LN-5 AECM 14. Den uppskattade renhet AECM proteinerna var cirka 90% -95%; detta värde härleddes genom att jämföra förhållanden mellan bandintensiteterna för målproteinet och andra proteinband som är närvarande på SDS-gel (Figur 4, spår 4). Slutligen, för att bestämma om det renade proteinet var verkligen de AECM proteinerna, utfördes Western-blotting utfördes. Därefter MALDI-TOF utfördes också för att noggrant bestämma innehållet av det renade materialet 14 förorening. Figur 5 visar proteinrenhet av the tre AECM proteiner med en SDS-PAGE-gel i fig 5A och att jämföra mot en bild av nitrocellulosamembranet för western blotting i figur 5B, som visar närvaron av målproteinerna Col-IV AECM och LN-5 AECM, taggade med användning av anti -6x His-tag-antikroppar konjugerade med pepparrotsperoxidas (HRP). De slutliga utbytena av de AECM proteinerna uppgick till mellan 60 mg / l till 120 mg / l.

Figur 1
Figur 1. DNA agarosgelelektrofores av AECM proteiner. Kontroll av slut AECM protein DNA-konstruktioner genom restriktionsenzymerna matsmältningen körde på 1,2% DNA agarosgel. Rekombinanta plasmider som kodar för var och en av AECM proteinerna dubbeldigererades med Xhol och Sall under 3 h vid 37 ° C Storlekarna på insättningarna motsvarar storleken på varje AECM proteingenen (FN910: 1,8kbp, Col-IV: 696 bp, LN-5: 699 bp) och storleken av vektorn pET22b (+) som används är 5,5 kbp.

Figur 2
Figur 2. Schematisk flödet för proteinuttryck, lys och rening av AECM-proteiner. Den grundläggande guide för rekombinant proteinexpression, med början från inokulering av en enda koloni till små kultur och skala upp till en L kultur, skörd och återsuspendering av celler, följt av protein lys. Proteinrening utfördes genom användning av LCST beteende elastin-liknande domäner som är närvarande i de artificiella ECM-proteiner. De AECM proteinerna renas via ITC. Flera kalla och varma cykler utfördes för att uppnå en hög renhet hos målproteinet. Slutligen var målproteinet dialys med vatten och lyofiliserades tills vidare användning. "O / N" = över natten. "S / n" = vätskan.


Figur 3. Bild av lyofiliserat AECM protein renas genom Inverse Transition Cykling. Frystorkat LN5-AECM har en ull-liknande utseende.

Figur 4
Figur 4. SDS-PAGE-gelelektrofores av AECM-protein (LN-5 AECM). Spår 1 och 2 visar kultur före och efter proteininduktion. Förekomst av ett tjockt band nära 22 kDa visar att LN-5 AECM framgångsrikt uttrycktes. Bana 3 visar hela cellysatet medan rad 4 visar det renade LN-5 AECM protein efter 3 cykler av ITC.

Figur 5
Figur 5. (A) SDS-PAGE-gel av AECM proteinerna. (B) Western blot sonderade för 6x His-taggen för Col-IV Och LN-5 AECM proteiner. Båda Col-IV och LN-5 AECM proteiner innehåller C-terminal 6xHis-tag. Positiva kemiluminescens observerades vid den förutsagda molekylvikt på 22 kDa för prov LN-5 AECM och 24 kDa för prov Col-IV AECM representerar 6x His-tag förekommer i det renade proteinet.

<td rowspan = "9"> 2XYT media
Media / L Komponenter och instruktioner
SOC media 20 g trypton
5 g jästextrakt
0,6 g NaCl
0,2 g KCl
Lägg till och autoklav i 940 ml vatten,
lägg sedan till sterila (filtersteriliserat)
10 ml 1 M MgCl2
10 ml 1 M MgSO 4
40 ml 20% glukos
16 g trypton
10 g jästextrakt
5 g NaCl
15 g Bacto Agar (dessutom bara för agarplatta)
Lös i vatten och fyll upp till 1 L och autoklav.
För framställning av agarplattor, kyl till 55 ° C före tillsats av antibiotika.
Blanda väl före upphällningen i petriskål.
Låt plattorna svalna tills ägarn stelnar.
Linda plattorna i Parafilm och lagra upp och ner i 4 ° C.
Terrific Broth (TB) 12 g trypton
24 g jästextrakt
4 ml Glycerol
Lös i 700 ml vatten och autoklav.
16,42 g K 2 HPO 4(Merck)
2,31 g KH 2 PO 4 (Merck)
Lös i 300 ml vatten och autoklav separat, för att säkerställa salter är fullständigt upplöst.
Kombinera både medium och salter efter kylning.

Tabell 1. Recept för SOC media, 2xYT media / agar och Terrific Broth. Media för E. coli kultur används i molekylär kloning och proteinuttryck.

Lösning / L Komponenter och instruktioner
Coomassie Brilliant Blue-färgning 0,25 g Coomassie blueR250
100 ml Isättika
450 ml Metylalkohol
450 ml vatten
100 ml Isättika
400 ml Metylalkohol
500 ml vatten

Tabell 2. Recept på lösningar för att färga och avfärgning SDS-PAGE-gel. Coomassie Brilliant Blue R250 för färgning och en avfärgningslösning för karaktärisering med användning av SDS-PAGE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rekombinant protein engineering är en mångsidig teknik för att skapa nya proteinmaterial med hjälp av en bottom-up-strategi. De proteinbaserade material kan utformas för att ha flera funktioner, skräddarsys enligt ansökan av intresse. På grund av ökad befordran i klonings- och proteinexpressionstekniker, har det blivit relativt enkel (och kostnadseffektivt) för att skapa en mängd olika konstgjorda proteiner på ett reproducerbart och skalbart sätt. Elastin-liknande domänen har införlivats i ett antal konstgjorda proteiner, för att tjäna som en reningsmarkör, liksom att ge de mekaniska egenskaperna. Artificiella proteiner som innehåller en elastin-liknande sekvens kan lätt renas med användning av ITC, vilket eliminerar behovet av dyra reningskolonner och antikroppar.

Detta protokoll beskriver stegen för att bygga rekombinanta plasmider som kodar för AECM proteiner. Gener som kodar för elastin liknande upprepningar köptes. Förmycket repetitiva peptidsekvens som elastin som polypeptider, är det rekommenderat att utforma kloningsstrategin så att rekursiv riktad ligering (RDL) strategier kan användas 22. Genom att använda RDL kan repetitiva polypeptider med en specifik kedja längd syntetiseras och därför generna av intresse kan köpas som korta monomerer.

I vårt arbete har de cellbindande domänerna är avsett att innehålla flankerande Nhel-restriktionsställen på båda ändarna för att tillåta modulärt swapping av den centrala cellbindande domänen. Det är viktigt att välja restriktionsställen som är unika och inte är närvarande i den funktionella domänen eller någon annanstans utanför kloningsstället (MCS) i värdvektor multipeln. Detta för att begränsa nedbrytning av insatsen eller vektorn till de avsedda platserna. I vissa fall kan det vara nödvändigt att införa nya restriktionsställen i värdvektor med användning av mutagenes före införandet av den funktionella domänen.

Vårkloningsstrategi tillät oss att enkelt ändra centrala cellbindande domän för att få tre varianter av AECM proteiner. Vi noterade också att sätta in en lysinrest efter start metionin ökad proteinutbyte med mer än 10-faldigt. Denna dramatiska ökning av proteinutbyte var tydligast med LN-5 AECM protein, där den slutliga proteinutbytet ökat från 5 mg / L till 60 mg / L.

Olika E. coli expressionsvärdar jämfördes, och BL21 (DE3) pLysS E. coli-stam gav de bästa proteinutbyten. Förbättringen av proteinutbytet var minimal när proteinuttryck inducerades med IPTG under mer än fyra timmar. Det fanns ingen signifikant skillnad i proteinuttryck på IPTG koncentrationer större än 1 mm. Emellertid var proteinexpression den högsta när induceras vid OD närmare 0,6.

För effektiv återvinning av AECM proteiner med användning av ITC, är det viktigt att notera temperaturen i centrifugen. För examenpel, de flesta av de reningssteg utfördes i ett kylrum (4 ° C) för att säkerställa maximal löslighet AECM proteiner. Det kan också vara nödvändigt att i förväg kyla till (4 ° C), centrifugrotorn O / N innan den kalla cykeln. Likaså centrifugrotorn förvärmdes till (37 ° C) innan det varma cykeln för att säkerställa att temperaturen hos proteinlösningen hölls över sin T t.

Sammanfattningsvis, de förfaranden utforma och klona rekombinanta plasmider som kodar för artificiella ECM-proteiner beskrivs. I synnerhet uttrycket och reningen av AECM proteiner med hjälp av ITC som beskrivs. Slutligen har karakterisering av AECM proteiner med användning av SDS-PAGE-elektrofores och Western Blotting beskrivits.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Författarna vill tacka för finansiering från undervisningsministeriet AcRF Tier 1 (RG41) och startbidrag från Nanyang Technological University. Låg och Tjin finansieras av Vetenskaps Student Scholarship (RSS) från Nanyang Technological University, Singapore.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET22b (+) Novagen 69744 T7 expression vectors with resistance to ampicillin 
BL21(DE3)pLysS  Invitrogen C6060-03 additional antibiotics - chloramphenicol
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) Gold Biotechnology I2481C 1 M stock solution with autoclaved water, make fresh prior to induction.
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 plasmid isolation kit
T4 ligase New England Biolabs M0202S
Ampicillin Affymetrix 11259
Chloramphenicol Affymetrix 23660
Zymoclean™ gel DNA recovery kit Zymo Research D4001
XL10-gold strain Agilent Technologies 200315

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, Q., Liang, S., Thouas, G. A. Elastomeric biomaterials for tissue engineering. Prog Polym Sci. 38, (3-4), 584-671 (2013).
  2. Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering - In vivo and in vitro applications. Adv Drug Deliv Rev. 63, (4-5), 352-366 (2011).
  3. Kushner, A. M., Guan, Z. Modular Design in Natural and Biomimetic Soft Materials. Angewandte Chemie International Edition. 50, (39), 9026-9057 (2011).
  4. Gagner, J. E., Kim, W., Chaikof, E. L. Designing protein-based biomaterials for medical applications. Acta Biomater. 10, (4), 1542-1557 (2014).
  5. Gomes, S., Leonor, I. B., Mano, J. F., Reis, R. L., Kaplan, D. L. Natural and genetically engineered proteins for tissue engineering. Prog Polym Sci. 37, (1), 1-17 (2012).
  6. Werkmeister, J. A., Ramshaw, J. A. M. Recombinant protein scaffolds for tissue engineering. Biomedical Materials. 7, (1), 012002 (2012).
  7. MacNeil, S. Biomaterials for tissue engineering of skin. Materials Today. 11, (5), 26-35 (2008).
  8. Fong, E., Tirrell, D. A. Collective Cell Migration on Artificial Extracellular Matrix Proteins Containing Full-Length Fibronectin Domains. Advanced Materials. 22, (46), 5271-5275 (2010).
  9. Ratner, B. D., Bryant, S. J. BIOMATERIALS: Where We Have Been and Where We are Going. Annual Review of Biomedical Engineering. 6, (1), 41-75 (2004).
  10. Cai, L., Heilshorn, S. C. Designing ECM-mimetic materials using protein engineering. Acta Biomater. 10, (4), 1751-1760 (2014).
  11. Annabi, N., et al. Elastomeric recombinant protein-based biomaterials. Biochemical Engineering Journal. 77, (0), 110-118 (2013).
  12. Heilshorn, S. C., DiZio, K. A., Welsh, E. R., Tirrell, D. A. Endothelial cell adhesion to the fibronectin CS5 domain in artificial extracellular matrix proteins. Biomaterials. 24, (23), 4245-4252 (2003).
  13. Simnick, A. J., Lim, D. W., Chow, D., Chilkoti, A. Biomedical and Biotechnological Applications of Elastin-Like Polypeptides. Polymer Reviews. 47, (1), 121-154 (2007).
  14. Tjin, M. S., Chua, A. W. C., Ma, D. R., Lee, S. T., Fong, E. Human Epidermal Keratinocyte Cell Response on Integrin-Specific Artificial Extracellular Matrix Proteins. Macromolecular Bioscience. 14, (8), 1125-1134 (2014).
  15. MacNeil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445, (7130), 874-880 (2007).
  16. Kariya, Y., et al. Differential regulation of cellular adhesion and migration by recombinant laminin-5 forms with partial deletion or mutation within the G3 domain of α3 chain. J Cell Biochem. 88, (3), 506-520 (2003).
  17. Shang, M., Koshikawa, N., Schenk, S., Quaranta, V. The LG3 module of laminin-5 harbors a binding site for integrin α3Β1 that promotes cell adhesion, spreading, and migration. J Biol Chem. 276, (35), 33045-33053 (2001).
  18. Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Current Protocols in Protein Science. 6.11.1-6.11.16 (2010).
  19. Keeley, F. Ch. 4. Evolution of Extracellular Matrix.Biology of Extracellular Matrix. Springer. Berlin Heidelberg. 73-119 (2013).
  20. Le, D. H. T., et al. Self-Assembly of Elastin-Mimetic Double Hydrophobic Polypeptides. Biomacromolecules. 14, (4), 1028-1034 (2013).
  21. MacEwan, S. R., Hassouneh, W., Chilkoti, A. Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), e51583 (2014).
  22. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3, (2), 357-367 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics