Diseño y Construcción de Artificial matriz extracelular (AECM) Las proteínas de

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Low, P. S. J., Tjin, M. S., Fong, E. Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (100), e52845, doi:10.3791/52845 (2015).

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Abstract

Protocol

1. Clonación de plásmidos que codifican recombinante para AECM Proteínas

  1. Diseño de la secuencia de aminoácidos del dominio funcional (por ejemplo, el dominio de unión celular y elastina repeticiones similares). Sitios de restricción Diseño flanquean los extremos de los dominios funcionales para facilitar la sub-clonación usando software libre de acuerdo con las instrucciones del software (por ejemplo, http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). Aquí, seleccionar sitios de restricción únicos que no están presentes en el dominio funcional para confinar la digestión a los sitios previstos. Elige sitios de restricción que aparecen en el sitio de clonación múltiple (MCS) del vector de host (por ejemplo, pET22b (+)) para sub-clonación.
  2. Invertir traducir la secuencia de aminoácidos en la secuencia de nucleótidos utilizando sitios web gratuitos acuerdo con las instrucciones de software. (Por ejemplo, http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). Asegurarse de codones están optimizados para E. anfitriones coli.
  3. Gen de interés puede ser purchasoligonucleótidos ed comercialmente como una sola cadena (es decir, si los oligonucleótidos <100 pares de bases (pb)) y realizar el recocido de ADN (véase el paso 1.4) para reducir el costo. De lo contrario, los genes de más de 100 pb, que podían ser adquiridos a través de empresas comerciales.
  4. Recocido de ADN de los oligonucleótidos
    1. Recocer la oligómeros de ADN para obtener la secuencia del gen deseado. Disolver oligonucleótidos de ADN en un tampón de oligómero de ADN (mM Tris 10: 2-amino-2- (hidroximetil) propan-1,3-diol, pH 8,0, filtrada) a una concentración final de 1 g / l.
    2. Añadir 4 l de cada oligómero a 32 l de tampón de hibridación de ADN (Tris 10 mM, NaCl 100 mM y 100 nM de MgCl 2) para conseguir un total de mezcla de 40 l.
    3. Hervir un vaso de precipitados de agua utilizando una placa caliente y sumergir la mezcla durante 5 min, 95 ° C. Retire el vaso de precipitados y enfriar gradualmente la totalidad de configurar en una caja de espuma de poliestireno O / N. Los oligómeros han sido recocidas y están listos para la digestión.
    Añadir las enzimas de restricción correspondientes a digerir los oligómeros hibridados (es decir, referido como inserto) y vector huésped (es decir, pET22b (+)) por separado. Utilice la siguiente receta (1-2 g de ADN, 2 l de cada enzima de restricción, 5 l de tampón 10x enzima de restricción, y agua hasta un total mezcla de 50 l) durante 3-4 horas a 37 ° C.
    NOTA: El pET22b (+) plásmido vector es resistente a los antibióticos ampicilina y contiene un 6x-His tag en el extremo C-terminal. El 6x-His presente en pET22b (+) nos permite utilizar sus-etiquetados anticuerpos para identificar la proteína diana a través de Western Blot en el paso 7.
  5. Agregar colorante de carga 6x a cada mezcla de digestión. Ejecutar las mezclas de digestión por separado incluyendo una escalera de ADN en 1.2% geles de agarosa de ADN que contiene una mancha de ADN fluorescente UV durante 1 hora a 100 V. visualizar el DNA en gel de agarosa 1,2% con un iluminador de luz UV.
  6. Cortar el gel para extraer productos de ADN digeridos utilizando kits de purificación de gel comercial. Elute utilizando el volumen mínimo de la columna para lograr una concentración mínima de ADN de 50-100 ng / l.
  7. Combinar el gen de interés secuencialmente ligando el inserto de ADN digerido (es decir, repeticiones de elastina o dominios de unión de células obtenidos por recocido de ADN) en el vector de plásmido usando la ligasa de T4 utilizando la siguiente receta: (2 l de vector, 1 l de T4 ligasa, 1,5 l de tampón de ligación T4, x l de inserto, 10,5 x-l de agua para un total mezcla de 15 l). Incubar la mezcla de ligación a RT durante 2 hr.
    NOTA: la concentración molar del vector para insertar debe variar para optimizar la eficiencia de la ligadura. Volumen de inserto descrito como x en la receta depende de la concentración de ADN eluido de la etapa 1.7.
  8. Descongele E. células químicamente competentes coli DH5a (o cualquier cepa de clonación) en hielo. Placas de agar 2xYT caliente (Tabla 1) que contiene ampicilina (25 mg / ml) a 37 ° C.
  9. Transformar las células utilizandoGolpe de calor:
    1. Alícuota de 50 l de células competentes en tubos de microcentrífuga limpio, pre-refrigerados. Pipetear 5 l (entre 100 pg a 100 ng) de la mezcla de unión en las células, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Deje la mezcla en hielo durante 20 min.
    2. Sumergir el tubo de micro-centrífuga que contiene la mezcla de células en un baño de agua 42 ° C durante 2 min y vuelto a en hielo durante 2 min. Tiempo de la duración de inmersión para minimizar el daño por calor a las células.
    3. Añadir 500 l de medio SOC (Tabla 1) en el tubo de microcentrífuga y se incuba a 37 ° C con agitación durante 1 hr.
    4. Spread 50 500 l de la mezcla de células / ligadura sobre una placa de agar 2xYT que ha sido pre-calentado a RT, que contiene ampicilina (25 mg / ml) e incubar las placas al revés a 37 ° CO / N (12-16 hr) .
  10. Al día siguiente, escoja colonias de ADN de la placa de agar utilizando puntas de pipeta limpias. Cultivar las colonias en 5 ml de medio 2YT (Tabla1) que contiene ampicilina (25 mg / ml) O / N a 37 ° CO / N (12-16 hr) con agitación (225 rpm).
  11. Al día siguiente, utilice un kit de aislamiento de plásmido para extraer los plásmidos de ADN para cada colonia elegido de acuerdo con el protocolo del fabricante. Eluir el ADN con 50 l de agua.
  12. Realice una prueba de digerir con enzimas de restricción utilizando la siguiente receta: (ADN 5 l, 0,2 l de cada enzima de restricción, de amortiguamiento de la enzima 1 l 10x restricción y recarga de agua para un total mezcla de 10 l), se incuba durante 2 horas a 37 ° C para la detección de colonias que probablemente contienen el inserto y se ejecutan en un 1,2% en gel de agarosa de ADN como en el paso 1.6.
    NOTA: Después de la digestión, una ligadura de éxito debe resultados en dos grupos, uno para cada vector y el inserto que se corresponden con su respectivo peso molecular (Figura 1).
  13. Enviar las posibles colonias para la secuenciación de ADN utilizando promotor T7 cebadores directo e inverso a secuenciadores comerciales.

  1. Desde el resultado de la secuenciación, seleccionar una colonia que ha sido ligado con éxito y utilizar el plásmido de ADN para la transformación en una E. huésped de expresión coli.
  2. Descongele E. cepa de expresión coli (BL21 (DE3) pLysS) en hielo. Mientras tanto, las placas de agar caliente que contiene ampicilina (25 mg / ml) y cloranfenicol (34 mg / ml) a RT.
    NOTA: El plásmido presente en bacterias pLysS cepa BL21 (DE3) pLysS contiene un gen de resistencia a cloranfenicol. El plásmido pLysS contiene un gen represor T7 que se expresa constitutivamente a limitar la expresión de la proteína con fugas AECM. El cloranfenicol es necesario seleccionar para las células de bacterias que contiene pLysS durante el cultivo.
  3. Repita el paso 1,10 para obtener transformó E. células de E. coli que están listos para expresar las proteínas artificiales. Envolver las placas de agar en Parafilm y almacenar al revés en 4 6; C durante un máximo de un mes.

3. Expresión bacteriana de AECM Proteínas

  1. Consulte la Figura 2, elegir una colonia de la placa de agar transformada con una punta de pipeta e inocular en 10 ml de caldo Terrific (TB) medios estériles (Tabla 1) que contiene tanto los antibióticos ampicilina y cloranfenicol en un tubo de ensayo. Incubar este cultivo iniciador a 37 ° CO / N (12.16 h) con agitación a 225 rpm.
  2. Transferir 10 ml del cultivo iniciador en 1 L de medios de TB frescos y estériles suplementado con los mismos antibióticos en un matraz Erlenmeyer de 3 l. Incubar el cultivo a 37 ° C con agitación a 225 rpm durante 2-3 hr y observar la densidad óptica del cultivo (OD 600) alcanzado 0,6-0,8 pipeteando 1 ml de cultivo en una cubeta vacía para la lectura. Guardar 1 ml de cultivo antes de la inducción para la caracterización de SDS-PAGE.
    1. Para medir OD 600 del cultivo celular, preparar 1 vial de medios de comunicación de TB en una cubetapara una medición en blanco. Por otra parte, la transferencia de 1 ml de cultivo del matraz de cultivo en una nueva cubeta vacía. Medir la densidad óptica del cultivo usando un espectrofotómetro contra el blanco de control a una absorbancia de 600 nm.
    2. Guardar la muestra (para el análisis SDS-PAGE posterior) mediante la transferencia de los 1 ml de muestra de cultivo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, se centrifuga a 12.000 xg durante 2 min, y decantar el sobrenadante.
  3. Inducir la cultura con isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 1 mM y se incuba a 37 ° C con agitación a 225 rpm durante otras 4 h. Guardar 1 ml de cultivo al final de la inducción a 4 hr para la caracterización de SDS-PAGE.
  4. Recoger las células mediante la transferencia de la cultura a botellas de centrífuga de 1 L y se centrifuga a 12.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Descartar el sobrenadante, sopesar los sedimentos de células y resuspender en tampón TEN (Tris 1 M, 0,01 M EDTA, 0,1 M NaCl, pH = 8,0) a 0,5 g / ml.

4. La lisis de cultivos bacterianos

  1. Congelar la re-suspendido de cultivo celular a -80 ° CO / N. Descongelar el cultivo celular congelado en un baño de agua a temperatura ambiente o en hielo para lisar las células. Añadir 10 g / ml Deoxyribonuclease I (DNasa I), 10 mg / ml de ribonucleasa A (RNasa I), y 50 mg / ml de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) mientras que la descongelación y homogeneizar la solución con agitación lenta.
  2. Después de todas las células resuspendidas se descongelan, ajustar la solución a pH 9,0 para aumentar la solubilidad de la proteína en agua 12. Añadir 6 N de NaOH gota a gota con agitación en hielo para alcanzar una consistencia homogénea. Lyse por la interrupción de ultrasonidos durante 20 min en hielo utilizando una punta plana de diámetro 2 mm, 5 pulso seg.
  3. Centrifugar la solución de células a 12.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un frasco vacío y limpio y se almacena a 4 ° C para la purificación posterior.
  4. Mientras tanto, volver a suspender el sedimento celular nuevo con tampón TEN y volver a congelar a -80 ° C. Alisis celular completa, repetición de congelación / descongelación y sonicación proceso hasta tres veces. Ahorra un 20 lisado celular l para la caracterización de SDS-PAGE.

5. Purificación de proteínas usando AECM Inverse Transición Cycling

  1. Intercalar el lisado celular de la etapa 4.3 y proceder a purificar las proteínas AECM utilizando ITC, similar a la utilizada para la purificación de proteínas basado en elastina 21. Ciclos se hará con las diferentes temperaturas que son 4 ° C (referidos como "frío") y 37 ° C (referidos como "calientes") ciclos respectivamente.
  2. Dividir el lisado celular en 50 ml botellas de centrífuga, y se centrifuga a 40.000 xg durante 2 horas a 4 ° C. El aspecto del sedimento celular debe ser de color marrón oscuro y buscar nasal.
  3. Eliminar el sobrenadante con la pipeta para conseguir una separación limpia del sedimento. Recoger el sobrenadante en botellas de centrífuga limpio y añadir NaCl a una concentración final de 1 M (hasta un máximo de 3 M). Calientela solución a 37 ° C durante 2 horas con agitación a 225 rpm.
    NOTA: La adición de NaCl se disparará la transición del componente elastina de la AECM causando agregación. El sobrenadante se volverá turbia. Si la concentración de proteína es lo suficientemente alta, la proteína blanco espumoso se puede ver en los lados de la botella de centrífuga.
  4. Centrifugar el sobrenadante del paso 5.3 a 40.000 xg durante 2 horas a 37 ° C. Decantar el sobrenadante. Triturar el sedimento usando una espátula de metal y resuspender los bits de pellets en autoclave de agua destilada enfriada con hielo (50 mg / ml) con agitación vigorosa O / N a 4 ° C utilizando una barra de agitación magnética y la placa. El sedimento debe ser completamente disuelto.
  5. Repita los pasos 5.2 a 5.4 durante otros tres a cinco veces para obtener una mayor pureza de la proteína.
  6. Después del ciclo final de la purificación, desalar la solución de proteína por diálisis contra agua destilada a 4 ° C. Dializar solución de proteína contra el agua durante 2-3 días con los cambios de agua cada 4hr o 8 horas de O / N. Ahorre 20 l de la proteína purificada por SDS-PAGE y liofilizar el resto de la proteína purificada y almacenar a -80 ° C hasta su uso posterior.

6. Caracterización de AECM proteínas utilizando SDS-PAGE electroforesis

  1. Preparar un gel de SDS-PAGE al 12% (si el peso molecular es grande, utilice 8% en geles de SDS-PAGE para una mejor separación). Añadir tampón de carga SDS 2x a cada muestra, calentar las muestras durante 10 min a 100 ° C y ejecutar muestras en el gel durante 1 hora a 100 V o hasta que la escalera de proteína correspondiente al peso molecular de la proteína AECM alcanza el medio de la gel.
  2. Recuperar el gel de la SDS-PAGE configurar y añadir Coomassie Brilliant mancha azul (Tabla 2) con un volumen de sumergir el gel durante 1 hora en una placa de Petri. Enjuague el gel en una solución decolorante (Tabla 2) durante 5 min en un eje de balancín. Cambie la solución decolorante, y continuar destain el gel con balanceo hasta que el fondo de tél gel se vuelve claro. Las bandas de proteínas deben ser claramente visibles.
  3. Comparación de la posición de la proteína diana contra la escalera de proteínas para determinar el peso molecular de la proteína diana.
  4. Para confirmar aún más la presencia de la proteína diana, lleve a cabo el Western Blot como en el paso 7.

7. Caracterización de AECM proteínas usando Western Blotting

  1. Ejecute las muestras en un gel SDS-PAGE al 12%, como en la sección 6 sin manchas.
  2. Cortar membrana de nitrocelulosa a un tamaño ligeramente mayor que el gel SDS-PAGE. Cortar 4 trozos de papel de filtro para el mismo tamaño.
  3. Moje un pedazo de papel de filtro con transferencia Western Buffer (20% v / v de metanol, 25 mM Tris, 190 mM de glicina, pH 8,3), colocar el gel SDS-PAGE en la parte superior del papel de filtro, seguido de otro pedazo de papel de filtro , a continuación, la membrana de nitrocelulosa y una final otros dos trozos de papel de filtro. Asegúrese de que el conjunto de configuración se sumerge con tampón de transferencia occidental suficiente.
    NOTA: El gel y la membrana no deben estar en contacto en este punto de tiempo como proteínas podrían unirse a la membrana tras el contacto.
  4. Transferir las proteínas en la membrana de nitrocelulosa mediante la colocación de dos papeles de filtro en una unidad de transferencia semiseca occidental, seguido de la membrana de nitrocelulosa, y coloque cuidadosamente el gel SDS-PAGE de dentro y de la membrana, por último colocar el último papel de filtro húmedo en dos el gel SDS-PAGE. Ejecutar la transferencia oeste a 45 mA, 30 min. Añadir búfer si el voltaje es superior a 30 V.
    NOTA: De preferencia colocar el gel SDS-PAGE en la membrana con un intento y evitar cambiar el gel de forma innecesaria en la membrana como proteínas podrían unirse a la membrana al entrar en contacto.
  5. Recuperar y bloquear la membrana de nitrocelulosa con solución de bloqueo (leche desnatada al 5% en PBS pH 7,4, se filtró con papel de filtro) durante 2 horas a RT. Deshágase de tampón de bloqueo y añadir PBS para enjuagar.
    NOTA: El cambio a los nuevos guantes para evitar la contaminación de la membrana con prote no deseadoins.
  6. Incubar anticuerpo anti-His primaria con la dilución en PBS a 1: 1000 a RT durante 1 hr con balanceo. Preparar una mezcla en un volumen que podría sumergir toda la membrana, por ejemplo, con relación de dilución 1: 1.000, añadir 1 l de anticuerpo (concentración Stock: 1 mg / ml) a 999 l de PBS para una mezcla total de 1 ml.
  7. Enjuague la membrana con 5 ml de PBST (PBS con 0,1% de Tween 20).
  8. Incubar con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) con una dilución en PBS a 1: 5000 a RT durante 1 hr con balanceo. Preparar una mezcla en un volumen que podría sumergir toda la membrana, por ejemplo, con relación de dilución 1: 5.000, añadir 1 l de anticuerpo (concentración Stock: 1 mg / ml) a 4999 l de PBS para una mezcla total de 5 ml.
  9. Se lava la membrana con 5 ml de PBST y repetir dos veces.
  10. Aplicar el sustrato quimioluminiscente a la membrana con un volumen para cubrir la membrana y se incuba siguiendo las instrucciones para el sustrato utilizado.
    NOTA: La sensibilidad de la detección de la proteína sustrato que puede variar, se recomienda un sustrato con la máxima sensibilidad para señales muy bajas en el caso de aumento de la concentración de anticuerpo no aumenta señales.
  11. Captura de las señales de quimioluminiscencia utilizando un generador de imágenes basada cámara CCD. Ajustar la relación de dilución de anticuerpo primario y secundario si las señales son débiles y no específica. Incubar ya en solución de bloqueo si la señal de fondo es alto.

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Representative Results

En el diseño de proteínas de fusión que contienen repeticiones tipo elastina, es importante para mantener un contenido de elastina en general, gran parte suficiente de la proteína de fusión 18. Esto es para asegurar que el constructo de proteína de fusión conserva sus características tipo elastina, con el fin de utilizar ITC para la purificación. El diseño y las secuencias de proteínas descritas en esta sección AECM se tomaron específicamente de la obra por Tjin et al. 14. En este trabajo, tres proteínas AECM se clonaron con éxito en el vector de expresión pET22b (+). Ligación secuencial primero comenzó con la ligadura de las repeticiones de elastina se insertan en el vector pET, seguido de insertar el dominio de unión celular. Finalmente se inserta el último conjunto de repeticiones de elastina en el extremo terminal del dominio de unión celular utilizando el mismo método. Para verificar si los genes recombinantes se han construido con éxito, cada plásmido recombinante se digirió el ensayo con XhoI y SalI durante 3 horas a 37 °C. La Figura 1 muestra el inserto de ADN y las bandas de vector después de la digestión de prueba. Para cada una de las proteínas AECM, el tamaño de los insertos correspondía al tamaño del gen, lo que confirma que la clonación era de hecho un éxito. Además verificación a través de la secuenciación del ADN también confirmó los resultados de digestión prueba.

Hemos sido capaces de purificar las proteínas a través de AECM suficiente contenido de elastina ITC dado presente en cada proteína AECM. La Figura 2 muestra el esquema del proceso global de purificación. El cultivo O / N se inoculó en matraz de agitación 1 L con un OD de partida típico 600 de 0,01. La cultura creció a OD 600 de 0,6 a 0,8 después de 3-4 horas. La expresión de proteínas se indujo usando 1 mM de IPTG. Después de 4 horas, se logra la DO típica de 1,5. El cultivo bacteriano se recogió y se sometió a centrifugación. El sobrenadante se descartó y el sedimento celular se pesó. El peso medio de la sedimento celular fue de aproximadamente 3 g / L decultura. El sedimento se resuspendió en tampón TEN y se congeló a -80 ° CO / N.

Una serie de ciclos de congelación / descongelación se utilizaron para la lisis de las células. La etapa de congelación-descongelación hace que la célula a hincharse y encogerse, en última instancia, romper debido a los cristales de hielo formados durante el proceso de congelación. Posteriormente, DNasa I y RNasa I se añadieron a la lisado celular para digerir todo el ADN y el ARN. PMSF es un inhibidor de la proteasa, que también se añadió al lisado celular para minimizar la degradación de proteínas. Mientras que para garantizar aún más la lisis celular completa, el lisado se sometió a ultrasonidos más mantuvo en hielo.

El lisado celular se sometió a 3 ciclos de purificación ITC. Al final de los 3 ciclos, el sedimento al final del ciclo de calentamiento se parecía a la miel en la consistencia y tenía una leve coloración amarilla. El sedimento se volvió transparente tras el contacto con agua, y se disuelve fácilmente en agua en autoclave pre-enfriada con agitación. La proteína purificada se dializa para eliminar cualquier s residualesalt. La solución de proteína obtenida al final del ciclo de calentamiento final fue transferida a una longitud corta de tubo de diálisis (con 12 kDa de peso molecular cortado). Al final de la diálisis, la solución de proteína se transfirió a un tubo de centrífuga de 50 ml limpio y se congeló a -20 ° C. El día siguiente, la solución de proteína congelada se liofilizó para eliminar el contenido de agua. La figura 3 muestra una imagen de la proteína dializada, que tiene una apariencia típica similar a la lana.

Para determinar si la expresión de la proteína se indujo de hecho, las muestras recogidas antes y después de la inducción se analizaron por electroforesis en SDS-PAGE. Aquí, 12% de gel de SDS-PAGE fue suficiente para separar las proteínas con pesos moleculares de 20-150 kDa. En el caso de que el peso molecular es grande, es decir,> 100 kDa, 8% en geles de SDS-PAGE se podrían utilizar para una mejor separación de proteínas. La figura 4 muestra una banda de proteína intensa en el peso molecular predicho en el sa inducidample (carril 2). Típicamente, el análisis de SDS-PAGE se realizó inmediatamente después de la expresión de proteínas antes de que comience la purificación. Posteriormente, las muestras tomadas a través del proceso de purificación también podría ser analizado utilizando electroforesis en SDS-PAGE para asegurar la purificación eficiente de la proteína diana. Figura 4 también muestra un gel de SDS-PAGE que contenía una muestra de proteína purificada con un peso molecular de 22 kDa (carril 4 ), correspondiente a la LN-5 AECM 14. La pureza estimada de las proteínas AECM era aproximadamente el 90% -95%; este valor se derivó mediante la comparación de proporciones de las intensidades de banda de la proteína diana y otras bandas de proteínas presentes en el gel de SDS (Figura 4, carril 4). Por último, para determinar si la proteína purificada era de hecho las proteínas AECM, se realizó el Western Blot. Posteriormente, MALDI-TOF también se realizó para determinar con precisión el contenido de impurezas del material purificado 14. La Figura 5 muestra la pureza de la proteína THe tres proteínas con AECM un gel de SDS-PAGE en la figura 5A y para comparar contra una imagen de la membrana de nitrocelulosa para transferencia de western en la Figura 5B, muestra la presencia de las proteínas diana Col-IV AECM y LN-5 AECM, etiquetados utilizando anti -6x anticuerpos Su-etiqueta-conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP). Los rendimientos finales de las proteínas AECM oscilaron entre 60 mg / L a 120 mg / L.

Figura 1
Figura 1. ADN electroforesis en gel de agarosa de las proteínas AECM. Verificación de la proteína final AECM construcciones de ADN a través de las enzimas de restricción digestión corrió en 1,2% en gel de agarosa de ADN. Los plásmidos recombinantes que codifican para cada una de las proteínas AECM se digirieron doble con XhoI y SalI durante 3 horas a 37 ° C. Los tamaños de los insertos se corresponden con el tamaño de cada gen de la proteína AECM (FN910: 1,8kpb, Col-IV: 696 pb, LN-5: 699 pb) y el tamaño del vector pET22b (+) que se utiliza es de 5,5 kpb.

Figura 2
Figura 2. Esquema de flujo para la expresión de la proteína, la lisis y purificación de proteínas AECM. La guía básica para la expresión de la proteína recombinante, a partir de la inoculación de una sola colonia a pequeña cultura y escalar hasta 1 l de cultivo, la cosecha y la resuspensión de las células, seguido por la lisis de proteínas. Purificación de proteínas se llevó a cabo mediante el uso de comportamiento LCST de los dominios de tipo elastina presentes en las proteínas ECM artificiales. Las proteínas AECM se purifican a través de las TIC. Se llevaron a cabo múltiples ciclos fríos y calientes para lograr una alta pureza de proteína diana. Por último, la proteína diana se dializa con agua y se liofilizó hasta su uso posterior. "O / N" = durante la noche. "S / n" = sobrenadante.


Figura 3. Imagen de la proteína liofilizada AECM purificada por Inverse Transición Ciclismo. Liofilizada LN5-AECM tiene una apariencia similar a la lana.

Figura 4
Figura 4. SDS-PAGE electroforesis en gel de proteína AECM (LN-5 AECM). El carril 1 y 2 muestra cultivo antes y después de la inducción de proteínas. La presencia de una banda gruesa cerca de 22 kDa muestra que el LN-5 AECM se expresó con éxito. Carril 3 muestra el lisado celular completo, mientras que el carril 4 muestra la proteína AECM LN-5 purificada después de 3 ciclos de ITC.

Figura 5
Figura 5. gel (A) SDS-PAGE de las proteínas AECM. (B) Western blot probaron para 6x His-tag para ColProteínas -IV y LN-5 AECM. Ambas proteínas Col-IV y LN-5 AECM contienen C-terminal 6xHis-tag. Quimioluminiscencia positiva observada en el peso molecular predicho a 22 kDa para la muestra LN-5 AECM y 24 kDa para la muestra Col-IV AECM representa 6x His-tag presente en la proteína purificada.

<rowspan td = "9"> medios 2xYT
Medios / L Componentes e instrucciones
Medios de comunicación SOC 20 g de triptona
5 g de extracto de levadura
0,6 g NaCl
0,2 g KCl
Agregar y autoclave en agua 940 ml,
a continuación, añadir estéril (filtro esterilizado)
10 ml 1 M de MgCl 2
10 ml 1 M MgSO 4
40 ml 20% de glucosa
16 g de triptona
10 g de extracto de levadura
5 g de NaCl
15 g de Bacto Agar (adición única para la placa de agar)
Disolver en agua y completar hasta 1 L y autoclave.
Para preparar las placas de agar, fresco a 55 ° C antes de la adición de antibióticos.
Mezclar bien antes de verter en la placa de Petri.
Enfriar las placas hasta que se solidifica agar.
Envuelva las placas en Parafilm y almacenar al revés en 4 ° C.
Caldo Terrific (TB) 12 g de triptona
24 g de extracto de levadura
4 ml de glicerol
Disolver en agua 700 ml y autoclave.
16,42 g K 2 HPO 4(Merck)
2,31 g de KH 2 PO 4 (Merck)
Disolver en agua 300 ml y autoclave por separado, para asegurar sales se disuelven completamente.
Combinar ambos medio y sales después del enfriamiento.

Tabla 1. Recetas de medio SOC, 2xYT media / agar y caldo Terrific. Medios para E. cultivo de E. coli utilizado en la clonación molecular y expresión de proteínas.

Solución / L Componentes e instrucciones
Coomassie Brilliant mancha azul 0,25 g de Coomassie blueR250
100 ml de ácido acético glacial
Alcohol 450 ml de metilo
Agua 450 ml
100 ml de ácido acético glacial
Alcohol 400 ml de metilo
Agua 500 ml

Tabla 2. Recetas de soluciones para manchar y destain gel de SDS-PAGE. Azul Brillante de Coomassie R250 para la tinción y una solución decolorante para la caracterización mediante SDS-PAGE.

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Discussion

Ingeniería de proteínas recombinantes es una técnica versátil para crear materiales de proteínas novedosas utilizando un enfoque de abajo hacia arriba. Los materiales basados ​​en proteínas pueden ser diseñados para tener múltiples funcionalidades, adaptado de acuerdo con la aplicación de interés. Debido a la creciente avance en las tecnologías de clonación y expresión de proteínas, se ha convertido en relativamente simple (y rentable) para crear una variedad de proteínas artificiales de una manera reproducible y escalable. El dominio de la elastina como ha sido incorporado en un número de proteínas artificiales, para servir como una etiqueta de purificación, así como para conferir propiedades mecánicas. Proteínas artificiales que contienen una secuencia de elastina como pueden purificarse fácilmente usando ITC, lo que elimina la necesidad de columnas de purificación costosos y anticuerpos.

Este protocolo se describen los pasos para la construcción de plásmidos recombinantes que codifican para las proteínas AECM. Los genes que codifican para las repeticiones tipo elastina se compraron. Porsecuencia peptídica altamente repetitiva como la elastina como polipéptidos, se recomienda para diseñar la estrategia de clonación tal que (RDL) estrategias de ligación direccional recursiva se pueden utilizar 22. Mediante el uso de RDL, polipéptidos repetitivas con una longitud de cadena específica podrían ser sintetizados y por lo tanto los genes de interés se pueden comprar como monómeros cortos.

En nuestro trabajo, los dominios de unión celular fueron diseñados para contener sitios de restricción que flanquean NheI en ambos extremos para permitir el intercambio modular del dominio de unión celular central. Es importante seleccionar sitios de restricción que son únicos y no están presentes en el dominio funcional o en otro lugar fuera del sitio de clonación múltiple (MCS) del vector de host. Esto es para confinar la digestión de la inserción o vector a los sitios previstos. En algunos casos, puede ser necesario introducir nuevos sitios de restricción en el vector de host mediante mutagénesis antes de la inserción del dominio funcional.

Nuestroestrategia de clonación nos permitió cambiar fácilmente el dominio de unión celular central para obtener tres variantes de proteínas AECM. También señaló que la inserción de un residuo de lisina después de la metionina de partida se incrementó la producción de proteína en más de 10 veces. Este dramático incremento en el rendimiento de proteína fue más evidente con LN-5 proteína AECM, donde el rendimiento final de proteína aumentó de 5 mg / L a 60 mg / L.

Varios E. coli expresión anfitriones fueron comparados, y el BL21 (DE3) pLysS E. coli cepa dio los mejores rendimientos de proteína. La mejora en el rendimiento de proteína fue mínima cuando la expresión de proteínas se indujo con IPTG durante más de 4 h. No hubo diferencia significativa en la expresión de proteínas a concentraciones de IPTG mayor de 1 mm. Sin embargo, la expresión de proteínas fue el más alto cuando se induce a una DO más cerca de 0,6.

Para la recuperación eficaz de proteínas AECM utilizando ITC, es importante tener en cuenta la temperatura del aparato de centrífuga. Para el examenplo, la mayoría de las etapas de purificación se llevaron a cabo en una habitación fría (4 ° C) para asegurar la solubilidad máxima de las proteínas AECM. También puede ser necesario pre-enfriamiento a (4 ° C) la centrífuga rotor O / N antes del ciclo de frío. Del mismo modo, el rotor de la centrifugadora se pre-calienta a (37 ° C) antes del ciclo de calentamiento para asegurar que la temperatura de la solución de proteína se mantuvo por encima de su T t.

En resumen, los procedimientos para diseñar y plásmidos recombinantes clones que codifican proteínas ECM artificiales se describen. En particular, la expresión y purificación de las proteínas utilizando AECM ITC se describen. Finalmente, la caracterización de las proteínas AECM utilizando electroforesis en SDS-PAGE y transferencia Western fueron descritos.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a la financiación del Ministerio de Educación ACRF Tier 1 (RG41) y puesta en marcha beca de la Universidad Tecnológica de Nanyang. Bajo y Tjin son financiados por la Beca Estudiantil de Investigación (RSS) de la Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET22b (+) Novagen 69744 T7 expression vectors with resistance to ampicillin 
BL21(DE3)pLysS  Invitrogen C6060-03 additional antibiotics - chloramphenicol
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) Gold Biotechnology I2481C 1 M stock solution with autoclaved water, make fresh prior to induction.
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 plasmid isolation kit
T4 ligase New England Biolabs M0202S
Ampicillin Affymetrix 11259
Chloramphenicol Affymetrix 23660
Zymoclean™ gel DNA recovery kit Zymo Research D4001
XL10-gold strain Agilent Technologies 200315

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