Ontwerp en constructie van kunstmatige extracellulaire matrix (AECM) Eiwitten uit

JoVE Journal
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Low, P. S. J., Tjin, M. S., Fong, E. Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (100), e52845, doi:10.3791/52845 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Klonering van recombinant plasmiden die coderen voor eiwitten AECM

  1. Ontwerp van de aminozuursequentie van de functionele domein (bijvoorbeeld celbindende domein en elastine-achtige herhalingen). Ontwerp restrictieplaatsen flankeren de uiteinden van de functionele domeinen te vergemakkelijken sub-kloneren met behulp van gratis software volgens de instructies van de software (bijv http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). Select unieke restrictieplaatsen die niet in de functionele domein digestie beperken tot de beoogde sites. Kies restrictieplaatsen die in de meervoudige kloneringsplaats (MCS) van de gastheer vector verschijnt (bijvoorbeeld, pET22b (+)) te subkloneren.
  2. Reverse vertalen de aminozuur- sequentie in de nucleotidesequentie behulp vrij websites volgens instructies van de software. (Bijv http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). Controleer codons zijn geoptimaliseerd voor E. coli gastheren.
  3. Gen van belang kan zijn purchased commercieel als enkelstrengs oligonucleotiden (bijvoorbeeld, indien de oligonucleotiden <100 baseparen (bp)) en voer DNA annealing (zie stap 1.4) de kosten te verlagen. Anders naar genen die groter zijn dan 100 bp, ze kunnen worden gekocht via commerciële bedrijven.
  4. DNA hybridisatie van de oligonucleotiden
    1. Hybridiseren de DNA oligomeren aan de gewenste gensequentie te verkrijgen. Los DNA oligonucleotiden in een DNA-oligomeer buffer (10 mM Tris: 2-amino-2- (hydroxymethyl) propaan-1,3-diol, pH 8,0, gefilterd) tot een eindconcentratie van 1 ug / ul.
    2. Voeg 4 pi van elk oligomeer tot 32 pl DNA hybridisatie buffer (10 mM Tris, 100 mM NaCI en 100 nM MgCl2) tot totaal 40 pi mengsel te bereiken.
    3. Kook een bekerglas water met een kookplaat en onderdompelen gedurende 5 min, 95 ° C het mengsel. Verwijder de beker en geleidelijk afkoelen de set-up in een piepschuim doos O / N gehele. De oligomeren zijn getemperd en zijn klaar voor de spijsvertering.
    Voeg de overeenkomstige restrictie-enzymen om de gegloeide oligomeren (bijv genoemd insert) en gastheer vector (bijv pET22b (+)) afzonderlijk verteren. Met het volgende recept (1-2 pg DNA, 2 pi van elk restrictie-enzym, 5 ui 10X restrictie-enzym buffer en water tot in totaal 50 pi mengsel) gedurende 3-4 uur bij 37 ° C.
    OPMERKING: De pET22b (+) plasmide-vector is ampicilline antibiotica-resistente en bevat een 6x His-tag aan het C-terminus. De 6x His-tag aanwezig in pET22b (+) kunnen we-His-gemerkte antilichamen gebruiken om het doeleiwit in stap 7 identificeren via Western blotting.
  5. Voeg 6x loading dye elke digestiemengsel. Voer de digestie af- zonderlijk omvattende een DNA ladder op 1,2% agarosegels DNA bevattende een UV-fluorescerende DNA kleuring gedurende 1 uur bij 100 V. visualiseren 1,2% DNA agarose gel met UV licht belichtingstoestel.
  6. Snijd de gel om verteerd DNA-producten met behulp van commerciële gel zuivering kits te halen. Elute met de minimaal volume van de kolom tot ten minste DNA concentratie van 50-100 ng / pl te bereiken.
  7. Combineer het gen van belang achtereenvolgens door het ligeren van het gedigereerde DNA insert (bijv elastine repeats of celbinding domeinen verkregen DNA annealing) in de plasmidevector toepassing van T4 ligase met het volgende recept: (2 pl vector, 1 pi T4-ligase, 1,5 pl T4 ligatiebuffer, x pi insert, 10,5-x pi water gedurende in totaal 15 pi mengsel). Incubeer het ligatiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
    OPMERKING: Molaire concentratie vector te voegen moet variëren om ligatie te optimaliseren. Hoeveelheid inzetstuk genaamd x in het recept is afhankelijk van het geëlueerde DNA-concentratie van stap 1.7.
  8. Thaw E. coli DH5a chemisch competente cellen (of klonen stam) op ijs. Warm 2xYT agar-platen (Tabel 1) dat ampicilline (25 gg / ml) tot 37 ° C.
  9. Transformeer de cellen met behulpheat shock:
    1. Aliquot 50 pi competente cellen in schone, pre-gekoelde micro-centrifuge buizen. Pipetteer 5 ul (tussen 100 pg tot 100 ng) van het ligatiemengsel in de cellen voorzichtig pipetteren en neer te mengen. Laat het mengsel op ijs gedurende 20 minuten.
    2. Dompel de micro-centrifuge buis met de cel mengsel in een 42 ° C waterbad gedurende 2 minuten en keerde terug naar op ijs gedurende 2 minuten. Tijd de onderdompeling duur om warmte schade aan de cellen te minimaliseren.
    3. Voeg 500 gl SOC medium (tabel 1) in de micro-centrifugebuis en incubeer bij 37 ° C onder schudden gedurende 1 uur.
    4. Verspreid 50 500 pi van de cellen / ligatiemengsel op een 2 x YT agar plaat die is voorverwarmd tot KT, dat ampicilline (25 ug / ml) en incubeer platen omgekeerd bij 37 ° CO / N (12-16 uur) .
  10. De volgende dag, pick DNA kolonies van de agar plaat met schoon pipet tips. Groeien de kolonies in 5 ml 2YT medium (Tabel1) dat ampicilline (25 ug / ml) O / N bij 37 ° CO / N (12-16 uur) onder schudden (225 rpm).
  11. De volgende dag gebruikt een plasmide isolatiekit het DNA plasmiden extraheer gedurende elke kolonie opgepikt volgens het protocol van de fabrikant. Elueer het DNA met 50 ui water.
  12. Voer een test digest met restrictie-enzymen met het volgende recept: (5 ul DNA, 0,2 pl van elk restrictie-enzym, 1 gl 10x restrictie-enzym buffer bijvullen water gedurende in totaal 10 pi mengsel), incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C voor het screenen op kolonies die waarschijnlijk bevatten de insert en run op 1,2% DNA agarosegel zoals in stap 1.6.
    OPMERKING: Bij digestie, een succesvolle ligatie moet resulteert in twee banden, een voor elk van vector en insert die aan hun respectievelijke molecuulgewicht (figuur 1).
  13. Stuur de waarschijnlijke kolonies voor DNA-sequencing met behulp van T7 promotor voorwaartse en achterwaartse primers commerciële sequencers.

  1. Uit de sequencing resultaat, selecteer een kolonie die met succes geligeerd en gebruik de DNA-plasmide voor transformatie in een E. coli expressie gastheer.
  2. Thaw E. coli-expressie stam (BL21 (DE3) pLysS) op ijs. Ondertussen warme agar platen die ampicilline (25 gg / ml) en chlooramfenicol (34 ug / ml) tot kamertemperatuur.
    OPMERKING: De pLysS plasmide aanwezig bacteriestam BL21 (DE3) pLysS bevat een chloramfenicol resistentiegen. De pLysS plasmide bevat een T7 repressor gen dat constitutief tot expressie wordt gebracht om lekkende expressie van het eiwit AECM beperken. Chloramphenicol noodzakelijk te selecteren op bacteriecellen die pLysS bevat tijdens kweken.
  3. Herhaal stap 1,10 te verkrijgen getransformeerde E. coli-cellen die klaar zijn om de kunstmatige eiwitten tot expressie zijn. Wikkel agar platen in Parafilm en opslaan ondersteboven in 4 6; C gedurende maximaal één maand.

3. Bacteriële Expressie van AECM Eiwitten

  1. Zie Figuur 2, kies een kolonie van de getransformeerde agarplaat met een pipetpunt en beënt in 10 ml steriel Terrific Broth (TB) medium (tabel 1) die zowel ampicilline en chlooramfenicol antibiotica in een reageerbuis. Incubate dit starter cultuur bij 37 ° CO / N (12-16 uur) onder schudden bij 225 rpm.
  2. Breng 10 ml van de startercultuur in 1 L verse en steriele media TB aangevuld met dezelfde antibiotica in een 3 L Erlenmeyer kolf. Incubeer de kweek bij 37 ° C onder schudden bij 225 rpm gedurende 2-3 uur en observeer de optische dichtheid van de kweek (OD 600) bereikt 0,6-0,8 pipetteren 1 ml kweek in een lege cuvet te lezen. Sla 1 ml van de cultuur voorafgaand aan de inductie voor SDS-PAGE karakterisering.
    1. Om OD 600 van de celkweek te meten, voor te bereiden 1 flacon van TB media in een cuvetvoor een blanco meting. Afzonderlijk, overdracht 1 ml van de cultuur van de kolf in een nieuwe lege cuvet. Meet de optische dichtheid van de kweek onder toepassing van een spectrofotometer tegen de blanco controle bij een absorptie van 600 nm.
    2. Sla het monster (voor volgende SDS-PAGE-analyse) in door de 1 ml cultuur monster in een 1,5 ml microcentrifugebuis, centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 2 min, en decanteer supernatant.
  3. Braken de kweek met isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) tot een uiteindelijke concentratie van 1 mM en incubeer bij 37 ° C onder schudden bij 225 rpm gedurende nog 4 uur. Sla 1 ml kweek eind inductie bij 4 uur voor SDS-PAGE karakterisatie.
  4. Oogst de cellen door overdracht van de cultuur aan 1 L centrifugeflessen en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant, wegen de celpellets en resuspendeer in TEN buffer (1 M Tris, 0,01 M EDTA, 0,1 M NaCl, pH = 8,0) en 0,5 g / ml.

4. Lysis van bacterieculturen

  1. Freeze de re-opgeschort celcultuur bij -80 ° CO / N. Ontdooi de bevroren celkweek in een waterbad bij kamertemperatuur of op ijs om de cellen te lyseren. Voeg 10 ug / ml Deoxyribonuclease I (DNase I), 10 ug / ml ribonuclease A (RNase I), en 50 ug / ml fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), terwijl ontdooien en homogeniseer de oplossing langzaam roeren.
  2. Immers geresuspendeerde cellen zijn ontdooid, stel de oplossing op pH 9,0 om de oplosbaarheid in water 12 eiwit te verhogen. Voeg 6 N NaOH druppelsgewijs onder roeren op ijs een homogene consistentie. Lyse door ultrasone verstoring gedurende 20 min op ijs met behulp van een 2 mm diameter platte tip, 5 sec puls.
  3. Centrifugeer de cellen oplossing bij 12.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Breng de supernatant naar een schone, lege fles en bewaar bij 4 ° C voor zuivering later.
  4. Ondertussen, resuspendeer de celpellet opnieuw met TEN buffer en opnieuw invriezen bij -80 ° C. Naarvolledige cellyse herhalen invriezen / ontdooien en sonificatie proces tot drie maal. Bespaar 20 ul cellysaat voor SDS-PAGE karakterisering.

5. Zuivering van AECM eiwitten met behulp van Inverse Transition Fietsen

  1. Sorteren het cellysaat uit stap 4.3 en naar de AECM eiwitten met behulp ITC, vergelijkbaar met die toegepast voor de zuivering van elastine-gebaseerde eiwitten 21 te zuiveren. Cycles zal geschieden met de verschillende temperaturen die 4 ° C (aangeduid als "cold") en 37 ° C (aangeduid als "warm") cycli.
  2. Verdeel het cellysaat in 50 ml centrifuge flessen en centrifugeer bij 40.000 xg gedurende 2 uur bij 4 ° C. Het uiterlijk van de cel pellet moet donkerbruin zijn en kijken loopneus.
  3. Verwijder het supernatant door pipetteren een schone scheiding van de pellet krijgen. Verzamel de bovenstaande vloeistof in schone centrifugeflessen en voeg NaCl tot een eindconcentratie van 1 M (maximaal 3 M). Warmde oplossing tot 37 ° C gedurende 2 uur onder schudden bij 225 rpm.
    OPMERKING: toevoeging van NaCl de overgang van de elastine component van de AECM veroorzaken aggregatie veroorzaken. De supernatant wordt ingeschakeld troebel. Wanneer de eiwitconcentratie hoog genoeg is, kunnen witte schuimachtige eiwit te zien aan de zijkanten van de centrifugefles.
  4. Centrifugeer de supernatant van stap 5,3 bij 40.000 xg gedurende 2 uur bij 37 ° C. Schenk de bovenstaande vloeistof. Plet de pellet met een metalen spatel en resuspendeer de pellet bits in ijskoud geautoclaveerd gedestilleerd water (50 mg / ml) onder krachtig roeren O / N bij 4 ° C met een magnetische roerstaaf en plaat. De pellet moet volledig worden opgelost.
  5. Herhaal stap 5,2-5,4 nog drie tot vijf keer een hogere zuiverheid van het eiwit te verkrijgen.
  6. Na de laatste cyclus van zuivering, ontzouten de eiwitoplossing door dialyseren tegen gedestilleerd water bij 4 ° C. Dialyseren eiwit oplossing tegen water voor 2-3 dagen met veranderingen in het water elke 4uur of 8 uur voor O / N. Bewaar 20 pl van het gezuiverde eiwit van SDS-PAGE en lyofiliseren de rest van het gezuiverde eiwit en bewaar bij -80 ° C tot verder gebruik.

6. Karakterisering van AECM eiwitten door SDS-PAGE elektroforese

  1. Bereid een 12% SDS-PAGE-gel (wanneer het molecuulgewicht groot is, gebruiken 8% SDS-PAGE gels betere scheiding). Voeg 2x SDS loading buffer aan elk monster, verwarm de monsters gedurende 10 minuten bij 100 ° C en laat monsters op de gel gedurende 1 uur bij 100 V of totdat de proteïneladder overeenkomt met het molecuulgewicht van het eiwit AECM het midden van het bereiken gel.
  2. Haal de gel uit de SDS-PAGE zetten en registreer Coomassie Brilliant Blue kleuring (Tabel 2) met een volume van de gel gedurende 1 uur onderdompelen in een petrischaal. Spoel gel in een ontkleuroplossing (Tabel 2) gedurende 5 min op een rocker. Wijzig de ontkleuroplossing, en blijven de gel Destain met exponenten tot de achtergrond van tHij gel duidelijk. Eiwitbanden moet duidelijk zichtbaar.
  3. Vergelijk de positie van het doeleiwit tegen proteïneladder om het molecuulgewicht van het beoogde eiwit te bepalen.
  4. Om de aanwezigheid van het doeleiwit verder te bevestigen, voert western blotting zoals in stap 7.

7. Karakterisering van AECM eiwitten met behulp van Western Blotting

  1. Laat de monsters op een 12% SDS-PAGE gel zoals in paragraaf 6 zonder kleuring.
  2. Knip nitrocellulose membraan iets groter dan de SDS-PAGE gel. Snij 4 filtreerpapiertjes dezelfde grootte.
  3. Natte één stuk filterpapier met Western Transfer Buffer (20% v / v methanol, 25 mM Tris, 190 mM glycine, pH 8,3), plaatst de SDS-PAGE-gel bovenop het filterpapier, gevolgd door een stuk filtreerpapier vervolgens het nitrocellulosemembraan en een uiteindelijke andere twee stukken filtreerpapier. Zorg ervoor dat de hele set-up is ondergedompeld met voldoende westerse overdracht buffer.
    OPMERKING: De gel en het membraan niet in aanraking op dit tijdstip eiwitten kunnen binden aan het membraan bij contact.
  4. Overdracht van de eiwitten op het nitrocellulosemembraan door twee filtreerpapier in een western halfdroge overdrachtseenheid, gevolgd door het nitrocellulosemembraan en voorzichtig plaats de SDS-PAGE-gel in en op het membraan, tenslotte plaatst de laatste twee natte filtreerpapier op de SDS-PAGE gel. Voer de westerse overdracht op 45 mA, 30 min. Voeg buffer als de spanning hoger is dan 30 V.
    OPMERKING: Bij voorkeur plaatst de SDS-PAGE gel op de membraan met verschillende pogingen vermijden het verschuiven van de gel onnodig op het membraan eiwitten bij contact kan binden aan het membraan.
  5. Ophalen en blokkeren de nitrocellulose membraan met blokkeeroplossing (5% vetvrije melk in PBS pH 7,4, gefilterd met filtreerpapier) gedurende 2 uur bij KT. Gooi blokkeerbuffer en voeg PBS te spoelen.
    OPMERKING: Verander om nieuwe handschoenen om te voorkomen dat besmetting van de membraan met ongewenste proteins.
  6. Incubeer primaire anti-His antilichaam met verdunning in PBS bij 1: 1000 bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met schommelen. Maak een mengsel in een volume dat het gehele membraan kan dompelen, bijvoorbeeld met verdunningsverhouding 1: 1000, voeg 1 pl antilichaam (voorraadconcentratie: 1 mg / ml) met 999 ul PBS gedurende een 1 ml totaal mengsel.
  7. Spoel het membraan met 5 ml PBST (PBS met 0,1% Tween 20).
  8. Incubeer met secundair antilichaam geconjugeerd met mierikswortel peroxidase (HRP) met verdunning in PBS bij 1: 5000 bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met schommelen. Maak een mengsel in een volume dat het gehele membraan kan dompelen, bijvoorbeeld met verdunningsverhouding 1: 5000, voeg 1 pl antilichaam (voorraadconcentratie: 1 mg / ml) tot 4999 ul PBS gedurende een 5 ml totale mengsel.
  9. Was het membraan met 5 ml PBST en tweemaal herhalen.
  10. Breng de chemiluminescent substraat aan het membraan met een volume aan het membraan bedekken en incubeer door de instructies van het gebruikte substraat.
    OPMERKING: De gevoeligheid van de ondergrond om eiwitdetectie kan variëren, raden we aan een substraat met een maximale gevoeligheid voor zeer lage signalen in het geval toenemende antilichaam concentratie niet signalen toenemen.
  11. Leg de chemiluminescerende signalen met behulp van een CCD-camera gebaseerd imager. Stel de primaire en secundaire antilichaamverdunning verhouding als signalen zijn zwak en niet-specifiek. Langer Incubeer in het blokkeren oplossing als achtergrond signaal hoog.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bij het ​​ontwerpen van fusie-eiwitten die elastine-achtige herhalingen, is het belangrijk om een totaal elastine, voldoende groot deel van het fusie-eiwit 18 te handhaven. Dit is zodat het fusie-eiwit construct behoudt zijn elastine-achtige kenmerken, teneinde ITC gebruiken voor zuivering. De AECM eiwitten ontwerp en sequenties in dit hoofdstuk beschreven werden specifiek uit het werk genomen door Tjin et al. 14. In dit werk werden drie AECM eiwitten met succes gekloond in de pET22b (+) expressievector. Sequential ligatie eerst begon met het ligeren van het elastine herhalingen te voegen in de pET vector, gevolgd door het plaatsen van de cel bindende domein. Tenslotte is de laatste set elastine herhalingen werden aan het uiteinde van het celbindingsdomein ingebracht met behulp van dezelfde methode. Om te controleren of de recombinante genen met succes is uitgevoerd, elk recombinant plasmide werd gedigereerd met XhoI proef en SalI gedurende 3 uur bij 37 °C. Figuur 1 toont de DNA-insert en vector bands na de test digestie. Voor elk van de AECM eiwitten, de grootte van de inserts overeen met de grootte van het gen te bevestigen dat de klonen inderdaad succesvol. Verdere verificatie door middel van DNA-sequencing bevestigde ook de test spijsvertering resultaten.

We konden de AECM eiwitten door middel ITC voldoende elastine in elk AECM eiwit te zuiveren. Figuur 2 toont het schema van het totale zuiveringsproces. De O / N kweek werd geïnoculeerd in 1 L schudkolf met een typische start OD 600 van 0,01. De cultuur groeide uit tot OD 600 van 0,6-0,8 na 3-4 uur. Eiwitexpressie werd geïnduceerd met behulp van 1 mM IPTG. Na 4 h wordt het karakteristieke OD van 1,5 bereikte. De bacteriële kweek werd geoogst en gecentrifugeerd. Het supernatant werd weggegooid en de celpellet werd gewogen. Het gemiddelde gewicht van de celpellet werd ongeveer 3 g / lcultuur. De pellet werd opnieuw gesuspendeerd in TEN buffer en bij -80 ° CO / N bevroren.

Een aantal invries / ontdooi cycli werden toegepast om de cellen te lyseren. De vries-dooi stap zorgt ervoor dat de cel te zwellen en krimpen, uiteindelijk breken als gevolg van ijskristallen gevormd tijdens het invriezen. Vervolgens DNase I en RNase werd toegevoegd aan het cellysaat alle DNA en RNA te verteren. PMSF een protease remmer, die ook werd toegevoegd aan het cellysaat om eiwitafbraak te beperken. Om verder te zorgen voor volledige cellysis, werd het lysaat verder gesoniceerd terwijl op ijs bewaard.

Het cellysaat werd vervolgens onderworpen aan 3 cycli van ITC zuivering. Aan het einde van de 3 cycli, de pellet aan het einde van de warme cyclus leek honing consistentie en hadden een lichtgele kleur. De pellet gedraaid transparant bij contact met water, en loste gemakkelijk in voorgekoeld geautoclaveerd water onder schudden. Het gezuiverde eiwit wordt gedialyseerd om eventuele s verwijderenalt. De eiwitoplossing verkregen aan het einde van de laatste warming cycle werd overgebracht in een kort stuk dialyseslang (met 12 kDa molecuulgewicht afsnijding). Aan het eind van de dialyse werd de eiwitoplossing overgebracht in een schone centrifugebuis van 50 ml en bij -20 ° C ingevroren. De volgende dag werd de bevroren eiwitoplossing gevriesdroogd om het watergehalte te verwijderen. Figuur 3 toont een afbeelding van de gedialyseerde eiwit heeft typisch wol-achtig uiterlijk.

Om te bepalen of de eiwitexpressie geïnduceerd inderdaad, monsters voor en na inductie verzameld werden geanalyseerd door SDS-PAGE elektroforese. Hier, 12% SDS-PAGE gel werd voldoende eiwitten scheiden met molecuulgewichten van 20-150 kDa. Indien het molecuulgewicht groot is, dat wil zeggen,> 100 kDa, 8% SDS-PAGE gels kunnen worden gebruikt voor een betere scheiding van eiwitten. Figuur 4 toont een intense eiwitband bij het ​​voorspelde molecuulgewicht geïnduceerde sample (laan 2). Typisch, werd SDS-PAGE-analyse uitgevoerd onmiddellijk na eiwitexpressie alvorens zuivering wordt begonnen. Vervolgens werden monsters genomen via het zuiveringsproces ook kunnen worden geanalyseerd met SDS-PAGE elektroforese efficiënte zuivering van het doelwiteiwit te waarborgen. Figuur 4 toont ook een SDS-PAGE gel die een gezuiverd eiwit monster met een molecuulgewicht van 22 kDa (laan 4 ), overeenkomende met de LN-5 AECM 14. De geschatte zuiverheid van het AECM eiwitten ongeveer 90% -95%; deze waarde werd afgeleid door vergelijking van de verhoudingen band intensiteiten van het doeleiwit en andere eiwitbanden aanwezig op de SDS-gel (Figuur 4, laan 4). Tenslotte, om te bepalen of het gezuiverde eiwit inderdaad de AECM eiwitten, werd western blotting uitgevoerd. Vervolgens werd MALDI-TOF ook uitgevoerd om nauwkeurig de onzuiverheden van het gezuiverde materiaal 14 te bepalen. Figuur 5 toont de eiwitzuiverheid vae AECM drie eiwitten met een SDS-PAGE gel in figuur 5A en vergelijken met een beeld van het nitrocellulosemembraan voor western blotting in figuur 5B, waarin de aanwezigheid van de eiwitten Col-IV AECM en LN-5 AECM, gelabeld met behulp van anti -6x His-tag antilichamen geconjugeerd met mierikswortelperoxidase (HRP). De uiteindelijke opbrengsten aan AECM eiwitten varieerde tussen 60 mg / l tot 120 mg / l.

Figuur 1
Figuur 1. DNA agarosegelelektroforese van AECM eiwitten. Verificatie van de definitieve AECM eiwit DNA-constructen door middel van restrictie-enzymen spijsvertering liep op 1,2% DNA agarosegel. Recombinante plasmiden die coderen voor elk van de AECM eiwitten werden dubbel gedigereerd met XhoI en SalI gedurende 3 uur bij 37 ° C De afmetingen van de inzetstukken afgestemd op de grootte van elk AECM proteïnegen (FN910: 1,8kbp, Col-IV: 696 bp, LN-5: 699 bp) en de grootte van de vector pET22b (+) gebruikt is 5,5 kbp.

Figuur 2
Figuur 2. Schematische stroom voor eiwitexpressie, lysis en zuivering van AECM eiwitten. De basis handleiding voor recombinante eiwitexpressie vanaf de enting van een enkele kolonie kleine cultuur en schalen naar 1 L kweek, oogst en hersuspenderen van de cellen, gevolgd door eiwitten lysis. Eiwit zuivering werd uitgevoerd door gebruik LCST gedrag van elastine-achtige domeinen in het kunstmatige ECM eiwitten uitgevoerd. De AECM eiwitten worden gezuiverd door ITC. Meerdere koud en warm cycli werden uitgevoerd om een ​​hoge zuiverheid van doeleiwit te verwezenlijken. Tenslotte, het doeleiwit werden gedialyseerd met water en gelyofiliseerd tot verder gebruik. "O / N" = 's nachts. "S / n '= supernatant.


Figuur 3. Afbeelding van gevriesdroogd AECM eiwit gezuiverd door Inverse Transition Fietsen. Lyophilized LN5-AECM heeft een wollen-achtige uitstraling.

Figuur 4
Figuur 4. SDS-PAGE gelelektroforese van AECM eiwit (LN-5 AECM). Laan 1 en 2 toont kweek vóór en na inductie eiwit. Aanwezigheid van een dikke band in de buurt van 22 kDa toont aan dat de LN-5 AECM succes werd uitgedrukt. Laan 3 toont de volledige cellysaat terwijl laan 4 toont het gezuiverde LN-5 AECM eiwit na 3 cycli van ITC.

Figuur 5
Figuur 5 (A) SDS-PAGE-gel van de AECM eiwitten. (B) Western blot gesondeerd voor 6x His-tag voor Col-IV En LN-5 AECM eiwitten. Beide Col-IV en LN-5 AECM eiwitten bevatten C-terminus 6xHis-tag. Positieve chemiluminescentie waargenomen op de voorspelde moleculair gewicht bij 22 kDa voor monster LN-5 AECM en 24 kDa voor het monster Col-IV AECM vertegenwoordigen 6x His-tag aanwezig is in het gezuiverde eiwit.

<td rowspan = "9"> 2xYT media
Media / L Componenten en instructies
SOC media 20 g trypton
5 g gistextract
0,6 g NaCl
0,2 g KCl
Toevoegen en autoclaaf in 940 ml water,
voeg dan steriele (filter gesteriliseerd)
10 ml 1 M MgCl2
10 ml 1 M MgSO4
40 ml 20% glucose
16 g trypton
10 g gistextract
5 g NaCI
15 g Bacto Agar (toevoeging alleen voor agar plaat)
Oplossen in water en top tot 1 L en autoclaaf.
Om agarplaten, cool om 55 te bereiden ° C vóór de toevoeging van antibiotica.
Meng goed voorafgaand aan het gieten in de petrischaal.
Koel de platen tot agar is gestold.
Wikkel platen in Parafilm en opslaan ondersteboven in 4 ° C.
Terrific Broth (TB) 12 g Trypton
24 g gistextract
4 ml Glycerol
Oplossen in 700 ml water en autoclaaf.
16.42 g K 2 HPO 4(Merck)
2,31 g KH 2 PO 4 (Merck)
Oplossen in 300 ml water en afzonderlijk autoclaaf te zorgen zouten volledig opgelost.
Combineer zowel medium en zouten na afkoeling.

Tabel 1. Recepten voor SOC media, 2xYT media / agar en Terrific bouillon. Media voor E. coli-kweek in de moleculaire klonering en eiwitexpressie.

Oplossing / l Componenten en instructies
Coomassie Brilliant Blue stain 0,25 g Coomassie blueR250
100 ml ijsazijn
450 ml Methyl alcohol
450 ml water
100 ml ijsazijn
400 ml Methyl alcohol
500 ml water

Tabel 2. Recepten oplossingen om vlekken en ontkleuring SDS-PAGE gel. Coomassie Brilliant Blue R250 voor het kleuren en ontkleuren oplossing voor de karakterisering door SDS-PAGE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Recombinant eiwit engineering is een veelzijdige techniek om nieuwe proteïne materialen met behulp van een bottom-up aanpak te creëren. De op eiwit gebaseerde materialen kunnen worden ontworpen om meerdere functionaliteiten, afgestemd op de toepassing van belang. Door de toenemende vooruitgang in kloneren en eiwitexpressie technologieën is het relatief eenvoudige (en kosteneffectieve) wordt een aantal kunstmatige eiwitten creëren op een reproduceerbare en schaalbaar. Het elastine-achtige domein is opgenomen in een aantal artificiële eiwitten, om te dienen als een zuivering tag, en mechanische eigenschappen te verlenen. Kunstmatige eiwitten die een elastine-achtige sequentie bevatten kunnen gemakkelijk worden gezuiverd met behulp ITC, die de noodzaak voor dure zuiveringskolommen en antilichamen elimineert.

Dit protocol beschrijft de stappen om recombinante plasmiden die coderen voor eiwitten AECM construeren. Genen die coderen voor de elastine-achtige herhalingen werden aangekocht. Voorsterk herhalende peptidesequentie zoals elastine polypeptiden, wordt aanbevolen de kloneringsstrategie zodat recursieve gerichte ligatie (RDL) strategieën kunnen worden gebruikt 22 ontwerpen. Door het gebruik van RDL, kon repetitieve polypeptiden met een bepaalde ketenlengte worden gesynthetiseerd en dus genen van belang kan worden gekocht als korte monomeren.

In ons werk, werden de cel-bindende domeinen ontworpen om flankerende Nhel restrictieplaatsen bevatten aan beide uiteinden modulaire swapping van de centrale cel bindende domein mogelijk te maken. Het is belangrijk om restrictieplaatsen die uniek zijn en niet aanwezig in het functionele domein of elders buiten de meervoudige kloneringsplaats (MCS) van de gastheer vector te selecteren. Dit is om de destructie van de insertie of vector beperken tot de beoogde gebieden. In sommige gevallen kan het nodig zijn om nieuwe restrictieplaatsen in de ontvangende vector middels mutagenese voor het inbrengen van de functionele domein voeren.

Onzeklonen strategie liet ons toe om gemakkelijk veranderen de centrale cel bindende domein drie varianten van AECM eiwitten te verkrijgen. We hebben ook vastgesteld dat het inbrengen van een lysine residu na de start Methionine verhoogde eiwit opbrengst met meer dan 10-voudig. Deze dramatische verhoging eiwitopbrengst was het meest duidelijk bij LN-5 AECM eiwit, waarvoor de meest eiwitrendement verhoogd van 5 mg / l tot 60 mg / l.

Verscheidene E. coli expressie gastheren werden vergeleken, en de BL21 (DE3) pLysS E. coli stam gaf de beste eiwitopbrengsten. De verbetering eiwitopbrengst was minimaal bij eiwitexpressie werd geïnduceerd met IPTG langer dan 4 uur. Er was geen significant verschil in eiwitexpressie op IPTG concentraties hoger dan 1 mM. Echter, eiwitexpressie werd het hoogst wanneer geïnduceerd bij OD dichter bij 0,6.

Voor een effectieve terugwinning van AECM eiwitten onder toepassing ITC, is het belangrijk om de temperatuur van de centrifuge nota. Voor examenple meeste zuiveringsstappen werden uitgevoerd in een koude ruimte (4 ° C) om maximale oplosbaarheid van het AECM eiwitten garanderen. Het kan ook noodzakelijk zijn om vooraf chill tot (4 ° C) de centrifuge rotor O / N voor de koude kringloop. Ook de rotor centrifuge werd voorverwarmd tot (37 ° C) voordat het warme cyclus zodat de temperatuur van de eiwitoplossing boven zijn Tt gehandhaafd.

Samengevat, de procedures te ontwerpen en te klonen recombinant plasmiden die coderen kunstmatige ECM eiwitten beschreven. In het bijzonder, de expressie en zuivering van de eiwitten met behulp van ICT AECM geschetst. Tenslotte karakterisering van de AECM eiwitten door SDS-PAGE elektroforese en Western Blotting werden beschreven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

De auteurs willen graag om de financiering van het ministerie van Onderwijs ACRF Tier 1 (RG41) erkennen en start subsidie ​​van Nanyang Technological University. Lage en Tjin worden gefinancierd door de Student Research Scholarship (RSS) van Nanyang Technological University, Singapore.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET22b (+) Novagen 69744 T7 expression vectors with resistance to ampicillin 
BL21(DE3)pLysS  Invitrogen C6060-03 additional antibiotics - chloramphenicol
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) Gold Biotechnology I2481C 1 M stock solution with autoclaved water, make fresh prior to induction.
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 plasmid isolation kit
T4 ligase New England Biolabs M0202S
Ampicillin Affymetrix 11259
Chloramphenicol Affymetrix 23660
Zymoclean™ gel DNA recovery kit Zymo Research D4001
XL10-gold strain Agilent Technologies 200315

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, Q., Liang, S., Thouas, G. A. Elastomeric biomaterials for tissue engineering. Prog Polym Sci. 38, (3-4), 584-671 (2013).
  2. Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering - In vivo and in vitro applications. Adv Drug Deliv Rev. 63, (4-5), 352-366 (2011).
  3. Kushner, A. M., Guan, Z. Modular Design in Natural and Biomimetic Soft Materials. Angewandte Chemie International Edition. 50, (39), 9026-9057 (2011).
  4. Gagner, J. E., Kim, W., Chaikof, E. L. Designing protein-based biomaterials for medical applications. Acta Biomater. 10, (4), 1542-1557 (2014).
  5. Gomes, S., Leonor, I. B., Mano, J. F., Reis, R. L., Kaplan, D. L. Natural and genetically engineered proteins for tissue engineering. Prog Polym Sci. 37, (1), 1-17 (2012).
  6. Werkmeister, J. A., Ramshaw, J. A. M. Recombinant protein scaffolds for tissue engineering. Biomedical Materials. 7, (1), 012002 (2012).
  7. MacNeil, S. Biomaterials for tissue engineering of skin. Materials Today. 11, (5), 26-35 (2008).
  8. Fong, E., Tirrell, D. A. Collective Cell Migration on Artificial Extracellular Matrix Proteins Containing Full-Length Fibronectin Domains. Advanced Materials. 22, (46), 5271-5275 (2010).
  9. Ratner, B. D., Bryant, S. J. BIOMATERIALS: Where We Have Been and Where We are Going. Annual Review of Biomedical Engineering. 6, (1), 41-75 (2004).
  10. Cai, L., Heilshorn, S. C. Designing ECM-mimetic materials using protein engineering. Acta Biomater. 10, (4), 1751-1760 (2014).
  11. Annabi, N., et al. Elastomeric recombinant protein-based biomaterials. Biochemical Engineering Journal. 77, (0), 110-118 (2013).
  12. Heilshorn, S. C., DiZio, K. A., Welsh, E. R., Tirrell, D. A. Endothelial cell adhesion to the fibronectin CS5 domain in artificial extracellular matrix proteins. Biomaterials. 24, (23), 4245-4252 (2003).
  13. Simnick, A. J., Lim, D. W., Chow, D., Chilkoti, A. Biomedical and Biotechnological Applications of Elastin-Like Polypeptides. Polymer Reviews. 47, (1), 121-154 (2007).
  14. Tjin, M. S., Chua, A. W. C., Ma, D. R., Lee, S. T., Fong, E. Human Epidermal Keratinocyte Cell Response on Integrin-Specific Artificial Extracellular Matrix Proteins. Macromolecular Bioscience. 14, (8), 1125-1134 (2014).
  15. MacNeil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445, (7130), 874-880 (2007).
  16. Kariya, Y., et al. Differential regulation of cellular adhesion and migration by recombinant laminin-5 forms with partial deletion or mutation within the G3 domain of α3 chain. J Cell Biochem. 88, (3), 506-520 (2003).
  17. Shang, M., Koshikawa, N., Schenk, S., Quaranta, V. The LG3 module of laminin-5 harbors a binding site for integrin α3Β1 that promotes cell adhesion, spreading, and migration. J Biol Chem. 276, (35), 33045-33053 (2001).
  18. Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Current Protocols in Protein Science. 6.11.1-6.11.16 (2010).
  19. Keeley, F. Ch. 4. Evolution of Extracellular Matrix.Biology of Extracellular Matrix. Springer. Berlin Heidelberg. 73-119 (2013).
  20. Le, D. H. T., et al. Self-Assembly of Elastin-Mimetic Double Hydrophobic Polypeptides. Biomacromolecules. 14, (4), 1028-1034 (2013).
  21. MacEwan, S. R., Hassouneh, W., Chilkoti, A. Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), e51583 (2014).
  22. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3, (2), 357-367 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics