Planung und Bau von künstlichen extrazellulären Matrix (aECM) Proteine ​​aus

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Bioengineering

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Low, P. S. J., Tjin, M. S., Fong, E. Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (100), e52845, doi:10.3791/52845 (2015).

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Abstract

Protocol

1. Klonierung von rekombinanten Plasmiden, die für Proteine ​​aECM

  1. Gestalten Sie die Aminosäuresequenz der funktionellen Domäne (zB Zellbindungsdomäne und Elastin-ähnliche Wiederholungen). Design Restriktionsstellen flankieren die Enden der funktionellen Domänen zu erleichtern Subklonierung mit freier Software nach Software-Anweisungen (zB http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). Wählen Sie hier einmal vorkommende Restriktionsstellen, die nicht in der funktionalen Domäne vorhanden, um die Verdauung an die vorgesehenen Standorte beschränkt sind. Wählen Restriktionsstellen in der multiplen Klonierungsstelle (MCS) des Wirt-Vektor angegeben (z pET22b (+)) für Sub-Klonen.
  2. Rückwärts übersetzen die Aminosäuresequenz in die Nukleotidsequenz mit kostenlosen Websites nach Software-Anweisungen. (ZB http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). Stellen Sie sicher, Codons für E. optimiert coli-Hosts.
  3. Gen von Interesse kann purchas seined Handel als Einzelstrang-Oligonukleotiden (dh, wenn die Oligonukleotide <100 Basenpaare (bp)) und durchzuführen, DNA Tempern (siehe Schritt 1.4), die Kosten zu reduzieren. Ansonsten für Gene größer als 100 bp, sie könnten durch die Handelsgesellschaften erworben werden.
  4. DNA Annealing der Oligonukleotide
    1. Tempern die DNA-Oligomeren, um die gewünschte Gen-Sequenz zu erhalten. Aufzulösen DNA-Oligonukleotide in einem DNA-Oligomer-Puffer (10 mM Tris: 2-Amino-2- (hydroxymethyl) -propan-1,3-diol, pH 8,0, filtriert) zu einer Endkonzentration von 1 ug / ul.
    2. Hinzuzufügen 4 ul jedes Oligomers zu 32 ul DNA Annealing-Puffer (10 mM Tris, 100 mM NaCl und 100 nM MgCl 2), um insgesamt 40 ul Mischung zu erzielen.
    3. Kochen Sie ein Becherglas mit Wasser unter Verwendung einer Kochplatte und tauchen Sie die Mischung für 5 min, 95 ° C. Das Becherglas und allmählich abkühlen die gesamte in einem Styropor-Box O / N eingestellt. Die Oligomere wurden geglüht und sind bereit für die Verdauung.
    Hinzufügen der entsprechenden Restriktionsenzyme, die geglüht Oligomere (dh als Einsatz bezeichnet) und Wirt-Vektor (dh pET22b (+)) separat zu verdauen. Verwenden des folgenden Rezepts (1-2 ug DNA, 2 ul jedes Restriktionsenzym wurden 5 ul 10x Restriktionsenzym-Puffer und Wasser bis zu insgesamt 50 & mgr; l Mischung) für 3-4 h bei 37 ° C.
    HINWEIS: Der pET22b (+) Plasmidvektor Ampicillin Antibiotika-resistente und enthält ein 6x-His-Tag am C-Terminus. Die 6x-His in pET22b (+) vorhanden tag ermöglicht es uns, His-markierten Antikörper zu verwenden, um das Zielprotein durch Western-Blot in Schritt 7 zu identifizieren.
  5. In 6x Ladepuffer zu jedem Verdauungsgemisch. Führen Sie die Aufschlussgemische getrennt einschließlich einer DNA-Leiter auf 1,2% Agarosegelen DNA, enthaltend eine UV-fluoreszierende DNA-Farbstoff 1 h bei 100 V visualisieren die 1,2% DNA Agarosegel mit einer UV-Lichtbeleuchtung.
  6. Schneiden Sie das Gel auf verdauten DNA-Produkte mit kommerziellen Gel Aufreinigungskits extrahieren. Elute mit dem Mindestvolumen für die Spalte, um eine minimale DNA-Konzentration von 50 bis 100 ng / & mgr; l zu erreichen.
  7. Kombinieren der das interessierende Gen sequentiell durch Ligation des DNA-Inserts verdaut (dh Elastin Wiederholungen oder Zellbindungsdomänen von DNA Glühen erhalten wird) in den Plasmidvektor unter Verwendung von T4-Ligase mit dem folgenden Rezept: (2 & mgr; l Vektor, 1 ul T4-Ligase, 1,5 ul T4-Ligationspuffer, x ul Einsatz, 10,5 x ul Wasser für insgesamt 15 & mgr; l Mischung). Inkubieren Sie die Ligationsmischung bei RT für 2 h.
    HINWEIS: molare Konzentration von Vektor einfügen sollte geändert werden, um Ligationseffizienz zu optimieren. Volumen als x im Rezept beschrieben Einsatz ist abhängig von der eluierten DNA-Konzentration von Schritt 1.7.
  8. Thaw E. coli DH5a chemisch kompetente Zellen (oder jedes Klonen Stamm) auf Eis. Warm 2xYT Agar-Platten (Tabelle 1), enthaltend Ampicillin (25 ug / ml) auf 37 ° C.
  9. Transformieren der Zellen unter VerwendungHitzeschock:
    1. Aliquot 50 ul kompetenter Zellen in saubere, vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen. Pipette 5 ul (zwischen 100 pg bis 100 ng) der Ligationsmischung in die Zellen, Pipettieren vorsichtig nach oben und unten zu mischen. Lassen Sie die Mischung auf Eis für 20 min.
    2. Eintauchen der Mikrozentrifugenröhrchen, das die Zellmischung in einem 42 ° C warmen Wasserbad für 2 Minuten und kehrte auf Eis für 2 min. Zeit der Eintauchdauer, um Hitzeschäden an den Zellen zu minimieren.
    3. Gib 500 & mgr; l SOC-Medium (Tabelle 1) in das Mikrozentrifugenröhrchen und Inkubieren bei 37 ° C unter Schütteln für 1 Stunde.
    4. Verbreiten 50 500 ul der Zell / Ligationsmischung auf einem 2 × YT-Agar-Platte, die auf RT erwärmt worden ist, enthaltend Ampicillin (25 ug / ml) und Inkubation Platten der Oberseite nach unten bei 37 ° CO / N (12-16 h) .
  10. Am nächsten Tag abholen DNA Kolonien von der Agar-Platte mit saubere Pipettenspitzen. Wachsen die Kolonien in 5 ml 2YT-Medium (Tabelle1), das Ampicillin (25 ug / ml) O / N bei 37 ° CO / N (12-16 h) unter Schütteln (225 rpm).
  11. Am folgenden Tag, mit einem Plasmid Isolation Kit, um die DNA-Plasmide für jede Kolonie nach Herstellerprotokoll aufgenommen zu extrahieren. Elution der DNA mit 50 ul Wasser.
  12. Führen Sie einen Test verdauen mit Restriktionsenzymen mit folgender Rezeptur: (5 ul DNA, 0,2 ul jedes Restriktionsenzym, 1 ul 10x Restriktionsenzym-Puffer und füllen Sie Wasser für insgesamt 10 ul Gemisch), Inkubation für 2 Stunden bei 37 ° C zum Bildschirm für die Kolonien, die wahrscheinlich enthalten den Einsatz und laufen auf 1,2% Agarose-Gel-DNA, wie in Schritt 1.6.
    HINWEIS: Bei der Verdauung, eine erfolgreiche Ligation sollten die Ergebnisse in zwei Bänder, je eine für Vektor- und Insert, das auf ihre jeweiligen Molekulargewicht entspricht (Abbildung 1).
  13. Senden Sie die wahrscheinlich Kolonien zur DNA-Sequenzierung unter Verwendung von T7-Promotor Vorwärts- und Rückwärtsprimer für kommerzielle Sequenzer.

  1. Von der Sequenzierung Ergebnis, wählen Sie eine Kolonie, die erfolgreich ligiert wurde und verwenden Sie den DNA-Plasmid für die Transformation in einen E. coli Expressionswirt.
  2. Thaw E. coli Expressionsstamm (BL21 (DE3) pLysS) auf Eis. Inzwischen warmen Agarplatten, enthaltend Ampicillin (25 ug / ml) und Chloramphenicol (34 ug / ml) auf Raumtemperatur.
    ANMERKUNG: Das Plasmid pLysS in Bakterien vorliegende Stamm BL21 (DE3) pLysS eine Chloramphenicol-Resistenz-Gen enthält. Die pLysS Plasmid enthält ein T7 Repressorgen, die konstitutiv exprimiert wird, um undichte Ausdruck der aECM Protein zu begrenzen. Chloramphenicol ist notwendig, um für die Bakterienzellen, die pLysS während der Kultur enthält auszuwählen.
  3. Wiederholen Sie Schritt 1,10 bis transformierten E. zu erhalten coli-Zellen, die bereit sind, die künstliche Proteine ​​zu exprimieren sind. Wrap-Agar-Platten in Parafilm und lagern auf den Kopf in 4 6; C für bis zu einem Monat.

3. Bakterielle Expression des Proteins aECM

  1. Siehe Abbildung 2, wählen Sie eine Kolonie von der Agarplatte transformiert mit einer Pipettenspitze und Beimpfen in 10 ml sterilem Terrific Broth (TB) -Medium (Tabelle 1), die sowohl Ampicillin und Chloramphenicol-Antibiotika in einem Reagenzglas. Inkubieren Sie dieses Starterkultur bei 37 ° CO / N (12-16 h) mit 225 rpm schütteln.
  2. 10 ml der Starterkultur in 1 l frisch und sterile TB-Medien mit den gleichen Antibiotika in einen 3 l-Erlenmeyerkolben ergänzt. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C unter Schütteln bei 225 rpm für 2-3 Stunden und beobachten Sie die optische Dichte der Kultur (OD 600) erreicht 0,6-0,8 durch Pipettieren von 1 ml der Kultur in eine leere Küvette zum Lesen. Sparen Sie 1 ml der Kultur vor der Induktion für SDS-PAGE Charakterisierung.
    1. Um OD 600 von der Zellkultur messen, bereiten 1 Flasche TB Medien in einer Küvettefür eine Leermessung. Getrennt davon wurde je 1 ml der Kultur aus der Kulturflasche in eine neue leere Küvette. Anschließend wird die optische Dichte der Kultur mit einem Spektrophotometer gegen die Blindprobe bei einer Absorption von 600 nm.
    2. Speichern der Probe (für nachfolgende SDS-PAGE-Analyse) durch Übertragen der 1 ml der Kultur in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, Zentrifugieren bei 12.000 × g für 2 min, und Dekantieren.
  3. Induzieren die Kultur mit Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) zu einer Endkonzentration von 1 mM und Inkubation bei 37 ° C unter Schütteln bei 225 rpm für weitere 4 Std. Speichern 1 ml der Kultur am Ende der Induktion bei 4 Stunden für die SDS-PAGE-Charakterisierung.
  4. Ernte der Zellen durch die Übertragung der Kultur in 1 l-Zentrifugenflaschen und Zentrifugieren bei 12.000 xg für 30 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen, wiegen die Zellpellets und resuspendieren in TEN-Puffer (1 M Tris, 0,01 M EDTA, 0,1 M NaCl, pH = 8,0) bei 0,5 g / ml.

4. Die Lyse von Bakterienkulturen

  1. Frieren Sie den resuspendierten Zellkultur bei -80 ° CO / N. Auftauen der gefrorenen Zellkultur in einem Wasserbad bei RT oder auf Eis, um die Zellen zu lysieren. Zugabe von 10 ug / ml Deoxyribonuclease I (DNase I), 10 & mgr; g / ml Ribonuclease A (RNase I), und 50 ug / ml Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), während dem Auftauen und homogenisieren der Lösung unter langsamem Rühren.
  2. Nachdem alle resuspendierten Zellen werden aufgetaut, passen Sie die Lösung auf pH 9,0, um das Protein Löslichkeit in Wasser 12 zu erhöhen. In 6 N NaOH tropfenweise unter Rühren auf Eis, um eine homogene Konsistenz zu erreichen. Lyse durch Ultraschall Unterbrechung für 20 Minuten auf Eis mit einem Durchmesser von 2 mm flache Spitze, 5 sec Puls.
  3. Zentrifugieren Sie die Zell-Lösung bei 12.000 × g für 30 min bei 4 ° C. Den Überstand in ein sauberes, leere Flasche und bei 4 ° C zur Reinigung später.
  4. Inzwischen Zellpellet wieder mit TEN-Puffer und wieder einfrieren bei -80 ° C. Bisvollständige Zelllyse, wiederholen Einfrieren / Auftauen und Beschallen Prozess bis zu dreimal. Sparen Sie 20 ul Zellysat für SDS-PAGE-Charakterisierung.

5. Reinigung von Proteinen mit aECM Inverse Transition Radfahren

  1. Kollationieren des Zelllysats aus Schritt 4.3 und damit fortfahren, die aECM Proteine ​​mittels ITC, ähnlich der für die Reinigung von Proteinen elastinbasiertem 21 verwendet zu reinigen. Zyklen bei den verschiedenen Temperaturen, die 4 ° C durchgeführt werden und 37 ° C (bezeichnet als "kalt" bezeichnet) Zyklen (nachfolgend als "warm" bezeichnet) auf.
  2. Spalten die Zelllysat in 50 ml-Zentrifugenflaschen und Zentrifugieren bei 40.000 × g für 2 Stunden bei 4 ° C. Das Aussehen der Zellpellet sollte dunkelbraun sein und freuen flüssig.
  3. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette, um eine saubere Trennung von dem Pellet zu erhalten. Sammeln Sie den Überstand in sauberes Zentrifugenflaschen und NaCl bis zu einer Endkonzentration von 1 M (bis zu einem Maximum von 3 M). Warmdie Lösung auf 37 ° C für 2 Stunden mit Schütteln bei 225 rpm.
    HINWEIS: Die Zugabe von NaCl wird der Übergang des Elastin-Komponente des aECM verursachen Aggregation auszulösen. Der Überstand wird sich trüben. Wenn die Proteinkonzentration hoch genug ist, kann weißen schaumigen Protein an den Seiten des Zentrifugenflasche ersichtlich ist.
  4. Zentrifugieren der Überstand aus Schritt 5.3 bei 40.000 × g für 2 Stunden bei 37 ° C. Den Überstand umfüllen. Crush the Pellet mit einem Metallspatel und das Pellet Bits in eiskaltem autoklaviert destilliertem Wasser (50 mg / ml) unter kräftigem Rühren O / N bei 4 ° C unter Verwendung eines magnetischen Rührstab und Teller. Das Pellet sollte vollständig aufgelöst werden.
  5. Die Schritte 5.2 bis 5.4 für weitere drei bis fünf Mal, um eine höhere Reinheit des Proteins zu erhalten.
  6. Nach dem letzten Reinigungszyklus, entsalzen der Proteinlösung durch Dialyse gegen destilliertes Wasser bei 4 ° C. Dialysiere Proteinlösung gegen Wasser für 2-3 Tage mit Veränderungen der Wasser alle 4h oder 8 h für O / N. Sparen Sie 20 ul des gereinigten Proteins für SDS-PAGE und lyophilisieren den Rest des gereinigten Proteins und bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.

6. Charakterisierung von aECM Proteinen mit SDS-PAGE-Elektrophorese

  1. Vorbereitung eines 12% SDS-PAGE-Gel (wenn das Molekulargewicht groß ist, nutzen 8% SDS-PAGE-Gele für eine bessere Trennung). Hinzuzufügen 2x SDS-Ladepuffer zu jeder Probe, Erwärmen der Proben für 10 min bei 100 ° C einstellen und Auftragung auf das Gel 1 h lang bei 100 V, bis das Protein Leiter entsprechend dem Molekulargewicht des Proteins aECM der Mitte der erreicht Gel.
  2. Abrufen des Gels aus dem SDS-PAGE einzurichten und fügen Coomassie Brilliant Blue-Färbung (Tabelle 2) mit einem Volumen, das Gel für 1 Stunde in einer Petrischale eintauchen. Rinse Gel in einer Entfärbelösung (Tabelle 2) für 5 min auf einer Wippe. Ändern Sie die Entfärbelösung, und weiter, um das Gel mit Schaukel bis dem Hintergrund t entfärbener gel deutlich. Proteinbanden muss deutlich sichtbar sein.
  3. Vergleichen der Position des Zielproteins gegen das Protein Leiter um das Molekulargewicht des Zielproteins zu bestimmen.
  4. Um die Anwesenheit des Target-Proteins weiter zu bestätigen, führen Western Blotting, wie in Schritt 7.

7. Charakterisierung von Proteinen mit aECM Western Blotting

  1. Führen Sie die Proben auf einem 12% SDS-PAGE-Gel, wie in Kapitel 6 ohne Färbung.
  2. Geschnitten Nitrocellulosemembran auf eine Größe geringfügig größer als die SDS-PAGE-Gel. Schneiden 4 Stück Filterpapier in der gleichen Größe.
  3. Wet einem Stück Filterpapier mit westlichen Transferpuffer (20% v / v Methanol, 25 mM Tris, 190 mM Glycin, pH 8,3), legen Sie die SDS-PAGE-Gel auf dem Filterpapier, gefolgt von einem weiteren Stück Filterpapier , dann die Nitrocellulosemembran und einem abschließenden beiden anderen Stücke von Filterpapier. Stellen Sie sicher, das ganze Set-up wird mit ausreichend westlichen Transferpuffer eingetaucht.
    ANMERKUNG: Das Gel und die Membran nicht in Kontakt zu diesem Zeitpunkt, wie Proteine ​​könnten an die Membran bei Kontakt zu binden.
  4. Übertragen Sie die Proteine ​​auf der Nitrocellulosemembran, indem zwei Filterpapiere in einen westlichen halbtrockenen Transfereinheit, gefolgt von der Nitrocellulosemembran und vorsichtig die SDS-PAGE-Gel in und an der Membran, schließlich legen Sie die letzten zwei feuchtem Filterpapier auf Die SDS-PAGE-Gel. Führen Sie den westlichen Übertragung bei 45 mA, 30 min. In Puffer, wenn die Spannung höher als 30 V.
    HINWEIS: vorzugsweise die SDS-PAGE-Gel auf die Membran bei einem Versuch und vermeiden Verschieben des Gels unnötig auf der Membran als Proteine ​​könnten an die Membran bei Kontakt zu binden.
  5. Abrufen und blockieren die Nitrocellulose-Membran mit Blockierungslösung (5% fettfreier Milch in PBS, pH 7,4, mit Filterpapier filtriert) für 2 h bei RT. Entsorgen Blockierungspuffer und fügen PBS spülen.
    HINWEIS: Wechseln Sie neue Handschuhe zu vermeiden Kontamination der Membran mit unerwünschten proteIns.
  6. Inkubieren primären anti-His Antikörper mit Verdünnung in PBS auf 1: 1000 bei RT für 1 h unter Schütteln. Vorbereitung einer Mischung mit einem Volumen, das die gesamte Membran eintauchen könnte, beispielsweise mit Verdünnungsverhältnis 1: 1.000, fügen 1 ul Antikörper (Stammkonzentration: 1 mg / ml) zu 999 & mgr; l PBS für eine 1 ml Gesamtmischung.
  7. Spülen der Membran mit 5 ml PBST (PBS mit 0,1% Tween 20).
  8. Inkubieren mit sekundärem Antikörper bei 1, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase (HRP) mit Verdünnung in PBS: 5000 bei RT für 1 h unter Schütteln. Vorbereitung einer Mischung mit einem Volumen, das die gesamte Membran eintauchen könnte, beispielsweise mit Verdünnungsverhältnis 1: 5.000, fügen 1 ul Antikörper (Stammkonzentration: 1 mg / ml) bis 4,999 & mgr; l PBS für eine 5 ml Gesamtmischung.
  9. Waschen Sie die Membran mit 5 ml PBST und zweimal wiederholen.
  10. Übernehmen Sie die Chemilumineszenzsubstrat an die Membran mit einem Volumen, um die Membran abdecken und inkubieren indem Sie die Anweisungen für das verwendete Substrat.
    HINWEIS: Die Empfindlichkeit der Substrat zur Proteinnachweis können variieren, empfehlen wir ein Substrat mit maximaler Empfindlichkeit für sehr niedrige Signale bei steigender Antikörperkonzentration keine Signale zu erhöhen.
  11. Erfassen Sie die chemolumineszierende Signale unter Verwendung einer CCD-Kamera auf Basis Imager. Stellen Sie die primären und sekundären Antikörperverdünnungsverhältnis, wenn Signale schwach und nicht-spezifisch sind. Länger inkubieren in Blockierungslösung, wenn Hintergrundsignal hoch ist.

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Representative Results

Bei der Konstruktion von Fusionsproteinen enthalten, Elastin-ähnlichen Wiederholungen, ist es wichtig, eine Gesamt Elastingehalt, groß genug Anteil des Fusionsproteins 18 aufrechtzuerhalten. Dies soll sicherstellen, dass das Fusionsproteinkonstrukt behält seine Elastin ähnlichen Eigenschaften, um die ITC zur Aufreinigung verwenden. Die aECM Proteine ​​Design und in diesem Abschnitt beschriebenen Sequenzen wurden speziell von der Arbeit von Tjin et al. 14 genommen. In dieser Arbeit wurden drei aECM Proteine ​​erfolgreich in den pET22b (+) Expressionsvektor kloniert. Sequenzielle Ligation begann mit Ligation des Elastin-Wiederholungen in den pET-Vektor, gefolgt vom Einsetzen der Zellbindungsdomäne einfügen. Schließlich wird die letzte Gruppe von Elastin Repeats am terminalen Ende der Zellbindungsdomäne unter Verwendung des gleichen Verfahrens eingesetzt. Zu überprüfen, ob die rekombinanten Gene erfolgreich aufgebaut wurde jedes rekombinante Plasmid Test mit XhoI und SalI verdaut 3 h bei 37 °C. Die 1 zeigt die DNA-Inserts und Vektor-Bänder nach dem Test Verdauung. Für jede der aECM Proteine ​​die Grße der Inserts entsprach der Größe des Gens, was bestätigt, dass die Klonierung der Tat erfolgreich. Weitere Überprüfung durch DNA-Sequenzierung bestätigt auch die Testergebnisse der Verdauung.

Wir konnten die aECM Proteinen durch ITC bei ausreichender Elastingehalt vorliegenden jeweils aECM Protein zu reinigen. 2 zeigt die schematische Darstellung des gesamten Reinigungsverfahrens. Die O / N-Kultur wurde in 1 l-Schüttelkolben mit einem typischen Ausgangs-OD 600 von 0,01 angeimpft. Die Kultur wurde nach 3-4 Stunden OD 600 von 0,6-0,8. Protein-Expression wurde unter Verwendung von 1 mM IPTG induziert. Nach 4 Stunden wird das typische OD von 1,5 erreicht. Die bakterielle Kultur wurde geerntet und zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde gewogen. Das Durchschnittsgewicht des Zellpellets betrug etwa 3 g / lKultur. Das Pellet wurde in TEN-Puffer resuspendiert und bei -80 ° CO / N froren.

Eine Reihe von Gefrier- / Tau-Zyklen wurden verwendet, um die Zellen zu lysieren. Die Gefrier-Tau-Stufe bewirkt, dass die Zelle zu quellen und zu schrumpfen, schließlich brechen aufgrund Eiskristallen während des Gefrierprozesses gebildet. Anschließend DNase I und RNase I wurden zu dem Zelllysat zugegeben, um alle DNA und RNA zu verdauen. PMSF ist ein Protease-Inhibitor, der auch zu dem Zelllysat zugegeben wurde, um den Proteinabbau zu minimieren. Um eine vollständige Lyse der Zellen weiter zu gewährleisten, wurde das Lysat weiter beschallt, während auf Eis gehalten.

Das Zellysat wurde dann zu 3 Zyklen ITC Reinigung unterworfen. Am Ende der 3 Zyklen wird das Pellet am Ende der Aufwärmzyklus glich Honig in Konsistenz und hatte eine leicht gelbe Färbung. Das Pellet einge transparent bei Kontakt mit Wasser, und leicht in vorgekühlte autoklaviertem Wasser unter Schütteln aufgelöst. Das gereinigte Protein wird dialysiert, um restliche s entfernenalt. Die am Ende des letzten Testzyklus erhaltene Proteinlösung wurde auf eine kurze Länge der Dialyseschlauch (mit 12 kDa Molekulargewicht abgeschnitten). Am Ende der Dialyse wurde die Proteinlösung in ein sauberes 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und bei -20 ° C eingefroren. Am nächsten Tag wurde die gefrorene Proteinlösung gefriergetrocknet, um den Wassergehalt zu entfernen. 3 zeigt ein Bild von dem dialysierten Protein, mit einer typischen wollähnlichen Aussehen.

Zu bestimmen, ob das Protein-Expression wurde in der Tat hervorgerufen, bevor Proben gesammelt und nach der Induktion wurden durch SDS-PAGE-Elektrophorese analysiert. Dabei wurde 12% SDS-PAGE-Gel ausreicht, um Proteine ​​mit Molekulargewichten von 20-150 kDa zu trennen. Im Falle, dass das Molekulargewicht groß ist, dh> 100 kDa, 8% SDS-PAGE-Gelen konnte bessere Proteintrennung verwendet werden. 4 zeigt eine intensive Proteinbande bei dem vorhergesagten Molekulargewicht der induzierten sample (Bahn 2). Typischerweise wurde SDS-PAGE-Analyse unmittelbar nach der Proteinexpression durchgeführt vor dem Reinigen. Anschließend Proben durch das Reinigungsverfahren kann auch unter Verwendung von SDS-PAGE-Elektrophorese, um eine effiziente Reinigung des Zielproteins sicherzustellen analysiert werden gemacht. 4 zeigt auch ein SDS-PAGE-Gel eines gereinigten Proteinprobe mit einem Molekulargewicht von 22 kDa (Spur 4 enthält ), entsprechend dem LN-5 aECM 14. Die geschätzte Reinheit der aECM Proteine ​​betrug etwa 90% -95%; Dieser Wert wurde durch Vergleich der Verhältnisse der Bandenintensitäten des Zielproteins und andere Proteinbanden auf SDS-Gel (Abbildung 4, Spur 4) vorhanden abgeleitet. Schließlich, um festzustellen, ob das gereinigte Protein wurde in der Tat die aECM Proteine ​​wurde Western-Blotting durchgeführt. Anschließend MALDI-TOF wurde ebenfalls durchgeführt, um den Gehalt an Verunreinigungen des gereinigten Materials 14 genau zu bestimmen. 5 zeigt das Proteinreinheit von the drei aECM Proteine ​​mit SDS-PAGE-Gel in 5A und gegen ein Bild der Nitrozellulosemembran für Western Blotting in 5B zu vergleichen, die das Vorhandensein der Zielproteine ​​Col-IV aECM und LN-5 aECM, markiert mit Anti -6x His-Tag Antikörper mit Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiert. Die endgültigen Ausbeuten der aECM Proteine ​​lagen zwischen 60 mg / l bis 120 mg / L.

Abbildung 1
Abbildung 1. DNA Agarose-Gelelektrophorese von Proteinen aECM. Überprüfung der endgültigen aECM Protein DNA-Konstrukte durch Restriktionsenzyme Verdauung lief auf 1,2% DNA Agarose-Gel. Rekombinante Plasmide enthalten, für jede der aECM Proteine ​​wurden doppelt mit XhoI und SalI bei 37 ° C verdaut 3 h Die Grßen der Inserts entsprechen der Größe jedes aECM Protein-Gens (FN910: 1,8kbp, Col-IV: 696 bp, LN-5: 699 bp) und die Größe des Vektors pET22b (+) verwendet wird, ist 5,5 kbp.

Figur 2
Figur 2: Schematische Fluss für die Proteinexpression, Lyse und Aufreinigung aECM Proteinen. Die Grundlagen für die Expression des rekombinanten Proteins ausgehend von der Inokulation einer einzelnen Kolonie auf kleine Kultur und skalieren bis 1-l-Kultur, Ernten und Resuspendieren der Zellen, gefolgt von Protein-Lyse. Proteinreinigung wurde unter Verwendung von LCST-Verhalten von Elastin artigen in den künstlichen ECM Proteine ​​vorhanden Domänen durchgeführt. Die aECM Proteine ​​über ITC gereinigt. Mehrere kalte und warme Zyklen wurden durchgeführt, um eine hohe Reinheit des Zielproteins zu erreichen. Schließlich wurden das Zielprotein mit Wasser dialysiert und gefriergetrocknet bis zur weiteren Verwendung. "O / N" = über Nacht. "S / n" = Überstand.


Abbildung 3. Bild von lyophilisiert aECM Protein durch Inverse Transition Radfahren. Lyophilized LN5-aECM gereinigt hat eine Wolle-wie Aussehen.

Figur 4
Abbildung 4. SDS-PAGE-Gelelektrophorese von aECM Protein (LN-5 aECM). Spur 1 und 2 zeigt, Kultur vor und nach der Proteininduktion. Vorhandensein eines dicken Band in der Nähe von 22 kDa zeigt, dass der LN-5 aECM wurde erfolgreich zum Ausdruck gebracht. Spur 3 zeigt den vollständigen Zelllysat während Spur 4 zeigt die gereinigten LN-5 aECM Protein nach 3 Zyklen von ITC.

Figur 5
Figur 5 (A) SDS-PAGE-Gel der aECM Proteinen. (B) Western-Blot für 6x His-Tag für Col sondiert-IV Und LN-5 aECM Proteinen. Beide Col-IV und LN-5 aECM Proteine ​​enthalten C-Terminus 6xHis-tag. An der vorhergesagten Molekulargewicht für die Proben LN-5 aECM und 24 kDa für die Proben Col-IV aECM beobachtet bei 22 kDa, die 6x im gereinigten Protein vorhanden His-Tag Positive Chemilumineszenz.

<td rowspan = "9"> 2 × YT-Medium
Medien / L Komponenten und Anweisungen
SOC-Medium 20 g Trypton
5 g Hefeextrakt
0,6 g NaCl
0,2 g KCl
Hinzufügen und Autoklaven in 940 ml Wasser,
dann fügen Sie sterile (filtersterilisiert)
10 ml 1 M MgCl 2
10 ml 1 M MgSO 4
40 ml 20% Glucose
16 g Trypton
10 g Hefeextrakt
5 g NaCl
15 g Bacto-Agar (Zusatz nur für Agar-Platte)
In Wasser gelöst und oben bis zu 1 L und Autoklaven.
Auf Agarplatten, cool bis 55 vorbereiten ° C vor der Zugabe von Antibiotika.
Gut mischen vor dem Gießen in Petrischale.
Kühlen die Platten bis Agar verfestigt.
Wickeln Sie Platten in Parafilm und lagern auf den Kopf in 4 ° C.
Terrific Broth (TB) 12 g Trypton
24 g Hefeextrakt
4 ml Glycerol
Man löst in 700 ml Wasser und Autoklaven.
16,42 g K 2 HPO 4(Merck)
2,31 g KH 2 PO 4 (Merck)
Man löst in 300 ml Wasser und im Autoklaven getrennt, um sicherzustellen, Salze vollständig gelöst.
Kombinieren Sie beide mittleren und Salze nach dem Abkühlen.

Tabelle 1 Rezepte für SOC-Medium, 2 × YT-Medium / Agar und Terrific Broth. Medien für E. coli-Kultur in die molekulare Klonierung und die Proteinexpression verwendet.

Lösung / L Komponenten und Anweisungen
Coomassie Brilliant Blue-Färbung 0,25 g Coomassie blueR250
100 ml Eisessig
450 ml Methylalkohol
450 ml Wasser
100 ml Eisessig
400 ml Methylalkohol
500 ml Wasser

Tabelle 2. Rezepte für Lösungen zu färben und entfärben SDS-PAGE-Gel. Coomassie Brilliant Blue R250 für Färbung und einer Entfärbelösung zur Charakterisierung unter Verwendung von SDS-PAGE.

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Discussion

Recombinant Protein-Engineering ist eine vielseitige Technik, um neue Proteinmaterialien unter Verwendung eines Bottom-up-Ansatz zu schaffen. Die Materialien auf Proteinbasis kann je nach Anwendungsfall von Interesse konstruiert werden, um mehrere Funktionalitäten aufweisen, zugeschnitten. Aufgrund der zunehmenden Fortschritt in der Klonierung und Proteinexpression Technologien ist es relativ einfach (und kostengünstiger) zu werden, um eine Vielzahl von künstlichen Proteine ​​auf eine reproduzierbare und skalierbare Weise zu erstellen. Elastin-ähnliche Domäne ist in einer Anzahl von künstlichen Proteine ​​eingebaut wurde, um als Reinigungsmarkierung dienen, sowie die mechanischen Eigenschaften zu verleihen. Künstliche Proteine, die ein Elastin-ähnliche Sequenz enthalten, können leicht gereinigt werden, unter Verwendung von ITC, wodurch die Notwendigkeit für teure Reinigungssäulen und Antikörper eliminiert.

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, um rekombinante Plasmide kodieren für Proteine ​​aECM zu konstruieren. Gene, die für die Elastin-ähnliche Wiederholungen angeschafft. Fürhoch repetitive Peptidsequenz wie Elastin ähnliche Polypeptide, ist es empfehlenswert, die Klonierungsstrategie, daß rekursive gerichtete Ligation (RDL) Strategien können verwendet werden, 22 zu gestalten. Durch die Verwendung von RDL, könnte sich wiederholenden Polypeptide mit einer bestimmten Kettenlänge synthetisiert und werden daher Gene von Interesse kann so kurz Monomere erworben werden.

In unserer Arbeit wurden die Zellbindungsdomänen zur flankierenden NheI Restriktionsstellen zu enthalten, um an beiden Enden modulare Swapping des zentralen Zellbindungsdomäne zu ermöglichen. Es ist wichtig, Restriktionsstellen, die einzigartig sind und sich nicht in der funktionellen Domäne vorhanden ist oder an anderer Stelle außerhalb der multiplen Klonierungsstelle (MCS) des Wirt-Vektor auszuwählen. Dies ist auf die Verdauung des Einsatzes oder der Vektor an die beabsichtigten Sites zu beschränken. In einigen Fällen kann es notwendig sein, neue Restriktionsstellen im Wirt-Vektor unter Verwendung Mutagenese vor dem Einführen der funktionellen Domäne einzuführen.

UnsereKlonierungsstrategie konnten wir die zentrale Zellbindungsdomäne zu drei Varianten aECM Proteine ​​zu erhalten ohne weiteres ändern. Wir auch festgestellt, daß das Einfügen eines Lysinrests nach dem Start-Methionin gesteigertem Proteingehalt von mehr als 10-fach. Diese drastische Zunahme der Proteinausbeute war am deutlichsten bei LN-5 aECM Proteins, wobei der endgültige Proteinausbeute stieg von 5 mg / l bis 60 mg / l.

Verschiedene E. coli Expressionswirte wurden verglichen, und die BL21 (DE3) pLysS E. coli-Stamm hat die besten Proteinausbeuten. Die Verbesserung in der Proteinausbeute war minimal, wenn die Proteinexpression mit IPTG für mehr als 4 Stunden induziert. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Proteinexpression in IPTG-Konzentrationen von mehr als 1 mM. Allerdings war die Proteinexpression am höchsten, wenn bei OD näher an 0,6 induziert.

Für eine effektive Rückgewinnung von aECM Proteinen unter Verwendung von ITC, ist es wichtig zu beachten, die Temperatur der Zentrifugenvorrichtung. Prüfungsweise die meisten der Reinigungsschritte wurden in einem Kühlraum (4 ° C) durchgeführt, um eine maximale Löslichkeit der aECM Proteine ​​gewährleisten. Es kann auch erforderlich sein, vor Kälte (4 ° C) der Zentrifugenrotor O / N vor dem Kaltzyklus. Ebenso ist der Zentrifugenrotor war (37 ° C) vor dem warmen Kreislauf zu gewährleisten, dass die Temperatur der Proteinlösung wurde über seiner T t aufrechterhalten vorgewärmt.

Zusammenfassend sind die Verfahren zu entwerfen und Klon rekombinanten Plasmide künstlichen ECM-Proteine ​​kodieren, sind beschrieben. Insbesondere die Expression und Reinigung von Proteinen unter Verwendung der aECM ITC skizziert. Schließlich Charakterisierung der aECM Proteine ​​mittels SDS-PAGE-Elektrophorese und Western Blotting wurden beschrieben.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgments

Die Autoren danken, die Finanzierung von Bildungsministerium ACRF Tier 1 (RG41) bestätigen und starten Zuschuss von der Nanyang Technological University. Low und Tjin werden von der Forschung Student Scholarship (RSS) aus Nanyang Technological University, Singapur finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET22b (+) Novagen 69744 T7 expression vectors with resistance to ampicillin 
BL21(DE3)pLysS  Invitrogen C6060-03 additional antibiotics - chloramphenicol
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) Gold Biotechnology I2481C 1 M stock solution with autoclaved water, make fresh prior to induction.
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 plasmid isolation kit
T4 ligase New England Biolabs M0202S
Ampicillin Affymetrix 11259
Chloramphenicol Affymetrix 23660
Zymoclean™ gel DNA recovery kit Zymo Research D4001
XL10-gold strain Agilent Technologies 200315

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