Progettazione e Costruzione di Artificiale matrice extracellulare (AECM) Proteine ​​da

JoVE Journal
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Low, P. S. J., Tjin, M. S., Fong, E. Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (100), e52845, doi:10.3791/52845 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Clonazione di ricombinante plasmidi codifica per proteine ​​AECM

  1. Progettare la sequenza aminoacidica del dominio funzionale (ad esempio, cellule dominio vincolanti e ripete elastina-like). Siti di restrizione design che fiancheggiano le estremità dei domini funzionali per facilitare sub-clonazione usando il software libero secondo le istruzioni del software (ad esempio, http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). Qui, selezionare i siti unici di restrizione che non sono presenti nel dominio funzionale di confinare la digestione ai siti previsti. Scegliere siti di restrizione che appaiono nel sito di clonaggio multiplo (MCS) del vettore host (ad esempio, pET22b (+)) per sub-clonazione.
  2. Reverse sequenza di amminoacidi nella sequenza nucleotidica utilizzando siti gratuiti secondo le istruzioni del software. (Ad esempio, http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). Assicurarsi codoni sono ottimizzati per E. host coli.
  3. Gene di interesse può essere purchasoligonucleotidi incagliati ed in commercio come singoli (cioè, se gli oligonucleotidi <100 coppie di basi (bp)) e permette di effettuare la ricottura del DNA (vedi punto 1.4) per ridurre i costi. In caso contrario, per i geni più grandi di 100 bp, potrebbero essere acquistati attraverso società commerciali.
  4. Ricottura DNA degli oligonucleotidi
    1. Ricuocere gli oligomeri di DNA per ottenere la sequenza del gene desiderato. Sciogliere oligonucleotidi di DNA in un buffer oligomero DNA (Tris 10 mM: 2-ammino-2- (idrossimetil) propan-1,3-diolo, pH 8,0, filtrato) ad una concentrazione finale di 1 mg / mL.
    2. Aggiungere 4 ml di ogni oligomero di 32 microlitri di tampone di ricottura DNA (Tris 10 mM, NaCl 100 mM e 100 nM MgCl 2) per ottenere una miscela totale 40 microlitri.
    3. Far bollire un bicchiere di acqua con una piastra e immergere la miscela per 5 minuti, 95 ° C. Togliere il bicchiere e gradualmente raffreddare l'intero set in una scatola di polistirolo O / N. Gli oligomeri sono stati ricotti e sono pronti per la digestione.
    Aggiungere i corrispondenti enzimi di restrizione per digerire gli oligomeri ricotto (cioè, denominato insert) e vettore ospitante (cioè, pET22b (+)) separatamente. Utilizzare la seguente ricetta (1-2 mg di DNA, 2 microlitri di ciascun enzima di restrizione, 5 ml di 10x tampone di restrizione enzimatica, e acqua fino a una miscela totale 50 microlitri) per 3-4 ore a 37 ° C.
    NOTA: Il pET22b (+) vettore plasmidico è ampicillina resistenti agli antibiotici e contiene un 6x-His tag al C-terminale. Il 6x-His tag presenti in pET22b (+) ci permette di usare il suo-tagged anticorpi per identificare la proteina bersaglio mediante western blotting al punto 7.
  5. Aggiungere caricamento 6x colorante per ogni miscela di digestione. Eseguire le miscele di digestione compreso separatamente una scaletta DNA su 1,2% gel di agarosio DNA contenenti una macchia DNA fluorescente agli UV per 1 ora a 100 V. I dettagli del 1,2% DNA gel di agarosio con un illuminatore luce UV.
  6. Tagliate il gel per estrarre prodotti di DNA digeriti utilizzando kit di purificazione gel commerciale. Elute utilizzando il volume minimo della colonna per ottenere una concentrazione minima di DNA di 50-100 ng / ml.
  7. Combinare il gene di interesse sequenzialmente legando l'inserto di DNA digerito (cioè, ripetizioni elastina o domini di legame cellulari ottenute mediante ricottura DNA) nel vettore plasmidico utilizzando T4 ligasi utilizzando la seguente ricetta: (2 ml di vettore, 1 ml di T4 ligasi, 1,5 ml di T4 tampone legatura, x ml di inserto, da 10,5 x ml di acqua per una miscela totale 15 ml). Incubare la miscela legatura a temperatura ambiente per 2 ore.
    NOTA: concentrazione molare di vettore inserire deve essere variato per ottimizzare l'efficienza legatura. Volume di inserto descritto come x nella ricetta dipende dalla concentrazione di DNA eluito dal punto 1.7.
  8. Thaw E. cellule chimicamente competenti coli DH5α (o qualsiasi sforzo di clonazione) su ghiaccio. Piastre 2xYT Warm agar (Tabella 1) contenente ampicillina (25 mg / ml) a 37 ° C.
  9. Trasformare le cellule utilizzandoshock termico:
    1. Aliquota 50 ml di cellule competenti in provette micro-centrifuga pulite, pre-refrigerati. Pipettare 5 microlitri (tra 100 pg a 100 ng) della miscela di ligasi nelle cellule pipettando delicatamente su e giù per miscelare. Lasciare la miscela in ghiaccio per 20 min.
    2. Immergere il tubo micro-centrifuga contenente la miscela di cellule in un bagno d'acqua 42 ° per 2 minuti e tornato in ghiaccio per 2 min. Tempo la durata di immersione per minimizzare i danni del calore alle cellule.
    3. Aggiungere 500 pl di supporti SOC (Tabella 1) nel tubo micro-centrifuga e incubare a 37 ° C con agitazione per 1 ora.
    4. Distribuire 50 500 microlitri della miscela di cellule / legatura su una piastra di agar 2xYT che è stato pre-riscaldato a RT, contenente ampicillina (25 mcg / ml) e incubare le piastre capovolta a 37 ° CO / N (12-16 hr) .
  10. Il giorno dopo, raccogliere le colonie di DNA dalla piastra di agar con puntali puliti. Far crescere le colonie in 5 ml di 2YT supporti (Tabella1) contenente ampicillina (25 mg / ml) O / N a 37 ° CO / N (12-16 ore) con agitazione (225 rpm).
  11. Il giorno seguente, utilizzare un kit di isolamento plasmide per estrarre i plasmidi di DNA per ogni colonia raccolti secondo il protocollo del produttore. Eluire il DNA con 50 ml di acqua.
  12. Eseguire un test digest con enzimi di restrizione utilizzando la seguente ricetta: (5 microlitri DNA, 0,2 ml di ogni enzima di restrizione, 1 ml 10x tampone di restrizione enzimatica e acqua rabboccare per una miscela totale 10 microlitri), incubare per 2 ore a 37 ° C a schermo per le colonie che probabilmente contengono l'inserto e corsa su 1,2% gel di agarosio DNA come al punto 1.6.
    NOTA: Dopo la digestione, una legatura di successo dovrebbe risultino due bande, una per ogni vettore e l'inserto che corrispondono ai rispettivi peso molecolare (Figura 1).
  13. Invia le colonie probabili per il sequenziamento del DNA usando promotore T7 avanti e indietro primer per sequencer commerciali.

  1. Dal risultato sequenziamento, selezionare una colonia che è stato ligato con successo e utilizzare il DNA plasmidico per trasformazione in E. ospite espressione coli.
  2. Thaw E. ceppo espressione coli (BL21 (DE3) pLysS) su ghiaccio. Nel frattempo, piastre di agar caldi contenenti ampicillina (25 mcg / ml) e cloramfenicolo (34 mg / ml) per RT.
    NOTA: Il plasmide pLysS presente nei batteri ceppo BL21 (DE3) pLysS contiene un gene di resistenza cloramfenicolo. Il plasmide pLysS contiene un repressore gene T7, che è costitutivamente espresso per limitare l'espressione della proteina che perde AECM. Cloramfenicolo è necessario selezionare per cellule batteriche contenenti pLysS durante la coltura.
  3. Ripetere il punto 1.10 di ottenere trasformato E. coli che sono pronti a esprimere le proteine ​​artificiali. Avvolgere piastre di agar in Parafilm e conservare a testa in giù a 4 6; C per un massimo di un mese.

3. L'espressione batterica di AECM Proteine

  1. Vedere la Figura 2, scegliere una colonia dalla piastra di agar trasformata con un puntale e inoculare in 10 ml di sterili Terrific Broth (TB) i media (Tabella 1) che contiene sia ampicillina e antibiotici cloramfenicolo in una provetta. Incubare questa coltura starter a 37 ° CO / N (12-16 ore) con agitazione a 225 rpm.
  2. Trasferimento 10 ml di coltura starter in 1 L mezzi TB freschi e sterili integrate con gli stessi antibiotici in un pallone 3 L Erlenmeyer. Incubare la coltura a 37 ° C con agitazione a 225 rpm per 2-3 ore ed osservare la densità ottica della coltura (OD 600) raggiunto 0,6-0,8 pipettando 1 ml di coltura in una cuvetta vuota per la lettura. Salva 1 ml di coltura prima dell'induzione per SDS-PAGE caratterizzazione.
    1. Per misurare OD 600 della coltura cellulare, preparare 1 fiala di mezzi TB in una provettaper una misurazione vuoto. Separatamente, trasferire 1 ml di coltura dal pallone di coltura in una nuova cuvetta vuota. Misurare la densità ottica della coltura utilizzando uno spettrofotometro contro il controllo in bianco in assorbanza a 600 nm.
    2. Salvare il campione (per la successiva analisi SDS-PAGE) trasferendo i 1 ml di campione di coltura in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, centrifugare a 12.000 xg per 2 minuti e decantare il surnatante.
  3. Indurre la coltura con isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ad una concentrazione finale di 1 mM e incubare a 37 ° C con agitazione a 225 rpm per altri 4 ore. Salva 1 ml di coltura alla fine dell'induzione a 4 ore per SDS-PAGE caratterizzazione.
  4. Raccogliere le cellule trasferendo cultura per bottiglie da centrifuga 1 L e centrifugare a 12.000 xg per 30 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante, pesare il pellet di cellule e risospendere in TEN tampone (1 M Tris, 0,01 M EDTA, 0,1 M di NaCl, pH = 8.0) a 0,5 g / ml.

4. Lisi di colture batteriche

  1. Congelare la coltura cellulare risospeso a -80 ° CO / N. Scongelare la coltura cellulare congelato in un bagno d'acqua a temperatura ambiente o su ghiaccio per lisare le cellule. Aggiungere 10 ug / ml Deoxyribonuclease I (DNasi I), 10 mg / ml ribonucleasi A (RNasi I), e 50 ug / ml phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF) mentre scongelamento e omogeneizzare la soluzione con lenta agitazione.
  2. Dopo che tutte le cellule risospese vengono scongelate, regolare la soluzione a pH 9,0 per aumentare la solubilità della proteina in acqua 12. Aggiungere 6 N NaOH goccia a goccia sotto agitazione su ghiaccio per ottenere una consistenza omogenea. Lyse dalla rottura ultrasuoni per 20 minuti sul ghiaccio con una punta piatta 2 mm di diametro, 5 sec impulso.
  3. Centrifugare la soluzione di cellule a 12,000 xg per 30 min a 4 ° C. Trasferire il surnatante di un ambiente pulito, una bottiglia vuota e conservare a 4 ° C per la purificazione dopo.
  4. Nel frattempo, risospendere il pellet cellulare nuovo con TEN tampone e ri-congelamento a -80 ° C. Alisi cellulare completo, ripetizione gelo / disgelo e sonicazione processo fino a tre volte. Risparmia il 20 lisato cellulare microlitri per SDS-PAGE caratterizzazione.

5. Purificazione di all'AECM proteine ​​Utilizzando Inverse transizione in bicicletta

  1. Fascicola lisato cellulare dal punto 4.3 e procedere per purificare le proteine ​​all'AECM utilizzando ITC, simile a quello utilizzato per la purificazione di proteine ​​di elastina-21. Cicli saranno fatte con diverse temperature che sono di 4 ° C (indicati come "freddo") e 37 ° C (denominati "caldi"), cicli.
  2. Dividere il lisato cellulare in 50 ml bottiglie centrifuga e centrifugare a 40.000 xg per 2 ore a 4 ° C. L'aspetto del pellet deve essere di colore marrone scuro e guardare che cola.
  3. Rimuovere il surnatante pipettando per ottenere una netta separazione dal pellet. Raccogliere il supernatante in bottiglie da centrifuga puliti e aggiungere NaCl ad una concentrazione finale di 1 M (per un massimo di 3 M). Caldola soluzione a 37 ° C per 2 ore con agitazione a 225 rpm.
    NOTA: L'aggiunta di NaCl attiverà il passaggio della componente elastina dell'aggregazione causando AECM. Il surnatante diventerà torbido. Se la concentrazione proteica è sufficientemente elevata, proteine ​​schiumoso bianco può essere visto ai lati della bottiglia centrifuga.
  4. Centrifugare il surnatante dal punto 5.3 a 40.000 xg per 2 ore a 37 ° C. Decantare il surnatante. Schiacciare il pellet con una spatola metallica e risospendere le bit pellet in acqua distillata autoclavata ghiacciata (50 mg / ml) con agitazione vigorosa O / N a 4 ° C utilizzando una ancoretta magnetica e la piastra. Il pellet dovrebbe essere completamente sciolto.
  5. Ripetere i passaggi 5,2-5,4 per altri tre a cinque volte per ottenere una maggiore purezza della proteina.
  6. Dopo il ciclo finale di purificazione, desalificare la soluzione proteica da dialisi contro acqua distillata a 4 ° C. Dializzare soluzione proteica contro l'acqua per 2-3 giorni con i cambiamenti in acqua ogni 4hr o 8 ore per O / N. Invia 20 microlitri della proteina purificata per SDS-PAGE e liofilizzare il resto della proteina purificata e conservare a -80 ° C fino all'utilizzo.

6. Caratterizzazione di all'AECM proteine ​​Utilizzando SDS-PAGE elettroforesi

  1. Preparare un SDS-PAGE gel al 12% (se il peso molecolare è di grandi dimensioni, utilizzare 8% gel SDS-PAGE per una migliore separazione). Aggiungere 2x tampone di caricamento SDS a ciascun campione, riscaldare i campioni per 10 min a 100 ° C ed eseguire campioni sul gel per 1 ora a 100 V o finché la scala della proteina corrispondente al peso molecolare della proteina all'AECM raggiunge la metà del gel.
  2. Recuperare il gel dalla SDS-PAGE configurare e aggiungere Coomassie Brilliant macchia blu (Tabella 2) con un volume di immergere il gel per 1 ora in una capsula di Petri. Gel risciacquo in una soluzione decolorante (Tabella 2) per 5 minuti su un agitatore meccanico. Cambiare la soluzione decolorante, e continuano a Decolorare il gel con dondolo fino al fondo della tegli gel diventa chiaro. Bande di proteine ​​devono essere chiaramente visibili.
  3. Confrontare la posizione della proteina bersaglio contro la scala di proteine ​​per determinare il peso molecolare della proteina bersaglio.
  4. Ad ulteriore conferma della presenza della proteina bersaglio, effettuare western blotting come al punto 7.

7. Caratterizzazione di all'AECM proteine ​​Utilizzando Western Blotting

  1. Eseguire i campioni su un SDS-PAGE gel al 12%, come nel capitolo 6, senza colorazione.
  2. Tagliare membrana di nitrocellulosa a una dimensione leggermente più grande del gel SDS-PAGE. Tagliare 4 pezzi di carta da filtro per le stesse dimensioni.
  3. Wet un pezzo di carta da filtro con Transfer occidentale Buffer (20% v / v di metanolo, 25 mM Tris, 190 mM glicina, pH 8,3), collocare l'SDS-PAGE gel sulla parte superiore della carta da filtro, seguito da un altro foglio di carta da filtro , quindi la membrana di nitrocellulosa e una finale altre due pezzi di carta da filtro. Garantire l'intero set-up è sommersa con sufficiente buffer di trasferimento occidentale.
    NOTA: Il gel e membrane non devono essere in contatto, a questo punto di tempo come proteine ​​potrebbe legarsi alla membrana a contatto.
  4. Trasferire le proteine ​​sulla membrana di nitrocellulosa posizionando due filtri di carta in una unità occidentale trasferimento semi-dry, seguita dalla membrana di nitrocellulosa, e posizionare accuratamente il gel SDS-PAGE all'interno e sulla membrana infine posizionare gli ultimi due carta da filtro umida sulla il gel SDS-PAGE. Eseguire il trasferimento occidentale a 45 mA, 30 min. Aggiungere tampone se la tensione è superiore a 30 V.
    NOTA: Preferibilmente posizionare la SDS-PAGE gel sulla membrana con un tentativo e evitare di spostare il gel inutilmente sulla membrana come proteine ​​potrebbe legarsi alla membrana a contatto.
  5. Recuperare e bloccare la membrana di nitrocellulosa con una soluzione bloccante (5% latte scremato in PBS pH 7.4, filtrata con carta da filtro) per 2 ore a temperatura ambiente. Smaltire tampone di bloccaggio e aggiungere PBS per sciacquare.
    NOTA: Passare nuovi guanti per evitare di contaminare la membrana con prote indesideratiins.
  6. Incubare primario anti-anticorpo con la sua diluizione in PBS a 1: 1.000 a temperatura ambiente per 1 ora con dondolo. Preparare una miscela in un volume tale da sommergere l'intera membrana, per esempio, con rapporto di diluizione 1: 1.000, aggiungere 1 ml di anticorpo (concentrazione magazzino: 1 mg / ml) a 999 ml di PBS per una miscela totale 1 ml.
  7. Lavare la membrana con 5 ml di PBST (PBS con 0,1% Tween20).
  8. Incubare con anticorpo secondario coniugato con rafano perossidasi (HRP) con diluizioni in PBS a 1: 5.000 a temperatura ambiente per 1 ora con dondolo. Preparare una miscela in un volume tale da sommergere l'intera membrana, per esempio, con rapporto di diluizione 1: 5.000, aggiungere 1 ml di anticorpo (concentrazione magazzino: 1 mg / ml) a 4,999 microlitri PBS per una miscela totale 5 ml.
  9. Lavare la membrana con 5 ml di PBST e ripetere due volte.
  10. Applicare il substrato chemiluminescente per la membrana con un volume per coprire la membrana e incubare seguendo le istruzioni del substrato utilizzato.
    NOTA: La sensibilità del substrato di rilevamento proteina può variare, si consiglia un substrato con la massima sensibilità per i segnali molto bassi in caso crescente concentrazione di anticorpi non aumenta i segnali.
  11. Cattura i segnali chemiluminescenti utilizzando un sensore basato su telecamera CCD. Regolare il rapporto di diluizione anticorpo primario e secondario se i segnali sono deboli e non specifici. Incubare più nel bloccare soluzione se il segnale di fondo è alto.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nella progettazione di proteine ​​di fusione contenenti ripetizioni elastina simile, è importante mantenere un contenuto di elastina generale, abbastanza grande frazione della proteina di fusione 18. Questo per garantire che il costrutto proteina di fusione mantiene le sue caratteristiche elastina simili, al fine di utilizzare ITC per la purificazione. Il design e le proteine ​​sequenze descritte in questa sezione AECM particolare sono stati presi dal lavoro di Tjin et al. 14. In questo lavoro, tre proteine ​​AECM sono stati clonati con successo nel pET22b (+) vettore di espressione. Legatura sequenziale ha iniziato con legatura delle ripetizioni elastina inserire nel vettore pET, seguita inserendo il dominio di legame delle cellule. Infine l'ultima serie di ripetizioni elastina fosse inserito all'estremità terminale del dominio di legame cellulare utilizzando lo stesso metodo. Per verificare se i geni ricombinanti è stato costruito con successo, ciascun plasmide ricombinante è stato digerito con XhoI prova e SalI per 3 ore a 37 °C. La Figura 1 mostra l'inserto di DNA e bande vettore dopo la digestione test. Per ciascuna delle proteine ​​all'AECM, la dimensione degli inserti corrisponde alla dimensione del gene, confermando che la clonazione era effettivamente successo. Ulteriore verifica attraverso il sequenziamento del DNA ha anche confermato i risultati di test di digestione.

Siamo stati in grado di purificare le proteine ​​AECM attraverso ITC dato contenuto di elastina sufficienti presenti in ciascuna proteina AECM. La Figura 2 mostra lo schema del processo globale di purificazione. La cultura O / N è stato inoculato in 1 L in pallone con un tipico OD partenza 600 di 0,01. La cultura è cresciuto a OD 600 di 0,6-0,8 dopo 3-4 ore. Espressione della proteina è stata indotta con 1 mM di IPTG. Dopo 4 ore, il diametro esterno tipico di 1,5 è raggiunto. La coltura batterica è stato raccolto e sottoposto a centrifugazione. Il supernatante è stato scartato e il pellet cellulare è stato pesato. Il peso medio del pellet era di circa 3 g / L dicultura. Il pellet è stato risospeso in tampone di TEN e congelato a -80 ° CO / N.

Una serie di cicli di congelamento / scongelamento sono stati usati per lisare le cellule. Il passo di gelo-disgelo induce la cellula a gonfiarsi e restringersi, infine rotture per cristalli di ghiaccio che si formano durante il processo di congelamento. Successivamente, DNase I RNase e mi sono stati aggiunti al lisato cellulare di digerire tutto il DNA e l'RNA. PMSF è un inibitore della proteasi, che è stato anche aggiunto al lisato cellulare per minimizzare la degradazione delle proteine. Mentre Per garantire ulteriormente la lisi cellulare completa, il lisato è stato ulteriormente sonicato tenuta in ghiaccio.

Il lisato cellulare è stato quindi sottoposto a 3 cicli di purificazione ITC. Al termine dei 3 cicli, il pellet alla fine del ciclo di riscaldamento assomigliava miele in consistenza e aveva una leggera colorazione gialla. Il pellet trasformato trasparente a contatto con l'acqua, e facilmente dissolto in acqua autoclavata pre-raffreddata con agitazione. La proteina purificata è dializzata per rimuovere eventuali residui salt. La soluzione proteica ottenuta al termine del ciclo finale caldo è stato trasferito ad un breve tratto di tubo di dialisi (con peso molecolare 12 kDa tagliato). Alla fine della dialisi, la soluzione proteica è stata trasferita ad un pulito 50 ml provetta da centrifuga e congelato a -20 ° C. Il giorno successivo, la soluzione proteica è stato congelato liofilizzato per rimuovere il contenuto di acqua. La figura 3 mostra un'immagine della proteina dializzato, avere un aspetto tipico di lana-like.

Per determinare se l'espressione della proteina è stata indotta in effetti, i campioni prelevati prima e dopo induzione sono stati analizzati mediante SDS-PAGE elettroforesi. Qui, 12% SDS-PAGE gel era sufficiente per separare le proteine ​​con pesi molecolari di 20-150 kDa. Nel caso in cui il peso molecolare è grande, cioè,> 100 kDa, 8% gel SDS-PAGE potrebbero essere utilizzati per una migliore separazione delle proteine. La Figura 4 mostra una banda proteica intenso il peso molecolare previsto nella sa indottample (corsia 2). In genere, SDS-PAGE analisi è stata eseguita subito dopo l'espressione della proteina prima della depurazione i. Successivamente, i campioni prelevati durante il processo di purificazione potrebbe anche essere analizzati utilizzando SDS-PAGE elettroforesi per garantire la purificazione efficace della proteina bersaglio. Figura 4 mostra anche un gel SDS-PAGE contenente un campione di proteina purificata con un peso molecolare di 22 kDa (corsia 4 ), corrispondente alla LN-5 AECM 14. La purezza stimata delle proteine ​​all'AECM era circa il 90% -95%; tale valore è stato derivato confrontando rapporti delle intensità di banda della proteina bersaglio e altre bande proteiche presenti sul gel SDS (Figura 4, corsia 4). Infine, per determinare se la proteina purificata era infatti le proteine ​​AECM, è stata eseguita western blotting. Successivamente, MALDI-TOF è stato anche eseguito per determinare con precisione il contenuto di impurità del materiale purificato 14. Figura 5 mostra la purezza della proteina di the tre proteine ​​all'AECM con un gel SDS-PAGE in Figura 5A e da confrontare con l'immagine della membrana di nitrocellulosa per western blotting in Figura 5B, mostra la presenza delle proteine ​​bersaglio Col-IV all'AECM e LN-5 all'AECM, marcati usando contro -6x anticorpi His-tag coniugati con rafano perossidasi (HRP). I rendimenti finali delle proteine ​​AECM compresi tra 60 mg / L a 120 mg / l.

Figura 1
Figura 1. DNA gel elettroforesi delle proteine ​​all'AECM. Verifica della proteina finale all'AECM DNA costruisce attraverso enzimi di restrizione digestione riceve 1,2% gel DNA. Plasmidi ricombinanti codificanti per ciascuna delle proteine ​​all'AECM stati digeriti con doppia XhoI e SalI per 3 ore a 37 ° C. Le dimensioni degli inserti corrispondono alle dimensioni di ogni all'AECM proteina gene (FN910: 1.8kbp, Col-IV: 696 bp, LN-5: 699 bp) e la dimensione del vettore pET22b (+) usato è 5,5 kbp.

Figura 2
Figura 2. Schema flusso per l'espressione di proteine, lisi e purificazione di proteine ​​all'AECM. La guida di base per l'espressione della proteina ricombinante, partendo dalla inoculazione di una singola colonia piccola cultura e scalare fino a 1 L coltura, la raccolta e risospendere di celle, seguita da proteine ​​lisi. Purificazione delle proteine ​​è stata effettuata utilizzando il comportamento LCST di domini presenti nelle proteine ​​ECM artificiali elastina-like. Le proteine ​​AECM sono purificati via ITC. Cicli caldi e freddi multipli sono stati eseguiti per ottenere un'elevata purezza di proteina bersaglio. Infine, la proteina bersaglio erano dializzata con acqua e liofilizzate fino ad ulteriore utilizzo. "O / N" = durante la notte. "S / n" = surnatante.


Figura 3. Immagine di liofilizzato proteine ​​all'AECM purificata da Inverse Transition Ciclismo. Liofilizzato LN5-AECM ha un aspetto di lana-like.

Figura 4
Figura 4. SDS-PAGE gel elettroforesi di proteine ​​all'AECM (LN-5 AECM). Corsia 1 e 2 mostra coltura prima e dopo l'induzione della proteina. La presenza di una band di spessore vicino a 22 kDa mostra che la LN-5 AECM è stato espresso con successo. Corsia 3 mostra il lisato cellulare pieno mentre corsia 4 mostra la purificata LN-5 AECM proteina dopo 3 cicli di ITC.

Figura 5
Figura 5. (A) SDS-PAGE gel delle proteine ​​all'AECM. (B) Western Blot sondato per 6x His-tag per Col-iv E LN-5 AECM proteine. Entrambe le proteine ​​Col-IV e LN-5 AECM contengono C-terminale 6xHis-tag. Chemiluminescence positivo osservato nel peso molecolare previsto a 22 kDa per il campione LN-5 AECM e 24 kDa per il campione Col-IV AECM rappresenta 6x His-tag presenti nella proteina purificata.

<td rowspan = "9"> supporti 2xYT
Media / L Componenti e istruzioni
Media SOC 20 g Triptone
5 g Estratto di lievito
0,6 g NaCl
0,2 g KCl
Aggiungere e autoclave in acqua 940 ml,
quindi aggiungere sterile (sterilizzato per filtrazione)
10 ml 1 M MgCl 2
10 ml 1 M MgSO4
40 ml 20% glucosio
16 g Triptone
10 g Estratto di lievito
5 g NaCl
15 g Bacto Agar (aggiunta solo per piastra di agar)
Sciogliere in acqua e l'alto fino a 1 L e autoclave.
Per preparare piastre di agar, cool per 55 ° C prima dell'aggiunta di antibiotici.
Mescolare bene prima di versare in piastra di Petri.
Raffreddare le piastre di agar è solidificato fino a quando.
Avvolgere le piastre in Parafilm e conservare a testa in giù a 4 ° C.
Brodo Terrific (TB) 12 g Triptone
24 g Estratto di lievito
4 ml glicerolo
Sciogliere in 700 ml di acqua e autoclave.
16.42 g K 2 HPO 4(Merck)
2.31 g KH 2 PO 4 (Merck)
Sciogliere in acqua 300 ml ed autoclave separatamente, al fine di garantire sali sono completamente sciolti.
Combina sia a medio e sali dopo il raffreddamento.

Tabella 1. Ricette per i media SOC, 2xYT media / agar e Terrific brodo. Supporti per E. cultura coli usato nella clonazione molecolare e l'espressione della proteina.

Soluzione / L Componenti e istruzioni
Coomassie Brilliant Blue macchia 0,25 g Coomassie blueR250
100 ml di acido acetico glaciale
Alcool 450 ml metilico
Acqua 450 ml
100 ml di acido acetico glaciale
Alcool 400 ml metilico
Acqua 500 ml

Tabella 2. Ricette per soluzioni per macchiare e Decolorare SDS-PAGE gel. Coomassie Brilliant Blue R250 per la colorazione e una soluzione decolorante per la caratterizzazione mediante SDS-PAGE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ingegneria proteica ricombinante è una tecnica versatile per creare sostanze proteiche nuovi con un approccio bottom-up. I materiali a base di proteine ​​può essere progettato per avere funzionalità multiple, su misura secondo l'applicazione di interesse. A causa della crescente avanzamento nelle tecnologie di clonaggio e di espressione proteica, è diventato relativamente semplice (ed economico) per creare una varietà di proteine ​​artificiali in modo riproducibile e scalabile. Il dominio elastina-like è stata incorporata in un certo numero di proteine ​​artificiali, per servire come un tag di purificazione, nonché per conferire proprietà meccaniche. Proteine ​​artificiali che contengono una sequenza elastina-simili possono essere facilmente purificati utilizzando ITC, che elimina la necessità di colonne di purificazione costosi e anticorpi.

Questo protocollo descrive i passi per costruire plasmidi ricombinanti che codificano per proteine ​​AECM. I geni che codificano per le ripetizioni elastina, come sono stati acquistati. Persequenza di peptidi altamente ripetitiva come elastina come polipeptidi, si raccomanda di progettare la strategia di clonazione tale che ricorsiva legatura direzionale (RDL) strategie possono essere utilizzati 22. Utilizzando RDL, polipeptidi ripetitivi con una lunghezza specifica catena potrebbero essere sintetizzati e quindi geni di interesse possono essere acquistati come brevi monomeri.

Nel nostro lavoro, i domini cellulari vincolante stati progettati per contenere fiancheggianti i siti di restrizione NheI su entrambe le estremità per consentire lo scambio modulare del dominio di legame cella centrale. È importante selezionare siti di restrizione che sono unici e non sono presenti nel dominio funzionale o altrove fuori del sito di clonaggio multiplo (MCS) del vettore host. Questo per limitare la digestione dell'inserto o vettoriale per i siti rientranti. In alcuni casi, può essere necessario introdurre nuovi siti di restrizione nel vettore host mediante mutagenesi prima dell'inserimento del dominio funzionale.

Nostrostrategia clonazione ci ha permesso di cambiare facilmente la cellula dominio centrale di legame per ottenere tre varianti di proteine ​​AECM. Abbiamo anche notato che l'inserimento di un residuo di lisina dopo la metionina partendo resa di proteine ​​di oltre 10 volte. Questo drammatico aumento nella resa di proteine ​​è più evidente con LN-5 all'AECM proteina, in cui la resa di proteine ​​finale aumentata da 5 mg / L a 60 mg / L.

Vari E. coli espressione host sono stati confrontati, e BL21 (DE3) pLysS E. coli ha dato i migliori rendimenti di proteine. Il miglioramento della resa di proteine ​​era minimo quando l'espressione della proteina è stata indotta con IPTG per più di 4 ore. Non c'era alcuna differenza significativa nella espressione della proteina a concentrazioni IPTG superiori a 1 mm. Tuttavia, l'espressione della proteina era il più elevato quando indotta a OD più vicino a 0,6.

Per un efficace recupero di proteine ​​all'AECM utilizzando ITC, è importante rilevare la temperatura alla centrifuga. Per esameple, la maggior parte delle fasi di purificazione sono stati eseguiti in una stanza fredda (4 ° C) per garantire la massima solubilità delle proteine ​​all'AECM. Può anche essere necessario pre-raffreddare a (4 ° C) del rotore della centrifuga O / N prima del ciclo freddo. Analogamente, il rotore della centrifuga è stato pre-riscaldato a (37 ° C) prima del ciclo di riscaldamento per assicurare che la temperatura della soluzione proteica è stata mantenuta al di sopra della T t.

In sintesi, le procedure di progettazione e di plasmidi ricombinanti clone che codificano proteine ​​ECM artificiali sono descritti. In particolare, l'espressione e la purificazione delle proteine ​​all'AECM utilizzando ITC sono delineati. Infine, la caratterizzazione delle proteine ​​all'AECM usando elettroforesi SDS-PAGE e Western Blotting sono stati descritti.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgments

Gli autori vorrebbero riconoscere il finanziamento del Ministero della Pubblica Istruzione ACRF Tier 1 (RG41) e l'avvio di sovvenzione da Nanyang Technological University. Basso e Tjin sono finanziati dalla borsa di ricerca per studenti (RSS) da Nanyang Technological University, Singapore.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET22b (+) Novagen 69744 T7 expression vectors with resistance to ampicillin 
BL21(DE3)pLysS  Invitrogen C6060-03 additional antibiotics - chloramphenicol
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) Gold Biotechnology I2481C 1 M stock solution with autoclaved water, make fresh prior to induction.
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 plasmid isolation kit
T4 ligase New England Biolabs M0202S
Ampicillin Affymetrix 11259
Chloramphenicol Affymetrix 23660
Zymoclean™ gel DNA recovery kit Zymo Research D4001
XL10-gold strain Agilent Technologies 200315

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, Q., Liang, S., Thouas, G. A. Elastomeric biomaterials for tissue engineering. Prog Polym Sci. 38, (3-4), 584-671 (2013).
  2. Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering - In vivo and in vitro applications. Adv Drug Deliv Rev. 63, (4-5), 352-366 (2011).
  3. Kushner, A. M., Guan, Z. Modular Design in Natural and Biomimetic Soft Materials. Angewandte Chemie International Edition. 50, (39), 9026-9057 (2011).
  4. Gagner, J. E., Kim, W., Chaikof, E. L. Designing protein-based biomaterials for medical applications. Acta Biomater. 10, (4), 1542-1557 (2014).
  5. Gomes, S., Leonor, I. B., Mano, J. F., Reis, R. L., Kaplan, D. L. Natural and genetically engineered proteins for tissue engineering. Prog Polym Sci. 37, (1), 1-17 (2012).
  6. Werkmeister, J. A., Ramshaw, J. A. M. Recombinant protein scaffolds for tissue engineering. Biomedical Materials. 7, (1), 012002 (2012).
  7. MacNeil, S. Biomaterials for tissue engineering of skin. Materials Today. 11, (5), 26-35 (2008).
  8. Fong, E., Tirrell, D. A. Collective Cell Migration on Artificial Extracellular Matrix Proteins Containing Full-Length Fibronectin Domains. Advanced Materials. 22, (46), 5271-5275 (2010).
  9. Ratner, B. D., Bryant, S. J. BIOMATERIALS: Where We Have Been and Where We are Going. Annual Review of Biomedical Engineering. 6, (1), 41-75 (2004).
  10. Cai, L., Heilshorn, S. C. Designing ECM-mimetic materials using protein engineering. Acta Biomater. 10, (4), 1751-1760 (2014).
  11. Annabi, N., et al. Elastomeric recombinant protein-based biomaterials. Biochemical Engineering Journal. 77, (0), 110-118 (2013).
  12. Heilshorn, S. C., DiZio, K. A., Welsh, E. R., Tirrell, D. A. Endothelial cell adhesion to the fibronectin CS5 domain in artificial extracellular matrix proteins. Biomaterials. 24, (23), 4245-4252 (2003).
  13. Simnick, A. J., Lim, D. W., Chow, D., Chilkoti, A. Biomedical and Biotechnological Applications of Elastin-Like Polypeptides. Polymer Reviews. 47, (1), 121-154 (2007).
  14. Tjin, M. S., Chua, A. W. C., Ma, D. R., Lee, S. T., Fong, E. Human Epidermal Keratinocyte Cell Response on Integrin-Specific Artificial Extracellular Matrix Proteins. Macromolecular Bioscience. 14, (8), 1125-1134 (2014).
  15. MacNeil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445, (7130), 874-880 (2007).
  16. Kariya, Y., et al. Differential regulation of cellular adhesion and migration by recombinant laminin-5 forms with partial deletion or mutation within the G3 domain of α3 chain. J Cell Biochem. 88, (3), 506-520 (2003).
  17. Shang, M., Koshikawa, N., Schenk, S., Quaranta, V. The LG3 module of laminin-5 harbors a binding site for integrin α3Β1 that promotes cell adhesion, spreading, and migration. J Biol Chem. 276, (35), 33045-33053 (2001).
  18. Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Current Protocols in Protein Science. 6.11.1-6.11.16 (2010).
  19. Keeley, F. Ch. 4. Evolution of Extracellular Matrix.Biology of Extracellular Matrix. Springer. Berlin Heidelberg. 73-119 (2013).
  20. Le, D. H. T., et al. Self-Assembly of Elastin-Mimetic Double Hydrophobic Polypeptides. Biomacromolecules. 14, (4), 1028-1034 (2013).
  21. MacEwan, S. R., Hassouneh, W., Chilkoti, A. Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), e51583 (2014).
  22. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3, (2), 357-367 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics