Einkanal-Analyse und Calcium Imaging in den Podozyten der frisch isolierten Glomeruli

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli. J. Vis. Exp. (100), e52850, doi:10.3791/52850 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Nieren halten homöostatischen Gleichgewicht für verschiedene Stoffe und Regulierung des Blutvolumens in einer Weise, die Gesamtblutdruck bestimmt. Störungen der Nierenfiltration, Resorption oder Sekretion führen zu begleiten oder pathologische Zustände, die von Hyper- oder Hypotonie, um Nierenerkrankungen im Endstadium, die schließlich erfordert Nierentransplantation beenden. Die Nieren-Filtereinheit (Glomerulus) besteht aus drei Schichten - die Kapillarendothel, Basalmembran und eine Einzelzellschicht von Epithelzellen - Podozyten, die eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Spaltmembran Integrität und Funktion 1 zu spielen. Dysfunktion bei permselektiven glomerulären Filter verursacht Urinverlust von Makromolekülen, wie Proteinurie. Verschiedene Mittel können die Struktur der podocytes und deren Fuß Verfahren, die die Integrität der Glomeruli Filtrationsbarriere bestimmen beeinflussen.

Die podocytes in der Aufrechterhaltung der glom beteiligtenEruli Filterfunktion. Es wurde festgestellt, dass Fehlcalcium Handhabung durch den podocyte führt zu Zellschäden und spielt eine wichtige Rolle beim Fortschreiten der verschiedenen Formen von Nephropathien 2,3. Daher ist die Entwicklung eines Modells, das für die direkte Messung der intrazellulären Calciumkonzentration Veränderungen ermöglicht wird entscheidend für die Untersuchung der Podozyten Funktion sein. Isolated Glomeruli waren zuvor in einer Vielzahl von Studien, einschließlich Messung der Albuminreflexionskoeffizient ändert 4 und Beurteilung des integralen Zellströme in den Ganzzellelektrophysiologische Patch-Clamp-Messungen 5,6 verwendet. In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir das Protokoll, das die Forscher ermöglicht, intrazelluläre Calcium-Konzentration sich in Abhängigkeit von Anwendungen von pharmakologischen Mitteln zu messen, abzuschätzen Basalniveaus von Calcium in den Zellen und zu beurteilen einzelnen Calciumkanäle Aktivität. Ratometric Calciumkonzentration Messungen und Patch-Clamp-electrophysiology wurden verwendet, um Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration innerhalb des podocyte und Kanalaktivität zu bestimmen sind.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tierversuche und Tierschutz sollte auf die NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren folgende Protokolle überprüft und von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) genehmigt einzuhalten.

1. Kidney Flush

  1. Verwenden Sie 8 bis 12 Wochen alte männliche Ratten (empfohlen ist ein Stamm Sprague Dawley, aber andere Stämme von unterschiedlichen Alters und Geschlechts mit entsprechenden Änderungen verwendet werden).
  2. Betäuben das Tier nach dem Verfahren von IACUC Protokoll erlaubt; Narkosetiefe zu überwachen und zu kontrollieren das Tier. Die detaillierte Beschreibung der Operation in 1.3 durchgeführt werden - 1.8 kann in Ilatovskaya et al 7.
  3. Nach entsprechender Anästhesie, legen Sie das Tier auf einem temperaturgesteuerten Operationstisch, einen Mittellinienschnitt des Bauches (bis zu 3 cm in der Länge), und entdecken Sie die Hohlvene und die Aorta.
  4. Legen Ligatur um die Zöliakie und mesenterica superior Arterien und der BauchAorta über denen; nicht zu ligieren.
  5. Stumpf sezieren der abdominalen Aorta unterhalb der Nierenarterien, und legen Sie zwei Ligaturen um ihn herum, aber nicht unterbinden, dann klemmen die Aorta oberhalb der Ligaturen und binden Sie den Unterfaden.
  6. Katheterisierung der Aorta mit einer Polyethylen PE50-Schlauch (mit einer Spritzenpumpe mit PBS gefüllt befestigt) unterhalb der Klemme und Fixierung des Katheters mit dem zweiten Ligatur; entfernen Sie die Klammer, schalten Sie die Pumpe und ligieren der Aorta und der Mesenteriallymphknoten mit abdominaler Arterien. Schnell zu machen Einschnitt in Nierenvene, um den Druck zu entlasten.
  7. Infundieren die Aorta mit vorgekühltem PBS für 2 oder 3 Minuten lang bei einer Geschwindigkeit von 6 ml / min.
  8. Stoppen Perfusion, Verbrauchsteuern und decapsulate 7 die Nieren, und legte sie auf Eis in der PBS-Lösung. Euthanize das Tier nach Protokoll IACUC genehmigt.

2. Isolierung des Ratten-Glomeruli

  1. Vorbereitung 30 ml frische Lösung von 5% BSA in RPMI 1640.
  2. Mit einer Rasierklinge und Scheren,isolieren die Rinde beider Nieren, und dann, bis sie homogen Blatt vor den Mund. Dieses Verfahren wurde zuvor 7 beschrieben.
  3. Schieben Sie das Gewebe während der vorherigen Schritt Hackfleisch durch ein 100-Mesh-Sieb aus rostfreiem Stahl (in 5% BSA / RPMI-Lösung vorgeweicht) mit einem Spatel. Sammeln Sie die Durchfluss und durch Schwerkraft ermöglicht die Durchfluss um durch ein 140-Mesh-Sieb passieren.
  4. Filtern Sie die Durchfluss von den 140 mesh Sieb gesammelt unter Verwendung eines vorher eingeweicht 200-Mesh-Sieb, Filtrat verwerfen und waschen Sie die Spitze des Sieb mit 10 bis 15 ml der vorbereiteten BSA / RPMI-Lösung, um den Glomeruli, die auf sedimentieren sammeln das Sieb.
  5. Legen Sie die BSA / RPMI-Lösung, die Glomeruli auf Eis in einem 15-ml-Tube und lassen Sie die Glomeruli Sediment am Boden des Rohres für bis zu 20 min. Glomeruli Konzentrat auf der Unterseite des Rohres deutlich sichtbar. Entfernen Sie die überschüssige Lösung, so dass etwa 2 ml in die Röhre.

3. Single-Channel-Patch-Clamp Electrophysiology

  1. Bereiten Sie 5 x 5 mm Deckglas-Chips durch Beschichtung mit MW 70.000 - 150.000 poly-ʟ-Lysin, und trocknen lassen. Verwenden Sie ca. 30 & mgr; l 0,01% steril filtriert Lösung in Wasser pro Deckglas.
  2. Warm up die experimentellen Lösungen für RT und füllen Sie die Patch-Clamp-Kammer und Pipette. Für TRPC Kanäle Überwachung, verwenden Sie ein Bad-Lösung in mM: 126 NaCl, 1 CaCl 2, 10 HEPES, 2 MgCl 2, 10 Glucose, pH 7,4; Pipette: 126 NaCl, 1,5 CaCl 2, 10 HEPES, 10 Glucose; pH 7,4.
    1. In Inhibitoren auf die Pipettenlösung, um die Aktivität von endogenen Kanäle, die nicht für die Studien (empfohlen relevanten blockieren: 100 uM Nifluminsäure oder DIDS (auf Ca 2+ -aktivierte Cl blockieren - Kanäle), 10 mM TEA (um das zu verhindern mit großer Leitfähigkeit Ca 2 + - abhängigen K + Kanal), 10 nM Iberiotoxin (um die Ca 2+ -aktivierten K + Kanäle zu blockieren), 10 & mgr; M Nicardipin (N-Typ-Ca blockieren2+ Kanäle)) unmittelbar vor der Patch-Clamp-Experiment.
  3. Vorsichtig mischen die Glomeruli haltigen Lösung, und dann etwa 50 & mgr; l davon gelten für die poly-ʟ-Lysin beschichteten Deckglas-Chips. Lassen Sie die Glomeruli legen für ca. 5 min.
  4. Verschieben Sie die Glas-Chips mit Glomeruli auf die Patch-Clamp-Kammer mit der Badlösung vorgefüllt; versorgen die Kammer bei einer Rate von 3 ml / min für 1 min, um die Entfernung der ungebundenen Glomeruli gewährleisten.
  5. Durchführung einer konventionellen Patch-Clamp-Experiment in einem Cell-Attached-Modus 7. Mit einer Glaspipette (7-10 MOhm Pipette Widerstand) einen hochohmigen Dichtung zwischen einer Pipette und Podozyten Membran durch leichten Sog (einer Pipette, eine Podozyten auf der Oberfläche des isolierten Glomeruli angebracht zu bilden, wird in Abbildung 2 dargestellt, auf die linke).
  6. Für die Cell-Attached-Messungen, Tiefpass die Ströme bei 300 Hz durch einen achtpoligen Bessel-Filter.
  7. Use isoliert Glomeruli in Patch-Clamp-Experimente für bis zu 4 - 6 Std. Bewahren Sie die Lager Glomeruli Fraktion auf Eis.

4. Ratiometrisch konfokalen Fluoreszenzmessungen von intrazellulären Calciumkonzentration in den Podozyten

  1. Platzieren Sie 500 ul der Glomeruli Fraktion (bei 2.5 beschrieben) in 0,5 ml konischen Röhrchen und fügen Kalzium Farbstoffe Fura Red, AM und Fluo-4, AM. Verwenden Sie 2 mm und 1 mm Lager Konzentrationen von Fura Red, AM und Fluo-4, AM, bzw. (bei -20 ° C, gelöst in DMSO) und verwenden Sie 2,5 ul jeder Farbstoff für ein 500 ul Glomeruli Fraktion. Unmittelbar nach der Zugabe der Farbstoffe decken das Röhrchen mit Aluminiumfolie.
  2. Die Röhrchen auf einem rotierenden Schüttler für mindestens 20 min bis zu 1 h bei RT.
    Anmerkung: Die pharmakologische Mittel können während dieses Schritts zugegeben werden.
  3. Bereiten Sie Deckgläser, decken Sie sie mit poly-ʟ-Lysin und trocknen mit beheizten Plattensatz auf 70 ° C.
  4. Sobald die Beladung des Calcium Farbstoffe completE gelten 100 ul der Glomeruli enthaltenden Lösung auf das Poly-ʟ-Lysin beschichtete Deckgläser und ließ sie an der Oberfläche für etwa 5 min zu haften. Halterung Glomeruli losen Deck in eine Abbildungskammer und Perfusion mit dem Bad-Lösung (enthaltend (in mM): 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl 2, 10 HEPES, pH 7,35) mit einer Geschwindigkeit von 3 ml / min zu entfernen die ungebunden Glomeruli und die verbleibenden Farbstoffe.
  5. Stellen Sie die konfokale Laser-Scanning-Mikroskop mit einer 488 nm Anregungswellenlänge und Emissionsfiltern (525/25 und 650/25 nm für Fluo-4 und Fura Red, respectively). Legen Sie die Imaging-Software auf eine gewünschte Frequenz und Auflösung.
  6. Finden Sie die Glomeruli in Hellfeld und dann auf der Detektion des Fluoreszenzsignals zu drehen. Einstellen der Intensität des Laserstrahls für jeden Farbstoff, um die Sättigung des Signals zu vermeiden. Wählen der Brennebene mit den podocytes die direkt auf das Glas angebracht sind. Dies minimiert den Effekt, der durch Kontraktion eines Glomerulus verursacht in Reaktion auf ArzneimittelAnwendung. Überprüfen Sie, dass die Glomeruli der Wahl ist gut an das Glas gebunden ist;
  7. Starten Sie die Abbildung der Brennebene der Wahl (nehmen 512 x 512 Bilder mit der Frequenz bei 4 s eingestellt, um schnelle Ca 2+ vorübergehende Veränderungen sichtbar zu machen. Verwenden Sie einen 60X / NA 1.4 oder ähnliche Objektiv für hochauflösendes Bild) gelten Drogen von Interesse, und notieren Sie die Antwort.
    1. Wählen einer gewünschten Fokusebene (möglichst nahe an der Oberfläche des Glases als möglich zu Bildgebung podocytes auf der Oberfläche des Glomerulus zu gewährleisten). Überprüfen Sie die Intensität der Fluoreszenz auf der Fluo4 und FuraRed Kanäle und stellen Sie sicher, dass die Glomerulus ist eindeutig in Hellfeld gesehen.
    2. Starten Bildgebung. Vor der Anwendung von Drogen, Rekord mindestens 1 min von Fluoreszenzbasis, um sicherzustellen, dass das Signal stabil ist (es gibt keine plötzlichen Spitzen oder Verblassen des Signals).
    3. Gelten gewünschten Medikamente mit Hilfe einer Mikropipette; vorsichtig sein und sicherstellen, das Medikament in der Lage, gut diffundieren und erreichen die glomerUlus. Mischen Sie die Badlösung vorsichtig, wenn nötig, die Überwachung der ausgewählten Brennebene und überprüfen Sie, dass es nicht aus dem Fokus wegen der Medikamentenapplikation zu bewegen.
    4. Aufzeichnung der Änderungen der Fluoreszenzintensität für die Fluo4 und FuraRed Signalen. Achten Sie darauf, die Aufnahme ist lang genug, um zu warten, bis das Signal den Plateauniveau erreicht oder einen Spitzenwert erreicht und kehrt zum Ausgangswert dann. Führen Lösung Änderung oder Ergänzung von irgendwelchen anderen Drogen, wenn nötig.
    5. Beenden Sie die Aufnahme, und speichern Sie die Datei im nativen Format der Software.

5. Bildanalyse für die Calcium-Messungen

  1. Führen Sie die Bildanalyse mit dem ImageJ offene Software mit dem ND-Dienstprogramm-Plugin, das Importieren von Bildern in der nativen ND2-Format ermöglicht.
  2. Importieren Sie die Bildsequenz; stellen Sie sicher, um die Kanäle aufgeteilt und mit einem Hyperstack-Graustufen-Modus.
  3. Folgen Sie dem Analysieren → Werkzeuge → ROI Manager Pfad im ImageJ Software oStift ein ROI-Manager-Fenster. Wählen Sie mehrere Bereiche von Interesse (Podozyten) mit einem ovalen Auswahlwerkzeug und die "hinzufügen (t)" Funktion in der ROI-Manager. Als das letzte ROI, wählen Sie den Bereich, in den Hintergrund; speichern Sie die ausgewählten ROIs (Mehr → Speichern).
  4. Markieren Sie das Fenster mit der für die Analyse ausgewählten Kanal. Verwenden Sie die Optionen → Multi Funktion Messen in der ROI-Manager, markieren Sie die "eine Zeile pro Scheibe"-Box in der Dialog, der herausspringt, und klicken Sie dann auf OK. Die Ergebnisse werden in dem Format, das sich im Ergebnisfenster eingestellt werden kann gezeigt werden: in die Menüoption Ergebnisse → Set Maße geben, wählen Sie "Mittlerer Grauwert" und berechnen die Pixelintensitätswerte für jede ROI, die in der angezeigt wird, Ergebnisfenster in separaten Spalten für jede ROI.
  5. Kopieren Sie die gemessenen ROI Intensitätswerte für jeden Kanal (Fluo-4 und Fura Red) in bevorzugten Datenanalyse-Software; subtract Hintergrund Intensitätswerte von jedem datein Punkt.
  6. Für jeden Zeitpunkt wird das Verhältnis der Intensitäten des Fluo-4 zu Fura Red-Kanälen. Plot Scatter / Linienpunkt-Zeitänderungen von Ca 2+ Transienten für jede ROI. Berechnen Sie Mittelwert / SE Werte für ausgewählte Glomeruli.
    Hinweis: Zeitspalte sollte nach Bildgebungsfrequenz bei 4,5 ausgewählt eingestellt werden.

6. intrazellulären Calciumkonzentration Berechnungen mit Fluo-4 Fluoreszenz-Signal

  1. Nehmen Sie eine Probe der Glomeruli und führen Sie die experimentelle Protokoll bis zu Schritt 4.7. Nach der Aufnahme der Hintergrundfluoreszenz hinzufügen Ionomycin (Endkonzentration in der Badewanne Kammer sollte 10 & mgr; M) zu der Badlösung und Rekordfluoreszenzintensität zu erhöhen. Sobald die Intensität erreicht sein Maximum und der Zerfall beginnt, fügen MnCl 2 (Endkonzentration sollte 5 mM), die Fluoreszenz 8 quenchen.
  2. Analysieren Sie die in 6.1 erhaltenen Daten. Kopieren Sie die Fluo-4-Signal ROI Intensitätswerte erhalten nachzu der am 5.1 Protokoll - 5,5 von bevorzugten Analysesoftware.
  3. Berechnen intrazellulären Calciumkonzentration (in nM) in der podocyte entsprechend dem ROI durch eine Formel:
    Gleichung 1
    wobei K d ein vorbestimmter Dissoziationskonstante für Fluo-4 (345 nM) konstant ist F die Intensität an dem Zeitpunkt, dass man die Berechnung werden die Calciumkonzentration (Grundlinie) und F min und F max die Intensitätswerte bei der Punkt maximaler Calciumlast (nach Ionomycin Anwendung) und nach Löschung der Fluoreszenz (mit MnCl 2), bzw. (siehe Abbildung 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hier haben wir uns mit dem Problem der Messung der akuten Veränderungen der Calciumspiegel in den podocytes. 1 zeigt eine schematische Darstellung des experimentellen Protokolls, um eine hohe Auflösung Live Fluoreszenz konfokale Bildgebung und Einzelionenkanalaktivität in den Aufnahmen podocytes des frisch zuführen entworfen isoliert Nagetier Glomeruli. Kurz nachdem die Ratte betäubt, die Nieren sollten mit PBS gespült werden, um sie von Blut zu löschen. Dann werden die Nieren herausgeschnitten und entkapselt und Glomeruli aus der Nierenrinde von Differential Sieben isoliert. Ein Teil der Probe kann für Patch-Clamp-Analyse entnommen werden und der Rest kann mit fluoreszierenden Farbstoffen Kalzium Fluo-4, AM und Fura Red geladen werden, BIN, um konfokale ratiometrische Calcium Imaging durchzuführen.

Elektrophysiologische Messungen der einzelnen Ionenkanalaktivität kann nach der Isolierung der Glomeruli sofort durchgeführt werden. Aktivität von Ionen channels kann sowohl in zell befestigt und Ganzzell-Konfiguration der Patch-Clamp-Verfahren gemessen werden. Um die Durchführbarkeit des gezeigten Ansatzes zu demonstrieren ist die Aufzeichnung der einzelnen TRPC artigen Calciumleitende Ionenkanal-Aktivität (2). Zusätzlich ist es möglich, zelldurchlässig oder rezeptorbindende Medikamente ihre Wirkung auf den Calcium-Zustrom in die podocytes auf der Ebene der einzelnen Ionenkanäle testen anzuwenden.

Ein Ansatz, der einzelne Ionenkanalaktivität Beurteilung ermöglicht produziert eine Vielzahl von Daten, die Podozytenfunktion charakterisieren kann. Sie kann jedoch stark durch Messen der Calciumkonzentration Veränderungen auf der Ebene der ganzen Zellen ergänzt. Um diese Tests durchzuführen, wurden frisch isolierte Glomeruli mit Fluoreszenzfarbstoffen für das Hochdurchsatz-konfokale Bildgebung geladen. Mit einer hohen optischen Auflösung ist es möglich, Calciumspiegel in mehreren podocytes zu einem Zeitpunkt zu überwachen, Fig. 3 zeigt die zeitWeichen für die typischen Experiment entworfen, um die Veränderungen der Calciumkonzentration innerhalb des podocyte bewerten. Der basale Calcium-Konzentration im podocyte wurde basierend auf der Fluo-4-Fluoreszenz ausgewertet. Nach Aufzeichnung der basalen Signalintensität für 1 min (F) wird Ionomycin angelegt, die zu Peak-Fluoreszenz (F max) erreicht werden, die dann von MnCl 2 abgeschreckt (F min bemerkt wird). Entsprechend der Formel in 6.3 kann Intensität Fluo-4 Signal zu jedem Zeitpunkt des Experiments dann in das eigentliche Konzentration der Calciumionen in der Zelle translatiert werden. Wie aus dem Diagramm zu sehen ist, bedeutet Fluoreszenz in den Hintergrund (etwa 400 willkürlichen Einheiten) führt zu 140 nm, was innerhalb eines normalen Konzentrationsbereich für den intrazellulären Kalzium in gesunden nicht-apoptotischen Zellen.

Die Bedeutung und der Nutzen der beschriebenen Ansatz von einer anderen Anwendung, die zur Messung der akuten Calcium transie ermöglicht gerechtfertigtnts in podocytes ansprechend auf verschiedene Medikamente. 4A veranschaulicht repräsentative Bilder des Ratten Glomeruli mit Fluo-4 und Fura Red gefärbt in der 2 mM Calcium enthaltenden Lösung (in 4.5 beschrieben) vor und nach Zugabe von 10 & mgr; m ATP. Beachten einen dramatischen Anstieg in der grünen (Fluo-4 AM) Fluoreszenz der podocytes (mit Pfeilen markiert), und ein Abfall der Fura Red-Fluoreszenz (rot Pseudofarbe). Fluo4 und FuraRed spiegeln eine Zunahme der Calciumkonzentration bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm in entgegengesetzter Weise, dh wenn Calcium-Konzentration in der Zelle erhöht Fluo 4 Intensität steigt, während FuraRed geht. Dies ist auf Dualanregungs Natur FuraRed Fluorophors möglich. Je nach Anregungswellenlänge kann es wie Calciumgebundenen (420 nm) oder Calcium-freie (488 nm) Fluorophors mit entsprechenden Zunahme oder Abnahme der Fluoreszenz verhält. Daher ist die Verwendung von FuraRed allein in einer ratiometrischen Bildgebungsmodus möglich, aber es requires zwei Anregungswellenlängen - 420 nm und 488 nm. Dadurch wird die Frequenz des Bildgebungs mindestens zweimal (im Vergleich zur Verwendung von einer Anregungswellenlänge) zu verringern; wenn der Forscher möchte, um das hohe Tempo der Bildgebung zu halten, sollte die Bildauflösung verringert werden. Jedoch Fluo 4 und FuraRed können in einer Verhältnismodus ohne Verlust der Auflösung oder Abnahme der Abbildungsfrequenz verwendet werden, da diese Fluorophore können durch das gleiche 488-nm-Laser angeregt werden, und eine gute Differenzierung der Emissionsspektren. Eine typische transiente aus den ROIs zusammengefasst gekennzeichnet mit Pfeilen in Figur 4A ist in 4B dargestellt ist; Der Graph zeigt deutlich eine akute Zunahme Fluo4 / FuraRed Intensitätsverhältnis nach Zugabe von 10 & mgr; M ATP, die innerhalb von einigen Minuten zerfällt. Bilder wurden alle 4 sec aufgenommen, und daher kann die Technik erlaubt die Beobachtung schnelle Änderungen der Calciumkonzentration innerhalb der Zelle.


Abbildung 1. Schematische Darstellung des Versuchsprotokoll. Nachdem das Tier richtig betäubt und für die Operation vorbereitet werden die Nieren mit PBS gespült, um Blut zu entfernen. Dann werden die Nieren herausgeschnitten und entkapselt und Glomeruli aus der Nierenrinde von Differential Sieben isoliert. Dabei wird ein Teil der Probe für Patch-Clamp-Analyse entnommen, und der Rest wird mit fluoreszierenden Farbstoffen und Kalzium konfokalen ratiometrische Calcium Imaging durchgeführt wird geladen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Repräsentative Aufzeichnung, die die Aktivität der Calciumkanäle TRPC im podozyten des frisch isolierten Ratten Glomeruli. Linke Tafel zeigt die Patch-Clamp-Pipette auf die podocyte Körper auf der Oberfläche des Glomerulus während einer elektrophysiologischen Aufzeichnung in einer Cell-Attached-Konfiguration gebunden ist; ein Teil eines gekapselten glomerulus können in der rechten unteren Ecke des Bildes zu sehen. Vertreter aktuelle Spur der TRPC artigen Kanälen Aktivität aus einer Cell-Attached-Patch auf der Podozyten der Ratte Glomerulus bei einem -40 mV Haltepotential besteht, auf der rechten Seite angezeigt. Die c und o i bezeichnen geschlossenen und offenen Kanalpegel auf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Representative Experiment entworfen, um die intrazelluläre Kalziumspiegel in beurteilen die podocytes. Zur Messung der intrazellulären Calciumkonzentration, Glomeruli mit Fluo-4 AM, Fluoreszenzintensität wird in der Grundlinie und nach der Zugabe von Ionomycin und MnCl 2 aufgezeichnet geladen. Der Graph zeigt das Fluoreszenzsignal im Ansprechen auf Ionomycin (Erzeugung des Maximums des Fluo-4-Fluoreszenz, F max) und MnCl 2, die den Farbstoff und die Ergebnisse in der niedrigsten Fluoreszenz-Intensität (F min) quencht. Fluoreszenzintensität (linke Abszisse) für jeden Zeitpunkt kann in den eigentlichen Calciumkonzentration in Nanomol nach der Formel 6.3 umgesetzt werden (rechte Abszisse). Beachten Sie die Einsätze mit den Bildern, die Podozyten zu den Zeitpunkten, wenn F, F max und F min berechnet. Die hier gezeigte Graph zeigt die Fluoreszenzintensität der Podozyten durch einen Kreis (ROI) gekennzeichnet; Bilder wurden alle 4 Sek gemacht.nk "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Figur 4. Messung der Calcium Transienten der podocytes ansprechend auf ATP. (A) repräsentative Bilder, welche die Wildtyp-Ratten-Glomeruli mit Fluo-4 (grün Pseudofarbe) und Fura Red (rot Pseudofarbe) in der 2 mM Calcium enthaltenden Lösung gefärbt vor und nach Zugabe von 10 & mgr; M ATP. Geringere Intensität grün gefärbte Fluoreszenz vor der Applikation des Arzneimittels sollten beachtet werden. (B) zusammengefasst Beispiel der intrazellulären Calcium-Transienten in Podozyten durch Anwendung von 10 & mgr; m ATP hervorgerufen. Beachten Sie einen starken und schnellen Anstieg der Fluo-4 / Fura Red Fluoreszenzintensitätsverhältnis nach Zugabe des Medikaments, das für die Stimulation und Entleerung der Calcium-Depot und Calcium-Einstrom von th-Kontene außerhalb der Zelle, was zu einer Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration. Fehlerbalken stellen den Standardfehler der Mittel zum 11 Podozyten der gleichen Glomerulus berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der hier beschriebene Ansatz ermöglicht die Analyse von Calcium Handhabung durch den Podozyten der Glomeruli Nagetier. Diese Technik ermöglicht die Anwendung der Patch-Clamp-Elektrophysiologie und Einzelkanal-Fluoreszenz ratiometrische konfokale Bildgebung. Jedoch beide Ansätze können einzeln, für sich allein verwendet werden. Das vorgeschlagene Protokoll hat mehrere relativ einfache Schritte, einschließlich 1) Nieren flush; 2) Isolierung der Glomeruli durch Differential Sieben; 3) Durchführen von Patch-Clamp-elektrophysiologischen Experimenten oder Inkubation der Glomeruli mit fluoreszierenden Calciummarkierungsfarbstoffe für ratiometrisch konfokale Bildgebung von Änderungen der intrazellulären Calcium.

Um die Glomeruli, ein modifiziertes Protokoll basierend auf Gloy isolieren et al. 5 verwendet. Der Hauptvorteil der gegenwärtigen Technik der Differenz Siebung, die es produziert Glomeruli der Bowmans Kapsel abgezogen und somit nicht die anspruchsvolle und zeitaufwendige Schritt verlangenmanueller decapsulation. Die Mehrheit der Glomeruli in der isolierten Fraktion werden entkapselt, aber die Forscher müssen sich bewusst sein, dass es gekapselt Glomeruli sein, auch. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Glomeruli abgestreift von der Bowman-Kapsel abgebildet werden, als Kapsel verhindert, dass die Medikamente vom Erreichen der Podozyten. Wie in Abbildung 2 zu sehen ist, haben decapsulated Glomeruli eine raue Oberfläche mit deutlichen Kapillaren und Podozyten Körper, während gekapselt Glomeruli glatt und rund förmigen angezeigt. Außerdem gekapselt im Vergleich zu decapsulated diejenigen Fluo4 und FuraRed geladen Glomeruli emittieren weniger intensive Fluoreszenzsignal.

Der Anteil der Ratte Glomeruli erhalten ist 95% rein (mit Spuren von proximalen Tubuli) und kann leicht für Western-Blot oder andere molekularbiologische Anwendungen bei Bedarf verwendet werden. Es ist außerordentlich wichtig, dass in dieser Zubereitung Podozyten sind an den Kapillaren angebracht, intakt zu halten Fuß Prozesse und Funktion als Teilder nativen glomerulus Filtervorrichtung Maschinen. Die Mechanismen der Calcium-Verarbeitung durch die podocytes haben eine wichtige regulatorische Rolle bei der Entwicklung und Verhinderung von Nierenkomplikationen bei Krankheiten wie Diabetes oder Hypertonie 9-12. Podozyten tragen wesentlich zur Permeabilitätsbarrieren, wie durch die Tatsache, dass akute Verletzung verändert Podozyten Morphologie und Struktur und kann Proteinurie 2,3,13-15 verursachen belegt. Daher ist es von großer Bedeutung, um die Ansprechempfindlichkeit des Calcium-Einstroms in diesen Zellen, Medikamente, die sich leicht in dieser Zubereitung gescreent werden können, zu beobachten. Es versteht sich, dass wenn sich der Forscher Sondieren podocytes in einem pathologischen Zustand, zum Beispiel, Hypertonie oder Diabetes, der gewöhnlich in Proteinurie und Glomeruli Schäden führen, die Ausbeute von Glomeruli vielleicht weniger rein als die der gesunden Tieren angesehen werden. Es wird empfohlen, die Glomeruli Fraktionen in jeder Phase des Trennprozesses zu vermeiden Verlust von immer überwachendas Gewebe. In einigen Fällen könnte schwer erkrankten Glomeruli oder Glomeruli von Alter oder zu junge Tiere individuelle Einstellung der Isolationsverfahren, einschließlich der Auswahl von größer / kleiner Mesh Siebe erfordern.

Wir haben diesen Ansatz zunächst angewendet, um die Wirksamkeit von nicht-steroidalen entzündungshemmenden Arzneimitteln zur Hemmung der Calciumkanäle in TRPC podocytes 16 bestimmen. Im Anschluss an diese Studien 7,16-22 wir beschäftigt die beschriebenen Techniken, um mehrere kritische Mechanismen, die Podozyten Funktion zu etablieren. Wir haben zum Beispiel das Profil des P2 (purinergen) -Rezeptoren in den podocytes der Ratten beschrieben und definiert die Regulation der Calcium-Einstrom durch Angiotensin II in der Maus Glomeruli. Wie in einem späteren Handschrift 20 beschrieben ist, kann das Protokoll angepasst ist, um nicht nur ähnliche Untersuchungen bei Ratten, aber auch in anderen Spezies, wie Mäusen, durchgeführt werden. Ratiometrisch Calciumfluoreszenzbildgebung (bei der Verwendung von zwei FluoreszenzFarbstoffe - Fluo-4 und Fura Red) sorgt für zusätzliche Sicherheit der Daten und, wenn nötig Calcium Imaging kann mit anderen fluoreszierenden Farbstoffen kombiniert werden, um Veränderungen in anderen Substanzen innerhalb der podocytes überwachen. Zum Beispiel wird diese Vorgehensweise verwendet wurden, um Stickoxid mit Hilfe des DAF-FM Farbstoff messen. Patch-Clamp-Elektrophysiologie kann allein verwendet werden, oder (Setup erlaubt) in Kombination mit Calcium-Bildgebung. Außer Calciumkanäle ermöglicht die Technik die Aufzeichnung der Aktivität von anderen Ionenkanälen. Darüber hinaus kann die Verwendung von Transfektion und siRNA das Einsatzgebiet noch erweitern, wie vor kurzem von Dr. Trocknergruppe 23 gezeigt.

Konventionelle Epifluoreszenzmikroskopie kann anstelle der weniger erschwinglich konfokale Bildgebung benutzt werden. Jedoch sollte der Forscher wissen, dass die effektive Empfindlichkeit Weitfeldfluoreszenzmikroskopie wird allgemein durch out-of-focus Licht beschränkt. Diese (im Vergleich zu konfokalen imaging) bewirkt, dass solche Beschränkungen als Unfähigkeit, hohe Bildauflösung von Einzel ROI (Podozyten) oder dessen Fuß Prozesse zu erzeugen. Darüber hinaus erschwert Weitfeldmikroskopie Identifizierung von Podozyten, wie es ist schwer, zwischen Oberfläche des Glomerulus und tiefe Gewebe zu unterscheiden. Ab sofort ist die kommerzielle Verfügbarkeit der verschiedenen Fluorophore für konfokale Abbildung ist viel besser und rasant. Alternativ könnte Epifluoreszenz Studien leicht mit einer elektrophysiologischen Einrichtung, die eine gleichzeitige intrazelluläres Ca 2+ und Einzelkanalaktivität Aufzeichnungs- können kombiniert werden. Fura2-AM Beladung von Glomeruli podocytes mit Filterrad-Monochromator und Neutralfiltern Aufbau weit verbreitet, ist jedoch nicht immer geeignet für hochauflösende Bildqualität.

Es sollte auch beachtet werden, dass der isolierte funktionelle Glomerulus der Lage ist, ihr Volumen in Reaktion auf physiologische Stimuli zu verändern. Die Forscher sollten sich dieser während der Durchführung der seinExperimente und sorgfältig die Brennebene während der konfokalen Studien wählen, um die Fokusverlust zu vermeiden, und führen Kontrollversuche bei Auswahl neuer Medikamente, um unbeabsichtigte Kontraktion oder Relaxation zu testen.

Diese Technik bietet eine einzigartige Gelegenheit, um Änderungen in der Calcium-Einstrom in die einzelnen Ionenkanal einzelnen Zellen Spiegel nach pharmakologische Behandlungen oder andere Manipulationen, in einer Vielzahl von Nagetier-Hintergründe zu überwachen. Diese Technik kann auch in menschlichen Nierenerkrankung Studien verwendet als modifiziertes Protokoll kann für Gewebe von Nierenbiopsien, die zweifellos zur Verfügung stellt außerordentlich wertvolle Informationen erhalten, angewendet werden kann. Zusätzlich könnten Calciumkonzentration Messungen mit den elektrophysiologischen patch-clamp Experimente in Echtzeit, die in der Regulation der Calcium-Handling innerhalb Podozyten in normalen und pathologischen Bedingungen bieten kann mehr in die Tiefe und mechanistische Erkenntnisse gepaart werden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

Die Autoren bedanken sich bei Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) und Colleen A. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) für hervorragende technische Unterstützung bei der Mikroskopie Experimente danken. Gregory Blass ist für kritische Korrekturlesen des Manuskripts anerkannt. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Zuschuss HL108880 und American Diabetes Association unterstützt gewähren 1-15-BS-172 (als), und der Ben J. Lipps-Forschungsstipendium von der American Society of Nephrology (auf DVI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluo4 AM Life Technologies F14217 500 µl in DMSO
FuraRed AM Life Technologies F-3020
Poly-ʟ-lysine Sigma-Aldrich P4707
Pluronic acid Sigma-Aldrich F-68 solution
Ionomycin Sigma-Aldrich I3909-1ML
Tube rotator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-753 Germany
Nikon confocal microscope (inverted) Nikon Nikon A1R Laser exitation 488 nm. Emission filters 500-550 nm and 570-620 nm
Objective Nikon Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil
Cover Glass Thermo Scientific 6661B52
High vacuum grease Dow Corning Silicone Compound
Software Nikon Nikon NIS-Elements
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Patch clamp amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B
Data acquisition system Molecular Devices Digidata 1440A Axon Digidata® System
Low pass filter Warner Instruments LPF-8 8 pole Bessel
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B150F-4
Micropipette puller Sutter Instrument Co P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microforge Narishige MF-830 Japan
Motorized micromanipulator Sutter Instrument Co MP-225
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti
Microvibration isolation table TMC equipped with Faraday cage
Multichannel valve perfusion system AutoMake Scientific Valve Bank II
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Software Molecular Devices pClamp 10.2
Nicardipine Sigma-Aldrich N7510
Iberiotoxin Sigma I5904-5UG
Niflumic acid Sigma-Aldrich N0630
DIDS Sigma-Aldrich D3514-25MG
TEA chloride Tocris T2265
RPMI 1640 Life Technologies 11835030 without antibiotics
BSA Sigma-Aldrich A8327 30% albumin solution
Temperature controlled surgical table MCW core for rodents
Steel sieves: #100 (150 μm), 140 (106 μm)
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200 Fisher Sci 50-871-316
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270 Fisher Sci 50-871-318
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400 Fisher Sci 50-871-320
mesh 200 Sigma-Aldrich s4145 screen for CD-1
Binocular microscope Nikon Eclipse TS100
Binocular microscope Nikon SMZ745
Syringe pump-based perfusion system Harvard Apparatus
Polyethylene tubing Sigma-Aldrich PE50
Isofluorane anesthesia VetEquip, Inc. 911103
Other basic reagents Sigma-Aldrich

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Machuca, E., Benoit, G., Antignac, C. Genetics of nephrotic syndrome: connecting molecular genetics to podocyte physiology. Hum. Mol. Genet. 18, R185-R194 (2009).
  2. Haraldsson, B., Nystrom, J., Deen, W. M. Properties of the glomerular barrier and mechanisms of proteinuria. Physiol. Rev. 88, 451-487 (2008).
  3. Patrakka, J., Tryggvason, K. New insights into the role of podocytes in proteinuria. Nat. Rev. Nephrol. 5, 463-468 (2009).
  4. Savin, V. J., Sharma, R., Lovell, H. B., Welling, D. J. Measurement of albumin reflection coefficient with isolated rat glomeruli. J. Am. Soc. Nephrol. 3, 1260-1269 (1992).
  5. Gloy, J., et al. Angiotensin II depolarizes podocytes in the intact glomerulus of the Rat. J. Clin. Invest. 99, 2772-2781 (1997).
  6. Nitschke, R., et al. Angiotensin II increases the intracellular calcium activity in podocytes of the intact glomerulus. Kidney Int. 57, 41-49 (2000).
  7. Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).
  8. Snitsarev, V. A., McNulty, T. J., Taylor, C. W. Endogenous heavy metal ions perturb fura-2 measurements of basal and hormone-evoked Ca2+ signals. Biophys. J. 71, 1048-1056 (1996).
  9. Fukuda, A., Fujimoto, S., Iwatsubo, S., Kawachi, H., Kitamura, K. Effects of mineralocorticoid and angiotensin II receptor blockers on proteinuria and glomerular podocyte protein expression in a model of minimal change nephrotic syndrome. Nephrology (Carlton). 15, 321-326 (2010).
  10. Abramowitz, J., Birnbaumer, L. Physiology and pathophysiology of canonical transient receptor potential channels). FASEB J. 23, 297-328 (2009).
  11. Heeringa, S. F., et al. A novel TRPC6 mutation that causes childhood FSGS. PLoS ONE. 4, e7771 (2009).
  12. Zhang, X., Song, Z., Guo, Y., Zhou, M. The novel role of TRPC6 in vitamin D ameliorating podocyte injury in STZ-induced diabetic rats. Mol. Cell. Biochem. 399, 155-165 (2015).
  13. Bohrer, M. P., et al. Mechanisms of the puromycin-induced defects in the transglomerular passage of water and macromolecules. J. Clin. Invest. 60, 152-161 (1977).
  14. Olson, J. L., Rennke, H. G., Venkatachalam, M. A. Alterations in the charge and size selectivity barrier of the glomerular filter in aminonucleoside nephrosis in rats. Lab. Invest. 44, 271-279 (1981).
  15. Schiessl, I. M., Castrop, H. Angiotensin II AT2 receptor activation attenuates AT1 receptor-induced increases in the glomerular filtration of albumin: a multiphoton microscopy study. Am J Physiol Renal Physiol. 305, F1189-F1200 (2013).
  16. Ilatovskaya, D. V., Levchenko, V., Ryan, R. P., Cowley, A. W., Staruschenko, A. NSAIDs acutely inhibit TRPC channels in freshly isolated rat glomeruli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 408, 242-247 (2011).
  17. Peti-Peterdi, J. Calcium wave of tubuloglomerular feedback. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, F473-F480 (2006).
  18. Peti-Peterdi, J., Warnock, D. G., Bell, P. D. Angiotensin II directly stimulates ENaC activity in the cortical collecting duct via AT(1) receptors. J. Am. Soc. Nephrol. 13, 1131-1135 (2002).
  19. Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305, C1050-C1059 (2013).
  20. Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidney Int. 305, C1050-C1059 (2014).
  21. Schaldecker, T., et al. Inhibition of the TRPC5 ion channel protects the kidney filter. J. Clin. Invest. 123, 5298-5309 (2013).
  22. Roshanravan, H., Dryer, S. E. ATP acting through P2Y receptors causes activation of podocyte TRPC6 channels: role of podocin and reactive oxygen species. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 306, F1088-F1097 (2014).
  23. Anderson, M., Roshanravan, H., Khine, J., Dryer, S. E. Angiotensin II activation of TRPC6 channels in rat podocytes requires generation of reactive oxygen species. J. Cell. Physiol. 229, 434-442 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics