Single-channel Analyse et Imagerie de calcium dans les podocytes des glomérules fraîchement isolés

1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin
Published 6/27/2015
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Biology

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Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli. J. Vis. Exp. (100), e52850, doi:10.3791/52850 (2015).

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Abstract

Introduction

Les reins maintiennent l'équilibre homéostatique pour diverses substances et de réguler le volume sanguin d'une manière qui détermine la pression sanguine totale. Des perturbations dans la filtration rénale, la réabsorption ou la sécrétion d'entraîner ou d'accompagner des états pathologiques, allant de l'hyper ou hypotension pour mettre fin à l'insuffisance rénale qui nécessite éventuellement une transplantation rénale. L'unité de filtration rénale (glomérule) se compose de trois couches - l'endothélium capillaire, la membrane basale et une couche mono-cellulaire des cellules épithéliales - podocytes, qui jouent un rôle majeur dans le maintien de l'intégrité et de la fonction 1 fente diaphragme. Dysfonction dans le filtre glomérulaire provoque une perte urinaire à perméabilité sélective de macromolécules, telles que la protéinurie. Différents agents peuvent affecter la structure des podocytes et leurs procédés de pied, qui déterminent l'intégrité de la barrière de filtration de glomérules.

Les podocytes sont impliqués dans le maintien de la glomfonction de filtration Eruli. Il a été établi que la manipulation de calcium impropre à l'podocytes conduit à une lésion de la cellule et joue un rôle important dans la progression de diverses formes de néphropathies 2,3. Par conséquent, le développement d'un modèle qui permet de mesure directe des changements de concentration de calcium intracellulaire sera déterminante pour les études de la fonction des podocytes. Glomérules isolés ont été précédemment utilisés dans de nombreuses études, y compris une mesure du coefficient de réflexion albumine change 4 et l'évaluation des courants cellulaires intégraux dans les cellules entières électrophysiologiques mesures de patch-clamp 5,6. Dans le présent article, nous décrivons le protocole qui permet au chercheur de mesurer intracellulaires changements de concentration de calcium en réponse aux demandes d'agents pharmacologiques, estimer les niveaux de calcium dans les cellules basales, et d'évaluer l'activité des particuliers canaux calciques. Mesures de la concentration de calcium Ratometric et patch-clamp electrophysiology ont été utilisés pour déterminer respectivement des changements dans la concentration de calcium intracellulaire au sein de l'activité de canal et podocytes.

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Protocol

L'utilisation et le bien-être des animaux devraient adhérer à la NIH Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire suivant les protocoles examinés et approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle (IACUC).

1. Kidney Flush

  1. Utiliser 8 à 12 semaines vieux rat mâle (suggéré est une souche Sprague Dawley, mais d'autres souches d'âge et sexe différent peuvent être utilisés avec les modifications appropriées).
  2. Anesthésier les animaux selon le mode opératoire autorisé par le protocole IACUC; surveiller la profondeur de l'anesthésie et d'inspecter l'animal. La description détaillée de l'opération à effectuer dans 1.3 à 1.8 peuvent être trouvés dans Ilatovskaya 7 et al.
  3. Après une anesthésie adéquate, placer l'animal sur une table chirurgicale à température contrôlée, faire une incision médiane de l'abdomen (jusqu'à 3 pouces de longueur), et de découvrir la veine cave et l'aorte.
  4. Insérez ligature autour les cœliaques et mésentériques supérieure artères et les abdominauxceux au-dessus de l'aorte; ne pas ligaturer.
  5. Blunt disséquer l'aorte abdominale dessous des artères rénales, et placez deux ligatures autour de lui, mais ne ligaturer, puis serrer l'aorte au-dessus des ligatures et attacher le fil inférieur.
  6. Cathétériser l'aorte avec une tubulure PE50 polyéthylène (attaché à une pompe à seringue remplie de PBS) au-dessous de la pince et fixer le cathéter à la seconde ligature; retirer la pince, tourner sur la pompe, et ligaturer l'aorte et des artères mésentériques avec coeliaques. Vite incision dans la veine rénale pour soulager la pression.
  7. Infuser l'aorte avec le PBS pré-refroidi pendant 2 ou 3 minutes à une vitesse de 6 ml / min.
  8. Arrêtez la perfusion, accises et décapsuler 7 les reins, et les mettre sur la glace dans la solution PBS. Euthanasier l'animal selon un protocole approuvé par le IACUC.

2. Isolement des glomérules Rat

  1. Préparer 30 ml de solution fraîche de 5% de BSA dans du milieu RPMI 1640.
  2. En utilisant une lame de rasoir et des ciseaux,isoler le cortex des deux reins, puis émincer jusqu'à homogénéité. Cette procédure a été décrite précédemment 7.
  3. Appuyez sur le tissu haché lors de l'étape précédente à travers un tamis en acier inoxydable de 100 mesh (pré-trempés dans 5% de BSA en solution / RPMI) à l'aide d'une spatule. Recueillir l'écoulement et par la force de gravité permettent l'écoulement de passer à travers un tamis 140 mesh.
  4. Filtrer la accréditives recueillies auprès des 140 tamis en utilisant un tamis à mailles de 200 pré-imprégné, jeter le filtrat, et laver le haut du tamis avec 10 - 15 ml de la solution préparée BSA / RPMI pour recueillir les glomérules que les sédiments sur le tamis.
  5. Mettre la solution de BSA / RPMI contenant glomérules sur de la glace dans un tube de 15 ml et laisser le sédiment de glomérules au fond du tube pour un maximum de 20 min. Le concentré de glomérules sur le fond du tube sera clairement visible. Retirer la solution en excès, en laissant environ 2 ml dans le tube.

3. Single-channel patch-clamp Electrophysiology

  1. Préparer 5 x 5 mm éclats de verre de couverture en les enduisant d'MW 70.000 - 150.000 poly-ʟ-lysine, et laisser sécher. Utilisez environ 30 pi de 0,01% solution filtrée stérile dans l'eau par verre de couverture.
  2. Réchauffez les solutions expérimentales à RT et remplir la chambre de patch-clamp et la pipette. Pour les canaux de TRPC surveillance, utiliser une solution de bain, en mm: 126 NaCl, CaCl2 1, 10 HEPES, 2 MgCl 2, 10 glucose, pH 7,4; pipette: 126 NaCl, CaCl2 1,5, HEPES 10, 10 glucose; pH 7,4.
    1. Ajouter inhibiteurs à la solution de la pipette pour bloquer l'activité de canaux endogènes, qui ne sont pas pertinentes pour les études (recommandées sont les suivantes: 100 uM acide niflumique ou DIDS (pour bloquer Ca 2+ activés par canaux Cl -), 10 mM TEA (pour inhiber la grande conductance Ca 2 + - K + dépendante canal), 10 nM ibériotoxine (pour bloquer les Ca2 + canaux K + activés par), 10 uM nicardipine (pour bloquer Ca de type N2+ canaux)) directement avant l'expérience de patch-clamp.
  3. Mélanger doucement la solution contenant glomérules, et ensuite appliquer environ 50 pi de celui-ci à la couverture enduite éclats de verre poly-ʟ-lysine. Laissez les glomérules attachent pendant environ 5 min.
  4. Déplacer les éclats de verre avec glomérules à la chambre de patch-clamp pré-remplies avec la solution de bain; perfuser la chambre à un débit de 3 ml / min pendant 1 min à assurer l'élimination des glomérules seules.
  5. Mener une expérience de patch-clamp conventionnel dans un mode cellule attachée 7. Avec une pipette en verre (7 à 10 MQ de résistance à la pipette) forment un joint d'étanchéité à haute résistance entre une pipette et une membrane de podocytes par application d'une aspiration douce (une pipette fixée à un podocytes sur la surface du glomérule isolé est représenté sur la figure 2, sur la gauche).
  6. Pour les mesures ci-joint cellules passe-bas, les courants à 300 Hz par un filtre à huit pôles Bessel.
  7. Usoi isolé glomérules dans les expériences de patch-clamp pour un maximum de 4 - 6 h. Gardez la fraction stock glomérules sur la glace.

4. Ratiométrique confocale de fluorescence mesures de la concentration intracellulaire de calcium dans les podocytes

  1. Placez 500 pi de la fraction de glomérules (décrit à 2,5) dans 0,5 ml tube conique et ajouter des colorants de calcium Fura rouges, AM et Fluo-4, AM. Utilisez 2 mm et 1 mm actions concentrations de Fura-Rouge, AM et Fluo-4, AM, respectivement (conserver à -20 ° C, dissous dans du DMSO) et utiliser 2,5 pi de chaque colorant pendant 500 pi de fraction de glomérules. Immédiatement après l'ajout des colorants couvrir le tube de papier d'aluminium.
  2. Placer les tubes sur un agitateur rotatif pendant au moins 20 minutes jusqu'à une heure à température ambiante.
    Remarque: Les agents pharmacologiques peuvent être ajoutés au cours de cette étape.
  3. Préparer des lamelles de verre, les couvrir avec de la poly-ʟ-lysine et de permettre un séchage en utilisant ensemble de plaque chauffée à 70 ° C.
  4. Une fois le chargement des colorants de calcium est complete, applique 100 pl de solution contenant les glomérules des lamelles couvre-objet enduites de poly-lysine-ʟ et qu'ils adhèrent à la surface pendant environ 5 min. Monter les lamelles de glomérules inscrits dans une chambre de formation d'image, et perfuser avec la solution de bain (contenant (en mM): 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl2, 10 HEPES, pH 7,35) à un débit de 3 ml / min pour supprimer les glomérules seules et les colorants restants.
  5. Régler la confocal à balayage laser à une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et de filtres d'émission (525/25 et 650/25 nm pour Fluo-4 et Fura-Rouge, respectivement). Réglez le logiciel d'imagerie à une fréquence et la résolution souhaitée.
  6. Trouver les glomérules en clair et puis tourner sur la détection du signal de fluorescence. Ajuster l'intensité du laser pour chaque colorant pour éviter la saturation du signal. Choisir le plan focal avec les podocytes qui sont directement attachés à la vitre. Ceci minimise l'effet provoqué par la contraction d'un glomérule en réponse à médicamentapplication. Double-vérifier que le glomérule de choix est bien fixé à la vitre;
  7. Lancer l'imagerie du plan focal de choix (prendre 512 x 512 images avec la fréquence fixée à 4 secondes de visualiser Ca 2+ rapide des changements transitoires. Utilisez un / NA 1.4 ou objectif 60X similaire image haute résolution pour), appliquer médicaments d'intérêt, et enregistrer la réponse.
    1. Sélectionner un plan focal souhaité (le plus près de la surface du verre, donc, pour assurer l'imagerie de podocytes sur la surface du glomérule). Vérifiez l'intensité de fluorescence sur le Fluo4 et canaux FuraRed, et assurez-vous que le glomérule est clairement visible dans fond clair.
    2. Lancer imagerie. Avant l'application de toutes les drogues, fiche d'au moins 1 min de fluorescence de base pour vous assurer que le signal est stable (il n'y a pas de pointes soudaines ou évanouissement du signal).
    3. Appliquer médicaments souhaités à l'aide d'une micro-pipette; soyez prudent et veiller à la drogue était capable de bien diffuser et atteindre le glomerUlus. Mélanger la solution de bain en douceur si nécessaire, suivre le plan focal choisi et vérifier qu'il ne bougeait pas de mise au point en raison de la demande de drogue.
    4. Enregistrer les variations de l'intensité de fluorescence pour les signaux Fluo4 et FuraRed. Assurez-vous que l'enregistrement est assez long, en attendant que le signal atteint le niveau du plateau ou atteint un pic, puis retourne à la ligne de base. Effectuer le changement de la solution ou l'addition de tous les autres médicaments si nécessaire.
    5. Arrêtez l'enregistrement, et enregistrer le fichier dans le format natif du logiciel.

5. Analyse d'image pour les mesures de calcium

  1. Effectuer l'analyse d'image avec le logiciel ImageJ ouverte équipée avec le plugin utilitaire ND qui permet d'importer des images dans le format natif ND2.
  2. Importez la séquence d'images; assurez-vous de séparer les canaux et utiliser un mode HyperStack en niveaux de gris.
  3. Suivez l'→ Outils → ROI chemin Analyser de gestionnaire dans le logiciel ImageJ à oStylo une fenêtre du gestionnaire de ROI. Sélectionnez plusieurs régions d'intérêt (podocytes) en utilisant un outil de sélection ovale et le "(t) Ajouter" fonction dans le Gestionnaire de ROI. Comme la dernière ROI, sélectionnez la zone à l'arrière-plan; enregistrer les ROI sélectionnés (Plus → Enregistrer).
  4. Mettez en surbrillance la fenêtre contenant le canal sélectionné pour analyses. Utilisez la fonction multi More → Mesurer dans le Gestionnaire de ROI, cochez la case "une ligne par tranche» dans le dialogue qui sort, puis cliquez sur OK. Les résultats seront affichés dans le format qui peut être mis en place dans la fenêtre des résultats: entrer dans les options de menu Résultats → Set Mesures, sélectionnez "Valeur moyenne grise» et de calculer les valeurs d'intensité de pixel pour chaque ROI, qui sera affiché dans la fenêtre Résultats dans des colonnes distinctes pour chaque ROI.
  5. Copiez les valeurs d'intensité de ROI mesurées pour chaque canal (Fluo-4 et Fura-Rouge) dans le logiciel d'analyse de données pratique; valeurs d'intensité de fond Soustraire de chaque datun point.
  6. Pour chaque point de temps de calculer le rapport des intensités du Fluo-4 à canaux Fura rouges. Terrain scatter / ligne change de point de temps de la Ca transitoire pour chaque ROI. Calculer les valeurs moyennes / SE pour glomérules sélectionnés.
    Remarque: la colonne de temps devrait être fixé en fonction de la fréquence d'imagerie sélectionné à 4,5.

6. Calculs intracellulaires de calcium de concentration en utilisant Fluo-4 Fluorescence Signal

  1. Prélever un échantillon des glomérules et exécuter le protocole expérimental jusqu'à l'étape 4.7. Après l'enregistrement de la fluorescence de fond ajouter ionomycine (concentration finale dans la chambre de bain doit être de 10 uM) à la solution de bain, et de l'augmentation de l'intensité de fluorescence fiche. Une fois l'intensité atteint son maximum et la décroissance commence, ajouter MnCl2 (concentration finale doit être de 5 mm) pour étancher la fluorescence 8.
  2. Analyser les données obtenues en 6.1. Copier les valeurs d'intensité de ROI Fluo-4 signal obtenues selonle protocole décrit à 5/1 à 5/5 par un logiciel d'analyse préféré.
  3. Calculer la concentration en calcium intracellulaire (en nM) dans le podocyte correspondant à la ROI en utilisant une formule:
    Equation 1
    K d est une dissociation prédéterminée constante de Fluo-4 (345 nM), F est l'intensité au point de temps que vous êtes le calcul de la concentration en calcium de (niveau de référence), et F min et F max sont les valeurs d'intensité au point de charge maximale de calcium (après application ionomycine) et après extinction de la fluorescence (avec MnCl 2), respectivement (voir Figure 3).

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Representative Results

Ici, nous avons abordé le problème de la mesure des changements de courte durée dans les niveaux de calcium dans les podocytes. La figure 1 montre une représentation schématique du protocole expérimental conçu pour effectuer l'imagerie haute résolution fluorescence confocale en temps réel et des enregistrements individuels de l'activité des canaux ioniques dans les podocytes de la fraîchement glomérules isolés de rongeurs. Brièvement, après le rat est anesthésié, les reins doivent être rincés avec du PBS pour les faire disparaître du sang. Ensuite, les reins sont excisés et décapsulés et glomérules sont isolés du cortex du rein par tamisage différentiel. Une partie de l'échantillon peut être prélevé pour analyse patch-clamp et le reste peut être chargé avec des colorants de calcium fluorescent Fluo-4, AM et Fura rouges, AM afin d'effectuer l'imagerie calcique quotientométrique confocale.

Mesures électrophysiologiques de l'activité du canal ionique unique peuvent être effectuées immédiatement après l'isolement des glomérules. Activité de cha-ionnnels peuvent être mesurés à la fois dans des configurations cellule attachée et de cellules entières de la méthode patch-clamp. Pour démontrer la faisabilité de l'approche montré est l'enregistrement de l'activité (Figure 2) seule TRPC-comme le calcium conducteur de canaux ioniques. En outre, il est possible d'appliquer cellule-perméable ou de liaison au récepteur des médicaments pour tester leur effet sur l'afflux de calcium dans les podocytes au niveau des canaux ioniques simples.

Une approche qui permet l'évaluation de l'activité du canal unique d'ions produit une variété de données qui peuvent caractériser la fonction de podocytes. Toutefois, il peut être fortement complétée par mesure de la concentration de calcium changements au niveau des cellules entières. Pour effectuer ces études, les glomérules fraîchement isolés ont été chargées avec des colorants fluorescents pour l'imagerie confocale à haut débit. Avec une résolution optique élevée, il est possible de surveiller le taux de calcium dans les podocytes plusieurs à la fois. La figure 3 montre la Time-Bien sûr pour l'expérience typique conçu pour évaluer les changements de la concentration de calcium dans le podocytes. La concentration de calcium à l'intérieur de la base podocytes a été évaluée sur la base de la fluorescence Fluo-4. Après l'enregistrement de l'intensité du signal basal pendant 1 min (F), ionomycine est appliquée et provoque la fluorescence maximale (F max) à atteindre, qui est ensuite trempé par MnCl 2 (F min est noté). Selon la formule en 6,3, l'intensité de signal de Fluo-4 en chaque point de l'expérience de temps peut être ensuite traduit en la concentration réelle des ions calcium dans la cellule. Comme on le voit sur le graphique, la moyenne de fluorescence en arrière-plan (environ 400 unités arbitraires) se traduit par 140 nM, ce qui est dans une plage de concentration normale de calcium intracellulaire dans des cellules non apoptotiques sains.

L'importance et l'utilité de l'approche décrite est justifiée par une autre application, qui permet de mesurer transie de calcium aiguënts dans les podocytes en réponse à divers médicaments. La figure 4A illustre des images représentatives de la glomérule de rat colorées avec du Fluo-4 et Fura-Rouge dans la solution contenant du calcium 2 mM (décrit en 4.5) avant et après addition de 10 uM d'ATP. Remarque une augmentation spectaculaire dans le vert (Fluo-4 AM) fluorescence des podocytes (marqués par des flèches), et une chute de la fluorescence Fura-Rouge (de pseudo-rouge). Fluo4 FuraRed et reflètent une augmentation de la concentration de calcium à une longueur d'onde d'excitation de 488 nm à-dire en sens inverse, lorsque la concentration de calcium dans la cellule augmente Fluo 4 intensité augmente, alors que FuraRed descend. Cela est possible en raison de la double nature de l'excitation de FuraRed fluorophore. Selon d'onde d'excitation, il peut se comporter comme le calcium lié (420 nm) ou sans calcium (488 nm) fluorophore avec une augmentation ou une diminution correspondante de la fluorescence. Par conséquent, l'utilisation de FuraRed seule dans un mode d'imagerie ratiométrique est possible, mais il requires deux longueurs d'ondes d'excitation - 420 nm et 488 nm. Cela réduira la fréquence de la formation d'image au moins deux fois (par rapport à l'utilisation d'une longueur d'onde d'excitation); si le chercheur voudrait maintenir le rythme rapide de l'imagerie, la résolution de l'image doit être diminuée. Cependant, Fluo 4 et FuraRed peuvent être utilisés ensemble dans un mode ratiométrique sans perte de résolution ou de diminution de la fréquence de formation d'image, étant donné que ces fluorophores peuvent être excités par le même laser 488 nm, et fournissent une bonne différenciation des spectres d'émission. Un résumé transitoire typique à partir des régions d'intérêt indiqué par des flèches sur la figure 4A est montrée sur la figure 4B; le graphique montre clairement une augmentation aiguë de Fluo4 / rapport d'intensité FuraRed après l'addition de 10 uM d'ATP, qui se désintègre en quelques minutes. Les images ont été prises toutes les 4 secondes, et par conséquent, la technique permet l'observation des changements rapides dans la concentration de calcium dans la cellule.


Figure 1. Représentation schématique du protocole expérimental. Après que l'animal est correctement anesthésié et préparé pour la chirurgie, les reins sont rincées avec du PBS pour éliminer le sang. Ensuite, les reins sont excisés et décapsulés et glomérules sont isolés du cortex du rein par tamisage différentiel. Ici, une partie de l'échantillon est prélevé pour analyse patch-clamp, et le reste est chargé avec des colorants fluorescents de calcium et l'imagerie calcique quotientométrique confocale est effectuée. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Représentant enregistrement montrant l'activité des canaux TRPC de calcium dans le podocytes de glomérules de rat fraîchement isolés. Panneau de gauche montre la pipette de patch-clamp fixé au corps de podocytes sur la surface du glomérule pendant un enregistrement électrophysiologique dans une configuration cellule attachée; une partie d'un glomérule encapsulé peut être vu dans le coin inférieur droit de l'image. Trace actuelle représentante de l'activité de canaux TRPC comme d'un patch cellule attachée faite sur la podocyte du glomérule de rat à un potentiel de maintien -40 mV est affiché sur la droite. Le c o i désigner niveaux des canaux fermés et ouverts, respectivement. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Représentant expérience conçue pour évaluer le niveau de calcium intracellulaire dans les podocytes. Pour mesurer la concentration de calcium intracellulaire, les glomérules sont chargées avec Fluo-4 AM, l'intensité de fluorescence est enregistré dans la ligne de base et après addition d'ionomycine et MnCl 2. Le graphique illustre les variations du signal de fluorescence en réponse à l'ionomycine (produisant le maximum de la fluorescence Fluo-4, F max) et MnCl 2, qui éteint le colorant et conduit à la plus faible intensité de fluorescence (F min). Intensité de fluorescence (abscisse de gauche) pour chaque point de temps peut être traduit dans la concentration de calcium réelle en nanomoles (à droite abscisse) selon la formule 6.3. Noter les inserts avec les images montrant podocytes aux points de temps lorsque F, F et F max min ont été calculés. Le graphique présenté ici reflète l'intensité de fluorescence de la podocyte marquée par un cercle (ROI); images ont été prises toutes les 4 secondes.nk "> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. La mesure des transitoires calciques dans les podocytes, en réponse à l'ATP. (A) Des images représentatives illustrant le glomérule de type sauvage de rat colorées avec du Fluo-4 (pseudo-vert) et Fura-Rouge (pseudo-rouge) dans la solution contenant du calcium 2 mM, avant et après l'addition de 10 uM d'ATP. Basse intensité de couleur verte fluorescence avant l'application du médicament devrait être noté. (B) par exemple du transitoire de calcium intracellulaire évoqué dans les podocytes par l'application de 10 um ATP succincts. Remarque une augmentation forte et rapide en Fluo-4 / Fura Red rapport d'intensité de fluorescence après l'addition du médicament, qui représente la stimulation et la diminution du dépôt de calcium et l'influx de calcium à partir de the à l'extérieur de la cellule, ayant pour résultat l'élévation de la concentration de calcium intracellulaire. Les barres d'erreur représentent l'erreur-type de moyens calculés pour 11 podocytes de la même glomérule. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

L'approche décrite ici permet l'analyse de manipulation de calcium par les podocytes des glomérules chez les rongeurs. Cette technique permet l'application de patch-clamp électrophysiologie à canal unique et imagerie confocale à fluorescence ratiométrique. Cependant, les deux approches peuvent être utilisés séparément, sur leur propre. Le protocole proposé comporte plusieurs étapes relativement simples, y compris 1) Kidney Flush; 2) l'isolement des glomérules par tamisage différentiel; 3) exécuter des patch-clamp expériences électrophysiologiques, ou l'incubation des glomérules avec des colorants fluorescents d'étiquetage de calcium pour l'imagerie confocale quotientométrique des changements de calcium intracellulaire.

Pour isoler les glomérules, un protocole modifié sur la base Gloy et al. 5 a été utilisé. Le principal avantage de la technique actuelle de tamisage différentiel est qu'il produit glomérules dépouillés de la capsule de Bowman et ne nécessitent donc pas l'étape sophistiqué et fastidieuxde decapsulation manuel. La majorité des glomérules dans la fraction isolée sont decapsulated, cependant le chercheur doit être conscient qu'il ya des glomérules capsulées, aussi. Il est important de veiller à ce que les glomérules dépouillée de la capsule de Bowman sont imagés, comme la capsule empêche les médicaments d'atteindre les podocytes. Comme le montre la figure 2, glomérules décapsulés ont une surface rugueuse avec des capillaires distincts et des organismes de podocytes, alors que les glomérules capsulées apparaissent lisse et rond en forme. En outre, encapsulés Fluo4 et FuraRed glomérules chargées émettent signal de fluorescence moins intense par rapport à ceux décapsulés.

La fraction de glomérules de rat obtenu est pur à 95% (avec des traces de tubules proximaux) et peut être facilement utilisé pour buvardage de Western ou d'autres applications de biologie moléculaires si nécessaire. Il est extrêmement important que les podocytes dans cette préparation sont fixés aux capillaires, de conserver intactes les processus de pied et une partie en tant que fonctionde la machine de l'appareil de filtration de glomérule native. Les mécanismes de manipulation de calcium par les podocytes jouent un rôle essentiel dans la régulation du développement et de la prévention de complications rénales dans des maladies telles que le diabète ou l'hypertension 12.9. Podocytes contribuent de manière significative aux barrières de perméabilité, comme en témoigne le fait que les lésions aiguës modifie podocyte morphologie et la structure et peut provoquer une protéinurie 2,3,13-15. Par conséquent, il est d'une grande importance pour observer la réactivité de l'influx de calcium dans ces cellules à des médicaments, qui peuvent être criblés facilement dans cette préparation. Il doit être entendu que, si le chercheur scrute podocytes dans un état pathologique, par exemple, de l'hypertension ou du diabète, qui résultent généralement de la protéinurie et des dommages aux glomérules, le rendement en glomérules pourrait être moins pur que celui des animaux sains. Il est recommandé de toujours surveiller les fractions glomérules à chaque étape du processus d'isolement pour éviter la perte dele tissu. Dans certains cas, fortement glomérules malades ou les glomérules d'animaux âgés ou trop jeunes peuvent nécessiter un réglage individuel du processus d'isolement, y compris la sélection des plus grands / plus petits tamis de maille.

Nous avons appliqué cette approche initialement pour déterminer l'efficacité des médicaments anti-inflammatoires non-stéroïdes dans l'inhibition des canaux de calcium dans TRPC 16 podocytes. Suite à ces études 7,16-22 nous avons utilisé les techniques décrites à établir plusieurs mécanismes de contrôle critiques fonction podocytes. Par exemple, nous avons décrit le profil du P2 (purinergique) récepteurs dans les podocytes des rats et défini la régulation de l'influx de calcium par l'angiotensine II dans les glomérules de souris. Comme cela est décrit plus tard dans un manuscrit 20, le protocole peut être adapté pour effectuer des études similaires, non seulement chez les rats, mais également dans d'autres espèces, comme les souris. L'imagerie par fluorescence ratiométrique de calcium (avec l'utilisation de deux fluorescentcolorants - Fluo-4 et Fura rouges) assure la fiabilité supplémentaire des données, et si l'imagerie calcique nécessaire peut être combiné avec d'autres colorants fluorescents pour surveiller les changements dans d'autres substances dans les podocytes. Par exemple, nous avons utilisé cette approche pour mesurer l'oxyde nitrique avec l'aide du colorant DAF-FM. Patch-clamp électrophysiologie peut être utilisé seul ou (configuration le permet) en combinaison avec l'imagerie calcique. En dehors des canaux calciques, la technique permet l'enregistrement de l'activité d'autres canaux ioniques. En outre, l'utilisation de la transfection et siRNA peut élargir le champ d'application encore plus, comme cela a été démontré récemment par le groupe du Dr Sèche-23.

Microscopie à épifluorescence conventionnel peut être utilisé ici à la place de l'imagerie confocale moins abordable. Cependant, le chercheur doit être conscient que la sensibilité effective de large microscopie de fluorescence de champ est généralement limitée par la lumière out-of-focus. Cette comparaison (pour imagin confocaleg) provoque de telles limitations que l'incapacité de produire une résolution d'image élevée de ROI unique (podocytes) ou de ses processus de pied. En outre, la microscopie à champ large complique l'identification des podocytes car il est difficile de faire la différence entre la surface du glomérule et tissus profonds. A partir de maintenant la disponibilité commerciale des différents fluorophores pour l'imagerie confocale est beaucoup mieux et en pleine expansion. Alternativement, les études de épifluorescence pourraient être facilement combinés avec une configuration électrophysiologique qui peut fournir Ca intracellulaire simultanée 2+ et unique enregistrement de l'activité du canal. Fura2-AM chargement des podocytes des glomérules avec monochromateur roue à filtres et la configuration des filtres de densité neutre est largement utilisé, mais ne convient pas toujours pour la qualité de l'imagerie haute résolution.

Il convient également de noter que la, glomérule fonctionnel isolé est capable de modifier son volume en réponse à des stimuli physiologiques. Le chercheur doit être conscient de cela tout en effectuant leexpériences, et choisir avec soin le plan focal au cours des études confocale pour éviter la perte de concentration, et d'effectuer des expériences de contrôle lors de la sélection de nouveaux médicaments afin de tester la contraction ou la relaxation involontaire.

Cette technique offre une occasion unique de suivre l'évolution de l'afflux de calcium dans le canal ionique unique et les niveaux des cellules individuelles après des traitements pharmacologiques ou d'autres manipulations, dans une variété de milieux de rongeurs. Cette technique peut également être utilisée dans les études de la maladie rénale humains comme un protocole modifié peut être appliqué à des tissus obtenus à partir de biopsies du rein, qui sera sans doute fournir des informations extrêmement précieuses. En outre, les mesures de concentration de calcium pourraient être jumelés avec les expériences électrophysiologiques de patch-clamp en temps réel, qui peuvent fournir plus approfondie et une approche mécanistique dans la régulation du calcium dans les podocytes de manutention dans des conditions normales et pathologiques.

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Disclosures

Les auteurs ont rien à révéler.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) et Colleen A. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) pour une excellente assistance technique avec des expériences de microscopie. Gregory Blass est reconnu pour la relecture critique du manuscrit. Cette recherche a été financée par les Instituts nationaux de la santé HL108880 de subvention et American Diabetes Association accorder 1-15-BS-172 (AS), et Ben J. Lipps bourse de recherche de l'American Society of Nephrology (DVI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluo4 AM Life Technologies F14217 500 µl in DMSO
FuraRed AM Life Technologies F-3020
Poly-ʟ-lysine Sigma-Aldrich P4707
Pluronic acid Sigma-Aldrich F-68 solution
Ionomycin Sigma-Aldrich I3909-1ML
Tube rotator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-753 Germany
Nikon confocal microscope (inverted) Nikon Nikon A1R Laser exitation 488 nm. Emission filters 500-550 nm and 570-620 nm
Objective Nikon Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil
Cover Glass Thermo Scientific 6661B52
High vacuum grease Dow Corning Silicone Compound
Software Nikon Nikon NIS-Elements
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Patch clamp amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B
Data acquisition system Molecular Devices Digidata 1440A Axon Digidata® System
Low pass filter Warner Instruments LPF-8 8 pole Bessel
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B150F-4
Micropipette puller Sutter Instrument Co P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microforge Narishige MF-830 Japan
Motorized micromanipulator Sutter Instrument Co MP-225
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti
Microvibration isolation table TMC equipped with Faraday cage
Multichannel valve perfusion system AutoMake Scientific Valve Bank II
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Software Molecular Devices pClamp 10.2
Nicardipine Sigma-Aldrich N7510
Iberiotoxin Sigma I5904-5UG
Niflumic acid Sigma-Aldrich N0630
DIDS Sigma-Aldrich D3514-25MG
TEA chloride Tocris T2265
RPMI 1640 Life Technologies 11835030 without antibiotics
BSA Sigma-Aldrich A8327 30% albumin solution
Temperature controlled surgical table MCW core for rodents
Steel sieves: #100 (150 μm), 140 (106 μm)
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200 Fisher Sci 50-871-316
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270 Fisher Sci 50-871-318
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400 Fisher Sci 50-871-320
mesh 200 Sigma-Aldrich s4145 screen for CD-1
Binocular microscope Nikon Eclipse TS100
Binocular microscope Nikon SMZ745
Syringe pump-based perfusion system Harvard Apparatus
Polyethylene tubing Sigma-Aldrich PE50
Isofluorane anesthesia VetEquip, Inc. 911103
Other basic reagents Sigma-Aldrich

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