Phenomics فج: مقاربات الفسيولوجية لتوصيف رواية الفيروسية البروتينات

Immunology and Infection
JoVE Journal
Immunology and Infection
AccessviaTrial
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Sanchez, S. E., Cuevas, D. A., Rostron, J. E., Liang, T. Y., Pivaroff, C. G., Haynes, M. R., Nulton, J., Felts, B., Bailey, B. A., Salamon, P., Edwards, R. A., Burgin, A. B., Segall, A. M., Rohwer, F. Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins. J. Vis. Exp. (100), e52854, doi:10.3791/52854 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

التحقيقات الجارية في التفاعلات فج في استضافة تعتمد على استقراء المعرفة من (الفوقية) الجينوم. ومن المثير للاهتمام، 60-95٪ من كل فج تسلسل حصة لا تناظر للبروتينات المشروح الحالية. ونتيجة لذلك، يتم شرحها نسبة كبيرة من الجينات فج كما افتراضية. هذا الواقع يؤثر بشكل كبير على الشرح كل من جينات الأيض الهيكلية ومساعدة. نحن هنا نقدم طرق مظهري صمم للقبض على الاستجابة الفسيولوجية (ق) من مجموعة مختارة خلال التعبير عن واحد من هذه الجينات فج غير معروفة. وتستخدم متعددة النمط الظاهري الفحص لوحات (خرائط) لرصد تنوع استخدام الركيزة المضيفة وتشكيل الكتلة الحيوية لاحق، في حين توفر الايض تحليل ثنائي المنتج من خلال مراقبة وفرة الأيض والتنوع. وتستخدم كل من الأدوات في وقت واحد لتقديم لمحة المظهري المرتبطة تعبير عن فج المفترض إطار القراءة المفتوحة واحد (ORF). تتم مقارنة نتائج ممثلة لكلتا الطريقتين، HIGHLighting الاختلافات المظهرية الشخصي من مجموعة تحمل إما المفترضة الجينات فج الهيكلية أو التمثيل الغذائي. بالإضافة إلى ذلك، يتم عرض تقنيات التصور وإنتاجية عالية أنابيب الحسابية التي سهلت التحليل التجريبي.

Introduction

وتقدر الفيروسات التي تصيب البكتيريا (ويعرف أيضا باسم الجراثيم أو فج) في الوجود في أكثر من 10 31 فيروس مثل الجسيمات (VLPs) عالميا ويفوق عدد جميع الكائنات الحية الأخرى في بيئة 1،2. وركزت الدراسة الأولى metagenomic التحقيق في المجتمعات الفيروسية المرتبطة البيئات البحرية على قياس التنوع ينظر في جزء الفيروسي 3. بالإضافة إلى ذلك، وجد Breitbart وزملاؤه أن أكثر من 65٪ من تسلسل المجتمع الفيروسية المشتركة لا تناظر إلى أي تسلسل المتاحة في قواعد البيانات العامة. وجدت الدراسات metagenomic اللاحقة أدلة مماثلة: metagenomes من الرواسب البحرية في سان دييغو، كاليفورنيا تحتوي على 75٪ تسلسل الفيروسية مجهولة metagenomes من البحيرات ذات الملوحة العالية للبحر سالتون تحتوي على 98٪ تسلسل الفيروسية المجهولة وmetagenomes المرتبطة المرجانية تحتوي على 95-98٪ تسلسل الفيروسية مجهولة 6. وقد أدى هذا التراكم من المعلومات غير المشروحة فيفج المادة الوراثية بأنها "المادة المظلمة في الكون البيولوجي" (7).

توصيف الجيني من فج يعتمد على تحديد التشابه تسلسل من خلال المقارنة مع الأحماض والبروتينات قواعد بيانات النووية القائمة. لأن المعلومات الوراثية المشفرة فج هي في الغالب غير معروفة، وطرق القائم على التماثل غير فعالة. داخل الجينوم، وفاجات عادة ترميز ثلاثة أنواع رئيسية الجينات: النسخ والتكرار الجينات، الجينات التمثيل الغذائي، والجينات الهيكلية. وتشمل الجينات النسخ والتكرار (فئة I / II الجينات 8) بلمرة، primases، إندو / إكسو-nucleases، وتحركات. يتم حفظها هذه الجينات للغاية نظرا لأهميتها في الإصابة فج، الكتابة وتكرار فج المادة الوراثية. يتم تحديد بلمرة فج بسهولة باستخدام أساليب تناظر تسلسل التقليدية بسبب الحفظ العالمي من 9 ولقد ثبت لخدمة علامات النشوء والتطور فعالة إلى 10.في المقابل، فج التمثيل الغذائي والجينات الهيكلية (الطبقة II / III الجينات 8) بشكل متزايد متباينة، وغالبا ما المشروح في الجينات افتراضية.

فج جينات الأيض تؤثر على قدرة التمثيل الغذائي للمضيف وليس مطلوبا بالضرورة لتكاثر الفيروس. ويبدو أن هذه الجينات، وغالبا ما يشار إلى جينات الأيض المساعدة الى 11 (AMGs)، لتعديل التمثيل الغذائي المضيف والسماح التقدم الأمثل للعدوى ونجاح الفيريون النضج. وقد ارتبطت AMGs مع استخدام وامتصاص المواد الغذائية التي تحد أو في مسارات إنتاج الطاقة. وتشمل بعض الأمثلة الجينات الضوئي الموجودة في الجينوم من مختلف cyanophage 12-16، الجينات المتصلة والتي تنظمها استقلاب الفوسفات 17،18، والاستفادة من مسار الفوسفات البنتوز لفج dNTP الحيوي 18،19. في المقابل، الجينات الهيكلية من بين منتصف إلى أواخر الجينات التي تنتج أثناء العدوى وتختلف عبر مختلف فج حونظم الحادي والعشرين. إنتاج البروتينات الهيكلية تعتمد على توافر dNTP الفيروسي، وبرك الطاقة الخاصة بهم النسخ والترجمة، والتجمع 8. تعتبر البروتينات قفيصة والألياف ذيل هيكلية إذ أن معظم متباينة من كل جينات ترميز البروتينات الفيروسية وهناك حاجة لإنتاج الفيريون ناجحة. وعادة ما يعزى الاختلاف على الدور الفعال الذي تلعبه في تشكيل coevolution الفيروس في استضافة 20. البروتينات المختلفة، بغض النظر عن الطبقة الجينات، ويتم التغاضي بسهولة عند استخدام تقنيات التماثل والتوافق تسلسل التقليدية. وقد أدت محاولة لتصحيح القيود رأينا مع مقارنات تسلسل صارمة في أدوات المعلوماتية الحيوية قادرة على استخدام الخصائص تسلسل لتحديد تكوين الجمعيات، مثل الشبكات العصبية الاصطناعية 21. الشبكات العصبية الاصطناعية (الشبكات العصبية الصناعية) تسمح للتنبؤ الجينات الهيكلية والتمثيل الغذائي، ومع ذلك، تتطلب التحقق التجريبي المصب لتوصيف مباشرةوظيفة الجين.

والهدف من هذا المخطوط هو توفير بروتوكولات مظهري قادرة على رصد كل عملية الأيض تقويضي والمنشطة للبكتيريا المضيف خلال التعبير عن الجينات فج الرواية، وتوقع وظيفيا من خلال الشبكات العصبية الصناعية. مجال phenomics، البيولوجيا المرتبطة الظواهر الخلوية، راسخة في بيولوجيا النظم للمساعدة في التحقيق في البروتينات مع وظيفة غير معروفة أو عديد المظاهر. وتستخدم أدوات مظهري لربط المعلومات المظهرية على المعلومات الوراثية. نحن نفترض للجينات فج المفترضة أن وظيفة (ق) يمكن تحديدها من خلال مراقبة المضيف الآثار الفسيولوجية خلال التعبير فج الجينات. للتحقيق في هذه الفرضية، وقد تم اختيار اثنين من الأساليب الكمية. واستخدمت متعددة النمط الظاهري الفحص لوحات (خرائط) لمراقبة المضيف استخدام الركيزة وتشكيل الكتلة الحيوية لاحق في حين الايض قياس التنوع الأيض المضيفة والوفرة النسبية خلال النمو في البيئى محددةالظروف النفسية. تم overexpressed البروتينات الهيكلية والتمثيل الغذائي المفترضة في القولونية وتتم مقارنة نتائج ممثلة من كل التجارب. يتم عرض تقنيات بصرية عديدة وخطوط الأنابيب وتجهيز إنتاجية عالية لتسهيل النسخ التجريبية. وأخيرا، وتناقش استنساخ ودقة الأساليب المعروضة في سياق الآثار الفسيولوجية المتوقع للبروتين المشروح قفيصة وفج البروتين الأيض، thioredoxin، بالإضافة إلى اثنين AMGs المفترضة.

Protocol

1. إعداد متعدد النمط الظاهري فحص لوحة (MAP) ركائز، بصل وسائل الإعلام، وسائل الإعلام قبل النمو، والواق

  1. جعل 50 مل من 1.0 - الأسهم الركيزة 1.25٪.
    1. حل 1،0 حتي 1،25٪ (ث / ت) من الركيزة الصلبة في الماء المعقم (الحرارة إذا لزم الأمر). تصفية تعقيم حلول مع وحدة مرشح 0.22 ميكرون والأسهم مخزن في RT. وتقدم أمثلة من ركائز المستخدمة في هذه التجارب في الجدول 2.
  2. جعل 250 مل من وسائل الاعلام القاعدية بقوة 3x لجميع الفئات الركيزة (الكربون والنيتروجين والكبريت والفوسفور). واجتماعات الأطراف (3-morpholinopropane-1-سلفونات) وسائل الاعلام القاعدية على أساس 22 تحتوي على ما يلي: 1X اجتماعات الأطراف (40 ملي اجتماعات الأطراف + 10 ملي Tricine)، 0.4٪ الجلسرين * 9.5 ملي NH 4 الكلورين * 0.25 ملم ناسو 4 *، 1.0 ملي MgSO 4 *، 1.32 ملي K 2 هبو 4 *، 10 ملي بوكل، 0.5 ميكرومتر CaCl 5 ملي كلوريد الصوديوم، 6 ميكرومتر FeCl و 0.1٪ (ث / ت) L-أرابينوز ** (الجدولين 1 و 2) .
    ملاحظة: * لا يتم تضمين هذه المركبات اعتمادا على وسائل الإعلام القاعدية. على سبيل المثال، لا يتم استخدام 0.4٪ الجلسرين في وسائل الإعلام القاعدية الكربون والكبريت في وسائل الإعلام القاعدية 1.0 ملي MgSO 4 يتم استبداله 1.0 ملي MgCl 2. ** L-أرابينوز غير محددة لتحريض pBAD المروج ناقلات، pEMB11، التي تحولت إلى آرا - E. القولونية K-12 سلالة (BW 27784) 23.
    1. إضافة كل عنصر من وسائل الإعلام القاعدية إلى قارورة معقمة وتقديم حل للحجم. تخلط جيدا. مع وحدة 0.22 ميكرون التصفية، تصفية تعقيم كل وسائل الاعلام القاعدية في زجاجة معقمة.
  3. جعل 500 مل من وسائل الإعلام اجتماعات الأطراف قبل النمو. اجتماعات الأطراف القائمة على وسائل الاعلام قبل نمو 22 يحتوي على ما يلي: 1X اجتماعات الأطراف (40 اجتماعات الأطراف ملي + 10 ملي Tricine)، 0.4٪ الجلسرين، 9.5 ملي NH 4 CL، 0.25 ملي ناسو 1.0 ملي MgSO 1.32 ملي K 2 هبو 10 ملي بوكل، 0.5 ميكرومتر CaCl 5 ملي كلوريد الصوديوم، و 6 ميكرومتر FeCl 3.
    1. إضافة كلمكون من وسائل الإعلام قبل النمو إلى قارورة معقمة وتقديمهم للحجم. مرشح تعقيم مع وحدة مرشح 0.22 ميكرون، ثم يضاف الأمبيسلين بتركيز نهائي من 100 ميكروغرام / مل. متجر الحل في 4 درجات مئوية.
  4. جعل 500 مل من 0.5X لوريا، Bertani (LB) لوحات أجار. إلى قارورة معقمة، إضافة مكونات LB لجعل التركيز 0.5X (1.25 ز خلاصة الخميرة، 2.5 غرام كلوريد الصوديوم، 2.5 غرام تريبتون، 7.5 غ أجار). تخلط جيدا وتعقيم لتعقيم.
    1. بارد أجار، ثم إضافة 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين المضادات الحيوية مع الخلط. صب ~ 25 مل من أجار في أطباق بتري، والسماح لمجموعة، وتخزينها في 4 ° C لحين الحاجة إليها.
  5. جعل 250 مل من 10 ملي تريس (7.4 درجة الحموضة)، بالإضافة إلى 10 ملي MgSO 4 الحل العازلة. تصفية تعقيم مع وحدة 0.22 ميكرون التصفية، وحل مخزن في RT.

2. إعداد الخلية البكتيرية تعليق

  1. إعداد مستعمرات جديدة. من الجلسرين الأسهم المجمدة 12.5٪، لوحة E. جديدة القولونية نسيلةوفاق على 0.5X LB أجار تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  2. إعداد الثقافات السائلة:
    1. ماصة 3 مل من وسائل الاعلام قبل نمو تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين في أنابيب الثقافة. لكل استنساخ، استخدم يثلث البيولوجية.
    2. تطعيم المستعمرات مستقلة من القسم 2.1 في أنابيب ثقافة أعد. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الهز لمدة 22 ساعة.
  3. بيليه وغسل الخلايا البكتيرية:
    1. نقل O / N الثقافات إلى 1.7 مل أنابيب microfuge. خلايا بيليه عن طريق الطرد المركزي في أقصى سرعة (16900 x ج) لمدة 2 دقيقة في microcentrifuge. صب طاف وغسل الخلايا عن طريق إعادة تعليق في 500 ميكرولتر من 10 ملي تريس / 10 ملي MgSO 4 العازلة. تكرار.
    2. إعادة بيليه الخلايا، طاف صب وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من 10 ملي تريس / 10 ملي MgSO 4 العازلة.
  4. قياس كثافة الخلايا والتركيز الخلايا (إذا لزم الأمر):
    1. تمييع الخلايا من القسم 2.3.3 10 أضعاف في10 ملي تريس / 10 ملي MgSO 4 العازلة ونقل هذا التخفيف في كفيت. قياس الكثافة الضوئية (OD 600 نانومتر) من هذا التخفيف وسجل.
    2. تركيز خلايا لتحقيق تركيز النهائي من 0.07 (OD 600 نانومتر) في الخرائط (سوف تضعف الخلايا 15 أضعاف عند إضافتها إلى الخرائط، وبالتالي الخلايا تحتاج إلى أن تكون في تركيز الأولي من OD 600 نانومتر = 1.05). نقل تعليق خلية تتركز في خزان وحفظ (في RT) حتى الخطوة 3.5 إعداد الخرائط.

3. إعداد متعددة النمط الظاهري لوحات الفحص (خرائط)

  1. تسمية الخرائط. تسمية العقيمة 96-جيدا لوحات عيار الصغير مع E. القولونية رقم التعريف استنساخ وخريطة نوع التخطيطي.
  2. قسامة الماء المعقم إلى خرائط. جو معقم و مطهر نقل الماء المعقم إلى خزان السائل. ماصة 60 ميكرولتر في كل بئر من لوحة صغيرة عيار باستخدام ماصة متعدد القنوات.
  3. قسامة وسائل الإعلام القاعدية الباحثس الخرائط. نقل جو معقم و مطهر 3X وسائل الإعلام القاعدية إلى خزان السائل. ماصة 50 ميكرولتر في كل بئر من لوحة صغيرة عيار باستخدام ماصة متعدد القنوات. كرر الخطوات من 3.2 و 3.3 لكل وسائل الاعلام القاعدية المستخدمة في التخطيطي MAP.
  4. ركائز قسامة في الخرائط. نقل 30 ميكرولتر من كل الركيزة في البئر المناسب من الخرائط.
  5. إضافة تعليق البكتيرية على الخرائط. نقل 10 ميكرولتر من الخلايا البكتيرية من القسم 2.4.2 في كل بئر من خطة عمل البحر المتوسط ​​باستخدام ماصة متعدد القنوات. تغيير النصائح قبل إعادة إدخال ماصة مرة أخرى إلى الأسهم الثقافة.
  6. خرائط الغطاء مع فيلم لاصقة. تغطية كل لوحة تحمل لوحة فيلم لاصقة واحد. اضغط بقوة الفيلم على قمة الآبار من لوحة وعلى طول الحواف لإنشاء ختم حتى وضيق. إزالة الفيلم الزائد من حواف لوحة صغيرة عيار بشفرة حلاقة معقمة.
  7. قياس الكثافة البصرية من الخرائط:
    1. ضع إعداد خرائط للفي "الإدخال" كم من ألواح متعددة الطيفمضواء قارئ لوحة. فتح لوحة برنامج قارئ وإنشاء البروتوكول الذي يقيس الامتصاصية (OD 600 نانومتر) كل 30 دقيقة، أي ما مجموعه 32 ساعة، مع 60 ثانية من الهز بين يقرأ.
    2. ضبط درجة الحرارة في الجهاز إلى 37 درجة مئوية. بدء بروتوكول بمجرد معايرتها الخرائط لضبط درجة الحرارة.
    3. بعد 32 ساعة، وإزالة الخرائط من "إخراج" كم من قارئ لوحة. تسمية كل ملف نصي البيانات لتشمل: E. رقم التعريف استنساخ القولونية، تاريخ ركض خطة عمل البحر المتوسط، وMAP نوع التخطيطي.

4. متعددة النمط الظاهري الفحص لوحات (خرائط) تجهيز وإعداد المعاملات

  1. تقييم منحنيات النمو باستخدام عملية QA الآلي، على سبيل المثال، PMAnalyzer 24.
    1. تحقق من منحنيات النمو لها OD 600 نانومتر <0.20 في ساعة 2 الأولى. لا تستخدم الامتصاصية في نقطة زمنية الأولية (ر 0) في التصفية بسبب القطع الأثرية من التكثيف، الذي حل عادة فيتي 1 (30 دقيقة).
    2. إزالة منحنيات النمو التي تنتهك مرشح QA. حفظ المعلومات منحنى (اسم عينة، إضافة إلى عدد، وOD 600 القيم نانومتر) في ملف إخراج منفصل للرجوع إليها في المستقبل. تواصل مع التحليل إذا منحنى النمو يمر مرشح QA.
  2. حساب منحنيات النمو المتوسط. عن طريق تكرار البيانات، لكل بئر، وحساب منحنى النمو المتوسط ​​عن طريق اتخاذ الكثافة البصرية المتوسطة (OD 600 نانومتر) القيمة عند كل نقطة زمنية. سجل الناتج منحنيات نمو متوسط ​​في ملف إخراج منفصل لاستخدامها في المستقبل.
  3. حساب النموذج اللوجستي أفضل مناسبا لكل منحنى النمو باستخدام التكيف من المعادلة التي اقترحها Zwietering 25. تتضمن المعادلة اللوجستية المعلمات الثلاث تصف نمو البكتيريا: الوقت تأخر كثيرا، λ (ساعة)، الحد الأقصى لمعدل النمو، μ ماكس (OD 600 نانومتر 100 -1)، والعائد الكتلة الحيوية النهائي، α (OD 600 نانومتر). استخدام البيانات في الوقت = 30 دقيقة (ص 1) كما في القيمة الأولية بسبب القطع الأثرية من التكثيف.
    المعادلة 1 [1]
    1. حساب معدل النمو الأقصى باستخدام البحث المباشر. تسجيل أكبر معدل التغير على مدى فترة 90 دقيقة في البيانات.
      المعادلة 2 [2]
    2. تقدير العائد الكتلة الحيوية النهائي من خلال البحث عن قيمة مقارب العليا من أكبر المتوسط ​​المتحرك على نافذة 90 دقيقة. على وجه التحديد، وتحديد باعتبارها الخط المقارب للمنحنى النمو.
      المعادلة 3 [3]
    3. باستخدام أقصى μ وA القيم من 4.3.1 و4.3.2، والعثور على قيمة λ من خلال محاولة كل القيم λ:
      المعادلة 4 [4]
      1. استخدام كل قيمة λ لحساب مبلغ من الخطأ مربع (SSE). استخدام أدنى SSE هو SSE (λS):
        /files/ftp_upload/52854/52854eq5.jpg "/> [5]

5. تحليل النمط الظاهري من الخرائط

  1. حساب معدل النمو (GL) لكل منحنى النمو لتقييم النمو الإجمالي في استنساخ في الركيزة. تحديد GL باسم الوسط التوافقي القيم المجهزة لوجستية تحول:
    المعادلة 6 [6]
  2. تعيين النمط الظاهري على كل منحنى النمو على أساس القيم GL. هنا، والظواهر الأربعة المستخدمة هي: النمو المتوقع، أي نمو، وزيادة وظيفة، وفقدان الوظيفة.
    1. تحديد الظواهر بمقارنة النمو في جميع الحيوانات المستنسخة على ركيزة محددة من حيث الانحرافات المعيارية بعيدا عن المتوسط. استخدام هذه الإحصائية وعتبة النمو الحد الأدنى للدلالة على النمط الظاهري الذي قدمه منحنى النمو (الشكل 1A، B). يقدم الشكل 1C أمثلة الإحالة النمط الظاهري.
    2. تعريف النمو، GL ≥ 0.4 (شملت رقمالبريد 1A، B). تحديد ربح من وظيفة (الشكل 1C والأخضر)، وجود GL> اثنين من الانحرافات المعيارية فوق المتوسط ​​والمتوسط> عتبة النمو. يتم تعريف فقدان وظيفة (الشكل 1C، أحمر) عن وجود GL <اثنين من الانحرافات المعيارية أقل من المتوسط ​​ومتوسط> عتبة النمو.
  3. خلق تمثيل مرئي من مجموعة البيانات على أساس الظواهر ومنحنيات النمو.
    1. ديناميات الرأي نمو تصوير OD 600 القيم نانومتر كلون للمقارنة بسرعة منحنيات النمو بين الحيوانات المستنسخة متعددة (الشكل 2).
    2. عرض توزيعات المظهرية بين جميع الحيوانات المستنسخة بناء على ظروف النمو (الشكل 3).

6. بناء جهاز الثقافة المستمر

  1. بناء ميناء مفاعل (الشكل 4A، B). حفر ثلاث 1/4 في. الثقوب، متباعدة 3/4 في. وبصرف النظر، في الحد الأقصى للمفاعل الثقافة المستمر.
    1. FOα ميناء ص: المسمار خيط بالتركيبة وحة نمط الإناث جبل ل16/01 في تعليق لاذع من الجزء السفلي من الغطاء مع تعليق لاذع إلى الارتفاع، من الغطاء. شوكة آمن مع لوحة 1/4 في. جبل قفل الجوز.
    2. لمنفذ β: المسمار موضوع بالتركيبة وحة نمط الإناث جبل ل16/01 في تعليق لاذع مع تعليق لاذع إلى الارتفاع، من الغطاء. شوكة آمن مع لوحة 1/4 في. جبل قفل الجوز.
    3. لمنفذ γ: المسمار موضوع بالتركيبة وحة نمط الإناث جبل ل16/01 في تعليق لاذع من أسفل الغطاء حتى الشوكة إلى الارتفاع، من الغطاء. شوكة آمن مع 1/4 في. جبل لوحة قفل الجوز. المسمار بالتركيبة الذكور مع يتجزأ حلقة القفل إلى 1/8 في. تجويف واسع خرطوم لاذع المناسب في داخل الغطاء.
    4. للمنفذ تدفق: حفر 16/05 في حفرة عند علامة 75 مل من المفاعل الثقافة المستمر. قطع 3/4 في. قبالة نهاية الجوز من 1/4 في. الشائكة الحاجز المناسب. المسمار في 1/4 في. الحاجز الشائكة المناسب (طوقا على السطح الخارجي للزجاجة والجوز هو في الداخل، Figure 4B).
  2. تغذية بناء ميناء زجاجة (الشكل 4C). حفر اثنين 1/4 في. ثقوب متباعدة 1 في. وبصرف النظر في الحد الأقصى من زجاجة الرضاعة.
    1. لδ المنفذ: المسمار موضوع بالتركيبة وحة نمط الإناث جبل ل1/8 في تعليق لاذع مع تعليق لاذع إلى الارتفاع، من الغطاء. شوكة آمن مع لوحة 1/4 في. جبل قفل الجوز.
    2. لε المنفذ: المسمار موضوع بالتركيبة وحة نمط الإناث جبل ل16/01 في تعليق لاذع مع تعليق لاذع إلى الارتفاع، من الغطاء. شوكة آمن مع لوحة 1/4 في. جبل قفل الجوز.
      1. المسمار بالتركيبة الذكور مع يتجزأ حلقة القفل إلى 1/8 في. تجويف واسع خرطوم لاذع المناسب، في الداخل من الغطاء.
  3. تغذية أنابيب وملحقات أنبوب:
    1. قطع اثنين 1 في. قطعة من الأنابيب (1/8 في قطرها الخارجي (OD) × 1/16 في. قطرها الداخلي (ID)). قطع تناسب على الموانئ α و γ المفاعل ثقافة المستمر المحرز في القسم 5.2.
    2. قطع واحد 1 في. قطعة من رubing (1/4 في. OD X 1/8 في. ID). قطعة مناسبا على Β ميناء المفاعل الثقافة المستمر.
    3. قطع واحد 3.5 في. قطعة من الأنابيب (1/8 في. OD X 1/16 في. ID). تناسب هذه القطعة إلى داخل γ الميناء، على بالتركيبة الذكور مع يتجزأ حلقة القفل إلى 1/8 في. خرطوم تجويف واسع. ميناء γ هو المنفذ عينة من مفاعل الثقافة المستمر.
    4. قطع واحد 1 في. قطعة من الأنابيب (1/4 في. OD X 1/8 في. ID). تناسب هذه القطعة على منفذ δ من زجاجة الرضاعة.
    5. قطع واحد 11 في. قطعة من الأنابيب (1/16 في. OD X 1/8 في. ID). تناسب هذه القطعة إلى داخل ε المنفذ من زجاجة الرضاعة، على بالتركيبة الذكور مع يتجزأ حلقة القفل إلى 1/8 في. خرطوم تجويف واسع.
    6. قطع اثنين 18 في. قطعة من الأنابيب (1/8 في. OD X 1/16 في. ID). تناسب قطعة واحدة إلى ميناء ε من زجاجة الرضاعة. حفظ قطعة أخرى في الباب 7.

7. تشغيل الثقافات مستمرة لالايض

  1. تعقيم المواد:
    1. Autoclaلقد المواد الجافة لمدة 30 دقيقة. تأكد من التفاف الغطاء من زجاجة الرضاعة المحرز في القسم 5 في رقائق الألومنيوم. الحفاظ المرفقة أنابيب مباشرة.
      1. لف غطاء المفاعل الثقافة المستمر، المحرز في القسم 5، في رقائق الألومنيوم. الحفاظ المرفقة أنابيب مباشرة. لف 18 في. قطع الأنابيب في القسم 6.3.5 وأصغر مضخة تحوي محول الأنابيب في رقائق الألومنيوم. إبقاء الأنابيب على التوالي. الأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة.
    2. جعل 2 L من 0.5X LB مرق. في زجاجة الرضاعة، وجعل 0.5X LB مرق. تغطية زجاجة الرضاعة مع احباط. الأوتوكلاف لمدة 1 ساعة.
    3. جعل 70 مل من 0.5X LB مرق. صب المرق في المفاعل الثقافة المستمر. وضع بقضيب في مفاعل الثقافة المستمر. تغطية المفاعل مع احباط والأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة.
  2. ثقافة مستمرة انشاء:
    1. بكتيريا خلية تعليق.
      1. من الجلسرين الأسهم المجمدة 12.5٪، لوحة E. جديدة استنساخ القولونية على 0.5X LB أجار تحتوي على 100 ​​ميكروغرام / مل الأمبيسلين. احتضانعند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
      2. تطعيم مستعمرة واحدة إلى 3 مل من 0.5X LB مرق تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين. لكل استنساخ استخدام يثلث البيولوجية. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الهز لمدة 22 ساعة.
    2. ربط الأجزاء معا.
      1. وضع جميع المواد تعقيمها في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية وتحويل الأشعة فوق البنفسجية على حين يبرد وسائل الإعلام. بمجرد أن يبرد وسائل الإعلام، إضافة 0.1٪ L-أرابينوز و 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين لجميع مرق 0.5X LB.
      2. بسط المستمر سقف مفاعل الثقافة والمسمار على المفاعل. تجنب لمس أنبوب أخذ العينات. بسط غطاء زجاجة الرضاعة والمسمار على زجاجة الرضاعة. تجنب لمس أنبوب أخذ العينات.
      3. الحفاظ على 18 في. أنابيب موصولة إلى ميناء ε عقيمة. برنامج الأمم المتحدة للالتفاف على 18 في. أنابيب وتحوي محول مضخة الأنابيب.
      4. تناسب نهاية خالية من 18 في. أنابيب على واحدة من نهاية تحوي محول مضخة الأنابيب. تناسب الطرف الآخر من محول مضخة تحوي أنابيب ل18 في. أنابيب موصولة إلى ميناء ε من غطاء زجاجة الرضاعة.
      5. المسمار 0.22 ميكرون وحدات التصفية على منافذ β وδ المفاعل الثقافة المستمر. المسمار وحدة 0.22 ميكرون تصفية على محول من ميناء α. إلى وحدة مرشح 0.22 ميكرون، تناسب نهاية خالية من ال 18 في. الأنبوب.
    3. بدء الثقافة مستمرة.
      1. في غطاء محرك السيارة السلامة الأحيائية، تطعيم المفاعل ثقافة المستمر مع 100 ميكرولتر من O / N الثقافة المحرز في القسم 7.2.1.1.
      2. نظام قريب قبل أن ينتقل الثقافة مستمرة في الحاضنة 37 درجة مئوية. في الحاضنة لها لوحة تحريك مغناطيسي ومضخة صغيرة تحوي اقامة.
      3. تناسب تحوي محول مضخة الأنابيب إلى مضخة تحوي. أنابيب من زجاجة الرضاعة يبدأ في "في" يبدأ الجانب والأنابيب مما يؤدي إلى المفاعل في الجانب "الخروج".
      4. ضبط مضخة تحوي على: "FAST". بدء ضخ تحوي عن طريق التحول إلى R20؛ FORWARD ". تحقق من أن وسائل الإعلام يبدأ في التدفق من خلال الأنبوب.
      5. وضع المفاعل على المغناطيسية لوحة ضجة ويبدأ الخلط. مفاعل ثقافة المستمر يجب أن تتوازن لمدة 24 ساعة قبل أخذ العينات.
    4. أخذ عينات من ثقافة مستمرة. المسمار حقنة لوك 5 مل بالتركيبة على γ الميناء وسحب ما يصل 4.5 مل من الثقافة.
      1. استخدام 500 ميكرولتر من الثقافة لقياس الكثافة (OD 600 نانومتر). تمييع الخلايا لجعل 4 × 1 مل الثقافات في OD 600 نانومتر = 0.35.
      2. قسامة المخفف الثقافات إلى 1.7 مل أنابيب microfuge. تكرار أخذ العينات كل 12 ساعة لمدة 4 أيام.
    5. تحضير عينات للGC-TOFMS:
      1. خلايا بيليه عن طريق الطرد المركزي في أقصى سرعة (16900 x ج) لمدة 2 دقيقة. طاف صب. غسل الخلايا مع 500 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). كرر هذه الخطوة.
      2. صب طاف مرة أخيرة، ثم غمر أنابيب microfuge مع الخلايا مكعبات في النيتروجين السائل حتى السطح توقف. Sمزق العينات في الفريزر -80 درجة مئوية.

8. تشغيل الممر المسلسل الثقافات دفعة لالايض

  1. إعداد البكتيرية خلايا تعليق. من الجلسرين الأسهم المجمدة 12.5٪، لوحة E. جديدة القولونية الحيوانات المستنسخة على 0.5X LB أجار تحتوي على 100 ​​ميكروغرام / مل الأمبيسلين. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    1. تطعيم المستعمرات الفردية إلى 3 مل من 0.5X LB مرق تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين. استخدام يثلث البيولوجية لكل نسخة.
  2. ثقافات دفعة مرور التسلسلي.
    1. ثقافة فرعية O / N من 8.1.1 عن طريق التخفيف 500 أضعاف إلى 3 مل من مرق LB يحتوي على 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين و 0.1٪ L-أرابينوز. يجب أن يكون ثقافة فرعية لOD ​​600 نانومتر <0.005. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الهز.
    2. تحقق الكثافة الضوئية (OD 600 نانومتر) في 2 و 2.5 ساعة. تنمو الخلايا لتحقيق OD 600 نانومتر = 0.35.
      1. ثقافة فرعية عن طريق دي 500 أضعافlution إلى 3 مل من مرق LB يحتوي على 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين و 0.1٪ L-أرابينوز. يجب أن يكون ثقافة فرعية لOD ​​600 نانومتر <0.005.
    3. تحقق الكثافة الضوئية (OD 600 نانومتر) في 2 و 2.5 ساعة. تنمو الخلايا لتحقيق OD 600 نانومتر = 0.35.
  3. أخذ العينات الثقافات دفعة مرور التسلسلي.
    1. باستخدام ملقط معقم، وضع مرشح 0.22 ميكرون غشاء على رأس مشعب التصفية. قسامة 1 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) على ورقة الترشيح ثم تشغيل مضخة فراغ.
    2. أكرر إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني. نقل 1 مل من ثقافة فرعية من القسم 8.2.3 على ورقة الترشيح. من هنا، والتحرك بسرعة للحصول على عينات في النيتروجين السائل على الفور. إكمال هذا في 1 دقيقة.
    3. قسامة 1 مل من برنامج تلفزيوني على ورق الترشيح لغسل العينة. تدفق بسرعة من دون إراقة العينة على الجانبين من ورق الترشيح. تكرار.
    4. باستخدام ملقط معقم مرشح المكان إلى أنبوب microfuge 1.7 مل من قبل للطي بعناية فايlter. غمر microfuge أنبوب في النيتروجين السائل حتى السطح توقف. عينة تخزينها في الفريزر -80 درجة مئوية.

9. المستقلب التحليل والمعالجة

  1. سفينة 3 عينات في استنساخ على الثلج الجاف إلى مرفق الايض الأساسية لتجهيز العينات وتحليلها وتطبيع GC-TOFMS.
  2. لكل عينة تحديد الوسط الحسابي والوسيط والانحراف المعياري ومعامل الاختلاف عبر الأيض، باستخدام بيانات تكرار.
  3. للتحليل الإحصائي، رمز خط أنابيب QA يدويا باستخدام عبارات الشرطية والإعدام المتكررة 26 لإزالة نواتج الأيض التي لا تتبع الشروط المحددة.
    1. للتكييف 1، وإزالة نواتج الأيض فيها أكثر من 2 عينات لديها وفرة الصفر. إزالة المعايير الداخلية من لمحات metabolomic.
    2. لشرط 2، إزالة تلك الأيض التي لا توجد في خلايا الفائدة. هنا، وإزالة نواتج الأيض التالية: الإندول 3 خلات، dihydroabiet حمض جيم، حمض nonadecanoic، حمض الصفصاف، ساليسيلالدهيد، والكولسترول، والفينول، 1-monostearin، octadecanol، 1-monopalmitin، الدوديكان، dodecanol، 1-hexadecanol، 5-methoxytryptamine، وحمض البنزويك وحمض pentadecanoic، وحمض الفوسفوريك، وحمض pelargonic، النخيلي حامض، وحامض الكابريك، هيدروكسيل، حمض دهني، حمض Myristic، maleimide، levoglucosan، وحامض 4-هيدروكسي.
    3. للتكييف 3، إزالة تلك الأيض الذين معامل الاختلاف هو أكبر من 1.
  4. التقاط آثار الايض العالمية من خلال النظر في المستقلب فرة نسبية.
    1. خلق تمثيل مرئي من وفرة الأيض متوسط ​​في استنساخ لكل الأيض (الشكل 6).
  5. تحديد القيم المتطرفة من خلال مراقبة الترددات الزوج استنساخ الأيض.
    1. حساب النتيجة Z لكل قيمة وسيطة من كل الأيض في استنساخ. احتساب الدرجات ض باستخدام المعادلة التالية:
      /52854/52854eq7.jpg "/> [7]
      ملاحظة: مصطلح X MC يمثل مستوى فرة من المستقلب معين لاستنساخ معين. المدى μ C يمثل متوسط ​​جميع الحيوانات المستنسخة لالمستقلب معين. المدى σ C هو المعيار الانحراف المرتبطة بها.
    2. إنشاء التمثيل البصري للبيانات التي يتم تسليط الضوء القيم المتطرفة (البيانات لم تقدم).

Representative Results

وقد تم جمع جميع العينات المستخدمة لتحديد أطر القراءة المفتوحة (ORFS) المختارة في هذه الدراسة من جزيرة ستاربكس، الموقع 7 (STAR7) وكارولين أتول، الموقع 9 (CAR9) من جزر الخط الجنوبي. وقد تم جمع ما يقدر بنحو 100 L مياه البحر من هذه المواقع تحت المرجانية طبقة الحدود باستخدام مضخات ماء آسن، كما هو موضح سابقا 5. وكانت محتويات مضخات تخضع لتشقق من خلال مرشحات مسامي كبيرة لإزالة حقيقيات النوى الصغيرة وتتركز في وقت لاحق باستخدام 100 كيلو دالتون مرشحات تدفق عرضية ترك الميكروبات فقط والفيروسية مثل جسيمات (VLPs). لفصل VLPs، صدر المتبقية مياه البحر من خلال 0.45 ميكرون مرشحات مما أدى إلى virome. وقدم الكلوروفورم لهذا الكسر الفيروسي للحد من النمو في أي الخلايا المتبقية وتخزينها في 4 درجات مئوية.

وتنقيته VLPs باستخدام طريقة كلوريد السيزيوم، التي التدرجات كثافة منفصلة عن طريق الطرد المركزي وتسمح لاسترداد فيرالأيونات في ~ 1.35 جم / مل إلى 1.5 غرام / مل 3. تم استخراج الحمض النووي الفيروسي باستخدام CTAB / الفينول: بروتوكول الكلوروفورم وتضخيمها عبر عدة التضخيم التشرد باستخدام الكواشف Phi29. تم إنجاز تسلسل virome مع التكنولوجيا pyrosequencing المتاحة تجاريا.

المعلوماتية الحيوية المستخدمة في معالجة واختيار ORFS الفيروسية لهذه الدراسة هي على النحو التالي. واستخدمت ثلاث خطوات المعالجة المسبقة على CAR9 وSTAR7 metagenomes الفيروسي. أولا، كانت تستخدم البرمجيات العامة لإزالة تسلسل العلامة التي نتجت عن التضخيم من الحمض النووي الفيروسي قبل تسلسل 27. ثانيا، تم تصفيتها التحف التسلسل الشائعة مثل التكرارات تسلسل ورقم نسخة منخفضة من مجموعة البيانات عن طريق برنامج المعلوماتية الحيوية إضافي 28. وأخيرا، تم تنفيذ إزالة التلوث تسلسل الأجانب 29 لهذه التسلسلات التي كان ≥ تغطية 90٪ و 94٪ ≥ الهوية مع تسلسل في قواعد البيانات التالية: RefSeq الخامسالجينوم irus. الإنسان - المرجع GRCh37. الإنسان - سيليرا الجينوم. الإنسان - كريغ فنتر (HuRef)؛ الإنسان - سيونغ جين كيم (كوريا)؛ الإنسان - كروموسوم 7 الإصدار 2 (TCAG)؛ والإنسان - جيمس واتسون، YanHuang (YH، آسيا)، اليوروبا (NA18507؛ الأفريقية) تسلسل المرجعية 21. وبعد هذه العمليات، بلغ مجموع متواليات من العينات CAR9 591600 وبلغ تسلسل STAR7 939311. تم تحميل هذه السلاسل على MGRAST وتجميعها عن طريق برنامج المجمع باستخدام الإعدادات الافتراضية. وقد ترجمت Contigs إلى 6 إطارات القراءة والمفترضة إطارات القراءة المفتوحة (pORFs) تم تحديدها باستخدام البرامج النصية، كما هو موضح سابقا 21.

لتحديد ORFS غير معروفة تم إجراء عدد من عمليات البحث التشابه القائم على إزالة ORFS وظيفة معروفة. لفترة وجيزة، تم تنفيذ عمليات البحث التالية مع معاييرهم البحث المناظرة 21:

  1. تشابه كبير من ≥ 95٪ الهوية على ≥40 قاعدة الزوج (بي بي) من خلال MGRAST BLAT في قاعدة بيانات M5NR.
  2. تشابه كبير (قيمة الإلكتروني ≤ 0.001) من خلال TBLASTN ضد كل metagenomes العام في بلدي الموارد قاعدة بيانات Metagenome.
  3. تشابه كبير (قيمة الإلكتروني ≤ 0.001) من خلال BLASTP وTBLASTN ضد قاعدة بيانات NR.
  4. تشابه كبير (القيمة الإلكترونية ≤ 0.001) من خلال RPS-BLAST ضد قاعدة البيانات المحفوظة المجال.
  5. ترجمة البروتين من جزء محدد من كل مجموعة بيانات مقارنة ضد الهياكل بروتين حلها في بنك معلومات البروتين.
  6. حساب الترددات ثنائي النوكليوتيد باستخدام حزمة ثنائي النوكليوتيد التوقيعات.

تم تصميم pORFs الناتجة عن التعبير في E. القولونية باستخدام متوفرة علنا تصميم البرمجيات الجينات. العودة الترجمة من تسلسل الأحماض الأمينية المستخدمة جدول الاستخدام العالمي تسلسل معلومات النظام الجيني مصممة لاستيعاب التعبير في E. القولونية مع عتبة استخدام الحد الأدنى من 2٪. تقييد تسلسل اعتراف الانزيم تم استبعاد الصورة لBamHI وHindIII من متواليات لتسهيل الاستنساخ. تصنيعه شركة خارجية الجينات المهندسة تسلسلات 30 ثم تم استنساخ ORFS إلى وسيلة نسخ عدد pBAD المروج ناقلات، pEMB11، عبر معيار انزيم التقييد الاستنساخ. تم تحويل جميع الحيوانات المستنسخة في E. القولونية K-12 سلالة BW 27784 23.

لوحات متعددة النمط الظاهري الفحص (خرائط)

تم الاستدانة خط أنابيب إنتاجية عالية والبرمجيات قوية لتحليل الخرائط، وPMAnalyzer 24. تم تطوير خط أنابيب في بيئة خادم لينكس وينفذ الخطوات المختلفة بما في ذلك: إعراب ملفات الكثافة البصرية، تنسيق البيانات إلى ملفات نصية قابلة للقراءة، وتجهيز ما قبل منحنيات النمو لضمان الجودة (QA)، وأداء تقنيات النمذجة الرياضية لتحليل منحنيات النمو . وقد وضعت النصوص النمذجة الأولية في بيثون النسخة 2.7.5 إلى الاستفادة من وحدة PyLab.

ق ق = "jove_content"> الخرائط استنساخ تم تقييمها باستخدام الخطأ المعياري (SE) عن البيانات تكرار (الشكل 2A). وتمت مقارنة منحنيات النمو الخام إلى منحنيات النمو لوجستية لتحديد ما إذا كان البرنامج PMAnalyzer معلمات بدقة وعلى غرار النمو استنساخ خلال التجريب (لا تظهر البيانات). للحصول على مزيد من المعلومات حول دقة وصحة الخرائط وPMAnalyzer رؤية كويفاس وآخرون 24

وبعد التحقق من طريقة، تم تحليل بيانات خرائط تستخدم المعلمات متعددة، مثل معدل أقصى قدر من النمو (μ ماكس) ومستوى النمو (GL)، التي يقدمها خط أنابيب المعالجة. وكثيرا ما يستخدم التصور المقارن من منحنيات النمو لتفسير بيانات النمو. ومع ذلك، فإن عدد من المنحنيات التي يمكن تصور في وقت لمقارنة له حدود. لتحليل العديد من منحنيات النمو في وقت واحد، وناشد خريطة الحرارة المؤامرات المشتقة للمقارنة عشرات من الحيوانات المستنسخة نمت على substrat واحدةه ضد المتوسط ​​ردا على ذلك الظروف "(الشكل 2B). لوحظ تأثير وضعت من قبل overexpression من بروتين فج رواية من خلال التغييرات في منحنى المعلمات، وتحديدا: المرحلة، مرحلة الأسي وأقصى قدر من المحصول الكتلة الحيوية (الخط المقارب) متخلفة. وكمثال على ذلك، يرد الصعود الحاد من مرحلة التخلف إلى مرحلة الأسي غرار في منحنى النمو للبروتين قفيصة (الشكل 2A) من خلال تغيير سريع في كثافة اللون من الأسود إلى الأبيض لنفس استنساخ في المؤامرة الديناميكية الشكل 2B .

للحصول على صورة شاملة للتوزيع استنساخ عبر ركائز، استخدمت التصنيفات المظهرية المستمدة من GL (الشكل 3). هنا، والظواهر أربعة منفصلة إلى أربعة المخططات حيث ارتفاع كل شريط يمثل عدد من الحيوانات المستنسخة عرض هذا النمط الظاهري للركيزة محددة. يتم التعرف على القيم المتطرفة في البيانات كما استنساخ الوقوع في "كسب فوnction "أو" فقدان وظائف الفئة ". ويمكن بعد ذلك سعى القيم المتطرفة بشكل فردي والتحقيق عن كثب تجريبيا. بالإضافة إلى ذلك، تحليل عالمي يعترف التحيزات الركيزة في الفحص. ركائز مثل الفينيل ألانين وحمض الماليك، والجلايسين أسفرت عن "أي نمو" التصنيف. ركائز التي تقع باستمرار في أي تصنيف النمو، في جميع الحيوانات المستنسخة، لا يتم بثقل كبير في توصيف وظيفي المصب.

الايض

وقد تم تحديد المنتجات تقويضي من الحيوانات المستنسخة التعبير عن الجينات فج غير معروفة باستخدام الايض. باختصار، كانت تزرع استنساخ تحت أي ثقافة مستمرة أو مرور التسلسلي في بيئة الثقافة دفعة قبل ارسالهم خارج لتحليل GC-TOFMS في منشأة الايض الأساسية. للحصول على تفاصيل تجهيز العينات وتحليلها، وتطبيع للGC-TOFMS التي تنفذها المنشأة الأساسية المختارة رؤية Fiehn 31 آخرون بريefly، يضاف 1 مل من المذيب استخراج البارد لكل عينة، وبعد ذلك يتم vortexed العينات وsonicated في حمام بارد لمدة 5 دقائق. وطرد أخيرا عينات ويصب نصف العينة والمجففة أسفل لتحليلها. المقتطفات هي النقاء وارتفعت مع علامات مؤشر الاحتفاظ الداخلي قبل أن يتم تحميلها على اللوني للغاز ومن ثم تم نقلهم إلى مطياف الكتلة. ويتم تحليل البيانات من كل عينة من هذا القبيل أن شدة إشارة لجميع إشارات الكشف في اللوني يتم الإبلاغ عنها. للتطبيع، ولخص وفرة من القمم لكل عينة، وبلغ متوسط ​​مجموع الكميات المتوفرة الذروة بين جميع العينات في المجموعة. وتنقسم فرة الأيض في العينة الذروة فرة العينة ثم مضروبا في متوسط ​​ذروة وفرة من مجموعة العينة. يتم استخدام البيانات الناتجة عن تحليل الايض في البحوث التي تمت مناقشتها.

كان مطلوبا التحقق من الايض استنساخ لتحديد حجم العينة المناسب لكل طريقة زراعة. للكشف عن الدقة ينظر داخل العينات والاختلاف في انحاء عينة أحجام الخطأ المعياري للمتوسط ​​(S M) لكلا ن = 3 و n = تم استعراض 6 مجموعات البيانات (الشكل 5B). بغض النظر عن الثقافة المستمر (CC) حجم العينة، كان أقل من 1٪ من البيانات وS M ≤ 1.5. كان متوسط ​​S M ق 221 و 300، وتراوحت القيم 0 حتي 7،55 × 10 5 و 3.74 × 10 ل n = 3 و n = 6 على التوالي. حسبت أيضا S M الصورة لكل مجموعة من عينة يعيد في الأسلوب الثقافة مسلسل (SC). مرة أخرى، كان أقل من 1٪ من البيانات وM S ≤ 1.5، وهو S M متوسط ​​137، ومجموعة 0 حتي 3،51 × 10 5. لمقارنة التوزيعات S M بين كل مجموعة عينة (CC ن = 3 ضد ن = 3) تم إجراء اختبار التقليب. CC ن = 6، CC ن = 3 مقابل SC ن = 3، وCC ن = 6 مقابل SC. وDISTRIBكان ution إما ثقافة مستمرة S M تقدر بيانات لا يختلف كثيرا عن توزيع ثقافة التسلسلية القيم S M (ع القيمة = 0.0). ومع ذلك، كان توزيع القيم S M للثقافة مستمرة ن = 3 البيانات تختلف كثيرا عن تلك القيم S M للثقافة مستمرة ن = 6 البيانات (ف قيمة = 1.908804 × 10 -49). وأخيرا، تمت مقارنة معامل الاختلاف في المستقلب قبل وبعد تنفيذ خطوة لضمان الجودة (QA) (الشكل 5C). في المجموع، تم إزالة 210 الأيض بعد تنفيذ خط أنابيب QA (40٪ من البيانات). كان أقل من 1٪ من البيانات إزالة فرة المستقلب من الصفر، ~ كانت 2٪ البيانات القياسية الداخلية، ~ 5٪ والبيانات من نواتج الأيض لم يسبق له مثيل لوحظ في E. كان القولونية، والأيض المتبقية (> 30٪) ومعامل الاختلاف أكبر من 1.

كما هو الحال مع تحليل الخرائط، observatio العالمي قدمت نانوثانية فهم أولي لعمق الايض المعلومات العروض. للحصول على صورة شاملة، تم تجميع الحيوانات المستنسخة هرميا على أساس الكميات المتوفرة الأيض النسبية تقديم معلومات عن ملامح استنساخ الأيض، استنساخ المحتملة مع المهام ذات الصلة، والقيم المتطرفة استنساخ الأيض (الشكل 6). لتسليط الضوء على وظائف البروتين، يتم فصل الأيض وتجميعها على أساس المسارات الأيضية المشتركة. باستخدام هذا التحليل مع النتائج الأولية، كان من الواضح أن الايض قادر على فصل الجينات من فئات مختلفة (الشكل 6، أبرز استنساخ). بالإضافة إلى ذلك، تم تحديد هوية النموذجية مع البيانات الايض عن طريق حساب عشرات القياسية (عشرات ض) لكل زوج استنساخ الأيض. لضمان دلالة إحصائية، وتم تحديد القيم المتطرفة كزوج استنساخ الأيض مع Z قيمة بنتيجة 2، وهو ما يمثل 5٪ فقط من البيانات (لا تظهر البيانات).

ether.within صفحة = "دائما"> الشكل 1
الشكل 1. تعاريف التصنيفات النمط الظاهري. (A) العلاقة بين مستوى النمو (GL) ومعدل نمو أعلى. نقاط البيانات دائري باللون الأحمر تمثل منحنيات النمو تظهر قليل من دون استخدام الركيزة. (B) تمثيل Boxplot تحديد عتبة النمو القائم على توزيع منحنيات النمو مع معدل نمو الحد الأدنى (<0.15 OD / ساعة). (C) ويتم احتساب التباين والانحراف المعياري للGL لالركيزة D-اللبن. الخطوط المتقطعة قصيرة تمثل اثنين من الانحرافات المعيارية بعيدا عن المتوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

highres.jpg "/>
الشكل 2. التحقق من صحة العطرية عبر الدقة والتمايز. (A) منحنيات النمو لاستنساخ الهيكلية (قفيصة) والتمثيل الغذائي المشروح (Thioredoxin)، واثنين من الحيوانات المستنسخة التمثيل الغذائي رواية (EDT2440، EDT2441)، ومتوسط ​​استجابة من الحيوانات المستنسخة نمت على السكروز، D- الجلاكتوز والمانوز-D في الخرائط. الخطوط الزرقاء تدل على الخطأ المعياري ينظر بين البيانات تكرار (ن = 3). (B) يتم تمثيل منحنيات النمو لمدة 47 استنساخ مختلفة عن خرائط الحرارة لالسكروز، D-الجلاكتوز والمانوز D-. والهيكلية (الدائرة الخضراء) المشروح واستنساخ التمثيل الغذائي (دائرة البرتقال)، واثنين من الحيوانات المستنسخة التمثيل الغذائي رواية (الدوائر الزرقاء الداكنة والفاتحة)، ومتوسط ​​استجابة (الدائرة الحمراء) ويسلط الضوء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

pload / 52854 / 52854fig3highres.jpg "العرض =" 700 "/>
الشكل 3. توزيع استنساخ لكل النمط الظاهري عبر ركائز متعددة. العد واستنساخ النمط الظاهري لل47 الحيوانات المستنسخة عبر 72 شروط النمو الكربون محددة. ويقدم الجدول التهم المباشرة لكل النمط الظاهري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. رسم بياني يفصل بناء جهاز الثقافة المستمر. (A) خطوات تستخدم لبناء الموانئ α-γ المفاعل الثقافة المستمر، (B) الخطوات المستخدمة لبناء ميناء تدفق خارج المفاعل الثقافة المستمر، و (C ) الخطوات لبناء الموانئ وδ ε من زجاجة الرضاعة الثقافة مستمرة. = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52854/52854fig4highres.jpg" الهدف = "_ فارغة"> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. مقارنة بين أساليب مظهري المقدمة. (A) سير العمل للإعداد لوحات متعددة النمط الظاهري الفحص (خرائط)، والثقافات مستمرة والثقافات التسلسلية. (B) نسبة الخطأ المعياري للمتوسط ​​(S M) تعول على حد سواء ن = 3 و n = 6 أحجام العينة للثقافة المستمر (CC) والثقافة مسلسل (SC) الطرق استعدادا لالايض. المحور الصادي على نطاق والسجل. (C) وتوزيع معامل التغير (CV) في الأيض، قبل وبعد تنفيذ خط أنابيب QA للثقافة المستمر (CC) الأسلوب.g5highres.jpg "الهدف =" _ فارغة "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الرقم 6. ملامح Metabolomic من الحيوانات المستنسخة التي تزرع في الثقافة مستمرة. يتم رسم وفرة الأيض الوسيط لمجموعة من المركبات عن 84 الحيوانات المستنسخة التي تزرع في الثقافات مستمرة. ويسلط الضوء على ملامح الأيض لاستنساخ المشروح الهيكلية (قفيصة) والتمثيل الغذائي (Thioredoxin)، واثنين من الحيوانات المستنسخة التمثيل الغذائي رواية (EDT2440، EDT2441)، ومتوسط ​​استجابة عمليات التمثيل الغذائي في الحمراء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

مركب كربون نتروجين كبريت الفوسفور
الغليسيرول - 0.40٪ 0.40٪ 0.40٪
كلوريد الأمونيوم 9.5 ملم - 9.5 ملم 9.5 ملم
كبريتات الصوديوم 0.250 مم 0.250 مم - 0.250 مم
المغنيسيوم كبريتات 1.0 ملم 1.0 ملم - 1.0 ملم
البوتاسيوم الفوسفات 1.32 ملم 1.32 ملم 1.32 ملم -
كلوريد المغنيسيوم - - * -
كلوريد البوتاسيوم 10 ملي 10 ملي 10 ملي 10 ملي
كلوريد الكالسيوم 0.5 ميكرومتر 0.5 ميكرومتر 0.5 ميكرومتر
كلوريد الصوديوم 5 مم 5 مم 5 مم 5 مم
كلوريد الحديديك 6 ميكرومتر 6 ميكرومتر 6 ميكرومتر 6 ميكرومتر
أرابينوز L- 0.10٪ 0.10٪ 0.10٪ 0.10٪
اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 7.4 1X 1X 1X 1X

الجدول 1. المركبات وتركيزات مختلفة وسائل الإعلام القاعدية المستخدمة في الخرائط. * يتم استبدال 1.0 ملم من كلوريد المغنيسيوم. 1X اجتماعات الأطراف = 40 ملي اجتماعات الأطراف، 4 ملي Tricine.

L-يسين
ركائز الكربون ركائز النيتروجين ركائز الكبريت Pركائز hosphorus
2 ديوكسي-D-الريبوز 2-ديوكسي-D-الريبوز حمض 1-البوتان-السلفونيك الأدينوزين-5-monophoshate
حمض الخليك 4 هيدروكسي فينيل اسيتاميد أسيتيل سيستين بيتا سكرولي
حمض الاسيتيك الأدينين D-السيستين creatinephosphate
الأدينوزين-5-الأدينوزين الأدينوزين D-ميثيونين D-الجلوكوز 6 فوسفات
أدونيتول آلانتوين اثيل-dithiophosphate اثيل-dithiophosphate
ألفا-D-الجلوكوز بيتا phenylethylamine DL-إيثيونين DL-ألفا-سكرولي
ألفا-D-اللاكتوز البيوريت الجلوتاثيون فوسفات البوتاسيوم
ألفا-D-melebiose سيتيدين حمض isethionic بيروفسفات الصوديوم
حمض الستريك السيتوزين -L السيستئيك حمض thiophosphate الصوديوم
D-ألانين D-ألانين L-سيستين
D-أرابينوز D-الأسباراجين -L djenkolic حمض
D-أرابيتول D اسبارتاتي L-ميثيونين
D-الأسباراجين D-السيستين كبريتات المغنيسيوم
D اسبارتاتي D-الجلوكوزامين الميثان حمض السلفونيك
D-cellubiose حمض الجلوتاميك-D N-أسيتيل-DL-ميثيونين
D-السيستين حمض DL-ألفا-الأمينية-N-زبدي N-أسيتيل-L-السيستين
D-الفركتوز D-ميثيونين البوتاسيوم رباعي thionate D-اللبن D-سيرين وحمض الصوديوم
D-الجلوكوزامين D-حمض أميني أساسي حمض sulfanic
D-الجلوكوز حمض جاما أمينو-N-زبدي التورين
D-الجلوكوز 6 فوسفات الجلايسين حمض taurocholic
D-الغلوتامات غوانيدين ثيوريا
D-المانوز الهستامين
D-رافينوز إينوزين
D-الريبوز L-ألانين
D-salicin L-أرجينين
D-سيرين L-الأسباراجين
D-طرهالوز L-سيترولين
D الزيلوز- L-السيستين
دولسيتول حمض الجلوتاميك-L
الغليسيرول L-الجلوتامين
الجلايسين L-الجلوتاثيون
ط-اريثريتول L-الحامض الاميني
إينوزين L-يسوليوكيني
L-ألانين L-ليسين
L-أرابينوز L-يسين
L-أرابيتول L-ميثيونين
L-الأسباراجين L-الأورنيثين
L اسبارتاتي L-فينيل ألانين
-L السيستئيك حمض L-البرولين
L-السيستين حمض L-بايرو-الجلوتاميك
L-فوكوسي L-سيرين. L-ثريونين
حمض الجلوتاميك-L L-تريبتوفان
L-الجلوتامين L-حمض أميني أساسي
L-يسوليوكيني N-أسيتيل-D-الجلوكوزامين
L-ليسين بوتريسين
ثيوريا
L-ميثيونين الثيميدين
L-الفنيل الأنين الثايمين
حمض L-بايرو-الجلوتاميك الثيامين
L-رامنوز التيروزين
L-سيرين يوريدين
L-صوربوز
L-ثريونين
L-تريبتوفان
L-حمض أميني أساسي
L الزيلوز-
اللاكتات
اكتولوز
مالات
ميو-إينوزيتول
حمض الأكساليك
سوربات البوتاسيوم
حمض البروبيونيك
بوتريسين
حمض الكينيك
البيروفات الصوديوم
سكسينات الصوديوم
سكر القصب
الثيميدين
إكسيليتول

الجدول 2. قائمة ركائز المستخدمة في التجارب MAP.

Discussion

هنا، نقدم النهج مظهري لتوصيف وظيفي من الجينات فج المفترضة. وتشمل تقنيات مقايسة المتقدمة قادرة على رصد المضيف الابتنائية التمثيل الغذائي، لوحات متعددة النمط الظاهري الفحص (خرائط)، بالإضافة إلى الطريقة المتبعة في الايض، قادرة على قياس التأثيرات على الأيض تقويضي. قدمنا ​​أدوات إضافية لإدارة مجموعات كبيرة من البيانات الناتجة عن هذه التكنولوجيات، مما يسمح لارتفاع تجهيز الإنتاجية وتحليل 24. وأخيرا، من خلال مقارنة مشروحة البروتين فج قفيصة، فج thioredoxin، وهما المفترضة الجينات فج التمثيل الغذائي، ومتوسط ​​استجابة التجريبية نقترح استراتيجيات مختلفة لتفسير كل من مجموعات البيانات والطبقات الجينات، مع التركيز على تحديد الاتجاهات المظهرية وتحديد القيم المتطرفة.

كما ذكر، كلا النهجين قياس كميا فقط نصف الأيض المضيف. لتفسير وظيفة النسبية لأي منبروتينات جديدة قيد التحقيق، والبيانات المطلوبة من كل وسائل لتقديم أدلة على وظيفة. في حين أن هذا ليس محور مخطوطة الحالية لدينا، يتم وضع مخرجات البيانات من كل طريقة مظهري من خلال التحليلات توفيقية التي تركز على تقنيات التجميع مثل الغابات العشوائية وتحليل المكون الرئيسي. وعلاوة على ذلك، الفرضيات الناتجة عن تحليل مجتمعة يجب التحقق من صحة وقت لاحق منهجيات الوراثية التقليدية.

أخيرا، تتأثر بشكل كبير من قبل علم وظائف الأعضاء البكتيرية وبالتالي اتباع نفس المعايير الأساليب المقدمة. عند القيام إما الأسلوب، تحتاج الاعتبارات التي يتعين بذلها لضمان، وجربت مع مجموعة نسيلي مستقلة. يتم منع التلوث. ويجري اختبار متغير واحد. ويجري ركض الضوابط المناسبة في وقت واحد. وفشل لحساب هذه النقاط يؤدي إلى نتائج غير واضحة، على غرار أي فحص الفسيولوجية.

متعددة النمط الظاهري لوحات الفحص(خرائط)

وضع خرائط توفر إنتاجية عالية وفحص قدرة على التكيف بالمقارنة مع التكنولوجيات المتوفرة حاليا (الشكل 5A والجداول 1،2). يستخدم فحص اللوازم والمعدات والتقنيات الأساسية متوفرة في جميع مختبرات الأحياء المجهرية. إدراج خط أنابيب الحسابية، PMAnalyzer 24، لمعالجة البيانات وتحليلها لاحقا يضمن تفسير البيانات السريع. بالإضافة إلى ذلك، على حد سواء الجوانب التجريبية والتحليلية للنهج يمكن تعديلها بسهولة أو ضبطها لأغراض مخصصة. على سبيل المثال، إذا فشل نسبة كبيرة من البيانات لتمرير الترشيح الواردة في الباب 4، يمكن للمرء أن تدقيق يدويا من خلال منحنيات النمو لتحديد القضايا. إذا المشكلة تنشأ بسبب المعلمات تصفية صارمة، ويمكن إجراء تعديلات على السيناريو. بدلا من ذلك، إذا ترتبط مشاكل مع عملية التجريبية (أي التكثيف لفترات طويلة؛ وتحويل غير لائق من سل البكتيريةليرة سورية، وما إلى ذلك) ثم مكررات إضافية يمكن أن تتكرر بسهولة.

كما هو موضح في كويفاس وآخرون 24، PMAnalyzer هو برنامج باش واحد كما هو مكتوب نصي المجمع الذي ينفذ تحليل وتحليل النصوص بمثابة خط أنابيب متماسك الآلي. جميع النصوص يمكن الوصول إليها بحرية من بوابة مستودع في 25 بأخذ القيمة الوسطية لكل نقطة زمنية عبر البيانات ثلاث نسخ، وparameterizes في وقت لاحق منحنى اللوجستي للحصول على الوقت الضائع، ومعدل النمو الأقصى، الخط المقارب، ومصطلح الرواية، ومستوى النمو. وقد تم اختيار قيمة متوسط ​​فوق المتوسط ​​في دراستنا للحد من تأثير القيم المتطرفة الكبيرة، ومع ذلك، فإن السيناريو يمكن أن تتكيف بسهولة لحساب متوسط ​​البيانات تكرار. نظرا لانخفاض التباين (SE) ينظر عبر البيانات تكرار (الشكل 2A) حافظنا على استخدام المتوسط ​​في PMAnalyzer لتركيب منحنى اللوجستي. بالإضافة إلى ذلك، قطع للنمو في هذه الدراسة (GL ≥ 0.4) كان DETErmined بمقارنة كيفية فصل البيانات عبر مستوى النمو ومعدل النمو الأقصى (الشكل 1A، B). اعتمادا على نظام الصكوك والنموذج المستخدم قد تختلف هذه المدة، الأمر الذي يتطلب إعادة تعريف هذه بقطع القيمة.

والميزة الرئيسية لفحص لدينا القدرة على المقارنة بين الظواهر باستخدام معلمة واحدة تميز نمو الجراثيم العام، وهو ما نعرفه مستوى النمو (GL). GL هو الوسط التوافقي، وبالتالي يخفف من آثار القيم المتطرفة الكبيرة في البيانات. استخدام الوسط التوافقي مع القيم المجهزة لوجستية تحول لتوفير ووصل ملخص للنمو في خلال التجربة والخطأ. حاولت وسائل أخرى للتمييز وتضمن النمو: الوقت الذي استغرقته للوصول إلى معايير محددة منحنى (μ نصف كحد أقصى، μ كحد أقصى، والقدرة على التحمل)، ومعامل التحديد (R 2)، ومجموعات من R 2 مضروبا المعلمات منحنى محددة. باستخدام الوسط التوافقي مع تحولقدمت القيم اللوجستي مناسبا لGL أكبر مجموعة في تقييم النمو، وبالتالي فإنه أصبح الأسلوب المفضل. نظر احد هو أن نلاحظ أن دينامية أنماط منحنى النمو لديها القدرة للضياع عند استخدام معلمة واحدة أو نموذج المجهزة. على سبيل المثال، المعلمات منحنى الفردية المنحنى اللوجستي وGL عاجزة عن ما يمثل نموا ثنائي الطور. في بيئة واحدة من الكربون، وهذا أثر على النمو يعني وساطة من البروتين الفيروسي على أي تحويل الركيزة أو التحول في استخدام الركيزة. آثار إضافية محتملة فقدت عندما لا تفكر المعلمات نمو متعددة وتشمل: المطول الوقت الضائع، واقتراح زيادة العبء على الآلات والمنتجات الفيروسية. تسريع بسرعة المرحلة الأسية، مما يشير إلى البروتينات الفيروسية بالإضافة إلى استضافة مسارات إنتاج الطاقة؛ المستويات أو أعلى من تشكيل الكتلة الحيوية، مما يعني دعم الفيروسي في امتصاص المواد الغذائية المضيفة وتحريض استقلاب (لا تظهر البيانات). وبالتالي، بالتآمر منحنيات النمو الوليدة (

عند النظر في استجابات مختلفة ساهم الجينات الهيكلية والتمثيل الغذائي في الخرائط، لوحظ أن فصول الركيزة مختلفة في مسألة توفير أكبر دليل على وظيفة البروتين. على سبيل المثال، غالبا ما ترتبط بروتينات الأيض مع اكتساب الحد من المواد الغذائية، والتي هي غير محددة لاستضافة المركزي 16،32 الأيض. تكشف التجارب MAP الأولية أن الحيوانات المستنسخة إيواء المفترضة الجينات فج الأيض لديها مرحلة متخلفة زيادة عندما نمت على مصادر الأيض الكربون المركزية (الشكل 2A). على العكس، استنساخ تحمل الجينات الهيكلية المفترضة، والتي تتطلب نسب كبيرة من أحواض الطاقة المضيفة وdNTP، يؤدي إلى استجابة إيجابية كاذبة على نمو المائةركائز عملية التمثيل الغذائي الكربون راؤول والأحماض الأمينية. هذا هو الأرجح بسبب تراكم البروتينات غير قابلة للذوبان مما أدى إلى filamentation المضيف و / أو هيئات إدراج، كما لوحظ من خلال الفحص المجهري (الشكل 2A و لا تظهر البيانات). في حين أن المطلوب مزيد من التحليل للتحقق من صحة هذه النتائج الأولية، والخرائط قادرة على استرجاع الردود المظهرية التي ترتبط إلى الافتراض ظائف الطبقات فج جين معين.

بالإضافة إلى توضيح من البروتينات الفيروسية مجهولة، والخرائط مورد رواية للتحقيق في التنوع الوظيفي والتمثيل الغذائي للبكتيريا فرد أو جماعة من البكتيريا. تم تصميم مكونات خطة لتغيير السهل لدعم نمو مجموعة واسعة من البكتيريا. بما في ذلك الميكروبات اللاهوائية البحرية والعوز الغذائي، و. لتسهيل هذه الجهود القاعدية وقبل نمو وسائل الاعلام محددة تتطلب الأنواع الكيميائية إضافية أو تعديلها قبل أن تتمكن من دعم جنس البكتيرية المختلفة في الخرائط.ملاحظة واحدة في هذا الاستخدام للخرائط هو الحفاظ على وسائل الاعلام محددة، حظر استخدام مكونات مثل تريبتون، خلاصة الخميرة والبيبتون.

الايض

مجال الايض يعتمد على قواعد بيانات الأيض، والتي تشمل نواتج معزولة التي حددها مطياف الكتلة. مرفق الأساسية المختارة هنا لديه واحدة من أكبر قواعد البيانات الايض. ومن المثير للاهتمام، كان أكثر من نصف الأيضية الناتجة عن التجريب لدينا هويته (~ 65٪)، في حين أن آخرين لم يسبق أن سجلت في مضيفنا، الإشريكية القولونية (تشمل الأمثلة على ذلك: إندول حمض الخليك 3 33، حمض الصفصاف 34، وحمض dihydroabietic 35). ويمكن أن يعزى هذا الواقع إلى أي تحيز قوي من قاعدة البيانات نحو الأيض النباتية، أو بروتينات معينة قيد التحقيق. بغض النظر، والنتيجة هي عدد محدود من المركبات المعروفة المتاحة لتمثيل البيانات وتحليلها. في فوتلح، فإن الوسائل الايض متعددة باستخدام قواعد بيانات مختلفة تسمح لتغطية أكبر الأيض.

في الوقت الحاضر، معروفة وتستخدم نواتج غير معروفة عند مقارنة والمتناقضة لدينا البروتينات الفيروسية الجديدة على حد سواء. باستخدام هذا النهج، ونحن نفترض أن الحيوانات المستنسخة إيواء بروتينات مماثلة وظيفيا وتبادل تشابه زيادة في التعريف metabolomic التام عليها. وكشف تحليل الايض الأولي أنه في حين أن الجينات الهيكلية والتمثيل الغذائي لا تفصل بوضوح عن بعضها البعض، تلك الجينات نستعرض آثار مماثلة على المضيف عندما overexpressed لا ربط (الشكل 6). على سبيل المثال، مجموعات الجينات قفيصة مشروحة بشكل وثيق مع جينات الأيض المفترضة سلط عليها الضوء في هذه الدراسة، EDT2440 وEDT2441. وأظهرت التحقيقات باستخدام طوبولوجيا الغشاء وإشارة الببتيد البرنامج مؤشرا للجمهور دليل على أن كل من جينات الأيض المفترضة تؤوي مجال الغشاء واحد. ومن المثير للاهتمام 5 من أصل عشروتوقع ه 9 الحيوانات المستنسخة في نظام المجموعة الأولى (الأكثر ترك جزء من dendrogram) المجالات عبر الغشاء باستخدام برنامج طوبولوجيا نفسه. وهناك حاجة إلى مزيد من التحقيقات، ومع ذلك، فمن المرجح أن الأيض الحالية خلال overexpression من هذه الحيوانات المستنسخة ترتبط مع الاستجابة للضغط النفسي الخلوية الناتجة عن غشاء أو أعباء الهيكلية. هذا دليل يدعم ذلك في حين أن البيانات الايض يملك زيادة كمية الضجيج، فإن هذه الطريقة قادرة على تسليط الضوء على الإشارات التي تميز الآثار العامة من الجينات، داخل وعبر فئة الجينات على حد سواء. لتحديد ما إذا كان أسلوب قادر على استخراج أية معلومات محددة وظيفة الجين، تم تجميع نواتج الأيض في المسارات الأيضية محددة. الفرضية يكون، إن استنساخ يؤثر نواتج محددة لمسار واحد، ثم الجين overexpressed نشط في هذا الطريق. قبل إنشاء خط أنابيب لضمان الجودة الايض لدينا، وكشفت البيانات الأولية إلى أن أكثر منوكانت الأيض ممثلة تمثيلا ناقصا د عادة "غير معروف"، وتوفير معلومات قليلة عن مسارات فإنها ترتبط مع (لا تظهر البيانات). البيانات الايض Preprocessed، ومع ذلك، تبين أن اغلبية من لمحات الأيض متشابهة وفقط عدد مختار من وفرة الأيض غير معروفة ومعروف تختلف باختلاف الحيوانات المستنسخة، على سبيل المثال بوتريسين واليوراسيل (الشكل 6). لتوفير قدر أكبر من الدقة من جهود وظيفة البروتين تبذل لمقارنة بالتجربة الجينات فج جديدة ضد الجينات فج المعروفة، والتي يمكن استخدامها لملء في "الثقوب" من المستقلب أساس توصيف وظيفي. باستخدام هذه التقنية، الوظيفة المعينة من الجينات الفيروسية المعروفة توفر مرجعا لوظيفة الجينات مجهولة. ومع ذلك، فإن العوامل التي تحد من تحليل metabolomic هو حجم وأهمية قاعدة البيانات. لتصحيح هذه القيود، وقواعد البيانات metabolomic relatable لهذا البحث تحتاج إلى وضعها؛ مثلكقاعدة بيانات الأيض وفرة المحددة لجمع ASKA من E. استنساخ القولونية التي هى overexpressed على ORF واحد 36. وقدمت دليلا على الحاجة إلى قواعد البيانات هذه في عام 2013 عندما الباحثين في مختبر بيركلي الوطني ورنس تجميع أول قاعدة بيانات شاملة للنواتج محددة للمكتبات متحولة كاملة من البكتيريا نموذج 37. قدم هذا البحث رؤية جديدة في الجينات اللازمة لاستخدام نواتج محددة، وكشف عن صلة واضحة بين النمط الظاهري والتركيب الوراثي.

عند النظر الايض كأداة، فمن المهم أن تحدد اتباع نظام المعالجة في منشأة الأساسية. قطعة أثرية من معظم الإجراءات التجريبية هي التباين يوما بعد يوم المرتبطة صكوك الاستخدام. حتى الآن كل تحليل GC-MS بتطبيق استخدام المعايير الداخلية التي تم تضمينها في كل شوط التحليلي. ومع ذلك، بالإضافة إلى عينات الداخلية الخاصة بالمشروع </ م> ركض كل يوم من التجريب يزيل التباين إضافية. يجب أن تعالج هذه الاعتبارات في وقت مبكر لتفادي مشاكل التطبيع والتحيز. حل آخر هو لمعالجة جميع العينات في منشأة الأساسية على نفس الجهاز وكما دفعة واحدة، وهو خيار متاح في أي مرفق الأساسية.

ومختلف الأدوات التي أدخلت على حد سواء وإعادة استكشافها في هذه المخطوطة تقديم رواية تعني أن يحجب وتوصيف الجينات فج غير معروفة وظيفيا. البساطة والقدرة على التكيف من أساليب فنية تجريبية مع استخدام تبسيط خطوط الأنابيب الحسابية تؤكد هذه الأساليب هي التي تنطبق على مجموعة واسعة من الأنشطة البحثية والمجالات. هدفنا هو أن النهج مظهري المقدمة هنا سوف تساعد مزيد من التحقيقات من البروتينات فج جديدة بالإضافة إلى الأنظمة التي هي على حد سواء غير معروف وظيفيا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Sterivex Filter Fisher Scientific SVGP01050 Millipore
0.22 µm Millex Filters Fisher Scientific SLGV033RS Millipore
0.22 µm SteriCap Filter Fisher Scientific SCGPS02RE Millipore
0.22 µm Omnipore membrane filters Millipore JHWP02500 Millipore
96-well micro-titer plates VWR 82050-764 Standard F-Bottom 96 well Microplates
2 ml 96-well plate Fisher Scientific
Adhesive seal plate film Sigma-Aldrich Z369667
2 L Nalgene square bottles Cole Parmer T-06040-70
125 ml Nalgene square bottles Cole Parmer T-06040-50
1/4 in. Panel mount lock nut, black nylon Cole Parmer EW-45509-04
Female Luer thread style panel mount to 200 Series Barb, 1/16 in. Cole Parmer EW-45500-30
Female Luer thread style panel mount to 200 series barb, 1/8 in. Cole Parmer EW-45500-34
Male Luer integral lock ring to 500 series barb, 1/16 in. ID tubing Cole Parmer EW-45505-31
Male Luer with lock ring x female Luer coupler Cole Parmer T-45508-80
Barbed bulkhead fittings, 1/4 in. OD Fisher Scientific 6149-0002
Sanipure tubing, 1/16 in. ID x 1/8 in. OD SaniPure AR400002
Sanipure tubing, 1/4 in. OD x 1/8 in. ID SaniPure AR400007
Variable flow mini pump (peristaltic pump) Fisher Scientific 13-876-1
Magnetic stirrer Velp Scientifica F203A0160
Forceps Fisher Scientific 14-512-141 Millipore* Filter Forceps
Multi-plate spectrophotometer plate reader Molecular Devices Analyst GT
Filter manifold Fisher Scientific XX10 025 02
Software:
Python version 2.7.5 http://www.python.org/
PyLab module http://wiki.scipy.org/PyLab
R version 3.0.1 http://www.r-project.org/
reshape2 library http://had.co.nz/reshape
ggplot2 library http://ggplot2.org/
Gene Composer PSI Tech Portal http://www.genecomposer.net
Services:
West Coast Metabolomics Center UC Davis http://metabolomics.ucdavis.edu
DNA 2.0 https://www.dna20.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wommack, K. E., Colwell, R. R. Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, (1), 69-114 (2000).
  2. Hendrix, R. W. Recoding in Bacteriophages. Recoding: Expansion of decoding rules enriches gene expression. 24, 249-258 (2010).
  3. Breitbart, M., et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, (22), 14250-14255 (2002).
  4. Breitbart, M., et al. Diversity and population structure of a near-shore marine-sediment viral community. Proceedings. Biological sciences / The Royal Society. 271, (1539), 565-574 (2004).
  5. Dinsdale, E. A., et al. Functional metagenomic profiling of nine biomes. Nature. 452, (7187), 629-632 (2008).
  6. Vega Thurber, R. L., et al. Metagenomic analysis indicates that stressors induce production of herpes-like viruses in the coral Porites compressa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (47), 18413-18418 (2008).
  7. Pedulla, M. L., et al. Origins of highly mosaic mycobacteriophage genomes. Cell. 113, (2), 171-182 (2003).
  8. Calendar, R., Abedon, S. T. The bacteriophages. Oxford Univeresity Press. (2006).
  9. Breitbart, M., Miyake, J. H., Rohwer, F. Global distribution of nearly identical phage-encoded DNA sequences. FEMS microbiology letters. 236, (2), 249-256 (2004).
  10. Klenk, H. -P., Palm, P., Zillig, W. DNA-Dependent RNA Polymerases as Phylogenetic Marker Molecules. Systematic and Applied Microbiology. 16, (4), 638-647 (1993).
  11. Breitbart, M., Thompson, L., Suttle, C., Sullivan, M. Exploring the Vast Diversity of Marine Viruses. Oceanography. 20, (2), 135-139 (2007).
  12. Mann, N. H., Cook, A., Millard, A., Bailey, S., Clokie, M. Marine ecosystems: bacterial photosynthesis genes in a virus. Nature. 424, (6950), 741 (2003).
  13. Mann, N. H., et al. The genome of S-PM2, a “photosynthetic” T4-type bacteriophage that infects marine Synechococcus strains. Journal of bacteriology. 187, (9), 3188-3200 (2005).
  14. Lindell, D., et al. Transfer of photosynthesis genes to and from Prochlorococcus viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, (30), 11013-11018 (2004).
  15. Millard, A., Clokie, M. R. J., Shub, D. A., Mann, N. H. Genetic organization of the psbAD region in phages infecting marine Synechococcus strains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, (30), 11007-11012 (2004).
  16. Sullivan, M. B., Coleman, M. L., Weigele, P., Rohwer, F., Chisholm, S. W. Three Prochlorococcus cyanophage genomes: signature features and ecological interpretations. PLoS biology. 3, (5), e144 (2005).
  17. Rohwer, F., et al. The complete genomic sequence of the marine phage Roseophage SIOI shares homology with nonmarine phages. Limnology and Oceanography. 45, (2), 408-418 (2000).
  18. Miller, E. S., et al. Complete genome sequence of the broad-host-range vibriophage KVP40: comparative genomics of a T4-related bacteriophage. Journal of bacteriology. 185, (17), 5220-5233 (2003).
  19. Thompson, L. R., et al. Phage auxiliary metabolic genes and the redirection of cyanobacterial host carbon metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (39), E757-E764 (2011).
  20. Paterson, S., et al. Antagonistic coevolution accelerates molecular evolution. Nature. 464, (7286), 275-278 (2010).
  21. Seguritan, V., et al. Artificial neural networks trained to detect viral and phage structural proteins. PLoS computational biology. 8, (8), e1002657 (2012).
  22. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture Medium for Enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119, (3), 736-747 (1974).
  23. Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. Homogeneous expression of the P(BAD) promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter. Microbiology (Reading, England). 147, (Pt 2), 3241-3247 (2001).
  24. Cuevas, D. A., et al. Elucidating genomic gaps using phenotypic profiles. F1000Research. (2014).
  25. Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van’t Riet, K. Modeling of the bacterial growth curve. Applied and environmental microbiology. 56, (6), 1875-1881 (1990).
  26. Venables, W. N., Smith, D. M. An introduction to R. Available from: http://cran.r-project.org/doc/manuals/R-intro.pdf (2014).
  27. Schmieder, R., Lim, Y. W., Rohwer, F., Edwards, R. TagCleaner: Identification and removal of tag sequences from genomic and metagenomic datasets. BMC bioinformatics. 11, 341 (2010).
  28. Schmieder, R., Edwards, R. Quality control and preprocessing of metagenomic datasets. Bioinformatics (Oxford, England). 27, (6), 863-864 (2011).
  29. Schmieder, R., Edwards, R. Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets. PloS One. 6, (3), e17288 (2011).
  30. Welch, M., et al. Design parameters to control synthetic gene expression in Escherichia coli. PloS One. 4, (9), e7002 (2009).
  31. Fiehn, O., et al. Quality control for plant metabolomics: reporting MSI-compliant studies. The Plant journal: for cell and molecular biology. 53, (4), 691-704 (2008).
  32. Zeng, Q., Chisholm, S. W. Marine viruses exploit their host’s two-component regulatory system in response to resource limitation. Current biology: CB. 22, (2), 124-128 (2012).
  33. Shindy, W. W., Smith, O. E. Identification of plant hormones from cotton ovules. Plant physiology. 55, (3), 550-554 (1975).
  34. Lee, H. I., Leon, J., Raskin, I. Biosynthesis and metabolism of salicylic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, (10), 4076-4079 (1995).
  35. Chappell, J. The Biochemistry and Molecular Biology of Isoprenoid Metabolism. Plant Physiology. 107, (1), 1-6 (1995).
  36. Kitagawa, M., et al. Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (a complete set of E. coli K-12 ORF archive): unique resources for biological research. DNA research: an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 12, (5), 291-299 (2005).
  37. Baran, R., et al. Metabolic footprinting of mutant libraries to map metabolite utilization to genotype. ACS chemical biology. 8, (1), 189-199 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics