为远程沉默的神经活动在鼠害的方法在学习独立的阶段

Behavior

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Robinson, S., Adelman, J. S. A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning. J. Vis. Exp. (100), e52859, doi:10.3791/52859 (2015).

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Abstract

这个协议描述如何暂时和远程沉默神经元活动中的离散的大脑区域,而动物从事学习和记忆任务。该方法结合了药物遗传学(设计 - 受体 - 独占激活的逐设计-用药)与行为范式(感官预处理),其被设计不同形式的学习的区别开来。具体地,病毒介导的递送是用来表达基因修饰抑制G-蛋白偶联受体(设计器受体)插入在啮齿动物的离散大脑区域。三周后,当设计师受体表达水平是高的,药理剂(在设计药物)的全身给药30分钟之前,一个特定的行为会话。该药具有设计师受体的亲和力,从而导致抑制表达设计师受体神经元,但在其他生物惰性。该大脑区域保持沉默2-5小时(depen鼎上的剂量和给药途径)。在行为模式完成后,脑组织被评估正确的位置和受体的表达。这种方法是用于确定个体的大脑区域,以行为的特定组件的贡献,并且可以跨越任何数量的行为范例的使用是特别有用的。

Introduction

行为神经科学领域内一个令人兴奋的挑战是确定复杂行为的神经基础。许多如永久性病变,通过套管植入大脑暂时失活和光遗传学技术已经被用来确定离散的大脑区域的贡献了复杂行为的子组件。虽然在学习这些方法告知我们的区域特殊性的理解,每种技术也不是没有限制的。具体地讲,永久病灶通常进行前行为测试,因此它们的作用是在整个范例的持续时间存在。插管研究涉及一个短期神经灭活剂( 例如,河豚毒素)的呈现可以产生于脑组织实质损害,并且可以刚好在行为测试诱导应力的受试者。此外,通过插管灭活限于组织围绕的区域尖端的插管。最后,虽然光遗传学提供了一系列的灵活性可满足特定的大脑区域活动的时间控制,它是成本过高,技术要求高。

这些限制可以使用药理学方法(设计-受体独占激活的按设计药物,DREADDs)1,2有待克服。重要的是,而药物基因学的概念是复杂的,该技术的执行是简单的。类似于涉及输液毒素( 例如,NMDA,鹅膏蕈氨酸)转换成离散的大脑区域,这种技术涉及输注腺相关病毒(AAV),其中包含的DNA片段进行修饰抑制G蛋白偶联型受体的传统立体手术方法(hM4Di;设计者受体)进入的标准实验室啮齿类感兴趣的区域( 见图1)。所述病毒载体还含有荧光报道(mcitrine)。一旦合并到细胞中,设计者受体(和报告蛋白)的最大限度表达〜后3周输注和2-5小时由否则生物学惰性设计者药物的全身给药,氯氮平-N-氧化物可以被选择性地激活(CNO)1 3。因为实验者被赋予了超过在特定脑区域的神经活动的精确的,但遥控临时控制,药物遗传学结合特别好地与在多个阶段进行的行为范式。在这个例子中,retrosplenial皮质(RSC)的贡献对刺激刺激学习相比,其在巴甫洛夫学习的作用,然而办法这种组合非常适合于设法确定脑区如何具体向任意数量的问题复杂的行为。

此外,虽然在本协议中没有描述,病毒和转基因的方法可以用来实现细胞类型特异性DREADD表达式2。正如我固有在涉及药理学和/或其它类型的实验操作,仔细考虑的实验设计和随后的定量分析的行为范例是采用DREADD方法时需要。实验者新来的DREADD方法被称为当前DREADD 2技术的全面审查。

每一天,生物体了解新的刺激和事件以及它们彼此之间的关系。甚至在熟悉的环境,如家庭,一种是快速的以检测更改在刺激之间的关系,因为这些变化可能是预测有意义的事件。这种刺激的刺激( 即,关系)学习涉及多种刺激的互联以及历来与海马,其中心位于内侧颞叶4内相关联。但是,海马并不存在,也没有采取行动,孤立;内和出皮层区域颞叶内侧的一边提供关键的感官信息的海马结构5-7。传统的永久损伤研究提供了令人信服的证据的一个数字皮层区域( 例如,retrosplenial,postrhinal和内嗅皮质)中的海马依赖性学习的参与,但在其过程中的离散的阶段辨别一个特定区域的作用的能力是有限的学习8-10。

本协议测试的假设,即在RSC是必要的刺激-刺激的学习期间通过一个3相感官预处理范例11,12的单相沉默在RSC。简而言之,大鼠收到包含设计者受体和〜3周后施用设计者药物(CNO)30前行为测试开始分钟的AAV的输注。在本协议中,实验组大鼠在测试过程中的第一阶段(当刺激刺激李尔收到CNO宁发生),他们在接下来的2阶段测试接收车辆。为了控制CNO对行为的影响意外,注入老鼠与设计师受体(hM4Di),并注入一些车辆,而不是CNO。考虑到病毒输注和受体表达的一般效果,注入一个对照病毒不包含设计者受体和管理CNO。

许多AAV的不同血清型的用于输送遗传物质。研究涉及重组或合成的分子的当前的NIH指导方针主张的AAV(所有血清型)和重组的或合成的AAV构建体,其中所述转基因不编码任一种潜在的致瘤基因产物或毒素分子,并且产生在没有一辅助病毒,需要BSL-1的预防措施(附录B-1。风险组1(RG1)代理)13。可用14,15一些有关AAV结构,实用性和安全审查的。值得注意的是,虽然时,由于有关在啮齿动物可能生殖16,17和潜在的致癌机制18-20关注,一些机构要求使用的BSL-2的预防措施的AAV工作时。验证通过与地方研究会进行,疾病控制中心和美国国立卫生研究院准则研究使用病毒载体的基因操作在美国时涉及重组DNA分子13的监督委员会,在个别机构咨询,使用前适当的BSL。个人防护,调查培训,矢量遏制,净化,消毒处理的材料,以及注射后的动物住房需求是由这些原则规定。此外,参阅并遵循适当的机构动物护理和使用委员会的准则或同等机构的监督委员会的指导方针,以确保安全处理,管理和处置的AAV。

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Protocol

利用动物的奥伯林学院机构动物护理批准和使用委员会,并按照实验动物21与指南护理和使用。

1.准备输液病毒

注:该协议使用BSL-1的预防措施。当采用BSL-2的预防措施,一次性白大褂,手套,鞋套,保护眼睛和防护口罩(N95型)是必需的。所有个人处理BSL-2化合物必须符合由当地公共卫生机构测试的微粒呼吸器。请参阅洛厄&Majewska(2010)22对处理和储存病毒载体的其他详细信息。

  1. 当第一次使用,分装和储存未使用的病毒在20微升离心管,以避免反复冻融。
  2. 通过去除任何不必要的对象和灭菌的表面用70%的乙醇制备的工作表面上。准备1用于净化废AAV 0%的漂白粉溶液。放置一个完整的漂白溶液和无菌的10微升注射器到工作表面的烧杯中。将离心管中设置了与碎冰容器的AAV。
  3. 将离心管中的病毒变成一个标准的台虎钳。装载10微升注射器至少4微升的AAV。小心不要装载期间弯曲对微量离心管底部的注射器的尖端。确保没有气泡在4微升在注射器的AAV溶液。
  4. 在含有10%的漂白剂的烧杯处置空病毒管。存储病毒的未使用的部分所指定的供应商。
  5. 添加额外的10%的漂白粉到废液容器,并允许废物处置净化废液前坐了30分钟。
  6. 在生物危害容器处理所有的防护设备和塑料废弃物的指示机构的指导方针。德科ntaminate中随附用10%漂白粉病毒接触的任何设备或表面。

2.手术

  1. 通过立体定位仪下,并在指定为专用的病毒处理区相邻的空间放置吸水纸板凳,准备手术区。
    1. 放置一个10%的漂白剂废物容器中的手术装置附近的专用的病毒处理区。
  2. 诱导麻醉一个稳定的水平,并准备大鼠进行手术。
    1. 将鼠到包含异氟醚气(1〜3%范围内)和氧(100%,在大约1升/分钟)的混合物中,直到有意识和缺乏目的运动总值的损失感应腔室。维持异氟烷麻醉整个手术过程中。
    2. 经过6个深麻醉达到,刮老鼠从眼睛之间略有耳朵后面。
    3. 将大鼠放回感应腔,用于一个另外1-3分钟。
    4. 确保异氟烷麻醉系统连接到立体定位手术的鼻锥。打开对异氟烷油管旋塞阀开始异氟醚的stereotax流动。维持异氟烷和氧气在高于规定的电平。
    5. 由固定到嘴咬栏和固定耳棒放置在立体定向仪的老鼠。
    6. 敷眼润滑剂对眼睛和优碘到前切口手术部位。
  3. 使头骨的背表面皮肤的2.4厘米正中切口起约2毫米尾鳍的眼睛。收回的皮肤暴露颅骨。周期性地灌输在手术部位的边缘无菌的0.9%的无菌盐水以防止干燥组织。
  4. 从头骨直到前囟和lambda清晰膜组织都清晰可见。
  5. 确保头骨水平在测量背腹坐标前囟门和拉姆达。调整立体设备相应地,直到前囟和lambda背腹坐标差异不超过0.04毫米。
  6. 此时,减少异氟烷气体之间2和2.5%。
  7. 返回钻前囟门,重新调零坐标,然后钻移动到所需的内侧,外侧和前后坐标。
  8. 钻一个孔在协调使用0.9毫米钻头,因为它会产生一个28克注射针筒适当大小的洞。
  9. 设置输液泵以0.2微升/分的速率递送病毒。将注射器插入立体装置的输液臂和降低注射器成所需坐标。递送病毒的所需量(范围0.1〜0.8微升)。例如,递送0.8微升的AAV在4分钟。
    注:开展试点研究,以确定理想的输液量和病毒在每个关心区域的典型传播。
    1. 后病毒的递送是共mplete离开注射器到位10分钟,以防止回流进入针道。慢慢提升注射器以约5毫米/分钟的速率。重复,直到所有的坐标都被注入AAV。
  10. 关闭使用手术钉和大衣搭配外用抗生素软膏伤口创面。
  11. 遵循手术后的疼痛管理机构的指导方针。
  12. 将老鼠与床上用品,盖和适当的标牌笼子里的老鼠恢复到动物设施。
    1. 的时间由机构指定的指导方针的金额(通常为48-72小时),如果在BSL-2注意事项工作,收集的床上用品。将被褥成生物危险废物的容器。
    2. 所指定的为他们的安全处置规定进行处置所有AAV污染的材料。

3.行为仪器

注:感觉预处理装置由一个标准的操作性条件反射湛误码率(12“长x 9.5”宽×11.5“高)用不锈钢格栅地板,2有机玻璃侧壁和2金属壁。

  1. 当在2赫兹闪过安装在铝幕墙作为光房子之一,作为视觉刺激2.8紫外线光。安装扬声器的室提供的听觉刺激(10秒1500赫兹,78分贝纯音和10秒78分贝白噪声)。
    1. 使用食品料斗提供45毫克的食物颗粒进入食品杯。内的食物杯中,红外光电检测在食品杯花之前,期间和刺激和食物奖励的介绍后的总时间。
    2. 房子配备排风扇声音衰减柜室(22“宽x 22”高x 16“D)(〜68 dB为单位)。
    3. 使用PC计算机与地中海Associates的软件来控制操作性室和获取数据。在空调的会议,收集PRESENTA期间用头花费在食品杯的总时间数据灰光刺激(5秒纪元)和呈现的食物奖励(5秒纪元)的过程中。在测试会话,收集上花费在食物杯中响应于听觉刺激的演示的总时间(10秒时期开始时的听觉刺激终止)数据。

感官预处理范式4.概述

  1. 从手术中恢复之后,逐渐限制食物的老鼠,以他们的自由喂养体重的85%。一个适当限食范式请教兽医人员。
    注意:3相感官预处理范例示于图2。
  2. 预处理会议(第1阶段;每日64分钟的培训课程跨连续4天进行的):
    1. 目前大鼠12混合试验是由交付听觉和视觉刺激。包括审间的间隔,每一个平均后4.5分钟(范围4.0〜5.0分钟)uditory演示。
    2. 6试验,目前音(预条件刺激)为10秒,随后立即闪烁光刺激的一个5秒的介绍。
    3. 另外6项研究,提出了白噪声(配对的刺激)单独,持续10秒。
  3. 空调会议(第2阶段;跨连续5天每天进行64分钟的培训课程):
    1. 本大鼠8试验,它由输送视觉刺激(闪烁光刺激)为5秒的紧接着输送两个45毫克的食物颗粒。包括审间的间隔,每个审判后平均7分钟(范围6.0〜8.0分钟)。只偶尔需要超过5调理会话学习清淡的食物关联。
  4. 测试会议(第3阶段;一个78分钟的会话):
    1. 呈现大鼠12混合试验,它由输送单独的听觉刺激。包括AVE审间的间隔愤怒4.5分钟(范围4.0〜5.0分钟)每听演讲后。
    2. 6审判,呈现音刺激(预条件刺激)单独,持续10秒。
    3. 另外6项研究,提出了白噪声(未成对刺激)单独,持续10秒。
  5. 通过完成学习与第二组接收白噪声作为预处理刺激和乐音作为未成刺激大鼠抵消刺激。

5.药物和行为过程

  1. 打开电源的行为的装置和装载MED-PC的代码为适当的行为会话。电线和程序行为装置,使得被安装在声音衰减机柜风扇打开时,接通电源上。
  2. 以制备1mg / ml的溶液氯氮平N-氧化物(CNO)的,称重5.0毫克CNO的入15ml锥形管中并加入5毫升无菌0.9%萨利的无菌水或5毫升NE。涡旋直至溶液澄清。
    1. 如果CNO不溶解成溶液,或者如果CNO的更浓缩的溶液根据需要添加增溶剂,如DMSO 23。具体而言,以制备1mg / ml的溶液CNO的,用0.5%的DMSO,称量5.0毫克CNO,并添加25微升DMSO中至15ml锥形管中。轻弹轻轻确保内容保持在该管的基极。当溶液变得清晰,加入5毫升无菌水或5毫升无菌0.9%盐水中。可用的DREADD wiki资源第25页准备CNO的解决方案进一步的说明。
    2. 它给予每天准备一个新的CNO的解决方案。
  3. 注入CNO腹膜内以1mg / kg的剂量约30分钟前行为测试。例如,注入一个200克大鼠用0.2ml的1mg / ml的CNO溶液。 CNO给药的剂量和时间过程基于先前发表的报告2,12被选定。
    1. 之前注入到每个会话预处理CNO 30分钟(第一阶段,共4天注射),但事先管理该车辆的所有后续行为会话。
  4. 30分钟后,将大鼠放入行为测试室,并启动了适当的行为会话的计算机代码。
  5. 一旦该行为的任务完成后,立即从室的老鼠,并返回给大鼠动物殖民地。

6.分析行为数据

注:所有的行为会因变量是的时间量的老鼠的头部是食品杯内由食品杯红外光电中断的检测。 (在秒)的数据收集,并记录由计算机软件。

  1. 不进行分析了在预处理阶段产生的数据。
  2. 对于空调的会议:分析每一个大鼠的一通过相容性陈述横跨5届行为的视觉刺激的过程中比较的食用杯行为学光食品协会。具体而言,计算5秒光划时代的每个8试验/会议期间在食品杯花费的平均时间( 即,平均8试验每组是5秒的持续时间/大鼠)。比较平均控制值与实验值的每5日常会话( 见图3A)。
    1. 分析老鼠的动机通过交付该食物奖励(5秒时代)跨越使用相同的计算上面指定的5秒光划时代的5届的行为过程中比较的食用杯的行为来获得食物奖励。这些值会比介绍的视觉刺激的期间获得始终如一更高(参见图3B)。
  3. 对于测试会话:计算判别比描述为响应PRES老鼠的食物一杯行为每一个听觉刺激entations。
    1. 具体而言,对于每只大鼠分为以下各6演示的感官刺激预处理( 即,在音)通过在食品杯平均花费的时间总和在食品杯平均花费的时间在每次的6演示的感官刺激预处理( 刺激音)加在食品杯花费的总时间以下每6演示未成对刺激( 白噪声刺激)的平均水平。每个时期是10秒的持续时间。
      注意:0.5或以上的判别得分表明大鼠学习固有的感官预处理范例的关联。

7.验证AAV安置和表达

  1. 麻醉和灌注transcardially用4%多聚甲醛的作用。由于使用的荧光标记,不超过2小时的后固定时间最小imize损失抗原性,并保持了荧光信号。
  2. 通过将它们插入含有对于至少2天,或直至大脑下沉到脑罐的底部将30ml在磷酸盐缓冲盐水(1×)20%的蔗糖溶液中的脑罐脱水灌注大脑。
  3. 使用冷冻切片机滑动到整个感兴趣区域的整个rostrocaudal程度使冠状脑切片(20-40微米)。
  4. 进行免疫组织化学针对标记受体或报告蛋白,以确定设计者受体和/或报道12的位置和表达。提供了DREADD wiki资源第25页上的免疫组织化学染色协议。
  5. 安装使用100-200微升的水性封固剂的路段上的Superfrost加幻灯片和盖玻片。
  6. 对脑组织进行荧光显微镜来验证AAV安置和蛋白表达12,24。

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Representative Results

行为结果

在实验结束后,将区域专用临时灭活的有效性应该被定量和定性评估。本实施例涉及一个3相行为范式(感官预处理),其中CNO施用以减弱在预处理会话中在RSC神经活动来检验这一假设在RSC是必要的协会之间中性刺激12的形成。重要的是,实验者不局限于行为范式或本文描述的药物遗传学方法可以加上最多行为范例实验设计。

而分析通常不会对在预处理会议(第一阶段)产生的数据进行的,它是否量化了解到大鼠在调理会议(第2阶段)光食品协会是非常重要的。如图连接古尔3A,无论实验(实验)和控制(Ctrl键)演示了老鼠在增加光刺激( 图3A)的演示表明大鼠获得的视觉刺激(光)和食物奖励之间的关联巴甫洛夫食品杯的行为。此外,两组演示了越来越多的呈现食物奖励( 图3B)表示等价的动机,以获得报酬期间食品杯的行为。在关键的测试会话中,当听觉刺激在没有其他刺激的呈现,对照大鼠有一个判别得分即显著不同从实验大鼠( 图3C)。图的目视检查表明,对照组大鼠的平均判别比大于0.5,表示的更大食品杯行为响应于听觉刺激的演示,被配对的光(预处理期间)相比,他们的食物杯行为响应被未成(预处理期间)的听觉刺激的演示文稿。与此相反,实验组大鼠未能证明的差分值即以上机会。因此, 图3C证明了控制,但没有实验组大鼠表现出感官效果预处理。

AAV布局验证

在完成行为测试,分析大鼠脑组织的正确位置和设计师受体的表达。行为免疫12,25使用针对受体标记( 例如,一个抗HA初级抗体)或荧光报告初级抗体(在这个例子中,它是由一种抗体,以绿色荧光蛋白(GFP)的检测mcitrine)。通过大鼠脑冠状截面的示意图示于图4A。图4B示出了记者PROT鲁棒荧光免疫检测。EIN在RSC在一个代表性的实验大鼠在周围区域没有检测到荧光标记图4C - D图示报告蛋白的实验(实验代表荧光标记;大鼠输注的AAV构建体含有设计者受体基因和mcitrine基因)和控制(按Ctrl;大鼠注入含有绿色荧光蛋白基因,但没有序列设计师受体)的大鼠,分别类似的AAV构建。受体水平也可以被显示为最小,有代表性和最大表达24。如果标签在区域检测感兴趣的区域之外,排除从行为分析这些数据。

图1
图1:在AAV结构示意图hSyn-HA-hM4D(GI)的图-IRES-mCitrine AAV用于为exp快速膨胀的抑制性受体设计师(hM4Di)下一个神经元突触蛋白特异性启动子(hSyn)的RSC神经元。免疫荧光记者(HA标签和/或mcitrine)可用于分别以可视化的蛋白质和报道的表达,。 hSyn,人类突触蛋白启动子;指定的神经元中表达。 HA,hemagluttinin标签;该标签融合至设计者受体并用作表位标签能够检测受体的表达。 hM4Di,该基因为设计师抑制G蛋白偶联受体。 IRES,内部核糖体进入位点;让记者(mcitrine)翻译。 mcitrine,荧光报道是GFP的变体,但是光漂白更有抵抗力。

图2
图2:感觉预处理模式的示意图(a)在预处理SESS。离子,12混合试验呈现。期间6的实验中,某一听觉刺激呈现持续10秒紧跟一个闪烁房子光刺激(2赫兹,5秒)。在其他6试验,第二听觉刺激呈现没有视觉刺激。 二)在调理会议上,先前配对的视觉刺激是搭配食物奖励。 三)在测试环节中,也有在没有视觉刺激或食物的两个听觉刺激的12混杂的陈述。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3:行为结果的平均食品杯(A)在光反应和(B)食品杜历元响调理会议(第2阶段)。使用重复测量方差分析对数据进行分析。测试会议(第3阶段)期间(C)歧视的比率。虚线表示空调的食物一杯应对每个听觉刺激等量( 无感 ​​觉预处理)数据采用独立样本t检验。 EXPT;实验鼠(n = 17)注入含用于抑制G-蛋白偶联设计者受体(hM4Di)和荧光报告(mcitrine)的DNA序列的DNA序列的AAV构建体。 Ctrl键;控制鼠(n = 6)注入hM4Di和给药媒介物联合控制鼠(n = 4)注入的AAV病毒不包含设计者受体和施用CNO。对照组并未显著彼此(P> 0.05)差异。误差线表示±SEM。

图4 图4:蛋白表达的组织学验证(A)示意性示出在通过大鼠脑冠状部分在RSC的位置。 (B)的免疫组织化学标记的大鼠脑组织从实验大鼠(实验),将其注入含有用于抑制G-蛋白偶联设计师受体荧光报道的DNA序列(DNA序列(hM4Di)和的AAV构建体代表性图像mcitrine)。 mcitrine是绿色荧光蛋白的高度防褪色变体。 (C)从实验大鼠示出的荧光报告标签(mcitrine)的位置代表图像。 (D)中从一个对照大鼠(Ctrl键)注入含有该DNA序列的荧光报道的AAV构建体代表图像(增强的GFP)。比例尺:B,500微米; C和D,10081;米请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

这个协议描述了如何应用药理学方法(DREADD)调查如何特定脑区域有助于多相复杂的学习任务。随着跨学习阶段暂时和远程沉默的神经活动的离散的大脑区域的能力,这种方法相结合提供了一个平台,调查范围广泛的行为,包括学习更细致或屏蔽的形式。在这个协议中所描述的例子中,控制该表达在retrosplenial皮层(RSC)的设计者受体鼠和大鼠中的3相行为的任务12进行测试。任务的第一阶段参与演示的假设多个中性刺激的对照组将收购两个刺激之间的刺激,刺激的关联。的工作假说是,RSC是必要的刺激刺激学习,因此,在每个4调理天,行为试验开始前30分钟ING,控制和实验大鼠给予任设计师药物(CNO)或车辆全身用药。当结合到设计受体,CNO减少其中该受体被表达的神经元的活性。在行为调节和测试,当RSC不假设影响学习的剩余阶段,CNO未给予因而神经活动没有受到干扰。

在协议中的关键步骤

AAV化合物的安全处理:参与遗传药理学方法的手术方法并不比简单的立体输液技术上更为苛刻,但是,在一些机构中使用的AAV要求实验者坚持以BSL-2的预防措施。调查人员遵循由疾病控制中心,供资机构,所在的机构和具体到他们的研究计划等监督委员会制定的准则,这一点至关重要。上个信息Ë安全自动增值服务的处理更是一应俱全13。

设计师药物的制备和管理:CNO,设计师药物,结合设计师受体与神经沉默活动,但在其他生物惰性1,3。 CNO从供应商的出货量可以在一致性变化。化合物应该到达作为未附着在容器的侧面的粉末。

重要的控制组的考虑:为了控制设计师药物的非特异性作用,前行为测试,注入了一组不同的实验组大鼠( 那些表达设计师受体)与车辆注射,而不是CNO。此外,以控制设计者受体的非特异性效果包括一组输注用包含荧光报道,但不修改设计者受体的控制病毒大鼠和与设计师药物注入这些大鼠( CNO) 。 Ensu通过跨组制衡重新充分的实验设计。

验证构建体的表达:有许多方法,最大限度地设计者受体的表达和检测。此前输液,确认病毒滴度接近10 12颗粒/毫升。常的荧光报告的可视化是低,因此,它建议在免疫组织化学上的使用针对记者(多个)抗体感兴趣区域执行包括在病毒构建25。在本实施例中,抗GFP免疫反应提供了可靠的信号( 图4B - D)。由于荧光标记的性质重要的,限制的固定时间长度为2小时。

该技术的优点

一旦病毒构建已交付给通过立体定位手术脑,药物遗传学方法允许临时inacti在离散区域大脑活动通过微创全身注射设计者药物的手段VATION。药物施用可以发生多次,这有利于在整个连续几天或几周12,24,26中发生的行为任务。此外,有证据表明,设计者药物(CNO)不与运动行为或食欲27,28干扰。因此,该方法提供了机会,以衰减神经活动的时间(2-5小时)一个短时期,同时避免固有的临时灭活的其它方法的压力。具体地,在插管的研究中,临时失活是由输送通过套管神经毒素被永久地固定在颅骨的实现。这种方法是指在保持套管清除杂物和保护的是具有挑战性的限制。此外,诱发不活动,动物广泛地行为测试处理(管理通过插管毒素)之前,WHI通道强加给动物应力并且还增加了套管可以去除从头骨的可能性。因为CNO的影响相对短期,长期代偿机制的可能性(如所观察到下列永久损伤或在基因工程小鼠)被最小化29,30。

该技术的局限性

DREADD是一个相对较新的非侵入性地衰减神经元活性的方法。作为这种实验者可能倾向于独立地验证神经元沉默发生在它们的制备。验证可以使用电生理方法来进行,但这些实验是费时,昂贵且需要特殊的专业知识。此外,虽然chemogenetic技术比光遗传学成本较低,该方法比传统的失活与药理学试剂如河豚毒素更昂贵。所述DREADD方法的另一个限制是,infus病毒构建体的离子不会导致100%的感染中的感兴趣区域的神经元,也没有通过CNO导致100%减少的神经元活动的确实失活。最后,有些AAV血清可逆向转移,可以对复杂的实验结果2的解释。

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Acknowledgments

我们感谢罗宾逊等人 12的作者为他们从本议定书部分派生的手稿贡献。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Male, Long Evans Rats, 55-60 days old Hilltop Lab Animals Inc
rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine Virus Vector Core Caution: This is a BSL-1 compound
rAAV8/hSyn-GFP Virus Vector Core Caution: This is a BSL-1 compound
Clozapine-N-oxide R&D Systems 4936-10 Designer drug
Rat Cage lid (polycarbonate) Alternative Design  FT 8XL-PC Used to cover animal cages 48-72 hr post infusion
Filter paper (replacement) Alternative Design FP-R-1018XAD Filter paper that goes with cage lids
Table top vise JETS 2201-265 For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood
Biohazard trash bags Staples 113444 Medline biohazard liners
Biohazard trash can Amazon.com United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle
Isoflurane, 100 ml Patterson Veterinary Supply Inc. 07-890-8540 Anesthetic
Dual small animal stereotaxic with digital display readout console David Kopf Model 942 Surgical equipment
Non-rupture ear bars, set of 2 (rat) David Kopf Model 955 Surgical equipment
Anesthesia mask (rat) David Kopf Model 906 Surgical equipment
High speed stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder David Kopf Model 1474 Surgical equipment
Microdrill burrs, 0.9 mm Fine Science Tools Inc 19007-09 Surgical supply
Automated syringe pump with micro4 controller David Kopf Model UMP3-1 Surgical equipment
Pro-animal detachable ceramic blade clipper kit Ahdis 21420 Surgical supply
Betadine skin cleanser Perdue Products L.P 67618-149-04 Surgical supply
Triple antiobiotic ointment Medline Supply 53329-087-01 Surgical supply
Puralube vet ointment Only Veterinary Supply 17033-211-38 Surgical supply
Dino-lite Microscope AD7013MTL An alternative to the traditional disection scope
Dino-lite rigid table-top boom stand Microscope MS36B Surgical equipment
28 G 10 μl syringe Hamilton 80308-701SN Surgical equipment
Extra tall MDF sound attenuating cubicle Med Associates, Inc ENV-018MD 22' W x 22" H x 16" D
Extra tall modular test chamber Med Associates, Inc ENV-007 Behavioral equipment
Stainless steel grid floor Med Associates, Inc ENV-005 Behavioral equipment
House light Med Associates, Inc ENV-215M Used as the house light and stimulus light
Modular pellet dispenser Med Associates, Inc ENV-203M-45 Behavioral equipment
Pellet receptacle, cup type Med Associates, Inc ENV-200R1M Behavioral equipment
Head entry detector for rat Med Associates, Inc ENV-254-CB Behavioral equipment
Dustless precision food pellets, 45 mg Bio-Serv F0165 Behavioral supply
Cage speaker for rat chamber Med Associates, Inc ENV-224AM Behavioral equipment
Programmable audio generator Med Associates, Inc ANL-926 Behavioral equipment
Smart ctrl 8 input/16 output package Med Associates, Inc DIG-716P2 Behavioral equipment
Large table-top cabinet and power supply Med Associates, Inc SG-6510D Behavioral equipment
PCI interface package Med Associates, Inc DIG-700P2-R2 Behavioral equipment
MED Intel core computer pkg with X Pro 19" monitor Med Associates, Inc COM-103V Behavioral equipment
Paraformaldehyde (grannular), 1 kg Electron Microsopy Sciences 19210 Hazard: carcinogen, weigh in hood
Rabbit monoclonal antibody (HA-Tag) Cell Signaling Technologies 3724S Histology reagent
XP Rabbit monoclonal antibody (GFP) Cell Signaling Technologies 2956S Histology reagent
Anti-rabbit IgG Cell Signaling Technologies 4412S Histology supplies
Superfrost plus slides VWR international 483111-703 Histology supplies

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References

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