원자 힘 현미경 이미징 및 지원 지질 이중층의 힘 분광학

Bioengineering

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Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers. J. Vis. Exp. (101), e52867, doi:10.3791/52867 (2015).

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Abstract

Introduction

원자 힘 현미경 (AFM)은 매우 날카로운 팁 (1)과 캔틸레버를 사용하여 샘플의 영역에 걸쳐 주사함으로써 표면의 화상을 생성한다. 캔틸레버의 이동은 시료의 표면 토폴로지를 프로빙. 액체 2-5에 공기 또는 거의 원시 상태에서 고정 된 샘플을 분석하는 그 다양성 때문에, 단백질, DNA와 세포막을 포함하여 - AFM 널리 생체 분자에 적용되었습니다.

외에 나노 미터 범위에서의 고해상도 영상화 능력에서, AFM 캔틸레버는 작용 힘 (부착 및 반발력) 및 샘플 5,6의 기계적 특성을 조사하기 위해 스프링 역할을한다. 이것은 힘 분광법으로 알려져있다. 이 모드에서, 프로브는 먼저 샘플 (도 1a)과 접촉을 상실 할 때까지 후퇴되고, 시료에 접근하고 그것에 힘을 발휘한다. 생성 된 곡선은 앱 모두 캔틸레버의 거리의 함수로서 힘을 보여바퀴벌레과 후퇴. 탄성률 등 여러 가지 특성은 재료의 강성을 측정하고, 접착력이 유도 될 수있다.

지원 지질 이중층은 고체 지지체 위에 누워 생물학적 모델 막이다 - 보통 운모, 붕 규산염 유리, 용융 실리카, 또는 실리콘 산화 7. 이들은 소포 증착과 같은 다양한 기술을 사용하여 제조되며, 랭 뮤어 - 블로 젯 방법 및 8,9 스핀 코팅. AFM 영상이 지원 이중층 (10)의 형성을 수행하고, 상이한 조성 11-15의 멤브레인에 의해 형성된 상이한 구조를 조사하기 위해 사용되었다.

접근 곡선의 피크에서 지원 이중층 결과에 힘 분광법을 수행. 이 피크는 이중층을 관통하기 위해 필요한 힘을 나타내고, 획기적인 힘이라고 부른다. 이중층의 두께는도 6곡선을 사용하여 측정 될 수있다. 이중층의 전형적인 획기적인 힘1-50 사이의 범위 윈 6. 이러한 특성은 지질 포장 (액체 또는 젤 상)과 구조 (아실 체인 길이와 불포화도)과 막 활성제 (16)에 의해 변경에 따라 달라집니다. 파열 배후 이론은 17을 설명했지만 이러한 캔틸레버 부드러움, 팁 반경 및 접근 속도와 같은 다른 변수는 실험 15, 16, 18 획기적인 힘에 영향을 미친다. 포스 분광법은 막 (21)의 안정성, 다른 지질 상 11,19, 펩티드 등 조성 의존성 12,20 변화뿐만 아니라, 다른 생 분자의 효과의 특성을 분석하기 위해 사용되어왔다.

지원 이중층의 평면 방향은보다 구조 및 막의 성질을 특성화하기 위해 이러한 표면 플라즈몬 공명 (22) 및 형광 현미경 11,19 같은 다른 방법으로 결합 AFM 유리하다.

이 자세한 영상 프로토COL은 소포 증착을 사용하여 지원 된 지질 이중층을 준비하고 AFM 힘 분광기로 분석하도록 구성된다. 다양한 크기의 소포는 이중층을 제조하는데 사용될 수 있지만,이 프로토콜은 소형 및 대형 단층 라멜라 소포에 초점을 맞춘다. 상 액체 주문 (패 O) 및 액체 무질서 (패 D) 단계로 분리 지원 이중층은 11, 15을 특징으로했다. 2 : 1의 비율로 막 2에 디 - 올레 일 포스파티딜콜린 (DOPC), 스 핑고 미엘린 (SM), 및 콜레스테롤 (Chol을)로 구성된다. 이 구성 모델 단백질 인신 매매 및 정렬, 세포 신호 및 다른 세포 과정 (23, 24)에 대한 중요한 플랫폼으로 작동하도록 제안 지질 뗏목,.

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Protocol

지원 지질 이중층 1. 준비 (SLB) 11,12,21

  1. 지질 혼합 및 다중 층 소포 현탁액의 준비
    1. 사전에 다음과 같은 버퍼를 준비합니다.
      1. 2.7 mM의 KCl을, 농도의 PBS 완충액을 준비가 1.5mm KH 2 PO 4, 8 mM의 나 2 HPO 4, 및 137 mM의 염화나트륨, pH가 7.2.
      2. 150 mM의 염화나트륨, 10 mM의 HEPES, 산도 7.4의 농도에서 SLB (지원 지질 이중층) 버퍼를 준비합니다.
      3. 1 M 염화칼슘 (2)의 솔루션을 준비합니다.
    2. 원하는 농도의 클로로포름에 녹인 다음 지질 : 예를 들어, 디 - 올레 일 포스파티딜콜린 10 ㎎ / ㎖의 25 ㎎ / ㎖ 및 콜레스테롤 (Chol을) 25 ㎎ / ㎖, 스 핑고 미엘린 (SM)의 (DOPC).
    3. 2 : 1 DOPC : SM : Chol을 몰 비율이 총 지질의 1 mg을 가진 솔루션을 만들기 위해 DOPC의 18.38 μL, SM의 17.10 μL 및 Chol을의 11.30 μl를 가져 가라. conce을 기반으로 그에 따라 볼륨을 변화1.1.2에서 제조 지질 ntrations. 2 : 1 DOPC : SM : Chol을, 멤브레인 (25)의 위상 특성을 변경한다 몰비를 변화하지만, 2의 몰비를 유지한다.
    4. 텍싱에 의해 완전히 솔루션을 섞는다. 하나는 형광 현미경에 의해 이중층를 시각화하고자하는 경우는 0.05 몰 %로 지질 형광 염료를 추가한다.
      주 : 장쇄 dialkylcarbocyanines의 가족,처럼, DII 및 DIO는 넓은 파장 범위에 걸쳐 이상적으로 지질막 라벨을 사용할 수있다. 대안 적으로, 로다 포스파티딜 BODIPY 또는 콜레스테롤과 같은 형광 표지 된 지질을 사용할 수있다. 어떤 경우에, 염료의 농도는 지질에 결합 된 형광은 고농도의 지질 동작 (19)을 변경할 수 있다는 것을 염두에두고, 현미경 설정에 따라 최적화되어야한다.
    5. N 2 가스를 사용하여 클로로포름 (또는 사용 가능한 불활성 가스 Ar과 같은 그분을) 떨어져 건조.
    6. 또한 건조 T그는 적어도 1 시간 동안 진공 하에서 혼합 지질.
      주 :이 지질 혼합물을 저장하는 경우, 불활성 가스 (N 2 나 Ar 그는)에 공기를 제거하고 -20 ℃에서 저장. 작은 갈색 유리 병에 여분의 지질 -에 - 클로로포름 나누어지는. -20 ℃에서 불활성 가스 (N 2에 Ar 또는 He)와 저장소 공기를 변위, 지질 혼합물과 유사한 방식으로 그것들을 건조시킨다.
    7. 10 ㎎ / ㎖의 농도로 PBS 완충액 건조 지질을 녹인다.
    8. 소용돌이 1 분에 약 20 초 동안 적극적으로 혼합물 다중 층 소포를 포함, 흐린 서스펜션을 얻을 수 있습니다. 이 병의 측면에 집착에는 지질 필름이 없는지 확인합니다.
    9. 10 μL 씩 (지질의 1 mg을 10 분취한다)에이 현탁액을 배포합니다.
    10. 더 사용할 때까지 -20 ℃에서 보관하십시오.
  2. 단일 층 소포의 준비
    주 : 단층 라멜라 소포의 각종 크기는 초음파 법 또는 압출 법을 이용하여 제조 될 수있다. 초음파는 S를 사용운드, 에너지는 혼합물을 교반 및 다중 층 현탁액의 분액. 이는 불투명 한 현탁액까지 취소하여 표시됩니다. 압출 한정된 기공 크기의 멤브레인 필터를 통과 다중 층 소포를 강제.
    1. 초음파 방법
      1. 다중 층 지질 현탁액의 10 μl를 타고 SLB 버퍼의 150 μl를 추가합니다.
      2. 작은 (2 mL)에 덮인 유리 바이알에 옮기고, 혼합물을 파라 필름으로 밀봉.
      3. 10 분 동안하거나 (직경 50 nm의 아래의 SUVs) 소형 단일 층 소포를 수득 선명해질 때까지 욕조 초음파 처리기에서 실온에서 혼합물을 초음파 처리.
    2. 압출 방법
      1. 다중 층 지질 현탁액의 10 μl를 타고 SLB 버퍼의 150 μl를 추가합니다.
      2. 극저온 튜브로 현탁액을 전송합니다.
      3. 액체 질소에 몇 초 동안 극저온 튜브를 침지하여 지질 현탁액을 동결.
      4. 해동몇 분 동안 물을 실온에서 욕조 또는 37 ° C에서 극저온 튜브를 침지하여 지질 현탁액. 동결 해동 단계 적어도 10 번 반복합니다.
      5. 지질 현탁액을 압출하기 위해서, 200 nm의 기공 크기를 갖는 폴리 카보네이트 멤브레인을 사용하여 상업적 압출 장치 (26) (다른 기공 크기가 100 나노 미터 또는 400 나노 미터 등을 사용할 수있다).
        참고 : 현재, 두 개의 압출기 장치는 상업적으로 사용할 수있다 : 수동 압출기 작은 볼륨 (몇 ml를 200 μL)에 사용할 수 있습니다. 이 경우, 샘플은 수동 두 주사기 사이에 앞뒤로 현탁액 밀어 막을 통해 압출된다. 제조사에 따라, 지질 분취 량 세트의 최대 최소 체적에 도달하기 위해 결합 될 필요가있을 것이다. 더 큰 볼륨의 경우 (50 ml)을 더 정교한 장치가 사용되는 서스펜션은 압축 가스를 이용하여 폴리 카보네이트 막을 통해 강제된다. 설정 및 압출 조건에 따라 모드 변경엘. 사용하기 전에 제조업체의 지침을 참조하십시오. 이 프로토콜은 작은 볼륨에 대한 설명서를 압출기를 의미한다.
      6. 압출기를 통해 물을 통과시켜 물에 압출기 평형. 물 속에서 막 빠져.
      7. 두 개의 피스톤 사이에 막 배치 장치를 조립 한 주사기로부터 다른 압출기​​를 통해 버퍼를 통과시킴으로써, 평형 완충액. 이 단계는 추가적으로 시스템 leakiness 테스트를 허용한다. 이 묻은 경우, 분해하고 다시 멤브레인을 변경 재 조립.
      8. 압출기의 하나 주사기 ( '더러운면을')를 사용하여 지질 서스펜션을 가져 가라.
      9. 하나의 챔버에 지질 서스펜션과 반대 실의 빈 주사기가 들어있는 주사기를 연결합니다.
      10. 한쪽 끝에서 주사기를 밀어 넣습니다. 막 통해 반대 주사기에 솔루션을 전달합니다. 이것은 1패스입니다.
      11. 31 회 등 총 멤브레인 통해 합격이 솔루션은 반대 주사기 ( '깨끗한 편')에 끝나는 것을.
        참고 : 압출 후 멤브레인을 확인합니다. 이 파손 되었다면, 압출 공정은 성공적이지 반복 될 필요가있다.
      12. 작은 튜브에 주사기를 비 웁니다. 4 ℃에서 보관하는 경우 큰 단일 층 소포 (LUVs)는 1~2일에 대한 안정적이다.
  3. 운모 및 Coverslips는의 준비
    1. 세척은 에탄올에 먼저 물에 다음 된 커버. 공기 건조.
    2. 운모 디스크를 취하여 접착 테이프를 사용하여 외부 층을 벗겨.
    3. 커버 슬립에 운모 디스크를 연결합니다. 하나는 형광 현미경으로 이중층을 확인할 수 있도록 투명한 광학 접착제는 최적이다.
    4. 광학 접착제 / 그리스를 사용하여 플라스틱 실린더 (2.5 cm 외경, 2cm 내부 직경 0.5 cm의 높이)를 연결합니다. 모든 밀봉되어 있고 누수가 없는지 확인합니다. 이들은 쉽게 번째로부터 분리 될 수있는 실린더를 다시 사용하고자 할 때 그리스를 사용전자 coverslip에 세척. 플라스틱 실린더 사이즈 AFM 캔틸레버 홀더의 크기에 의존하고 그에 따라 조정되어야한다.
  4. 고체 지지체에 단일 층 소포의 증착
    1. 피펫 운모에 직접 전체 리포좀 솔루션입니다. 300 μL의 볼륨에 도달하기 위해 더 많은 SLB 버퍼를 추가합니다.
    2. 3 mM의 칼슘 이온의 최종 농도에 도달하기 위해 1 M 염화칼슘 용액 0.9 μL를 추가한다.
    3. 2 분 후, 적어도 10 분 동안 65 ° C에서 37 ° C에서 인큐베이션. 항상 버퍼 이중층 커버. 공기와 공기 거품 연락을 파괴 할 것이다. 필요한 경우 배양하는 동안, 높은 온도에서 배양 특히, 더 많은 버퍼를 추가합니다.
      참고 : 배양 온도가 필요한 지질 혼합물 및 단계에 따라 다릅니다. 적어도 10 분의 배양 시간은 지원 이중층을 형성 할 필요가 있지만, 온도 및 조성에 따라, 이상이 될 수있다.
    4. 빨래고온 (65 ℃에서)와 이중층 SLB 버퍼 15 ~ 20 시간은 칼슘과 융합 소포를 제거합니다. 버퍼에서 이중층을 유지하기 위해 세척 단계에서 좀 더주의를 기울여 부드럽게 이중층을 파괴 방지하기 위해 세척 용액을 피펫.
    5. AFM 측정 전에 실온으로 냉각 지원 이중층. 이는 멤브레인의 상이한 위상을 형성뿐만 아니라 기기의 열적 드리프트를 최소화 할 필요가있다.

2. 원자 힘 현미경 측정 (11, 12)

  1. 영상
    참고 : 접촉 모드 또는 모드를 도청에서 원자 힘 현미경 이미징을 수행합니다. 솔루션의 이미지 지원 이중층; 이 이중층을 파괴하므로 용액이 완전히 증발 할 수 없습니다. 하나의 버퍼로 작동 될 때, 어떤 AFM 부분은 액체 유출로부터 보호되어 있는지 확인하기에 안전주의 사항을 준수하십시오.
    1. 부드러운 캔틸레버를 선택 (0.2 N / M의 스프링 상수가 좋습니다 이하) 및 T로 마운트그는 AFM. 캔틸레버의 강성 력 선택 분광법 더 중요하다 (이는 나중에 설명 될 것이다).
    2. AFM 무대에서 샘플을 마운트하고 모든 진동 절연 모듈이 켜져 있는지 확인하십시오. 평형 시스템의 온도 편차를 줄이기 위해 최소 15 분 동안 기다립니다. AFM 세트 업에 따라, 조정 및 이미징 사양이 다를 수 있습니다. 제조업체의 지침서를 참조하십시오.
    3. 접촉까지 AFM 팁과 샘플을 접근.
    4. 지질 이중층은 일반적으로 높이가 4 나노 미터이기 때문에, (예 : 1.5 μm의 경우) 가장 높은 Z-해상도를 제공합니다 악기의 Z 범위를 사용합니다.
    5. 이미지 영역을 선택합니다. 지질 이중층의 개요, × 25 μm의 지역 이미지에 좋은 출발점이 될 것입니다 50 μm의 × 50 μm의 25 μm의를 얻으려면. 작은 기능이 들어 오면 작은 영역에서 하나의 캔 이미지 (10 μm의 × 10 μm의, 또는 2 μm의 × 2 μm의). 촬상 영역의 선택은 또한 작업 R에 의존압전 스캐너의 플랜지. 이 용 장비 설명서를 참조하시기 바랍니다.
    6. 이중층 매우 깨지기대로, 샘플과의 접촉을 유지하면서, 열 드리프트 최소 힘 및 정확한 영상을 유지하는 동안 AFM 팁의 세트 포인트를 조절한다. 접촉 모드에서, 세트 포인트를 최소화한다. 탭핑 모드에서, 상기 세트 포인트를 최대화.
    7. 다항식 레벨링 기능에 대한 각각의 스캔 라인 피팅으로 프로세스 이미지. AFM 제조 회사의 전용 소프트웨어를 사용하여 막과 접촉을 잃는 스캔 라인에 대해 제거를 수행한다.
  2. 힘 분광학
    1. 제조 업체의 프로토콜에 따라 지침에 따라 캔틸레버를 보정합니다. 교정은 포토 다이오드 힘 (그림 1B)의 전기 신호의 변환을 할 수 있습니다.
      1. 볼트의 팁의 감도 (길이의 단위) Z-압전 운동으로 변형을 측정하는 대신에 전기 신호를 보정합니다.
      2. 일반적으로 AFM 소프트웨어에 통합 열 잡음 주파수 방식을 사용 캔틸레버 스프링 상수를 계산한다. 이 방법에서, 전력 스펙트럼 밀도 플롯을 생성 발진 주파수에 따른 소음 진동의 진폭을 플롯. 이 그래프는 공진 주파수 주변의 피크를 보여줍니다. 여기서 주파수 진폭 I큰 s의 것은 공진 주파수이다. 소프트웨어에 의해 자동으로 스프링 정수를 산출하는 피크 주위 로렌츠 함수를 장착한다. 열 잡음 방법의 이론에 대한 몇 가지 유용한 리소스를 참조 27-30에 나와있다.
    2. 이중층의 영역을 묘화 한 후, 힘 분광법을 수행하는 이중층으로는 5㎛ × 5 ㎛의 영역을 선택한다.
    3. 그것은 그 지역의 16 × 16 격자에 힘 곡선을 취하도록 AFM을 설정합니다. 이 지역 당 256 힘 곡선을 초래한다. 이웃하는 두 점 사이의 공간은 막 면적은 다음 점과 일치 한 것 포인트 프로빙되는 것을 방지하기에 충분해야한다. 이 팁 반경에 따라 달라집니다. 두 점 사이의 100 nm의 거리가 이상적 일 것이다. 16 × 16 격자에 5 μm의 X 5 μm의 영역을 나눈다. 위상의 크기에 따라 하나 또는 더 작은 영역을 선택하고 그에 따라 격자 크기를 조정할 수있다.
    4. 로 설정 Z-압전 변위400 nm의. 이 Z-피에조의 움직임의 최대 범위를 결정합니다. 그것은 캔틸레버가 완전히 측정 사이에 샘플에서 멀리 후퇴 있는지 확인하기 위해 충분히 커야한다.
    5. 800 나노 미터 / 초에 접근 속도를 설정하고 200 nm의 / 초의 속도를 철회. 이중층 조성 및 지질 상 -6,16-를 공부하기에 따라 6,000 나노 미터 / 초 400 사이의 접근 속도를 사용합니다.
    6. 모든 파라미터를 설정 한 후, AFM 소프트웨어의 "실행"버튼을 누르면, 힘 곡선을 취득.
    7. 신장 곡선 대 세력으로 힘 곡선 (Z-피에조 이동 계수)를 저장한다. 이 때 시료와 접촉 계정에 캔틸레버의 굽힘을지지 않습니다. 데이터 처리 단계에서, 소프트웨어는 AFM 이중층 두께에 대한 적절한 값을 제공 할 것이다 팁 - 샘플 분리 곡선 (도 1C), 대 힘을 얻기 위해, 캔틸레버 벤딩에 대한 보정을 허용한다. 보정 값은 일반적으로 캘리 브레이션에 인용각각의 힘 곡선과 함께 저장됩니다 ATION. 주어진 지점에서 압전 운동에서 수직 편향을 뺀 팁 샘플 분리를 계산합니다.
      주 : 접근 력 곡선 피크 (력 수치 아래 캔틸레버 운동 방식주기 정지하더라도 간다) 멤브레인의 침투 력 인 반면,이 피크의 위치와 시점의 위치의 차이 힘이 위로 상승하기 시작 위치를 다시 막의 두께를 제공한다.
    8. 좋은 통계를 얻기 위해 각각의 조건에 대해 최소 500 힘 곡선을 획득. 기원 또는 매트랩 같은 프로그램을 이용하여 값의 히스토그램을 플롯 및 분포의 피크 폭을 얻기 위해 가우시안 분포 히스토그램을 장착한다.

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Representative Results

DOPC 이루어지는 지원 지질 이중층 : SM : Chol을 (2 : 2 : 1) AFM 이미지화 하였다 (도 2 AC). 때문에 지질 조성물, SM / Chol을 풍부 L의 O 및 DOPC 풍부한 L d 개의 상을 관찰 하였다. AFM 영상에서 높이 프로파일은 막 구조에 대한 중요한 정보를 제공 할 수있다. 높이 프로파일을 조사하여 이중층 두께를 제공 할 수있는 막 (도 2b) 또는 L의 O / L의 d 개의 상 사이의 높이 차이에 결함의 존재를 측정 할 수있다. 또한, AFM은 특히 선택이 단계를 대표하는 지역과 힘 분광법 (- F 그림 2 D)를 사용하여 기계적 특성을 분석 할 수 있습니다. 힘 분광법 모드로부터 유도 력 곡선 힘 곡선 (도 2DE)의 피크 하중 값을 찾음으로써 획기적인 힘을 측정하기 위해 사용되며, membr 아르거리 값에 힘 곡선의 피크 거리 값을 뺀 ANE 두께 힘 곡선은 다시 (도 2DF)을 증가하기 시작할 때.

AFM 측정의 민감도는 압전 재료 및 전자 피드백 루프에 따라 달라집니다. 따라서, 일을 실험하기 전에 설정 한 AFM을 잘하는 것이 중요합니다. 압전 재료에 대한 설정이 일반적인 악기가 있습니다 : (1) 튜브 스캐너 움직이지 끝에 샘플 압전 재료의 상단에 배치하고 샘플을 스캔하는이; 또는 (2)에 팁이 대신 시료의 압전 물질 상에 장착되는 굴곡 단. 후자의 경우, 압전 재료 및 기타 전자가 유출로부터 보호된다. 생물학적 응용 프로그램에 대한 AFM 모델의 많은이 구성을 가지고있다.

촬영하는 동안, AFM 팁은 샘플과 접촉을 잃고 저를 잘못된 될 수 있습니다asurements. 손실 얼마나 많은 검사에 따라, 이미지가 스캔 라인을 제거하고 주변 영역 (도 3)에서 새로운 값을 도출하는 평균 강도 필터를 사용하여 보정 될 수있다. 그러나 대부분의 경우, 좋은 이미지를 생성하지 않으며, 단순히 이미지를 폐기하도록 권장한다. 모니터링해야 다른 이슈가있다. 이러한 평활 / 손상된 / 더티 팁뿐만 아니라, 캔틸레버 (31)의 뒤에 레이저 스폿의 회절로부터 발생한다. 이러한 경우에, 이미지는 폐기되어야하고, AFM 팁을 교체해야한다.

힘 분광 측정 동안, 여러 문제가 발생할 수있다 : 피크 (1) 부재 (도 4a), 어깨 (2) 존재 대신에 잘 정의 된 피크 (도 4b)이 매우 낮거나, (3)의 작은 증가 및 후속 plateauing 힘 (그림 4C - D). 피크의 부재는 BIL없이 측정 영역에 기인​​ 할 수있다이어 나에 인수 조건은 최적화되지 않습니다. 그것은 AFM 이미지가 이중층 실제로 측정되고 있는지 확인하기 위해 힘 분광법을하기 전에 취득하는 것이 좋습니다. 취득 조건뿐만 아니라 팁 / 캔틸레버 사양 침투 이벤트 (17)의 확률에 영향을 미친다. 예리한 팁을 쉽게 같은 획기적인 낮은 힘을 표시하거나 잡음 레벨 아래이기 때문에 전혀 나타나지 않을 수도 이중층을 천공 할 수있다. . 접근 속도를 늘리면 획기적인 힘 (16)을 증가시킨다. 이중층은 선단부에 의해 가압 될 때, 지질 분자는 또한이 힘을 분산하도록 반응한다. 하부 접근 속도, 지질 이중층은 힘의 다음 단계 전에 평형화 충분한 시간을 갖고, 이는 침투 이벤트가 일어날 수있는 확률을 증가시킨다. 높은 접근 속도와 같은, 지질의 반응보다 더 빠르고 힘 램프는 획기적인 이벤트의 확률은 동일한 힘으로 낮다. 그것은 POSS입니다높은 접근 속도를 사용하여, 세트 포인트는 더 피크 관찰 결과 이​​중층 나누기 전에 도달된다 ible. 이 곡선에서 어깨의 모양을 설명 할보고는 없지만, 우리는 돌파구 전에 재료 압축으로 인해이 될 수 있다고 가정 하였다. 또한, 매우 낮은 힘에 고원 또는 넓은 피크가 끝에서 흙이나 느슨한 지질 물질의 존재를 나타낼 수있다. 팁 몇 가지 측정의 기간에 먼지와 지질 자료를 축적 할 수있다. 팁에 부착 된 먼지 나 재료 따라서 획기적인 힘을 증가가 무딘 만든다.

그것은 이러한 문제가 발생하는 경우 힘 곡선이 다른 지역에서 취득하는 것이 좋습니다. 두번째 권고 (이 재 보정을 필요로한다) 팁을 변경하는 것이다. 마지막으로, 접근 속도가 조정될 수 또는 다른 사양 (팁 반경 및 강성도)와 팁의 사용이 고려 될 수있다 필요가있다. 획기적인 힘은, T로, 0 ~ 50 윈 (6) 사이에서 변화그는 0.05-0.7 N / m의 범위에있을 수 캔틸레버의 스프링 상수. 대부분의 상용 캔틸레버는 20 ~ 40 nm의 주위에 소액의 팁 반경이있다. 대신 기존의 팁을 사용하는 tipless 캔틸레버도 구입하실 수 있고 (보통 크기 분포에 단 분산 있습니다) 알려진 반경의 구체는 그들에 부착 될 수있다. 재생 가능한 데이터를 얻기 위해, 항상 실험의 동일한 세트에 대해 동일 취득 조건 캔틸레버 사양을 사용합니다.

그림 1
그림 1 : 힘 분광학의 원리 샘플에서 캔틸레버의 접근 방식 후퇴 () 순서.. 빨간색 선은 평형 위치 (검은 선)에서 캔틸레버 편향을 보여줍니다. (B) 외팔보 교정 (뉴턴에) 강제 (볼트에서) 전기 신호를 변환한다. 캔틸레버 SENSI의 취득으로tivity과 스프링 상수 (볼트)에 수직 편향은 거리와 훅의 법칙을 이용하여 발효 거리로 변환된다. 힘 분광 측정에 접촉시 (C)는, Z-압전 스캔 운동은 굴곡 계정으로 캔틸레버을지지 않습니다. 이에 대한 보정이 Z-피에조 운동에서 (거리 단위에서) 수직 편향, X를 뺌으로써 수행 될 수 있고, Z (도 거리 단위). 이러한 방식으로, 대신에 단순히 Z-피에조 운동의 실제 팁 - 샘플 분리, 거리의보다 정확한 측정은 샘플의 두께를 측정하기 위해 중요하다,보고 될 수있다.

그림 2
SM : 그림 2 :. DOPC 구성 SLB 수의 SLB 수의 AFM (A) 방식 Chol을 (2 : 2 : 1) 무질서 액체 (패 D) 및 액체 주문 (패 O) 단계로 구분합니다. (B (C)는 B의 노란색 사각형 (10 μm의 × 10 μm의)에 해당합니다. 패 O와 L의 D 단계가 표시되어 있습니다. 라인 프로파일은 아래 그림에서 노란색 라인에 해당한다. L 오 단계가 L D 단계보다 1 ~ 2 nm의 높은 나타납니다. (D) 획기적인 힘과 막 두께를 유도하는 방법을 보여주는 샘플 힘 곡선. (E) 혁신적인 힘과 정량 가우시안 피팅 L D와 L 단계에 대한 (F)의 막 두께 분포.

그림 3
그림 3 : 영상 중 접촉의 손실로 연결. SM : Chol을 이미지의 나머지에 해당하지 않는 스캔 라인은 DOPC 구성된 이중층 지원 (2 : 2 : 1) 일부 라인 스캔의 접촉의 손실. 스케일 바 2 μm의.

그림 4
그림 4 :. 힘 분광학의 과제 (A) 어떤 힘 곡선은 더 피크이 없습니다. (나) 곡선 대신 잘 정의 된 피크의 어깨를 가질 수있다. 고원 피크의 부재하에 발생할 수 작은 증가 후 (C). 잘 정의 된 피크와 함께 고원의 (D) 모양.

막 지역 돌파구 포스 (윈) 막 두께 (㎚)
L의 D 단계 6 ± 1 4.7 &# 177; 0.5
L 오 단계 8 ± 1 6 ± 1

표 1 : DOPC의 막 성질 : SM : Chol을 (2 : 2 : 1). SLB 수 L에 D 단계 6 ± 1 윈의 획기적인 힘 및 4.7 ± 0.5 nm의 두께를 갖는다. L o를 8 ± 1 윈 6 ± 1 nm의 두께를 갖는다. 두 상 사이의 높이 차이는 1.4 ± 2 ㎚이다.

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Discussion

DOPC 이루어지는 SLB 수 : SM : Chol을 (2 : 2 : 1) 염화 칼슘에 의한 소포 ​​흡착 및 파열 후에 운모 상에 형성 하였다. 이 지질 조성물 L D와 L 상으로 분리 하였다. L 오 단계는 스 핑고 마이 엘린과 콜레스테롤이 풍부한과 L의 D 단계 (11)보다 적은 유체 / 점성 (그림 1A)이다. L의 D 단계에서 L 오의 분리 주변 (그림 1B, C) ​​이상 상승으로 원형 구조를 명시한다. 플랫폼가 L D 단계에 둘러싸여 L 오 단계입니다. 막 결함 (또는 막에 구멍)도 (도 1b, 청색 화살표)이 보이는 결함에 걸쳐 높이 프로파일은 이중층의 두께를 나타낸다. L의 D / L의 O를 높이 차이는 AFM 높이 프로파일 (도 1C)를 찾고 의해 검사 될 수있다.

지질의 준비혼합물을 조성물 이중층 특성을 결정으로 매우 중요하다. 지원 이중층의 제조 동안, 지질 상 (단계 1.4.5)의 형성을위한 적절한 온도에서 나타낸 작동하는 것이 중요하다. 이중층 파괴 나 선단에 오물이 축적되지 않도록 이미징 동안 낮은 힘을 유지하는 것은 매우 중요하다.

AFM 이미징 후, SLB의 지역을 선택하고 힘 분광법을 사용하여 탐색 할 수 있습니다. 힘 분광법은 우리가 막 다른 속성, 특히 획기적인 힘 (그림 1D)를 조사 할 수 있습니다. 단계 O L D와 L은 (그림 1E, F) 다른 획기적인 힘과 두께를 보여줍니다. 특성이 표 1에 요약되어있다. 우리는 Chiantia 외. (11)에 비해, L에 D 단계에서 획기적인 힘 유사한 값을 얻었다 유의하지만 L O를위한 위상 낮은 값. 이 수인하여 우리의 멤브레인에 이용 콜레스테롤의 낮은 양으로 (그들이 사용하는 동안 1.5 : 1 : SM : Chol을 비율 2 : 2 우리 DOPC 사용 1.5 : 1). 결과의 재현성에 매우 중요한 요소 - 이것은 또한 우측 지질 혼합비의 중요성을 보여준다. 또한, 다른 지질 (쇄 길이, 및 불포화도)을 사용하는 것은 또한 이중층 특성 6,15,18을 변경한다.

획기적인 힘의 분포를 플롯하면 유용 이미 이중층 특성의 차이를 나타낼 수 있지만, 획기적인 힘의 분포의 추가 분석은 라인 장력을 포함한 압력 11,17,21 확산 다른 기계적 특성을 추론하는데 사용될 수있다. 간략하게, 확률, P 특정 획기적인 힘 측정 (F)는 F, 연속체 모델 핵 11,15,17 의해 설명된다 :

식 (1)

여기서 A는 소나이다캔틸레버의 NCE 주파수, K가 캔틸레버의 스프링 상수이고, V는 접근법의 속도이고, Γ는 라인 장력 (막 열기에 구멍을 유지하는 데 필요한 에지 에너지), R은 AFM의 반경이며 팁은, 유전율 B는 T는 온도이고, 볼츠만 상수이고, S는 확산 압력 또는 구멍 닫 관련된 에너지이다 (막 장력의 반대 - 홀 (32)을 열도록 막에 의해 발휘되는 데 필요한 에너지). 이 방정식은 통합 될 수 있으며, DP / DF는 다음과 같이 계산 될 수있다 :

식 (2)

A, K, R은 캔틸레버 교정을 통해 획득 할 수있는 AFM 캔틸레버 / 팁의 재산입니다. T 및 V는 실험 내내 일정하게 유지되어야한다 실험적 파라미터이다. DP / DF는 라인 장력 확산 압력을 취득하는 히스토그램에 설치된다. 여러 파라미터 P (F)에 영향을 experi멘탈리스트는 줄 긴장과 확산 압력 비교 값이 비슷한 팁과 인수 조건을 사용하는 것이 좋습니다. (영상 중에 획득 한 끝에 먼지와 융합 소포 포함) AFM 팁의 오염은 비 재현 가능한 결과로 이어집니다. 또한, 지지체의 선택은 막 (20)의 기계적 특성에 영향을 미친다.

지질 이중층의 기계적 특성을 특성화하는 또 다른 기술은 거대 단일 층 소포 (GUVs) 마이크로 피펫 (33)의 흡입이다. 이 기술에서, 멤브레인 장력 흡인시 GUVs의 변형을 산출한다. 또한, 흡인을 증가시킴으로써, 하나는 장력을 계산할 수있는 핵 연속체 모델 라인 장력과 관련 될 수 GUV 파열 (또는 용해 장력) 34. 이 기법의 단점은 서로 다른 PHA로서, 막 분리, 위상 막의 장력을 계산 복잡성SES는 다른 기계적 성질 (35)이있다. 이것은 개별 상을 별개로 특성화 될 수 AFM 력 분광법, 대조된다. 많은 GUVs 통계적으로 중요한 결과를 생성하는 데 필요한 반면, 또한, AFM은 SLB 당 하나의 분포를 생성 할 수있다. 그러나, (예를 들어, 관상 및 함입에 대한) 막 리모델링 효과는 더 쉽게, GUVs와 시각 기계적 특성과 함께 이러한 모양 관련 효과의 특성을 그들에게 더 나은 시스템을 만들고있다.

이중층 특성에 막 단백질의 효과를 연구하기 위해 상기 애플리케이션들에서, 정제 된 단백질은 테오 있도록 이들 소포에 혼입 될 수있다. 이 작업을 수행하는 하나의 기술은 안정 막에 삽입 할 단백질을하기 위해 세제를 사용합니다. 투석 또는 크기 배제 크로마토 그래피를 통해 후속 정제 솔루션 (36)에 무료로 단백질과 세제를 제거합니다. 또 다른 방법은의 태그가 필요합니다및 (니켈 - nitriloacetic 산 니켈 (Ni-NTA) 또는 바이오틴 지질과) 리포좀이 태그에 대한 통합 선호도 파트너 (예, 히스티딘 또는 스트렙 타비 딘 태그) 정제 된 단백질.

요약하면, 우리는 지질 이중층을 분석하는 방법을 설명했다. 그것의 높은 해상도, AFM이 중에서도 지질 상을 포함 멤브레인 서브 마이크로 구조를 밝힐 수있다. 여기에서 지질막을 특성화에 사용 포스 분광법은 또한 막 단백질 및 다른 생체 분자의 막에 이용 될 수있다.

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Disclosures

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgements

이 작품은 (NO. 0,312,040 부여) 막스 플랑크 협회, 독일 암 연구 센터, 튀빙겐 대학과 Bundesministerium 대 Bildung 놀이 Forschung에 의해 지원되었다.

우리는 우리가이 원고의주의 독서의 힘 곡선 데이터와 박사 야콥 Suckale의 분석을 자동화 도와 에드워드 헤르만 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids, Inc. 850375P Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sphingomyelin (Brain, Porcine) Avanti Polar Lipids, Inc. 860062P Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Cholesterol Avanti Polar Lipids, Inc. 700000P Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sodium chloride (NaCl), 99.8% Carl Roth GmbH + Co. KG 9265.1
Potassium chloride (KCl), 88% Sigma P9541
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% AppliChem GmbH A1046
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% Carl Roth GmbH + Co. KG 3904.1
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade AppliChem GmbH A4689
HEPES, molecular biology grade AppliChem GmbH A3724
Glass coverslip, 24 x 60 mm, 1 mm thickness Duran Group 2355036
Punch and Die Set Precision Brand Products, Inc 40105
Optical Adhesive Norland Products, Inc. NOA 88 Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. 
Name Company Catalog Number Comments
Mica blocks NSC Mica Exports Ltd. These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.  Always handle mica with gloves or tweezers.
Laboratory Equipment Grease Borer Chemie AG Glisseal N
Liposome Extruder Avestin LiposoFast-Basic As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.
Adhesive Tape 3M Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)
Bath Sonicator Bandelin Sonorex Digitec DT-31 No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (Data sheet)
Silicon Nitride AFM Cantilever  Bruker AFM Probes DNP-10 Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.
AFM JPK JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200

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