Атомно-силовая микроскопия изображений и силовая спектроскопия поддерживаемых липидного бислоя

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers. J. Vis. Exp. (101), e52867, doi:10.3791/52867 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Атомно-силовая микроскопия (АСМ) генерирует изображение поверхности путем сканирования через область образца с помощью кантилевера с очень острым наконечником 1. Движение кантилевера зондов топологии поверхности образца. АСМ широко применяется для биологических молекул - в том числе белков, ДНК и мембран, благодаря своей универсальности в анализе основных образцов в воздухе или вблизи родного государства в жидком 2-5.

Помимо своей способности изображения с высоким разрешением в нанометровом диапазоне, консольные АСМ действует как пружина, чтобы исследовать силы взаимодействия (адгезионные и отталкивания) и механические свойства образца 5,6. Это известно как силовой спектроскопии. В этом режиме датчик первая подходы образец и оказывает силовое воздействие на него, а затем втягивается, пока он не теряет контакт с образцом (фиг.1А). Сформированные кривые показывают силы как функции расстояния от кантилевера, как для приложенияплотва и отвод. Некоторые свойства, включая модуль упругости для измерения жесткости материала, и силы адгезии могут быть получены.

Поддерживаемые липидных бислоев биологические модели мембраны, лежащие на верхней части твердой подложке - обычно слюда, боросиликатное стекло, плавленый кварц, или окисленного кремния 7. Они готовятся с использованием различных методов, как осаждения везикул, метод Ленгмюра-Блоджетт и спин-покрытия 8,9. АСМ была использована, чтобы следовать за формирование этих поддерживаемых бислоев 10, и зонд различные структуры, образованные мембранами различных композиций 11-15.

Выполнение силовой спектроскопии на поддерживаемых Бислои результатов в пик на кривой подхода. Этот пик указывает на усилие, необходимое для прокалывания бислой, и называется прорывом силой. Толщина бислой можно также измерить с помощью силы кривая 6. Типичный прорыв сила бислоямиДиапазон между 1-50 NN 6. Эти свойства зависят от липидного упаковки (жидкостью или гелем фаза) и структуры (ацил длины цепи и степени ненасыщенности) и изменено мембранных-активных веществ 16. Теория за разрыва было объяснено 17 и другие экспериментальные параметры, такие как консольной мягкости, радиус наконечника и скорости захода на посадку также влияют на прорыв силу 15,16,18. Сила спектроскопии был использован для анализа свойств различных фаз липидов, состав 11,19-зависимой изменений 12,20, а также влияния других биомолекул, таких как пептиды, на стабильность мембраны 21.

Плоская ориентация поддерживаемых бислоев выгодно для объединения АСМ с другими методами, такими как поверхностный плазмонный резонанс 22 и флуоресцентной микроскопии 11,19, чтобы лучше охарактеризовать структуру и свойства мембран.

Это подробное видео протокол предназначен для подготовки поддерживаемые бислоев путем осаждения везикул и анализировать их с АСМ и силовой спектроскопии. В то время как пузырьки различных размеров могут быть использованы для получения двойных слоев, этот протокол фокусируется на малых и больших однослойных везикул. Поддерживаемые бислои, что разделение фаз в жидкость приказал (Л О) и жидких (неупорядоченных L D) фазы характеризуются 11,15. Мембрана состоит из ди-олеоил-фосфатидилхолина (DOPC), сфингомиелина (SM), и холестерина (Хол) в 2: 2: 1 отношение. Эта композиция модели липидные рафты, которые предлагаются для себя в качестве платформ для торговли важных белков и сортировки, клеточной сигнализации и других клеточных процессов. 23,24

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка поддерживаемых липидного бислоя (SLB) 11,12,21

  1. Подготовка смеси липидов и многослойные везикулы, суспензий
    1. Подготовьте следующие буферы заранее.
      1. Подготовка PBS буфера при концентрациях 2,7 мм KCl, 1,5 мМ KH 2 PO 4, 8 мМ Na 2 HPO 4, и 137 мм NaCl, рН 7,2.
      2. Подготовьте SLB (поддерживаются липидного бислоя) буфере при концентрации 150 мМ NaCl, 10 мМ HEPES, рН 7,4.
      3. Приготовьте раствор 1 М CaCl 2.
    2. Растворите следующих липидов в хлороформе в желаемой концентрации, например, ди-олеоил-фосфатидилхолин (ДОФХ) при 25 мг / мл, сфингомиелина (SM) в дозе 25 мг / мл и холестерин (Чхором) в дозе 10 мг / мл.
    3. Возьмите 18,38 мкл ДОФХ 17,10 мкл SM и 11.30 мкл Чхоль, чтобы решение с 1 мг общих липидов в 2: 2: 1: ДОФХ молярном соотношении Чхоль: SM. Вары объемы соответственно на основе Concentrations липидов, полученных в 1.1.2. Тем не менее, поддерживать молярное соотношение в 2: 2: 1: SM DOPC: ХОЛ, так как изменение молярное соотношение будет меняться фазовые характеристики мембраны 25.
    4. Смешайте раствор полностью встряхиванием. Добавить флуоресцентный краситель на липидный 0,05 мольных%, если мы хотим визуализировать бислой путем флуоресцентного микроскопа.
      Примечание: семейство длинноцепочечных dialkylcarbocyanines, как сделал, DiI и DiO охватывают широкий диапазон длин волн, и может быть идеально используется для обозначения липидные мембраны. В качестве альтернативы, флуоресцентно меченных липидов, такие как родамин-фосфатидилэтаноламин или BODIPY-холестерина может быть использован. В любом случае, концентрация красителя должен быть оптимизирован в соответствии с настройкой микроскопии, имея в виду, что высокие концентрации флуорофора, связанного с липидами могут изменить липидный поведение 19.
    5. Вытрите хлороформ, используя N 2 газа (или любой доступный инертный газ, такой как Ar и He).
    6. Кроме того сухой тон липидной смеси в вакууме в течение по крайней мере 1 часа.
      Примечание: При хранении этого липидной смеси, удаления воздуха инертным газом (N2, Ar или He) и хранят при -20 ° С. Алиготе избыток липидов в хлороформе-в небольших коричневых флаконах. Сушат их в аналогичным образом, как липидной смеси, вытеснять воздух инертным газом (N2, Ar или He) и хранят при -20 ° С.
    7. Растворите высушенных липидов в PBS буфере до концентрации 10 мг / мл.
    8. Вихревой смесь энергично в течение приблизительно 20 секунд до 1 минуты, чтобы получить мутной суспензии, содержащие многослойные везикулы. Убедитесь, что нет липидные пленки прилипать к бокам флакона.
    9. Распространение этой суспензии в 10 мкл аликвоты (1 мг липида составляет 10 аликвот).
    10. Хранить при -20 ° С до дальнейшего использования.
  2. Подготовка однослойные везикулы
    Примечание: Различные размеры однослойные везикулы могут быть получены с использованием метода ультразвуковой обработки или методом экструзии. Озвучивание использует Sкруглый энергии перемешивание смеси и отделить слои многослойного суспензии. Об этом свидетельствуют прояснения туманной подвески. Экструзия заставляет многослойные везикулы пройти через мембранный фильтр с определенным размером пор.
    1. Метод Озвучивание
      1. Возьмите 10 мкл суспензии многослойных липидных и добавить 150 мкл буфера SLB.
      2. Передача смесь в небольших (2 мл) крышками стеклянных флаконах и печать с парафильмом.
      3. Разрушать ультразвуком смесь при комнатной температуре в ванне для обработки ультразвуком в течение 10 мин или пока не станет ясно, чтобы давать небольшие однослойные везикулы (SUV, ниже 50 нм в диаметре).
    2. Экструзионная Метод
      1. Возьмите 10 мкл суспензии многослойных липидных и добавить 150 мкл буфера SLB.
      2. Передача суспензии в криогенной трубе.
      3. Замораживание липидную суспензию путем погружения в криогенную трубу в течение нескольких секунд в жидкий азот.
      4. Оттепельлипидную суспензию путем погружения в криогенную трубу на водяной бане при комнатной температуре или 37 ° С в течение нескольких минут. Повторите шаги замораживания-оттаивания, по крайней мере в 10 раз.
      5. Для того, чтобы экструдировать липидную суспензию, используют поликарбонатную мембрану с размером 200 нм пор (другие размеры пор доступны, как, 100 нм или 400 нм) и коммерческий экструзии устройство 26.
        Примечание: В настоящее время существует два экструдера устройства коммерчески доступны: ручной экструдер для малых объемов (200 мкл до нескольких мл). В этом случае образец подвергают экструзии через мембрану вручную нажатием подвеску туда и обратно между двумя шприцами. В зависимости от производителя, липидов аликвоты должны быть объединены, чтобы достичь минимального объема настроить. Для больших объемов (до 50 мл) и более сложные устройства используются, в котором суспензию продавливают через поликарбонатную мембрану с помощью сжатого газа. Установка и экструзионные условия могут меняться в зависимости от модаэль. Перед использованием обратитесь к инструкции от производителя. Этот протокол относится к ручной экструдер для небольших объемах.
      6. Равновесие экструдера в воде при прохождении воды через экструдер. Погрузите мембрану в воду.
      7. Поместите мембрану между двумя поршнями, собрать устройство и уравновешивают в буфере, пропусканием буфера через экструдер, из одного шприца в другой. Этот шаг позволяет дополнительно тестирования неплотности системы. Если он попадает, разобрать и собрать его снова изменения мембраны.
      8. Возьмите липидную суспензию, используя один шприц экструдера ("грязная сторона").
      9. Прикрепите шприц, содержащий липидную суспензию на одной камере и пустой шприц на противоположной камере.
      10. Нажмите шприц на одном конце. Pass раствор через мембрану и в противоположной шприца. Это 1-й проход.
      11. Передайте это через мембрану в общей сложности 31 раз такихчто решение заканчивается на противоположной шприца ("чистой стороне ').
        Примечание: Проверьте мембрану после экструзии. Если была нарушена, то процесс экструзии не был успешным, и должен быть повторен.
      12. Опорожнить шприц в трубочку. Большие однослойные везикулы (БУВ) стабильны в течение 1-2 дней при хранении при 4 ° С.
  3. Подготовка Mica и покровные
    1. Промыть покровные сначала в воде, а затем в этаноле. Воздушная сушка.
    2. Возьмите слюды диски и шелушиться внешний слой с помощью клейкой ленты.
    3. Прикрепите слюды диск на покровное. Прозрачные оптические клеи являются оптимальными, так что можно проверить бислои с флуоресцентным микроскопом.
    4. Прикрепите пластиковые цилиндры (2,5 см Наружный диаметр 2 см внутренний диаметр, и 0,5 см высоты), используя оптический клей / смазку. Убедитесь, что все запечатаны, и что нет никаких утечек. Используйте смазку, когда требуется повторно использовать цилиндры, поскольку они могут быть легко отделены от йе покровное и промывают. Размеры пластиковых цилиндров зависит от размера держателя кантилевера АСМ и должны быть соответствующим образом скорректированы.
  4. Нанесение однослойных везикул на твердом носителе
    1. Внесите вся липосомы решение непосредственно на слюду. Добавить еще SLB буфер для достижения объема 300 мкл.
    2. Добавить 0,9 мкл 1 М раствора хлорида кальция, чтобы достичь конечной концентрации 3 мМ Ca 2+.
    3. Инкубируют при 37 ° С в течение 2 мин, а затем при 65 ° С в течение не менее 10 мин. Всегда покрытия бислоев буфером. Связаться с воздуха и воздушных пузырьков будет уничтожить его. Во время инкубации, добавить больше буфера, если это необходимо, особенно если инкубации при более высоких температурах.
      Примечание: температура инкубации варьироваться в зависимости от липидных смесей и фаз требуется. Время инкубации, по крайней мере, 10 мин необходим, чтобы сформировать поддерживаемые бислоев, но это может быть больше, в зависимости от температуры и состава.
    4. Мытьдвухслойная с горячей (65 ° С) SLB буфера в 15-20 раз для удаления кальция и неслитых пузырьки. Будьте особенно осторожны во время этапов промывки, чтобы сохранить бислой под буфер и осторожно пипеткой моющий раствор, чтобы избежать уничтожения бислой.
    5. Классные поддерживаемые бислои до комнатной температуры перед АСМ. Это необходимо для формирования различных фаз мембраны, а также свести к минимуму тепловой дрейф в приборе.

2. Атомно-силовая микроскопия Измерения 11,12

  1. Изображений
    Примечание: Выполнение микроскопии изображений атомно-силовой контакт в режиме или режиме, нажав. Поддерживаемые графические бислои в растворе; не позволяют раствор испаряется полностью, как это будет уничтожить бислои. Как и следовало работать с буфером, пожалуйста, соблюдайте меры предосторожности при убедившись, что любая часть АСМ защищен от пролитой жидкости.
    1. Выберите мягкую консоль (ниже 0,2 Н / м пружины рекомендуется) и установите его на тон АСМ. Выбор жесткость кантилевера является более важным для силовой спектроскопии (и это будет обсуждаться позже).
    2. Установите образец на этапе АСМ и убедитесь, что все модули вибрации изоляции включены. Подождите, по крайней мере, 15 мин, чтобы уравновесить и уменьшить температурный дрейф системы. В зависимости от AFM установки, настройки и визуализации характеристики могут различаться. Проконсультируйтесь руководство производителя.
    3. Подход образца с иглы АСМ до контакта.
    4. Так липидных двойных слоев, как правило, 4 нм в высоту, используйте Z-диапазон инструмента, который даст наибольшее Z-разрешение (например 1,5 мкм).
    5. Выберите регион к изображению. Чтобы получить представление о липидного бислоя, 50 мкм х 50 мкм или 25 мкм х 25 мкм область будет хорошей отправной точкой для изображения. Если появляются мелкие особенности, одна CAN изображения в небольших районах (10 мкм х 10 мкм, или 2 мкм х 2 мкм). Выбор области изображения также зависит от рабочей тAnge пьезоэлектрического сканера. Пожалуйста, обратитесь к руководству инструмент для этого.
    6. Как бислои очень хрупкие, регулировать уставку наконечника AFM во время съемки, чтобы сохранить силы на минимум и правильно для теплового дрейфа, сохраняя контакт с образцом. В контактном режиме, минимизировать уставки. В режиме разговоров, максимально уставки.
    7. Изображения процесса по установке каждую строку сканирования для полиномиальных функций выравнивания. Выполнить удаление строки для сканирования, которые теряют контакт с мембраной, используя собственное программное обеспечение производственного АСМ компании.
  2. Силовая спектроскопия
    1. Калибровка кантилевера, следуя инструкциям в соответствии с протоколом производителя. Калибровка позволяет преобразование электрического сигнала фотодиодов с силой (фиг.1В).
      1. Калибровка чувствительности кончика к измерению отклонения как движение г-пьезо (в единицах длины) вместо электрического сигнала в вольтах.
      2. Вычислить консольные жесткости пружины методом теплового шумы, как правило, включены в программное обеспечение АСМ. В этом методе, участок амплитуду вибрации от шума по отношению к частоте колебаний, создавая плотность мощности участок спектра. Этот участок будет показывать пик около резонансной частоты. Частота, на которой амплитуда яS большой резонансная частота. Установите функцию лоренцевскую вокруг пика для автоматического расчета жесткость пружины с помощью программного обеспечения. Некоторые полезные ресурсы для теории метода теплового шума приведены в ссылках 27-30.
    2. После визуализации площадь бислоя, выберите х 5 мкм область 5 мкм бислоя для выполнения силовой спектроскопии.
    3. Настройте АСМ так, что она занимает кривые силы в 16 х 16 сетке этом регионе. Это приводит к 256 кривых силы в регионе. Пространство между двумя соседними точками должно быть достаточно, чтобы избежать площадь мембраны зондируемой одной точки будет совпадать со следующей точки. Это зависит от радиуса вершины. 100 нм Расстояние между двумя точками будет идеальным. Разделите х 5 мкм 5 мкм регион в 16 х 16 сетке. В зависимости от размера фазе, можно выбрать меньшую или большую область, а затем отрегулировать размер сетки, соответственно.
    4. Установите г-пьезо смещение в400 нм. Это определяет максимальный диапазон движения г-пьезо. Он должен быть достаточно большим, чтобы убедиться, что консольные полностью отказался от образца между измерениями.
    5. Установите скорость захода на посадку до 800 нм / сек и скорость втягивания 200 нм / сек. Использование скорость захода на посадку между 400 до 6000 нм / с в зависимости от состава бислой и липидную фазу, чтобы быть изучены 6,16.
    6. После настройки всех параметров, приобретать кривые силы, нажав на кнопку "Выполнить" программного обеспечения АСМ.
    7. Сохранить кривые силы, как силы против кривых высота (мера движения г-пьезо). Это не принимает во внимание изгиб кантилевера в контакте с образцом. На этапе обработки данных, программное обеспечение АСМ позволяет коррекцию изгиба кантилевера, чтобы получить силу против кривых расстояния зонд-образец (рис 1в), которые дадут правильные значения для толщины бислоя. Значения поправок, как правило, включены в Calibrвания, которая сохраняется с каждой кривой силы. Рассчитать расстояние зонд-образец путем вычитания вертикальное отклонение от движения пьезо в данной точке.
      Примечание: Пик на кривой подход силы (сила значение снижается, даже если движение кантилевера еще на цикле подход) является прорыв сила мембраны, в то время как разница между положением пика и положением точки где сила начинает расти снова обеспечивает толщину мембраны.
    8. Приобретать по крайней мере, 500 кривые силы для каждого состояния, чтобы получить хорошую статистику. Постройте гистограмму значений с помощью таких программ, как происхождения или MatLab, и подходят гистограммы для распределения Гаусса, чтобы получить пик и ширину распределения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Поддерживаемые липидных бислоев, состоящие из DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) были обследованы в АСМ (Фигура 2 переменного тока). Из-за липидной композиции, наблюдались СМ / Чхор богатых L O и ДОФХ богатые L D фазы. Высота профиля от АСМ может предоставить важную информацию о структуре мембраны. Глядя на профиль высоты, толщина бислой может быть измерена в наличии дефектов в мембране (фиг.2В), или разница в высоте между L O / L D фаз может быть обеспечена. Кроме того, АСМ позволяет конкретно укажите регионы, представляющие эти этапы и анализировать их механические свойства, используя силовой спектроскопии (рис 2 D - F). Кривые силы, полученные в режиме силовой спектроскопии используются для измерения силы прорыв, находя значение силы на пике силы кривой (рис 2D и E), и MembrТолщина ане путем вычитания расстояния от пика кривой силы на значение расстояния, когда кривая сила начинает расти снова (рис 2D и F).

Чувствительность АСМ зависит от пьезоэлектрического материала и петель электронных обратной связи. Таким образом, прежде чем делать экспериментов, важно, чтобы ознакомиться с AFM создана. Есть два общих инструмент создан для пьезоэлектрических материалов: (1) сканера трубка, в которой образец помещается в верхней части пьезоэлектрического материала и образец сканируется на неподвижной наконечником; или (2) изгиба ступени, где наконечник установлен на пьезоэлектрическом материале вместо образца. В последнем случае, пьезоэлектрический материал и другие электронные устройства защищен от разливов. Многие модели АСМ для биологических применений имеют такую ​​конфигурацию.

Во время визуализации, наконечник АСМ может потерять контакт с образцом и привести к ошибочным меняasurements. В зависимости от того, сколько сканирует теряются, изображения могут быть исправлены путем удаления строк развертки и с помощью среднего фильтр интенсивности, чтобы получить новые значения из окрестностей (рис 3). Однако в большинстве случаев, это не дает хорошее изображение и рекомендуется, чтобы просто отказаться от изображения. Есть другие артефакты, которые должны быть проверены. Они возникают из тупых / поврежденных / грязных советов, а также дифракции лазерного пятна за кантилевера 31. В этих случаях изображения должны быть отброшены, и игла АСМ следует заменить.

Во время измерений спектроскопии силы, несколько проблем могут возникнуть: (1) отсутствие пиков (рис 4А), (2) наличие плечи вместо хорошо выраженные пики (рис 4б), (3) небольшое повышение и последующее плато в при очень низких Силы (фиг.4С - D). Отсутствие пика может быть отнесена к измерению в области без BILУсловия Айер или приобретения не оптимизированы. Рекомендуется АСМ изображение приобретается, прежде чем делать силовой спектроскопии, чтобы убедиться, что двухслойная действительно измеряется. Условия приобретения, а также характеристики наконечник / консольные влияет на вероятность прорыва случае 17. Острее кончик может легко проткнуть бислой, как таковой, прорыв сила может появиться низкий или не появляется вообще, потому что это ниже уровня шума. , Увеличение скорости захода на посадку и увеличивает силу прорыв 16. В бислой нажатии наконечником, липидные молекулы реагируют также рассеивать эту силу. При более низкой скорости захода на посадку, липидный бислой имеет достаточно времени, чтобы уравновесить до следующего шага в силу, и это увеличивает вероятность того, что прорыв может произойти событие. При более высокой скорости захода на посадку, сила пандусы быстрее, чем реакции липидов и, таким образом, вероятность прорыва случае ниже на той же силой. Это ПОССмых, что с помощью высокой скорости захода, уставка будет достигнута до двухслойных перерывов в результате каких-либо наблюдаемых пиков. Там нет никаких сообщений, объясняющих появление плечи на кривой, но мы допускаем, что это может быть из-за материальной сжатия до прорыва. Кроме того, плато или широкие пики при очень низких силах может указывать на наличие грязи или сыпучего липидного материала в наконечнике. Советы могут накапливаться грязь и липидный материал в протяжении нескольких измерений. Грязь и материал прикреплен к наконечнику дает тупые, тем самым увеличивая силу прорыв.

Рекомендуется, что кривые силы приобретаются в различных областях, если возникают эти проблемы. Вторая рекомендация заключается в изменении советы (это потребует калибровки). Наконец, скорость подход может должны быть скорректированы или использование наконечника с различными спецификациями (радиус наконечника и жесткости) могут быть рассмотрены. Прорыв сила колеблется между 0-50 NN 6, как таковой, тон пружины кантилевера может быть в диапазоне от 0.05-0.7 Н / м. Большинство коммерческих консоли имеют номинальную радиус закругления около 20-40 нм. Вместо того чтобы использовать обычные советы, tipless консоли также можно купить и сферы известным радиусом (которые, как правило, монодисперсными в распределении размера) может быть присоединен к ним. Чтобы получить воспроизводимые данные, всегда используют одни и те же условия сбора и спецификации консольные по той же серии экспериментов.

Фигура 1
Рисунок 1: Принципы силовой спектроскопии () Последовательность подвода-отвода кантилевера от образца.. Красная линия показывает отклонение кантилевера от положения равновесия (черная линия). (Б) калибровка Консольные преобразует электрический сигнал (в вольтах), чтобы заставить (в ньютонах). По приобретению консольной Сенсительность и пружины вертикального отклонения (в вольтах) преобразуется в расстояние и расстояние в силу, используя закон Гука. (С) При контакте в измерениях силы спектроскопии, движение сканирования г-пьезо не принимать во внимание консольный изгиб. Поправка на это может быть сделано путем вычитания вертикальное отклонение х (в единицах расстояния) от движения г-пьезо, г (также в единицах расстояния). Таким образом, фактическое разделение между образцом и зондом, а не просто движением Z-пьезо, могут быть представлены, который является более точным показателем расстояния и важно, чтобы измерить толщину образца.

Рисунок 2
Рисунок 2:. АФМ SLBS () Схема SLBS, состоящей из ДОФХ: SM: Чхоль (2: 2: 1) отделить в жидкость неупорядоченной (L D) и жидкости (L упорядоченной о) фаз. (С) соответствует желтый квадрат в B (10 мкм х 10 мкм). L O и L D фазы помечены. Профиль линии ниже соответствует желтой линии на изображении. Л О появляется фаза 1-2 нм выше, чем L-фаза. (D), образец кривой силы показывает, как прорыв сила и толщина мембраны получены. (Е) Прорыв сила и (F), мембранный распределение толщины для L D и L O фаз с гауссовой фитинга для количественного определения.

Рисунок 3
Рисунок 3: Потеря контакта во время съемки приводит к. сканирования строки, которые не соответствуют остальной части изображения поддерживается бислой, состоящий из ДОФХ: SM: Чхоль (2: 2: 1) с потерей контакта в некоторых сканирования строки. Масштабная линейка 2 мкм.

Рисунок 4
Рисунок 4:. Проблемы силовой спектроскопии () Некоторые кривые силы не будут иметь пики. (B), кривая может иметь плечи, а не хорошо выраженных пиков. (С) После незначительного роста плато может иметь место в отсутствие пика. (D) Внешний вид плато вместе с хорошо выраженный пик.

Мембрана область Прорыв группы (NN) Мембрана Толщина (нм)
L D фазы 6 ± 1 4.7 &# 177; 0,5
Л О фаза 8 ± 1 6 ± 1

Таблица 1: Мембранные свойства DOPC: SM: Чхор (2: 2: 1). SLBS L D фаза имеет прорыв силу 6 ± 1 пп и толщину 4,7 ± 0,5 нм. Л О имеет 8 ± 1 пп и толщину 6 ± 1 нм. Разница в высоте между двумя фазами составляет 2 ± 1,4 нм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SLBS состоящие из DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) были сформированы на слюде после везикул адсорбции и разрыва, индуцированного хлоридом кальция. Это липидный состав разделяется на L D и L O фаз. Л О фаза обогащается сфингомиелин и холестерина и меньше жидкости / более вязким (1А), чем L-фазе 11. Разделение л о с л-фаза проявляется как кольцевые структуры приподнят над окружающей (рис 1B, C). Платформы являются L O фазы, окруженные L D фаз. Мембранные дефекты (или отверстия в мембране) также видно (рис 1B, синяя стрелка) и высота профиля по этим дефектом показывает толщину бислоя. / L O разница по высоте L D также могут быть рассмотрены, глядя на профиль высоты АСМ (рис 1в).

Приготовление липидаСмесь очень важно, поскольку состав определяет свойства двухслойных. В ходе подготовки поддерживаемого бислой, важно работать при указанных температурах для правильного формирования липидных фаз (этап 1.4.5). Во изображений, сохраняя низкую силу очень важно, чтобы не разрушить бислой, ни накапливаться грязь на кончике.

После АСМ, регионы SLB выбраны и исследовали с помощью силовой спектроскопии. Силовая спектроскопия позволяет исследовать другие свойства мембраны, в частности, прорыв силы (рис 1D). L D и L O фаз показать другую прорыв силы и толщины (рис 1E, F). Свойства представлены в таблице 1. Отметим, что по сравнению с Chiantia и др. 11, были получены аналогичные значения для прорыва в силу L D фазе, но более низкое значение для L O фазы. Это может бытьиз-за снижения количества холестерина, используемого в наших мембран (мы использовали DOPC: SM: соотношение Чхоль 2: 2: 1, в то время как они использовали 1,5: 1,5: 1). Это также показывает важность смешивания правильный липидов соотношение - критический фактор в воспроизводимости результатов. Кроме того, используя различные липиды (длина цепи и степени ненасыщенности) также изменяет свойства двухслойных 6,15,18.

В то время как построение распределение прорыва сил полезно и может уже показать различия в свойствах двухслойных, дальнейший анализ распределения прорыв сила может быть использована, чтобы вывести другие механические свойства, включая линии напряжения и распространение давление 11,17,21. Вкратце, вероятность P (F) измерения определенный прорыв силы, F, описывается сплошной нуклеации модели 11,15,17:

Уравнение 1

где это Resonaсть частоты кантилевера, К пружины кантилевера, v является скорость подхода, Γ является линия натяжения (край энергия, необходимая, чтобы держать отверстие в мембране открытой), R является радиус АСМ Наконечник, к B постоянная Больцмана, Т температура и S является распространение давление или энергия, связанная, чтобы закрыть отверстие (напротив мембраны напряженности - энергия, необходимая, оказываемое на мембрану, чтобы открыть отверстие 32). Это уравнение может быть интегрирована и DP / дР может быть рассчитана как:

Уравнение 2

, К, Р, являются собственностью АСМ кантилевера / наконечником которые могут быть приобретены путем калибровки кантилевера. Т и V являются экспериментальные параметры, которые должны быть постоянным в течение эксперимента. DP / дР затем устанавливают на гистограмме, чтобы приобрести линии напряженности и распространения давления. Как несколько параметров влияет P (F), экспериментовменталисты рекомендуется использовать подобные советы и условия приобретения, чтобы иметь сопоставимые значения для линии напряженности и распространения давления. Загрязнение иглы АСМ (в том числе пыли и слитых везикул на кончике приобретенного во время съемки) приводит к невоспроизводимых результатов. Кроме того, выбор поддержки влияет на механические свойства мембраны 20.

Другой метод, который можно охарактеризовать механические свойства липидного бислоя является микропипетка стремление гигантских однослойных везикул (GUVs) 33. В этой технике, мембраны натяжения рассчитывается из деформации GUVs во время аспирации. Кроме того, за счет увеличения всасывания, можно рассчитать напряжение, при котором GUV разрывы (или лизиса напряжения) 34, которые могут быть связаны с напряжения линии в модели континуума нуклеации. Один из недостатков этого методов является сложность расчета мембраны натяжение мембраны разделения фаз, а на другом ФГАSES имеют различные механические свойства 35. Это в отличие от АСМ-силовой микроскопии, где отдельные фазы можно охарактеризовать по отдельности. Кроме того, в то время как многие GUVs необходимы для получения статистически релевантные результаты, АСМ может производить один дистрибутив за SLB. Тем не менее, мембранные реконструкции эффекты (например, tubulation и инвагинации) более легко визуализируют с помощью GUVs, что делает их более совершенных систем, характеризующих эти связанные формы-эффекты вместе с механическими свойствами.

В дальнейших приложений для изучения последствий мембранных белков на свойства двухслойных, очищенные белки могут быть включены в эти пузырьки, чтобы Протеолипосомы. Один из способов сделать это использует моющие средства, чтобы помочь стабилизировать белки и вставьте в мембрану. После очистки с помощью диализа или гель-хроматографии удаляет свободные белки и моющее средство в растворе 36. Другой подход требует маркировкуочищенные белки (например, гистидин или стрептавидином теги) и включающих сродства партнеров для этого тега в липосомы (с никелевым нитрилуксусная кислоты (Ni-NTA) или биотинилированными липидов).

В целом, мы описали метод для анализа липидных двойных. Благодаря высоким разрешением, АСМ может выявить суб-микрометра структуры в мембране, которые включают липидные фазы среди других. Силовая спектроскопия, здесь используется для характеристики липидные мембраны, также могут быть использованы на мембранных белков и других биомолекул на мембране.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Общества Макса Планка, в Немецкий центр исследований рака, Университет Тюбингена, и Bundesministerium für Bildung унд Forschung (грант №. 0312040).

Мы благодарим Эдуарда Германа за помощь в автоматизации анализа данных кривой силы и д-р Якоб Suckale для внимательного прочтения этой рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids, Inc. 850375P Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sphingomyelin (Brain, Porcine) Avanti Polar Lipids, Inc. 860062P Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Cholesterol Avanti Polar Lipids, Inc. 700000P Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sodium chloride (NaCl), 99.8% Carl Roth GmbH + Co. KG 9265.1
Potassium chloride (KCl), 88% Sigma P9541
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% AppliChem GmbH A1046
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% Carl Roth GmbH + Co. KG 3904.1
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade AppliChem GmbH A4689
HEPES, molecular biology grade AppliChem GmbH A3724
Glass coverslip, 24 x 60 mm, 1 mm thickness Duran Group 2355036
Punch and Die Set Precision Brand Products, Inc 40105
Optical Adhesive Norland Products, Inc. NOA 88 Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. 
Name Company Catalog Number Comments
Mica blocks NSC Mica Exports Ltd. These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.  Always handle mica with gloves or tweezers.
Laboratory Equipment Grease Borer Chemie AG Glisseal N
Liposome Extruder Avestin LiposoFast-Basic As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.
Adhesive Tape 3M Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)
Bath Sonicator Bandelin Sonorex Digitec DT-31 No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (Data sheet)
Silicon Nitride AFM Cantilever  Bruker AFM Probes DNP-10 Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.
AFM JPK JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).
  2. Hansma, P. K., Elings, V. B., Marti, O., Bracker, C. E. Scanning Tunneling Microscopy and Atomic Force Microscopy: Application to Biology and Technology. Science. 242, 209-216 (1988).
  3. Gaczynska, M., Osmulski, P. A. AFM of biological complexes: What can we learn. Curr, Opin. Colloid In. 13, 351-367 (2008).
  4. Goksu, E. I., Vanegas, J. M., Blanchette, C. D., Lin, W. -C., Longo, M. L. AFM for structure and dynamics of biomembranes. BBA-Biomembranes. 1788, 254-266 (2009).
  5. Muller, D. J. AFM: A Nanotool in Membrane Biology. Biochemistry-US. 47, 7986-7998 (2008).
  6. Redondo-Morata, L., Giannotti, M. I., Sanz, F. Atomic Force Microscopy in Liquid: Biological Applications. Baró, A. M., Reifenberger, R. G., Sanz, F. Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).
  7. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).
  8. Frederix, P. L. T. M., Bosshart, P. D., Engel, A. Atomic Force Microscopy of Biological Membranes. Biophys. J. 96, 329-338 (2009).
  9. Mennicke, U., Salditt, T. Preparation of Solid-Supported Lipid Bilayers by Spin-Coating. Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).
  10. Raviakine, I., Brisson, A. R. Formation of Supported Phospholipid Bilayers from Unilamellar Vesicles Investigated by Atomic Force Microscopy. Langmuir. 16, 1806-1815 (2000).
  11. Chiantia, S., Ries, J., Kahya, N., Schwille, P. Combined AFM and Two-Focus SFCS Study of Raft-Exhibiting Model Membranes. ChemPhysChem. 7, 2409-2418 (2006).
  12. Unsay, J., Cosentino, K., Subburaj, Y., Garcia-Saez, A. Cardiolipin effects on membrane structure and dynamics. Langmuir. 29, 15878-15887 (2013).
  13. Domènech, Ò, Sanz, F., Montero, M. T., Hernández-Borrell, J. Thermodynamic and structural study of the main phospholipid components comprising the mitochondrial inner membrane. BBA-Biomembranes. 1758, 213-221 (2006).
  14. Domènech, Ò, Morros, A., Cabañas, M. E., Teresa Montero, M., Hernández-Borrell, J. Supported planar bilayers from hexagonal phases. BBA-Biomembranes. 1768, 100-106 (2007).
  15. Garcia-Saez, A. J., Chiantia, S., Schwille, P. Effect of line tension on the lateral organization of lipid membranes. J Biol Chem. 282, 33537-33544 (2007).
  16. Alessandrini, A., Seeger, H. M., Caramaschi, T., Facci, P. Dynamic Force Spectroscopy on Supported Lipid Bilayers: Effect of Temperature and Sample Preparation. Biophys. J. 103, 38-47 (2012).
  17. Butt, H. -J., Franz, V. Rupture of molecular thin films observed in atomic force microscopy I. Theory. Physical Review E. 66, 031601 (2002).
  18. Garcia-Manyes, S., Oncins, G., Sanz, F. Effect of Temperature on the Nanomechanics of Lipid Bilayers Studied by Force Spectroscopy. Biophys. J. 89, 4261-4274 (2005).
  19. Chiantia, S., Kahya, N., Schwille, P. Raft domain reorganization driven by short- and long-chain ceramide: a combined AFM and FCS study. Langmuir. 23, 7659-7665 (2007).
  20. Canale, C., Jacono, M., Diaspro, A., Dante, S. Force spectroscopy as a tool to investigate the properties of supported lipid membranes. Microsc. Res. Techniq. 73, 965-972 (2010).
  21. García-Sáez, A. J., Chiantia, S., Salgado, J., Schwille, P. Pore Formation by a Bax-Derived Peptide: Effect on the Line Tension of the Membrane Probed by AFM. Biophys. J. 93, 103-112 (2007).
  22. Moreno Flores, S., Toca-Herrera, J. L. The new future of scanning probe microscopy: Combining atomic force microscopy with other surface-sensitive techniques, optical microscopy and fluorescence techniques. Nanoscale. 1, 40-49 (2009).
  23. Simons, K., Vaz, W. L. C. Model Systems, Lipid Rafts, and Cell Membranes1. Annu. Rev. Bioph. Biom. 33, 269-295 (2004).
  24. Pike, L. J. Rafts defined: a report on the Keystone symposium on lipid rafts and cell function. The Journal of Lipid Research. 47, 1597-1598 (2006).
  25. Kahya, N. Probing Lipid Mobility of Raft-exhibiting Model Membranes by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).
  26. Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation and applications. Nanoscale Research Letters. 8, 102 (2013).
  27. Butt, H. -J., Jaschke, M. Calculation of thermal noise in atomic force microscopy. Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).
  28. Chon, J. W. M., Mulvaney, P., Sader, J. E. Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids. Journal of Applied Physics. 87, 3973 (2000).
  29. Sader, J. E. Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope. Journal of Applied Physics. 84, 64 (1998).
  30. Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope. Journal of Applied Physics. 97, 12490310 (2005).
  31. Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).
  32. Lee, M. -T., Chen, F. -Y., Huang, H. W. Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides. Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).
  33. Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration. The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).
  34. Nichols-Smith, S., Teh, S. -Y., Kuhl, T. L. Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes. BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).
  35. Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration. Phys. Rev. Lett. 98, (2007).
  36. Rigaud, J. -L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics