כוח האטומי מיקרוסקופית הדמיה וחיל ספקטרוסקופיה של bilayers שומנים הנתמכים

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers. J. Vis. Exp. (101), e52867, doi:10.3791/52867 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

מיקרוסקופית כוח אטומי (AFM) מייצר תמונה של פני השטח על ידי סריקה על פני שטח של המדגם באמצעות שלוחה עם קצה חד מאוד 1. התנועה של שלוחה חוקרת את הטופולוגיה של מדגם המשטח. AFM כבר מיושם באופן נרחב למולקולות ביולוגיות - כוללים חלבונים, DNA, וקרומים, בשל צדדיות שלה בניתוח דגימות קבועות באוויר או מצב כמעט טבעי בנוזל 2-5.

מלבד יכולת ההדמיה ברזולוציה הגבוהה שלה בטווח ננומטר, שלוחה AFM פועלת כקפיץ לחקור כוחות אינטראקציה (הידבקות ודחייה) ותכונות מכאניות של המדגם 5,6. התופעה זו ידועה בכח ספקטרוסקופיה. במצב זה, החללית מתקרבת ראשונה המדגם ומפעילה כוח על זה, ואז הוא חזר עד שהוא מאבד קשר עם המדגם (איור 1 א). עקומות שנוצרו להראות כוח כפונקציה של מרחק של שלוחה לשתי האפליקציהמקק והכחשה. מספר נכסים כוללים מודולוס האלסטיות למדוד את הנוקשות של חומר, וניתן לגזור כוחות ההידבקות.

bilayers שומנים הנתמכים הם קרומים ביולוגיים מודל שוכבים על גבי תמיכה מוצקה - בדרך כלל נציץ,, סיליקה הזכוכית בורוסיליקט התמזגה, או חמצון סיליקון 7. הם מוכנים תוך שימוש בטכניקות שונות כמו בתצהיר שלפוחית, שיטת אנגמיור-באגט וספין-ציפוי 8,9. ההדמיה AFM נעשתה שימוש כדי לעקוב אחר היווצרות bilayers הנתמכות הבאות 10, ולחקור מבנים שונים שהוקמו על ידי קרומים של קומפוזיציות שונות 11-15.

ביצוע כוח ספקטרוסקופיה על תוצאות bilayers נתמכות בשיא בעקומת הגישה. שיא זה מצביע על הכוח הדרוש כדי לחדור את bilayer, והוא נקרא כוח פריצת דרך. עובי bilayer גם ניתן למדוד באמצעות כוח העקומה 6. כוח הפריצה האופייני של bilayersטווח שבין 1-50 ננ 6. מאפיינים אלה תלויים באריזת שומנים (שלב נוזלי או ג'ל) ומבנה (אורך שרשרת acyl ומידת unsaturation) ושונה על ידי סוכני קרום פעיל 16. התאוריה מאחורי הקרע הוסברה 17 ופרמטרים ניסיוניים אחרים כגון רכות שלוחה, רדיוס קצה ומהירות גישה משפיעים גם על כוח פריצת הדרך 15,16,18. ספקטרוסקופיה הכוח נעשתה שימוש כדי לנתח את התכונות של שלבים שונים שומנים 11,19, שינויי הרכב תלוי 12,20, כמו גם השפעות של מולקולות ביולוגיות אחרות, כמו פפטידים, ביציבות של הקרום 21.

הנטייה השטוחה של bilayers נתמכת היא יתרון עבור שילוב AFM עם שיטות אחרות כגון מיקרוסקופיה תהודת 22 וקרינת המשטח plasmon 11,19 לאפיין מבנה ותכונות של ממברנות טובות יותר.

פרוטו וידאו מפורט זהcol נועד להכין bilayers שומנים נתמכים באמצעות תצהיר שלפוחית ​​ולנתח אותם עם AFM והכח ספקטרוסקופיה. בעוד שלפוחית ​​בגדלים שונים ניתן להשתמש כדי להכין bilayers, פרוטוקול זה מתמקד בשלפוחית ​​unilamellar קטנה וגדולה. bilayers נתמכת ששלב להפריד לנוזל הורה (o L) ושלבים נוזליים סדר L) התאפיינה 11,15. הקרום מורכב מdi-oleoyl-phosphatidylcholine (dOPC), sphingomyelin (SM), וכולסטרול (חול) בשעה 2: יחס 1: 2. דגמי הרכב זה רפסודות השומנים בדם, אשר הציעו להתנהג כפלטפורמות חשובות לסחר בחלבון ומיון, איתות תא ותהליכים תאיים אחרים 23,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת bilayers שומנים הנתמכים (SLB) 11,12,21

  1. הכנת תערובת שומנים והשעיות שלפוחיות Multilamellar
    1. הכן את המאגרים הבאים מראש.
      1. הכן חיץ PBS בריכוזים של 2.7 מ"מ KCl, 1.5 מ"מ KH 2 PO 4, 8 מ"מ Na 2 HPO 4, ו -137 מ"מ NaCl, pH 7.2.
      2. הכן SLB חיץ (bilayer שומנים הנתמכים) בריכוזים של 150 מ"מ NaCl, 10 מ"מ HEPES, pH 7.4.
      3. הכן פתרון של 1 M CaCl 2.
    2. ממיסים את השומנים הבאים בכלורופורם בריכוז רצוי: למשל, די-oleoyl-phosphatidylcholine (dOPC) במינון 25 מ"ג / מיליליטר, sphingomyelin (SM) במינון 25 מ"ג / מיליליטר וכולסטרול (חול) בשעה 10 מ"ג / מיליליטר.
    3. קח 18.38 μl של dOPC, 17.10 μl של SM ו11.30 μl של חול כדי להפוך פתרון עם 1 מ"ג של שומנים כולל של 2: 1 dOPC: 2 יחס טוחנת חול: SM. להשתנות הכרכים בהתאם מבוסס על concentrations של השומנים שהוכנו ב1.1.2. עם זאת, לשמור על היחס טוחנת ב -2: dOPC 1: ​​2 SM: החול, כמו שינוי היחס טוחנת ישנה את מאפייני השלב של הקרום 25.
    4. מערבבים את הפתרון לחלוטין על ידי vortexing. הוסף צבע lipidic ניאון ב0.05% מול אם רוצה לדמיין את bilayer על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
      הערה: המשפחה של dialkylcarbocyanines ארוכת שרשרת, כמו שעשו, וDiI DIO span מגוון רחב של אורכי גל וניתן להשתמש בו באופן אידיאלי לתייג ממברנות שומנים בדם. לחלופין, שומנים שכותרתו fluorescently, כמו rhodamine-phosphatidylethanolamine או BODIPY כולסטרול ניתן להשתמש. בכל מקרה, את הריכוז של הצבע צריך להיות מותאם על פי הגדרת מיקרוסקופיה, תוך התחשבות כי ריכוזים גבוהים של fluorophore חייב השומנים יכולים לשנות את ההתנהגות 19 השומנים.
    5. ייבש את כלורופורם באמצעות גז 2 N (או כל גז אינרטי זמין כגון Ar והוא).
    6. לא יבש נוסףהוא השומנים תערובת תחת ואקום במשך שעה לפחות 1.
      הערה: אם אחסון תערובת שומנים זו, לטהר אוויר עם גז אינרטי (N 2, Ar או הוא) ולאחסן ב -20 ° C. Aliquot שומנים ב-כלורופורם עודפים לתוך צלוחיות קטנות וחום. מייבש אותם באופן דומה לתערובת השומנים בדם, לעקור אוויר עם גז אינרטי (N 2, Ar או הוא) ולאחסן ב -20 ° C.
    7. ממיסים את השומנים המיובשים במאגר PBS לריכוז של 10 מ"ג / מיליליטר.
    8. מערבולת את התערובת במרץ לכ -20 שניות עד 1 דקות כדי לקבל השעיה מעונן, המכילה שלפוחית ​​multilamellar. ודא שאין סרטי שומנים דבק הצדדים של הבקבוקון.
    9. להפיץ השעיה זו ל -10 aliquots μl (1 מ"ג של שומנים בדם גורם 10 aliquots).
    10. חנות ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
  2. הכנת Unilamellar שלפוחית
    הערה: בגדלים שונים של שלפוחית ​​unilamellar יכולים להיות מוכנים תוך שימוש בשיטה sonication או השיטה שחול. Sonication משתמש יםound אנרגיה כדי להתסיס את התערובת ולהפריד את השכבות של ההשעיה multilamellar. זה מסומן על ידי ניקוי מההשעיה המעורפלת. החול מאלץ את שלפוחית ​​multilamellar לעבור דרך מסנן קרום עם גודל נקבובית מובהק.
    1. שיטת Sonication
      1. קח 10 μl של מתלי שומנים multilamellar ולהוסיף 150 μl של חיץ SLB.
      2. מעבירים את התערובת ל( 2 מיליליטר) בקבוקונים קטנים כתרים זכוכית וחותם עם Parafilm.
      3. Sonicate את התערובת בטמפרטורת החדר בsonicator אמבטיה במשך 10 דקות או עד שיתברר להניב שלפוחית ​​unilamellar קטנה (רכבי שטח, מתחת ל -50 ננומטר בקוטר).
    2. חול שיטה
      1. קח 10 μl של מתלי שומנים multilamellar ולהוסיף 150 μl של חיץ SLB.
      2. מעבירים את ההשעיה לתוך צינור קירור.
      3. להקפיא את ההשעיה שומנים על ידי השריית צינור הקירור לכמה שניות בחנקן נוזלי.
      4. להפשירהשעיה שומנים על ידי השריית צינור הקירור באמבט מים בטמפרטורת חדר או 37 מעלות צלזיוס במשך כמה דקות. חזור על השלבים להקפיא להפשיר לפחות 10 פעמים.
      5. כדי extrude ההשעיה השומנים בדם, להשתמש קרום פוליקרבונט עם 200 גודל נקבובית ננומטר (גודל נקבובית אחר זמין כמו, 100 ננומטר או 400 ננומטר) ומכשיר שחול מסחרי 26.
        הערה: נכון לעכשיו, יש שני מכשירי מכבש זמינים מסחרי: מכבש ידני זמין עבור נפחים קטנים (200 μl לכמה מיליליטר). במקרה זה, המדגם הנמתח דרך הממברנה על ידי לחיצה על ההשעיה ידנית הלוך ושוב בין שני מזרקים. בהתאם ליצרן, aliquots שומנים היה צריך להיות בשילוב להגיע נפח מינימאלי של להגדיר. עבור אמצעי אחסון גדול יותר (עד 50 מיליליטר) מכשירים מתוחכמים יותר משמשים בי ההשעיה נאלצה דרך קרום פוליקרבונט באמצעות גז דחוס. תנאי הגדרה וחול יכולים להשתנות בהתאם לmodאל. עיין בהוראות של היצרן לפני השימוש. פרוטוקול זה מתייחס למכבש הידני לנפחים קטנים.
      6. לאזן את מכבש במים על ידי העברת מים דרך מכבש. לטבול את הקרום במים.
      7. מניחים את הקרום בין שתי הבוכנות, להרכיב את המכשיר ולאזן במאגר, על ידי העברה למאגר דרך מכבש, ממזרק אחד למשנהו. שלב זה מאפשר גם בדיקת הדליפות במערכת. אם הוא דולף, לפרק ולהרכיב מחדש את זה שוב משתנה הקרום.
      8. קח את ההשעיה השומנים באמצעות מזרק אחד מכבש ("צד מלוכלך").
      9. צרף את המזרק המכיל את ההשעיה שומנים בתא אחד ומזרק הריק בתא היריב.
      10. לדחוף את המזרק בקצה אחד. להעביר את הפתרון דרך הקרום ולתוך המזרק היריב. זה עובר 1 st.
      11. להעביר אותו דרך הקרום עבור הסכום כולל של 31 פעמים כגוןכי הפתרון בסופו של על המזרק היריב ("צד נקי").
        הערה: בדוק את הקרום לאחר extruding. אם זה נשבר, אז תהליך שחול לא היה מוצלח וצריך להיות חוזרים ונשנים.
      12. רוקן את המזרק לתוך צינור קטן. שלפוחית ​​גדולה unilamellar ("'לאב') הן יציבה במשך 1-2 ימים, אם כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס.
  3. הכנת נציץ וCoverslips
    1. לשטוף coverslips הראשון במים ולאחר מכן באתנול. אוויר יבש.
    2. קח דיסקים נציץ ולקלף את השכבה החיצונית באמצעות נייר דבק.
    3. צרף את הדיסק נציץ על coverslip. דבקים אופטיים שקופים הם אופטימליים, כך שאפשר לבדוק את bilayers עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
    4. צרף צילינדרי פלסטיק (קוטר 2.5 סנטימטר חיצוני, קוטר פנימי 2 סנטימטר, וגובה 0.5 סנטימטרים) באמצעות דבק / גריז אופטי. לוודא שהכל סגור ושאין נזילות. השתמש גריז כאשר רוצה להשתמש שוב בלונים כפי שהם יכולים להיות בקלות מנותק מהcoverslip דואר ורחץ. הממדים של גלילי הפלסטיק תלויים בגודלו של בעל שלוחה AFM וצריכים להיות בהתאם.
  4. בתצהיר של Unilamellar שלפוחית ​​על תמיכה מוצקה
    1. Pipet פתרון liposome כל ישירות על גבי נציץ. הוסף עוד חיץ SLB להגיע נפח של 300 μl.
    2. להוסיף 0.9 μl של פתרון כלוריד M סידן 1 להגיע לריכוז סופי של 3 מ"מ Ca 2 +.
    3. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ולאחר מכן ב 65 מעלות צלזיוס במשך לפחות 10 דקות. תמיד לכסות את bilayers עם חיץ. לתקשר עם בועות אוויר והאוויר יהיה להרוס אותו. במהלך דגירה, להוסיף עוד חיץ במידת צורך, במיוחד אם דוגרים בטמפרטורות גבוהות.
      הערה: טמפרטורות דגירה משתנות בהתאם לתערובות השומנים והשלבים הנדרשים. יש צורך בזמן דגירה של לפחות 10 דקות כדי ליצור bilayers נתמך, אבל זה יכול להיות ארוך יותר, תלוי בטמפרטורה ובהרכב.
    4. לשטוףbilayer עם (C ° 65) החם חיץ SLB 15-20 פעמים כדי להסיר סידן ושלפוחית ​​unfused. קח טיפול נוסף במהלך שלבי הכביסה לשמור bilayer תחת חיץ והעדינות pipet פתרון הכביסה כדי למנוע הרס bilayer.
    5. bilayers מגניב נתמכת לטמפרטורת חדר לפני מדידות AFM. זה נחוץ כדי ליצור את השלבים השונים של הקרום, כמו גם למזער סחיפה תרמית במכשיר.

2. מדידות מיקרוסקופית כוח אטומי 11,12

  1. הדמיה
    הערה: בצע הדמיה במיקרוסקופ כוח אטומי במצב קשר או הקשה מצב. bilayers תמונה נתמכת בפתרון; אינו מאפשר פתרון ללהתאדות לחלוטין כמו זה יהרוס את bilayers. כפי שניתן היה לעבוד עם חיץ, אנא הקפד על אמצעי זהירות בטיחות ובלוודא כי כל חלק AFM מוגן מנשפך נוזל.
    1. בחר שלוחה רכה (להלן 0.2 קבוע קפיץ N / מ 'מומלץ) ולהעלות אותו כדי לאהוא AFM. הבחירה של שלוחה נוקשות היא קריטית יותר לכוח ספקטרוסקופיה (וזה יידון בהמשך).
    2. הר המדגם על הבמה AFM ולוודא שכל המודולים רטט-הבידוד מופעלים. חכה לפחות 15 דקות כדי לאזן ולהפחית סחיפה תרמית של המערכת. בהתאם להגדרת AFM, מפרטי כוונון והדמיה עשויים להשתנות. התייעץ עם המדריך של היצרן.
    3. מתקרב למדגם עם קצה AFM עד ליצירת קשר.
    4. מאז bilayers השומנים הם בדרך כלל 4 ננומטר בגובה, להשתמש Z-הטווח של המכשיר שייתן לי הרזולוציה Z-הגבוהה ביותר (לדוגמא 1.5 מיקרומטר).
    5. בחר אזור לתמונה. כדי לקבל סקירה כללית של bilayer השומנים, 50 מיקרומטר x 50 מיקרומטר או 25 מיקרומטר x 25 מיקרומטר אזור יהיה נקודת התחלה טובה לתמונה. אם תכונות קטנות יותר מופיעות, תמונה יכול אחד באזורים קטנים יותר (10 מיקרומטר x 10 מיקרומטר, או 2 מיקרומטר x 2 מיקרומטר). הבחירה של אזור ההדמיה תלויה גם בr עובדAnge של הסורק פיזואלקטריים. אנא עיין במדריך למכשיר זה.
    6. כbilayers הן מאוד שבירה, להתאים את נקודת קצה AFM הסט במהלך הדמיה כדי לשמור על הכוח במינימום ונכון לסחיפה תרמית, תוך שמירה על קשר עם המדגם. במצב קשר, למזער את נקודת הסט. בהקשת מצב, למקסם את נקודת הסט.
    7. תמונות תהליך על ידי התאמת כל שורת סריקה לפונקציות פולינום פילוס. בצע הסר קו לסריקות שמאבדים קשר עם הקרום באמצעות תוכנת הקניינית של החברה לייצור AFM.
  2. חיל ספקטרוסקופיה
    1. כייל את שלוחה ביצוע ההוראות על פי הפרוטוקול של היצרן. כיול מאפשר המרה של האות החשמלית של פוטודיודות לכוח (איור 1).
      1. לכייל את הרגישות של הקצה למדוד סטייה כתנועה Z-piezo (ביחידות של אורך) במקום אות חשמלי בוולט.
      2. חשב את קבוע קפיץ שלוחה בשיטת תדר רעש התרמית, בדרך כלל שולבה בתוכנת AFM. בשיטה זו, עלילה משרעת של רטט מרעש ביחס לתדירות של תנודה, יצירת עלילת צפיפות ספקטרלית כוח. עלילה זו תציג שיא סביב תדר התהודה. התדירות שבי אני משרעתזה הגדול ביותר הוא תדר התהודה. להתאים פונקציה הלורנצית סביב השיא לחשב את קבוע הקפיץ באופן אוטומטי על ידי התוכנה. כמה משאבים שימושיים לתאוריה של שיטת הרעש התרמית ניתנים באזכור 27-30.
    2. לאחר ההדמיה על שטח של bilayer, בחר אזור x 5 מיקרומטר מיקרומטר 5 בbilayer לבצע כוח ספקטרוסקופיה.
    3. הגדרת AFM, כך שהוא לוקח עקומות כוח ב16 x 16 רשת של אזור זה. התוצאה היא 256 עקומות כוח לאזור. החלל שבין שתי נקודות הסמוכות צריך להיות מספיק כדי למנוע את זה באזור הקרום שחקר בנקודה אחת היה עולה בקנה אחד עם הנקודה הבאה. זה תלוי ברדיוס הקצה. מרחק 100 ננומטר בין שתי נקודות יהיה אידיאלי. לחלק x 5 אזור מיקרומטר מיקרומטר 5 ל- 16 x 16 רשת. בהתאם לגודל של השלב, ניתן לבחור אזור קטן יותר או גדול יותר, ולאחר מכן להתאים את גודל הרשת בהתאם.
    4. עקירת Z-piezo מוגדר400 ננומטר. זה קובע את הטווח המרבי של תנועה של Z-piezo. זה צריך להיות גדול מספיק כדי לוודא כי שלוחה חזרה בי משם באופן מלא מהמדגם בין מדידות.
    5. להגדיר מהירות גישה ל -800 ננומטר / sec ולחזור במהירות 200 ננומטר / sec. השתמש מהירות גישה בין 400 ל -6,000 ננומטר / sec תלוי בהרכב bilayer ושלב שומנים להיחקר 6,16.
    6. לאחר הגדרת כל הפרמטרים, לרכוש עקומות כוח, על ידי לחיצה על הכפתור "הפעל" של תוכנת AFM.
    7. להציל את עקומות כוח ככוח מול עקומות גובה (מדד לתנועת Z-piezo). זה לא לוקח בחשבון את הכיפוף של שלוחה בעת מגע עם המדגם. במהלך שלב עיבוד הנתונים, התוכנה מאפשרת AFM תיקון לשלוחת כיפוף כדי לקבל כוח מול עקומות הפרדת קצה מדגם (איור 1 ג), אשר תיתן ערכים ראויים לעובי bilayer. ערכי התיקון בדרך כלל משולבים בcalibrני, שנשמר עם כל עקומת כוח. לחשב הפרדת קצה מדגם על ידי הפחתת ההטיה האנכית מתנועת piezo בנקודה מסוימת.
      הערה: השיא בעקומת כוח הגישה (ערך הכוח יורד גם אם תנועת שלוחה היא עדיין במחזור הגישה) הוא כוח פריצת הדרך של הקרום, ואילו ההבדל בין העמדה של שיא זה והמיקום של הנקודה שבו הכוח מתחיל לעלות שוב מספק העובי של הקרום.
    8. לרכוש לפחות 500 עקומות כוח לכל תנאים כדי לקבל נתונים סטטיסטיים טובים. העלילה היסטוגרמה של הערכים באמצעות תוכניות כמו מקור או Matlab, ולהתאים את היסטוגרמות להפצת גאוס כדי לקבל את השיא ורוחב של ההפצה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

bilayers נתמכת שומנים מורכבים מdOPC: SM: חול (2: 2: 1) היו צילם בAFM (איור 2 AC). בגלל הרכב השומנים בדם, o L SM / חול עשירה ושלבי ד L dOPC העשירים נצפו. פרופיל הגובה מהדמית AFM יכול לספק מידע חשוב על מבנה הקרום. על ידי הסתכלות על פרופיל הגובה, עובי bilayer ניתן למדוד בנוכחות של פגמים בקרום (איור 2), או ההבדל בגובה בין שלבי ד L / o L ניתן לספק. בנוסף, AFM מאפשר לאזורים ספציפיים בחרו מייצגים שלבים אלה ולנתח את התכונות מכאניות שלהם תוך שימוש בכח ספקטרוסקופיה (איור 2 D - F). עקומות הכוח נגזרות ממצב הכוח ספקטרוסקופיה משמשות למדידת כוח פריצת הדרך על ידי מציאת ערך הכוח בשיא של עקומת הכוח (איור 2 ד ו- E), וmembrעובי Ane על ידי הפחתת ערך המרחק מהשיא של עקומת הכוח לערך המרחק כאשר עקומת הכוח מתחילה לעלות שוב (איור 2 ד ו F).

הרגישות של מדידות AFM תלויה בחומר פיזואלקטריים ולולאות משוב אלקטרוניות. ככזה, לפני ניסויים עושים, חשוב להכיר את AFM להגדיר. ישנם שני מכשיר נפוץ להגדיר עבור חומרים פיזואלקטריים: (1) סורק צינור שבו המדגם ממוקם על גבי החומר פיזואלקטריים והמדגם נסרק על קצה נייח; או (2) כפף בשלב שבו טיפ הוא רכוב על החומר פיזואלקטריים במקום המדגם. במקרה האחרון, חומר פיזואלקטריים ומוצרי אלקטרוניקה אחרות מוגנים מפני דליפות. הרבה דגמי AFM עבור יישומים ביולוגיים יש לי תצורה זו.

במהלך הדמיה, קצה AFM עלול לאבד את הקשר עם המדגם ולהוביל להשגוייםasurements. תלוי כמה סריקות הולכים לאיבוד, התמונה יכולה להיות מתוקנת על ידי הסרת קווי הסריקה ושימוש במסנן עוצמה ממוצעת לגזור את הערכים החדשים מסביבה (איור 3). עם זאת, ברוב המקרים, זה לא יניב תמונה טובה ומומלץ פשוט להשליך את התמונה. יש ממצאים אחרים שצריך להיות במעקב. אלה נובעים מפגומים / טיפים בוטים / מלוכלכים כמו גם העקיפה של נקודת הלייזר מאחורי שלוחה 31. במקרים אלה, צריכים להיות מושלכים תמונות ואת קצה AFM צריך להיות מוחלף.

במהלך מדידות ספקטרוסקופיה כוח, כמה אתגרים עלולים להתעורר: (1) העדר הפסגות (איור 4 א), (2) נוכחות של כתפיים במקום פסגות מוגדרות היטב (איור 4), (3) עלייה קטנה וplateauing עוקב בנמוך מאוד כוחות (איור 4C - D). העדר שיא ניתן לייחס למדידה באזור ללא בילעיןתנאי Ayer או לרכישה אינם מותאמים. מומלצת שתמונת AFM נרכשה לפני עושה כוח ספקטרוסקופיה לוודא כי bilayer אכן נמדדים. תנאי רכישה, כמו גם מפרטים / שלוחה קצה משפיעים על ההסתברות לאירוע פריצת דרך 17. טיפ חדים יותר יכול בקלות לנקב bilayer, כאמור, כוח פריצת הדרך עשוי להופיע נמוך או לא יופיע בכלל, כי זה הוא מתחת לרמות הרעש. . להגדיל את מהירות הגישה גם מגדיל את כוח פריצת הדרך 16. כbilayer נלחץ על ידי הקצה, מולקולות השומנים גם להגיב כדי להפיג את הכוח הזה. במהירות גישה נמוכה יותר, יש לו את bilayer השומנים מספיק זמן כדי לאזן לפני השלב הבא בכוח, וזה מגדיל את ההסתברות שאירוע פריצת דרך יכול לקרות. במהירות גישה גבוהה יותר, רמפות הכוח מהר יותר מאשר התגובה של השומנים ו, ​​כאמור, את ההסתברות לאירוע פריצת דרך היא נמוכה באותו הכוח. זה possידיהם כי באמצעות מהירות גישה גבוהה, הוא הגיע לנקודה שנקבעה לפני הפסקות bilayer וכתוצאה מכך אין פסגות נצפות. אין דיווחים להסביר את המראה של כתפיים על העקומה אבל אנחנו מניחים שזה יכול להיות בגלל דחיסת חומר שלפני פריצת הדרך. יתר על כן, רמה או פסגות רחבות בכוחות נמוכים מאוד עשויה להעיד על הנוכחות של לכלוך או חומר שומנים רופף בקצה. טיפים עלולים להצטבר לכלוך וחומר lipidic בפרק הזמן של כמה מדידות. העפר וחומר מצורף לקצה עושה את זה בוטה, וכך להגדיל את כוח פריצת הדרך.

מומלץ עקומות כוח נרכשות בתחומים שונים, אם באתגרים אלה מתעוררים. המלצה שנייה היא לשנות טיפים (זה יחייב כיול). לבסוף, מהירות הגישה ייתכן שתצטרך להיות מותאם או השימוש בטיפ עם מפרטים שונים (רדיוס קצה ונוקשות) יכול להיחשב. כוח פריצת הדרך משתנה בין 0-50 ננ 6, כאמור, לאהוא האביב קבוע של שלוחה יכולה להיות בטווח של .05-.7 N / m. רוב הזיזים המסחריים רדיוס קצה נומינלי סביב 20-40 ננומטר. במקום להשתמש בטיפים קונבנציונליים, יכולים להיות גם קנו זיזי tipless ותחומי רדיוס ידוע (שהם בדרך כלל monodisperse בהתפלגות גודל) יכולים להיות מחוברים אליהם. כדי לקבל נתונים לשחזור, תמיד להשתמש באותם תנאי הרכישה ומפרטי שלוחה לאותה הקבוצה של ניסויים.

איור 1
איור 1: עקרונות של חיל ספקטרוסקופיה רצף (א) לגישת הכחשה של שלוחה מהמדגם.. הקו האדום מראה את סטיית שלוחה מתפקידו שיווי משקל (קו שחור). כיול (B) קונסוליים ממיר אות חשמלית (בוולט) לכפות (בניוטונים). על ידי רכישה של Sensi שלוחהtivity והאביב מתמיד הסטייה האנכית (בוולטים) מומר למרחק והמרחק לתוקף באמצעות חוק הוק. (ג) בעת המגע במדידות הכוח ספקטרוסקופיה, תנועת סריקת Z-piezo אינו לוקח בחשבון את שלוחה כיפוף. תיקון לזה יכול להיעשות על ידי הפחתת ההטיה האנכית, x (ביחידות מרחק) מתנועת Z-piezo, Z (גם ביחידות מרחק). בדרך זו, הפרדת קצה המדגם בפועל, במקום פשוט תנועת Z-piezo, ניתן לדווח, שהנו מדד מדויק יותר של מרחקים וחשוב על מנת למדוד את העובי של המדגם.

איור 2
איור 2:. AFM של SLBs () תכנית של SLBs המורכב מdOPC: SM: חול (2: 2: 1) להפריד לנוזל המופרע L) ונוזל הורה שלבים (o L). (ג) מתאים לריבוע הצהוב בB (10 מיקרומטר x 10 מיקרומטר). שלבי o L ו- D L מסומנים. פרופיל הקו מתחת מתאים לקו הצהוב בתמונה. שלב o L מופיע גבוה יותר מאשר 1-2 ננומטר שלב ד L. מדגם עקומת כוח שמראה איך כוח הפריצה ועובי קרום נגזרים (ד '). כוח פריצת דרך (E) ו- (ו) הפצת עובי קרום לשלבי ד L וo L עם הולם גאוס לכימות.

איור 3
איור 3: אובדן הקשר במהלך ההדמיה מוביל ל. לסרוק קווים שאינם מתאים לשאר התמונה נתמכת bilayer המורכב מdOPC: SM: חול (2: 2: 1) עם אובדן קשר בכמה סריקות קו. סרגל 2 מיקרומטר.

איור 4
איור 4:. אתגרים בחיל ספקטרוסקופיה () עקומות כוח מסוימות לא תהיה פסגות. (ב) העקומה יכולה להיות כתפיים במקום פסגות מוגדרות היטב. (ג) לאחר עלייה קטנה מישור עלול להתרחש בהעדר השיא. מראה (D) של רמה יחד עם שיא מוגדר היטב.

אזור קרום פריצת דרך חיל (NN) קרום עובי (ננומטר)
שלב ד L 6 ± 1 4.7 &177 #; 0.5
שלב o L 8 ± 1 6 ± 1

טבלה 1: מאפיינים של ממברנה dOPC: SM: חול (2: 2: 1). SLBs יש שלב ד L כוח פריצה של 6 ± ננ 1 ועובי של 4.7 ± 0.5 ננומטר. O L יש 8 ± 1 ננ ועובי של ננומטר 6 ± 1. ההבדל בגובה בין שני השלבים הוא 2 ± 1.4 ננומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SLBs המורכב מdOPC: SM: חול (2: 2: 1) נוצרו על נציץ לאחר ספיחת שלפוחית ​​וקרע שנגרם על ידי סידן כלורי. הרכב שומנים בדם זה מופרד לשלבי ד L וo L. שלב o L מועשר בsphingomyelin וכולסטרול, והוא / (איור 1 א) נוזל צמיג פחות יותר מאשר שלב ד L 11. הפרדת o L משלב ד L באה לידי מבנים עגולים כמוגבהים מעל סביבתו (איור 1, ג). הפלטפורמות הן שלבי o L מוקפים שלבי ד L. פגמי קרום (או חורים בקרום) נראים גם (איור 1, חץ כחול) ופרופיל גובה פני פגם זה מראה את העובי של bilayer. הבדל גובה o L / D L יכול להיות גם נבדק על ידי מסתכל על פרופיל גובה AFM (איור 1 ג).

ההכנה של שומנים בדםהתערובת היא מאוד חשובה כמו הרכב קובע את מאפייני bilayer. במהלך תקופת ההכנה של bilayer הנתמכים, חשוב לעבוד בטמפרטורות מצויינים להיווצרות הנכונה של שלבי שומנים (צעד 1.4.5). במהלך הדמיה, שמירה על כוח נמוך מאוד חשובה כדי לא להרוס את bilayer ולא לצבור לכלוך על הקצה.

לאחר ההדמיה AFM, אזורים של SLB נבחרים וחקרו שימוש בכוח ספקטרוסקופיה. ספקטרוסקופיה הכוח מאפשרת לנו לחקור מאפיינים אחרים של הקרום, במיוחד כוח פריצת הדרך (1D איור). ד L ו- L o שלבים להראות כוח פריצת דרך שונה ועובי (איור 1E, F). המאפיינים מסוכמים בטבלה 1. נציין כי בהשוואה לChiantia et al. 11, ערכים דומים לכוח פריצת דרך בשלב ד L התקבלו אך ערך נמוך יותר עבור שלב o L. זה יכול להיותבשל כמויות נמוכות של כולסטרול משמש בממברנות שלנו (השתמשנו dOPC: SM: יחס חול 2: 2: 1, בזמן שהם בשימוש של 1.5: 1.5: 1). זה גם מדגים את החשיבות של ערבוב יחס שומנים תקין - גורם קריטי בשחזור של תוצאות. יתר על כן, שימוש בשומנים שונים (אורך שרשרת, ותואר של unsaturation) גם משנה את מאפייני bilayer 6,15,18.

בעוד זוממים חלוקת כוחות פריצת הדרך שימושית ויכול כבר להראות הבדלים בתכונות bilayer, ניתוח נוסף של הפצת כוח פריצת הדרך יכול לשמש כדי להסיק תכונות מכאניות אחרות, כולל מתח קו ומתפשטים לחץ 11,17,21. בקצרה, ההסתברות, P (F) של מדידת כוח פריצת דרך מסוימת, F, מתוארת על ידי מודל התגרענות רצף 11,15,17:

משוואת 1

שבו הוא resonaתדירות פליטות של שלוחה, K הוא קבוע הקפיץ של שלוחה, V היא מהירות הגישה, Γ הוא מתח הקו (אנרגיית הקצה הנדרשת כדי לשמור חור בקרום הפתוח), R הוא הרדיוס של AFM טיפ, k B הוא קבוע בולצמן, T הוא טמפרטורה, ו- S הוא הלחץ מתפשט או האנרגיה הקשורה לסגירת החור (ההפך ממתח קרום - האנרגיה הדרושה כדי להיות מופעל על ידי הקרום לפתוח חור 32). משוואה זו יכולה להיות משולבת וDP / DF ניתן לחשב את:

משוואה 2

, K, R הם תכונות של שלוחה / טיפ AFM שניתן לרכוש דרך כיול שלוחה. T ו- V הם פרמטרים ניסיוניים שצריך להישמר קבועים לאורך הניסויים. DP / DF אז מצויד להיסטוגרמה לרכוש את מתח הקו ולחץ מתפשט. כמספר פרמטרים משפיעים P (F), התנסותmentalists מומלץ להשתמש תנאי רכישת טיפים ודומים לערכים דומים למתח קו ולחץ מתפשט. זיהום של קצה AFM (כולל לכלוך ושלפוחית ​​unfused על הקצה שנרכש במהלך הדמיה) מוביל לתוצאות שאינן לשחזור. יתר על כן, הבחירה של תמיכה משפיעה על התכונות מכאניות של הקרום 20.

טכניקה נוספת שיכול לאפיין תכונות מכאניות של bilayer שומנים היא שאיפת micropipette של שלפוחית ​​ענקית unilamellar (GUVs) 33. בטכניקה זו, מתח קרום מחושב מהעיוות של GUVs בשאיפה. יתר על כן, על ידי הגדלת השאיבה, ניתן לחשב את המתח שבו קרעי אדון המנהל (או מתח תמוגה) 34, אשר יכול להיות קשור למתח הקו במודל התגרענות רצף. חסרון אחד של זה הוא טכניקות מורכבות חישוב מתח קרום לשלב הפרדת קרומים, כPHA שונהיש לי SES תכונות מכאניות שונות 35. זאת בניגוד לספקטרוסקופיה כוח AFM, שבו ניתן לאפיין שלבים בודדים בנפרד. יתר על כן, בעוד שיש צורך GUVs רב כדי להפיק תוצאות רלוונטיות מבחינה סטטיסטית, AFM יכול לייצר הפצה אחת לSLB. עם זאת, השפעות קרום שיפוץ (לדוגמא, צִנוּר ונקיקים) הם דמיינו בקלות רבה יותר עם GUVs, מה שהופך אותם מערכות טובות יותר לאפיון תופעות הקשורות לצורה אלה יחד עם תכונות מכאניות.

ביישומים נוספים כדי לחקור את ההשפעות של חלבונים בממברנה על נכסי bilayer, חלבונים מטוהרים עשויים להיות משולבים בשלפוחית ​​אלה כדי להפוך את proteoliposomes. טכניקה אחת עבור עושה את זה משתמשת בחומרי ניקוי כדי לעזור לייצב חלבונים ולהכניס לתוך הקרום. טיהור לאחר באמצעות כרומטוגרפיה דיאליזה או גודל הדרה מסירה חלבונים וחומרי ניקוי חופשיים בפתרון 36. גישה נוספת דורשת התיוג שלהחלבונים המטוהרים (לדוגמא, היסטידין או streptavidin תגים) ושותפים בשילוב זיקה לתג זה ביפוזומים (עם חומצת ניקל-nitriloacetic (Ni-נת"ע) או שומני biotinylated).

לסיכום, אנו תיארנו שיטה לנתח bilayers שומנים. בשל הרזולוציה הגבוהה שלה, AFM יכול לחשוף מבנים תת-מיקרומטר בקרום, הכוללים שלבי שומנים ועוד. ספקטרוסקופיה כוח, כאן משמשת לאפיון ממברנות שומנים בדם, יכולה לשמש גם בחלבונים בממברנה ומולקולות ביולוגיים אחרות בקרום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי אגודת מקס פלנק, המרכז הגרמני לחקר הסרטן, אוניברסיטת טובינגן, וBundesministerium für Bildung und Forschung (מענק לא. 0,312,040).

אנו מודים אדוארד הרמן שעזרו לנו להפוך את ניתוח נתוני כוח עקומת וד"ר יעקב Suckale לקריאה זהירה של כתב היד הזה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids, Inc. 850375P Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sphingomyelin (Brain, Porcine) Avanti Polar Lipids, Inc. 860062P Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Cholesterol Avanti Polar Lipids, Inc. 700000P Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sodium chloride (NaCl), 99.8% Carl Roth GmbH + Co. KG 9265.1
Potassium chloride (KCl), 88% Sigma P9541
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% AppliChem GmbH A1046
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% Carl Roth GmbH + Co. KG 3904.1
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade AppliChem GmbH A4689
HEPES, molecular biology grade AppliChem GmbH A3724
Glass coverslip, 24 x 60 mm, 1 mm thickness Duran Group 2355036
Punch and Die Set Precision Brand Products, Inc 40105
Optical Adhesive Norland Products, Inc. NOA 88 Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. 
Name Company Catalog Number Comments
Mica blocks NSC Mica Exports Ltd. These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.  Always handle mica with gloves or tweezers.
Laboratory Equipment Grease Borer Chemie AG Glisseal N
Liposome Extruder Avestin LiposoFast-Basic As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.
Adhesive Tape 3M Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)
Bath Sonicator Bandelin Sonorex Digitec DT-31 No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (Data sheet)
Silicon Nitride AFM Cantilever  Bruker AFM Probes DNP-10 Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.
AFM JPK JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).
  2. Hansma, P. K., Elings, V. B., Marti, O., Bracker, C. E. Scanning Tunneling Microscopy and Atomic Force Microscopy: Application to Biology and Technology. Science. 242, 209-216 (1988).
  3. Gaczynska, M., Osmulski, P. A. AFM of biological complexes: What can we learn. Curr, Opin. Colloid In. 13, 351-367 (2008).
  4. Goksu, E. I., Vanegas, J. M., Blanchette, C. D., Lin, W. -C., Longo, M. L. AFM for structure and dynamics of biomembranes. BBA-Biomembranes. 1788, 254-266 (2009).
  5. Muller, D. J. AFM: A Nanotool in Membrane Biology. Biochemistry-US. 47, 7986-7998 (2008).
  6. Redondo-Morata, L., Giannotti, M. I., Sanz, F. Atomic Force Microscopy in Liquid: Biological Applications. Baró, A. M., Reifenberger, R. G., Sanz, F. Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).
  7. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).
  8. Frederix, P. L. T. M., Bosshart, P. D., Engel, A. Atomic Force Microscopy of Biological Membranes. Biophys. J. 96, 329-338 (2009).
  9. Mennicke, U., Salditt, T. Preparation of Solid-Supported Lipid Bilayers by Spin-Coating. Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).
  10. Raviakine, I., Brisson, A. R. Formation of Supported Phospholipid Bilayers from Unilamellar Vesicles Investigated by Atomic Force Microscopy. Langmuir. 16, 1806-1815 (2000).
  11. Chiantia, S., Ries, J., Kahya, N., Schwille, P. Combined AFM and Two-Focus SFCS Study of Raft-Exhibiting Model Membranes. ChemPhysChem. 7, 2409-2418 (2006).
  12. Unsay, J., Cosentino, K., Subburaj, Y., Garcia-Saez, A. Cardiolipin effects on membrane structure and dynamics. Langmuir. 29, 15878-15887 (2013).
  13. Domènech, Ò, Sanz, F., Montero, M. T., Hernández-Borrell, J. Thermodynamic and structural study of the main phospholipid components comprising the mitochondrial inner membrane. BBA-Biomembranes. 1758, 213-221 (2006).
  14. Domènech, Ò, Morros, A., Cabañas, M. E., Teresa Montero, M., Hernández-Borrell, J. Supported planar bilayers from hexagonal phases. BBA-Biomembranes. 1768, 100-106 (2007).
  15. Garcia-Saez, A. J., Chiantia, S., Schwille, P. Effect of line tension on the lateral organization of lipid membranes. J Biol Chem. 282, 33537-33544 (2007).
  16. Alessandrini, A., Seeger, H. M., Caramaschi, T., Facci, P. Dynamic Force Spectroscopy on Supported Lipid Bilayers: Effect of Temperature and Sample Preparation. Biophys. J. 103, 38-47 (2012).
  17. Butt, H. -J., Franz, V. Rupture of molecular thin films observed in atomic force microscopy I. Theory. Physical Review E. 66, 031601 (2002).
  18. Garcia-Manyes, S., Oncins, G., Sanz, F. Effect of Temperature on the Nanomechanics of Lipid Bilayers Studied by Force Spectroscopy. Biophys. J. 89, 4261-4274 (2005).
  19. Chiantia, S., Kahya, N., Schwille, P. Raft domain reorganization driven by short- and long-chain ceramide: a combined AFM and FCS study. Langmuir. 23, 7659-7665 (2007).
  20. Canale, C., Jacono, M., Diaspro, A., Dante, S. Force spectroscopy as a tool to investigate the properties of supported lipid membranes. Microsc. Res. Techniq. 73, 965-972 (2010).
  21. García-Sáez, A. J., Chiantia, S., Salgado, J., Schwille, P. Pore Formation by a Bax-Derived Peptide: Effect on the Line Tension of the Membrane Probed by AFM. Biophys. J. 93, 103-112 (2007).
  22. Moreno Flores, S., Toca-Herrera, J. L. The new future of scanning probe microscopy: Combining atomic force microscopy with other surface-sensitive techniques, optical microscopy and fluorescence techniques. Nanoscale. 1, 40-49 (2009).
  23. Simons, K., Vaz, W. L. C. Model Systems, Lipid Rafts, and Cell Membranes1. Annu. Rev. Bioph. Biom. 33, 269-295 (2004).
  24. Pike, L. J. Rafts defined: a report on the Keystone symposium on lipid rafts and cell function. The Journal of Lipid Research. 47, 1597-1598 (2006).
  25. Kahya, N. Probing Lipid Mobility of Raft-exhibiting Model Membranes by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).
  26. Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation and applications. Nanoscale Research Letters. 8, 102 (2013).
  27. Butt, H. -J., Jaschke, M. Calculation of thermal noise in atomic force microscopy. Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).
  28. Chon, J. W. M., Mulvaney, P., Sader, J. E. Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids. Journal of Applied Physics. 87, 3973 (2000).
  29. Sader, J. E. Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope. Journal of Applied Physics. 84, 64 (1998).
  30. Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope. Journal of Applied Physics. 97, 12490310 (2005).
  31. Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).
  32. Lee, M. -T., Chen, F. -Y., Huang, H. W. Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides. Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).
  33. Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration. The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).
  34. Nichols-Smith, S., Teh, S. -Y., Kuhl, T. L. Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes. BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).
  35. Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration. Phys. Rev. Lett. 98, (2007).
  36. Rigaud, J. -L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics