Прямая мыши Травма / Запись Модель гетеротопической окостенения

1Department of Surgery, University of Michigan Medical School, 2Department of Biologic and Materials Sciences, University of Michigan School of Dentistry
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Peterson, J. R., Agarwal, S., Brownley, R. C., Loder, S. J., Ranganathan, K., Cederna, P. S., Mishina, Y., Wang, S. C., Levi, B. Direct Mouse Trauma/Burn Model of Heterotopic Ossification. J. Vis. Exp. (102), e52880, doi:10.3791/52880 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Заявление по этике: Все процедуры на животных были проведены в строгом соответствии с надлежащей практикой животных, как определено в руководящих принципах, предусмотренных в Руководстве по использованию и уходу за лабораторными животными: восьмой редакции от Института лабораторных животных исследований (ILAR, 2011 г.) и были утвержден уходу и использованию комитета Институциональная животных университета штата Мичиган (PRO0001553) по.

1. Хирургические процедуры мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 8-10 неделя C57BL / 6 мышей. Другие возраст, фоны, и штаммы мышей также может быть использован для тестирования различных условий или генетический состав. Для тенотомии части процедуры, поддерживать стерильные условия, используя маску, волосы капота и стерильные халат, перчатки и инструменты. Хирургические сайты должны быть стерильно подготовлен с повидон-йодом и стерильной драпировки. Избегайте переохлаждения с помощью ветеринарного грелку и нагревания реанимации решения до 37 ° С до администрания.

  1. Обезболить мыши, используя 2,5% вдыхаемого изофлурана. Используйте носовой конус, чтобы оставить тыльную и задние конечности-легко доступны. Отрегулируйте скорость введения ИФ поддерживать соответствующую скорость дыхания и окраску слизистых оболочек и обеспечить анестезию путем проверки мышечный тонус, ног щепотку, и роговицы рефлекс. Применить мягкий глазной мази для глаз мыши, чтобы предотвратить сухость глаз травмы во время процедуры. Поддержание адекватной температуры тела с помощью ветеринарного грелку или теплую воду циркуляционного под операционного поля.
  2. Администрирование бупренорфин, 0,1 мг / кг, подкожно непосредственно перед операцией для обезболивания.
  3. Внимательно брить хирургического сайта на левой задней лапы, используя ножницы от пятки до колена.
  4. Внимательно брить спинку мыши, начиная над позвоночника и расширение бритая область слева от средней линии спины, очищая площадь по крайней мере, 2 см х 3 см, чтобы приспособить ожогов.
  5. Подготовка операционного поля, в том числе задней лапы до колена с использованием 3 чередующихся повидон-йод скрабы.
  6. Выполните продольный разрез вдоль медиальной части левой ахиллова сухожилия. Расширьте разрез, так ахиллово сухожилие может быть легко визуализировать; примерно 0,5 см.
  7. Выполните тенотомию ахиллова острым рассечение сухожилия в середине с острыми ножницами ткани. Вставьте одно лезвие ножниц ткани в ткани плоскости под сухожилия и анализировать вдоль плоскости, пока лезвие не находится в середине сухожилия. Закрыть лезвия ножниц, чтобы разъединить сухожилия резко.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, включение всех задних сухожилий в том числе икроножных, камбаловидной и подошвенный сухожилий.
  8. Достижения гемостаза путем применения давления стерильной марли (не должно быть минимальное кровотечение) и закрыть разрез кожи с 5-0 викрил стежка.
  9. Выполните спинной частичное ожог толщина с алюминиевым блоком весом 35 г с приближенными проводились измеренияTS 2 см х 2 см х 3 см нагревают до 60 ° С на водяной бане, приложенного к бритой спины мыши в течение 17 сек.
    Примечание: достижения соответствующего глубину ожога должен поместить блок в верхней части наркозом мыши, гарантируя, что вся площадь поверхности блока находится в контакте с мышью, однако избегать применения какого-либо дополнительного давления к блоку, то есть, позволяют тяжести будет только сила, удерживающая блок на месте. Тонкая пластиковая ручка прикреплена к одной стороне блока удобен для манипулирования, стабилизации и извлечения из горячей водяной бане. Это создаст поверхность всего тела примерно 30% гореть в 8-10-недельных C57BL / 6 мыши. Этот контакт ожог был выбран по сравнению с другими методами (пламя или ошпаривают Burn) из-за однородности глубины выгорания на рану и воспроизводимости между животными.
  10. Высушите ожога сайт марлей и применять Tegaderm повязку.
  11. Администрирование согретые реанимации жидкости: раствор 1 мл лактата Рингеравнутрибрюшинной инъекции 0,5 мл подкожно. Это один раз администрация реанимации является достаточным для восстановления от ожогов и тенотомии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не вернуться наркотизированных мышей жилищных клетках с другими мышами, дом индивидуально в клетках чистых под контролем до тех пор, мышей не полностью выздоровел. Типичный восстановление происходит в течение 1-6 часов. Прожига сайты, как правило заживают в течение 2-4 недель, и редко осложняется раневой инфекции, если хранится в чистых жилищных условий.
  12. Администрирование бупренорфина 0,1 мг / кг подкожной инъекции каждые 12 ч в течение 3 дней после процедуры. Монитор рост HO с серийными μCT сканирования в определенные промежутки времени. Внематочная рост костей является первым очевидным около 3 недель после операции по μCT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство развития HO завершения на 9 недель послеоперационных. Мы не наблюдали различие в объеме HO или местоположения с повторным μCT сканирует два раза в неделю в течение 15 недель по сравнению с одной конечной точки μCT сканирования в 15 недель.В конце экспериментов, усыпить все мышей СО 2 ингаляции в соответствии с ведомственным руководящим принципам и проверить смерть с шейных позвонков после 10 мин.

2. μCT сбора и анализа

  1. Закрепите наркозом мыши на планшете сканера в положении лежа. Лента задние конечности надежно к кровати, чтобы предотвратить дыхание артефакт движения. Включите воздух, воду и гидроксиапатит, содержащий фантом под мышкой для калибровки изображения.
  2. Откройте программное обеспечение анализа костей и определить области интереса (ROI), который охватывает обе задние конечности от тазобедренного сустава проксимальнее кончика задней лапы дистально. Получить изображение, используя следующие параметры:. 80 кВ, 500 мкА и 1300 мс экспозиции, размер воксела 48 мкм 14,15
  3. Калибровка изображения на Хаунсфилда единиц (HU), опираясь на ROI в каждой из трех камер, и фантомных ввода среднюю плотность в соответствующие поля впрограммного обеспечения.
  4. Использование "граббер" инструмент в программном обеспечении, переориентировать изображение так, голени левой задней конечности параллельно вдоль оси Z, чтобы позволить ясное представление анатомические для разграничения ортотопических корковых костных структур и HO.
  5. Начиная с колена, выделите дистально через ломтиками изображения до HO не встречается. Использование ручного инструмента сплайна, сделать ROI вокруг внематочной кости на каждом 5-м срезе продолжающейся в дистальном направлении лапы или до HO был превзойден. Используйте инструмент экстраполировать расширить и сшейте трансформирования в одну ROI, который содержит все HO.
  6. Сделайте 3D ROI и выберите в меню анализа. Рассчитать объем костной ткани, установив нижний и верхний порог значения, которые лучше всего открыть окно кости. Используйте те же фиксированные пороговые значения для всех сканов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этом настоящем исследовании, протокол описан ранее опубликованной модели мыши травмы / ожог индуцированной HO. 14-17 Это предполагает создание одновременно локализованной травмы опорно-двигательного аппарата с тенотомии ахиллова и глобальной воспалительного оскорбление с частичным толщиной ожог. Это приводит к образованию надежного реактивной кости в месте тенотомии, которые могут быть далее с последовательным изображений. На сегодняшний день, все мыши (более 50), которые понесли как Ахиллес тенотомию и ожогов разработали измеримое количество HO в тенотомии сайта. Для количественной оценки формирование эктопической кости, калиброванный протокол изображения μCT используется в каждой желаемой временной точке. Добавление ожоговой травмы в сочетании с тенотомии ахиллова оказалась ключевой в индукции значительного HO. В обоих травмы происходит одновременно есть значительное увеличение количества внематочной кости, которая формируется на тенотомии сайта по сравнению с Acодна Hilles тенотомия (Рисунок 1). 17

Фигура 1
Рисунок 1. Развитие HO следующие ахиллова тенотомию с или без одновременного ожога. Все мыши получали ахиллова тенотомию левой задней конечности, половина мышей также получил 30% TBSA частичное толщина ожогов на тыльной. μCT сканирует были завершены в 5 дней и 3, 5, 7, 9 и 15 недель после травмы. (А). Представительства 3D реконструкции показаны ортотопическая кости белый и HO синего цвета. Красные круги указывают очагов HO. Внематочная кости развивается в области тенотомии а также местах дистальным и проксимальным к участку повреждения в нижней конечности. Подобно HO видел clnically, это реактивная кость может быть смежными с костей скелета или разработать дистанционно в мягких тканях. (Б). Количественное Хо комзавершена с протоколом калиброванного изображения и показаны на графике. НО сохраняется за 15 недель, однако плато развития между 9-15 недель с наибольшей скоростью роста, как правило, видели между 5-9 недель. Данные средства +/- SD, п = 4 в группе, Студенческая т -test * Р <0,05 (Пожалуйста, обратите внимание, что это ранее опубликованы данные, модифицированные с 17). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6 mice Jackson Laboratory 664 8-10 weeks old
Isoflurane – Fluriso VET one, Boise, ID V1 501017
Buprenorphine – Buprenex Reckitt Benckiser Healthcare NDC 12496-0757-1 0.3 mg/ml solution
Betadine Owens and Minor, Mechanicsville, VA 2047PVP202
5-0 Vicryl sutures Ethicon, Summerville, NJ J493
Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm 3M 1624W Cut in half to properly cover burn site
µCT - GE eXplore Locus SP GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada
Microview 2.2 Advanced Bone Analysis Application GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leblanc, E., et al. BMP-9-induced muscle heterotopic ossification requires changes to the skeletal muscle microenvironment. J Bone Miner Res. 26, (6), 1166-1177 (2011).
  2. Shore, E. M. Osteoinductive signals and heterotopic ossification. J Bone Miner Res. 26, (6), 1163-1165 (2011).
  3. Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. J Bone Miner Res. 27, (5), 1004-1017 (2012).
  4. Potter, B. K., et al. Heterotopic ossification following combat-related trauma. J Bone Joint Surg Am. 92, Suppl 2. 74-89 (2010).
  5. Van den Bossche, L., Vanderstraeten, G. Heterotopic ossification: a review. J Rehabil Med. 37, (3), 129-136 (2005).
  6. Chakkalakal, S. A., et al. An Acvr1 R206H knock-in mouse has fibrodysplasia ossificans progressiva. J Bone Miner Res. 27, (8), 1746-1756 (2012).
  7. Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic [corrected] ossification. Nat Med. 14, (12), 1363-1369 (2008).
  8. Culbert, A. L., et al. Alk2 regulates early chondrogenic fate in fibrodysplasia ossificans progressiva heterotopic endochondral ossification. Stem Cells. 32, (5), 1289-1300 (2014).
  9. Dinther, M., et al. ALK2 R206H mutation linked to fibrodysplasia ossificans progressiva confers constitutive activity to the BMP type I receptor and sensitizes mesenchymal cells to BMP-induced osteoblast differentiation and bone formation. J Bone Miner Res. 25, (6), 1208-1215 (1359).
  10. Peterson, J. R., et al. Burn injury enhances bone formation in heterotopic ossification model. Ann Surg. 259, (5), 993-998 (2014).
  11. Scott, M. A., et al. Brief review of models of ectopic bone formation. Stem Cells Dev. 21, (5), 655-667 (2012).
  12. Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model. J Orthop Trauma. 25, (8), 506-510 (2011).
  13. Tannous, O., et al. Heterotopic bone formation about the hip undergoes endochondral ossification: a rabbit model. Clin Orthop Relat Res. 471, (5), 1584-1592 (2013).
  14. Peterson, J. R., et al. Treatment of heterotopic ossification through remote ATP hydrolysis. Sci Transl Med. 6, (255), 255ra132 (2014).
  15. Peterson, J. R., et al. Early detection of burn induced heterotopic ossification using transcutaneous Raman spectroscopy. Bone. 54, (1), 28-34 (2013).
  16. Perosky, J. E., et al. Early detection of heterotopic ossification using near-infrared optical imaging reveals dynamic turnover and progression of mineralization following Achilles tenotomy and burn injury. J Orthop Res. 32, (11), 1416-1423 (2014).
  17. Peterson, J. R., et al. Effects of Aging on Osteogenic Response and Heterotopic Ossification Following Burn Injury in Mice. Stem Cells Dev. (2014).
  18. Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. Blast injuries and heterotopic ossification. Bone and Joint Research. 1, (8), 174-179 (2012).
  19. Hunt, J. L., Arnoldo, B. D., Kowalske, K., Helm, P., Purdue, G. F. Heterotopic ossification revisited: a 21-year surgical experience. J Burn Care Res. 27, (4), 535-540 (2006).
  20. Ring, D., Jupiter, J. B. Operative release of ankylosis of the elbow due to heterotopic ossification. Surgical technique. J Bone Joint Surg Am. 86-A, Suppl 1. 2-10 (2004).
  21. Crane, N. J., Polfer, E., Elster, E. A., Potter, B. K., Forsberg, J. A. Raman spectroscopic analysis of combat-related heterotopic ossification. Bone. 57, (2), 335-342 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics