ייצור שיבוט וקנה מידה גדולה של וקטורי adenoviral בקיבולת גבוהה המבוססים על סוג Adenovirus האדם 5

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ehrke-Schulz, E., Zhang, W., Schiwon, M., Bergmann, T., Solanki, M., Liu, J., Boehme, P., Leitner, T., Ehrhardt, A. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (107), e52894, doi:10.3791/52894 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

עבור יישומים טיפוליים גן זה הוא בעל חשיבות רבה, כדי למנוע תופעות לוואי רעילות לתאים וחיסוניים הנגרמות על ידי ביטוי של חלבונים נגיפיים, transgene עצמו או על ידי חלבונים נגיפיים נכנסים. וקטורי אדנווירוס (עו"ד) נמצאים בשימוש נרחב כדי להציג דנ"א זר לתוך מגוון רחב של תאים כדי לחקור את ההשפעה של ביטוי transgene 1,2. הגרסה המתקדמת ביותר של עו"ד מיוצגת על ידי וקטורי קיבולת גבוהה אדנווירוס (HCAdV) חסרים כל רצפי הקידוד הנגיפיים 3,4 ובכך מציע קיבולת אריזה עד 35 קילו בשילוב עם חיסוני נמוכות ונמוכה רעילות 5-8. בשל יכולת האריזה שלהם גבוהה הם מאפשרים משלוח של transgenes הגדול או מרובה באמצעות מינון וקטור יחיד. לכן, הם מייצגים כלי רב ערך עבור קהילת המחקר.

בניגוד לראשון או עו"ד דור השני חסר גנים המוקדמים E1 ו / או E3 שניתן להפיק בקלות באמצעות ערכות מסחריות, vecטור ייצור בניית הגנום ווירוס של HCAdV הוא מורכב יותר. המערכת לבניית הגנום HCAdV מבוססת על פלסמיד שנשא pAdFTC הגנום HCAdV נטול כל רצפי הקידוד הנגיפיים ופלסמיד הסעות pHM5 9-12. כל גן של עניין של עד 14 קילו בסיסים (KB) ניתן לשכפל לpHM5 וקטור הסעות שבאתר השיבוט מרובה מוקף הכרה / ביקוע אתרים של endonucleases ביות PI- SCE אני ואני- Céu I. לכן, גן משובט של עניין ניתן לשחרר על ידי PI- רצוף SCE אני ואני- Céu אני מעכל להכנסה הבאה מופנה לאותם אתרי ההגבלה הנוכחיים בגנום HCAdV הכלול בpAdFTC פלסמיד. בpAdFTC אתר הכנסת transgene ממוקם בין PI- SCE אני ואני- Céu אני מחשוף אתרים מוקף stuffer DNA ורצפי adenoviral noncoding נדרשים לאריזת הגנום כגון חוזר מסוף כ5 'ו 3' הפוכים (ITRS)בשני קצוות ואות האריזה במורד הזרם של 5'ITR. Stuffer DNA נוסף מספק גודל אופטימלי של הגנום HCAdV הסופי הנע 27-36 קילו כדי להבטיח אריזה יעילה בייצור וירוס. מאז pAdFTC הוא פלסמיד גדול עם עד 45 קילו (תלוי בגודל של transgene הוכנס) ואת השימוש של endonucleases ביות עם אתרי הכרה comparably ארוכים DNA מציג DNA החזק מחייב, כמה צעדי ניקוי נחוצים בעת העברה של transgene מpHM5 לpAdFTC. טיפול זהיר הימנעות כוחות הגז מומלץ.

ITRS של הגנום HCAdV נמצא לצד לא אני אתרי הכרת אנזים הגבלה ממוקמים ישירות במעלה הזרם של 5'ITR ומורד זרם של 3'ITR 12. לכן, יכול להיות שפורסם על ידי HCAdV לא אני לעכל לtransfection הבא של הגנום הנגיפי לתוך קו תא מפיק HCAdV. שימו לב שהשימוש באנזים ההגבלה לא אני לrelקלות הגנום הנגיפי מpAdFTC פלסמיד מרמזת כי transgene הוכנס הוא נטול הכרת אתרים לא אני DNA. תאי מפיק תא HEK293 מבוססים (116 תאים) ביציבות להביע recombinase Cre. להגברת וירוס 116 תאים שיתוף נגועים בוירוס עוזר (HV) מספק את כל הגנים עו"ד דרושים לשכפול ואריזה ב3,4 טרנס. HV הוא עו"ד דור ראשון עם אות אריזת floxed אשר הוסרה במהלך ההגברה וירוס על ידי recombinase Cre בא לידי ביטוי בתאים 116 4. הדבר מבטיח כי הגנום בעיקר HCAdV מכיל אות אריזת שלמי encapsidated.

טרום הגברה של HCAdV מתבצעת על ידי ביצוע צעדי passaging סידוריים ב116 תאים גדלו על משטחים במנות בתרבית רקמה. אחרי כל קטע חלקיקים נגיפיים משתחררים מהתאים נגועים על ידי ביצוע שלושה שלבים להקפיא להפשיר ברציפות. עם כל מעבר מספר רב של תאים נגועים ב1/3 של lysate תא מהמעבר הקודם. לבסוף lysate מהשלב טרום ההגברה האחרונה משמש להדביק תאי מפיק גדלו בהשעיה בבקבוק טווה להגברה בקנה מידה גדולה. Virions הם מטוהרים מתאי ההשעיה על ידי ביצוע ultracentrifugation בצפיפות צזיום כלוריד שיפוע 4,12. עם הליך זה חלקיקים ריקים וחלקיקים שנאספו באופן מלא מופרדים לשתי להקות שונות. להתרכז HCAdV נוסף חלקיקי צעד ultracentrifugation הלא הדרגתי שני מבוצע. בהמשך לכך וכתוצאה מהלהקה המכילה את HCAdV נאסף ודיאליזה נגד מאגר פיסיולוגי. הכנות וקטור סופיות מתאפיינות ביחס למספרים של חלקיקים נגיפיים מוחלטים, חלקיקים מזהמים ורמות זיהום HV. חלקיקים נגיפיים מוחלטים יכולים להיקבע על ידי lysing חלקיקים נגיפיים ומדידת הספיגה ב 260 ננומטר או על ידי ביצוע בזמן אמת PCR (qPCR) 12. הדבקה של PURחלקיקי נגיף ified יכולים להיקבע על ידי הגנום HCAdV מדידת qPCR הנוכחי בתוך תאים נגועים לאחר זיהום 3 שעות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בנייה של רקומביננטי HCAdV הגנומים מבוססים על פלסמיד pAdFTC

הערה: כל פלסמידים תוארו בעבר 11,12 וזמינים על פי בקשה. תהליך השכפול מוצג באופן סכמטי באיור 1.

  1. לשכפל גן של עניין (ממשלת ישראל) כולל אות אמרגן וpolyadenylation (הרשות הפלסטינית) להסעות פלסמיד pHM5, משתמש באסטרטגית שיבוט של בחירה, כדי ליצור pHM5-ממשלת ישראל.
    הערה: מאחר pAdFTC הוא פלסמיד גדול יחסית, פרוטוקולי הכנת פלסמיד קלאסיים מומלצים להימנע sheering של פלסמיד דנ"א באמצעות ערכות טיהור פלסמיד מסחריות המבוססות על ממברנות סיליקה. אני- Céu אני וPI -Sce אני מאוד להיקשר ל- DNA ולשנות את ניידות electrophoretic של DNA מתעכל. לכן, חילוץ פנול, כלורופורם ומשקעים EtOH (שלב 1.3) נדרש לפני ג'ל אלקטרופורזה agarose.
  2. Digest 20 מיקרוגרם של PHM5-ממשלת ישראל ו -10 מיקרוגרם של pAdFTC ידי-CeuI (10 U) במשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס בנפח כולל של 100 μl לlinearize פלסמידים (~ 2.8 kb רצף + ממשלת ישראל ORF ו~ 31kb, בהתאמה).
  3. לטהר פלסמידים לינארית באמצעות מיצוי פנול, כלורופורם ואחריו אתנול (EtOH) ממטרים 13.
    1. להוסיף של פנול 100 μl: כלורופורם: אלכוהול isoamyl ומערבבים בעדינות על ידי צינור היפוך מספר פעמים. צנטריפוגה 2 דקות ב15,000 x ז.
    2. מעבירים את supernatant לצינור חדש, להוסיף 20 μl של נתרן אצטט (pH 5, 3 מ ') ו -400 μl של קרח EtOH (99.8%) קרים ומערבבים נמרצות השעיה. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 15,000 x ז.
    3. הסר את supernatant, להוסיף 300 μl של 70% EtOH ו צנטריפוגות 2 דקות ב15,000 x ז. לאחר מכן להסיר supernatant וגלולת DNA אוויר יבש. ממיסים את גלולה ב10- 20 μl של DH 2 O. האם גלולה DNA לא יבשה מדי זמן, כפי שזה יהיה קשה יותר להשיג DNA בפתרון.
  4. התקציר אני-Céu אני -digested pHM5-ממשלת ישראל ופלסמיד pAdFTC מצעד 1.3) לפחות 3 שעות או O / N עם אנזים ההגבלה PI -Sce אני (10 U) על 37 מעלות צלזיוס בהיקף כולל של 50 μl ולאחר מכן לטהר אני -CeuI וPI -Sce אני מתעכל פלסמידים באמצעות מיצוי פנול, כלורופורם ואחריו המשקעים EtOH (ראו שלב 1.3). ממיסים DNA ב -20 μl של nuclease dH החופשי 2 O.
  5. עמוד השדרה נפרד pHM5 פלסמיד (2.8 קילו) וממשלת ישראל (מהשלב 1.4) על ג'ל agarose preparative וג'ל לטהר את ממשלת ישראל באמצעות ג'ל מסחרי וPCR- ערכת ניקוי. Agarose ג'ל נציג לעכל מוצג באיור 2 א.
  6. Dephosphorylate אני- Céu אני ו- מתעכל אני PI -Sce pAdFTC (משלב 1.4) עם עגל המעיים אלקליין phosphatase CIP (10 U) במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס בהיקף כולל של 25 μl ולטהר pAdFTC פלסמיד dephosphorylated על ידי מיצוי פנול, כלורופורם וEtOH הבא יחסי ציבורecipitation (שלב 1.3). Elute DNA ב -20 μl של nuclease dH החופשי 2 O.
  7. בצע ג'ל אלקטרופורזה אנליטית מaliquot של פלסמיד dephosphorylated pAdFTC (משלב 1.6) וממשלת ישראל-הבר מטוהר (משלב 1.5) לנתח אם מעכל שלמים והגדלים של שברים הצפויים נכונים (~ 31 KB לpAdFTC ינארית ).
    הערה: הגודל של ממשלת ישראל הוא משתנה בהתאם לגודל של קלטת ביטוי transgene. להעריך את הריכוזים היחסי של שברים המתאימים לקשירה שלאחר מכן. Agarose ג'ל נציג של שברים מטוהרים מוצג באיור 2.
  8. הגדר את תגובת קשירה בהיקף כולל של 20 μl באמצעות 400 האנזים U של T4 DNA ויחס טוחנת של וקטור להכניס של 1: 3.
    הערה: בהתאמה עם ג'ל agarose שמוצג באיור 2B אנחנו בדרך כלל לקשור בהיקף כולל של 20 μl עם 2 לוקטור 6-μl, 8 עד 12 μlהכנס ואנזים 400 U של T4 DNA. כריכוז ה- DNA הוא בדרך כלל נמוך לאחר כמה צעדי phenolization, להשתמש כמה שיותר DNA ככל האפשר כדי שלא H 2 O נוסף יש להוסיף כדי להגיע לנפח הסופי של 20 μl. ולקשור על 16 מעלות CO / N ולאחר מכן לבצע חילוץ פנול, כלורופורם ואחריו המשקעים EtOH (שלב 1.3).
    1. Elute DNA ב -15 μl של nuclease dH החופשי 2 O ולעכל את תגובת קשירה המטוהרת עם אנזים הגבלה שואי (10 U) לשעה 2 ב 25 מעלות צלזיוס בהיקף כולל של 20 μl. אז להתרכז ולטהר DNA, על ידי ביצוע חילוץ פנול, כלורופורם ואחריו המשקעים EtOH (שלב 1.3). Elute DNA ב 10 μl של nuclease dH החופשי 2 O.
  9. להפוך 2 μl של Swa המטוהר אני מתעכל מוצר קשירה ידי electroporation לDH10B או DH5α electrocompetent E. coli ושיבוטים בחרו עבור 16 עד 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס בLB המכיל אמפיציליןצלחות (50 מ"ג / מיליליטר אמפיצילין). בחר 5- 10 שיבוטים ולהכין מיני הכנות פלסמיד דנ"א באמצעות תמוגה בסיסית ואחרי חילוץ פנול, כלורופורם והמשקעים EtOH הבאים (שלב 1.3) 13.
  10. בצע לעכל אנליטי של מיני-הכנות פלסמיד אחרי ג'ל אלקטרופורזה agarose כדי לבדוק את הגודל של קטעי DNA. אנזימי הגבלה הציעו הם למשל אני- Céu אני וPI- SCE אני משחרר את התוסף, SPE אני או Hinc השני (איור 2 ג).
  11. להגביר שיבוט נכון במדיום LB המכיל אמפיצילין (50 מ"ג / מיליליטר אמפיצילין) ולבצע הכנת midi- או מקסי-פלסמיד באמצעות כל ערכת טיהור פלסמיד זמינה מסחרי.

2. שחרור HCAdV-הגנום מpAdFTC פלסמיד וPreamplification של וקטורי HCAdV בתא מפיק הקו 116

  1. לעכל 20 מיקרוגרם של פלסמיד המבוסס על pAdFTC ייצור adenoviral מכיל ממשלת ישראל המשובטת מצעד 1.11) בבהיקף כולל של 100 μl באמצעות לא אני (20 U) על 37 מעלות צלזיוס ל> שעה 2 ולבצע חילוץ פנול, כלורופורם ואחרי פעמיים על ידי המשקעים EtOH. לפזר ב20- 30 μl סטרילי DH 2 O.
  2. בדוק aliquot של 1:10 בדילול pAdFTC-ממשלת ישראל-DNA מתעכל על ידי ג'ל אלקטרופורזה. בר 9 KB לשדרת פלסמיד ו, תלוי בגודל של ממשלת ישראל, שבר DNA שני לגנום HCAdV (גודל: 28. 36 KB) ניתן לזהות.
    הערה: דוגמא מייצגת של לא אני לעכל מוצגת באיור 2 ד. ה- DNA לינארית יכול להיות מאוחסן במשך כמה ימים על 4 מעלות צלזיוס או ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות.
  3. לפני שתמשיך עם הפרוטוקול, לוודא כי וירוס עוזר AdNG163R-2 כבר מוגבר 4.
    הערה: תאי transfected עם וקטורי HCAdV pAdFTC נגזר הם אורגניזמים מהונדסים גנטי סווגו כרמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2), אנא השתמשו בלימה נכונה וטיפול בפסולתאמצעים, כולל ציוד מגן אישי, ועבודה תחת BSL-2 זרימה למינרית ברדסים.
  4. 116 תאי תרבות במדיום נשר ממ בתוספת 10% FBS וhygromycin B (100 מיקרוגרם / מיליליטר). מעבר זרע נמוך (מתחת מעבר 10) 116 תאים (~ 0.4x 10 6 תאים) ביום אחד צלחת תרבית רקמת 60 מ"מ לפני transfection כך שהם מגיעים 50 confluency 80% ביום שלמחרת.
  5. Transfect הגנום HCAdV לינארית מצעד (2.1) לתאים 116 באמצעות שיטות, כגון transfection סידן פוספט או חומרים כימיים אחרים זמינים מסחרי transfection (איור 3 א). 16 18 שעות לאחר transfection, להסיר בזהירות בינונית, להוסיף 3 מיליליטר בינוני טרי (ממ, 5% FBS) ולהדביק תאים עם HV החלת 5 יחידות transducing AdNG163R-2 4 (TU) לכל תא (מאז מחוברות 60 מ"מ צלחת תרבית רקמה מכילה ~ 3.2x 10 6 תאים, להוסיף ~ 1.6x 10 7 TU של HV).
    1. בעדינות להזיז את הצלחת בכל 20 דקות במהלך השעה הראשונה לאחר הדבקה ללהבטיח חלוקה שווה HV. לטפח תאים נגועים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. במקרה של השפעה היעילה cytopathic ההגברה וירוס (CPE) הנגרמת על ידי שכפול וירוס (תאים מעוגלים ורופף מצורפים או מנותק מצלחת תרבית הרקמה) הוא נצפים 48 שעות שלאחר infection.If CPE הוא ציין קודם לכן הסכום של HV יש ל לְהִצְטַמְצֵם. אם CPE מתחיל מאוחר יותר, יותר וירוס עוזר יש להשתמש.
  6. קציר תאים כוללים 48 שעות שלאחר זיהום supernatant על ידי שטיפה את התאים מצלחת התרבות באמצעות מדיום התרבות. תאים שמושעים במדיום התרבות שלהם נקראים מעבר 0 (P0). הפיצול P0 לשני שברים.
    1. מ0.5 מיליליטר של התאים מנותקים הספין למטה התאים במשך 3 דקות XG ב 2000 ולהסיר בינוני מהתא גלולה, שמאוחר יותר שימש לבידוד הדנ"א הגנומי (gDNA) לניתוח של תהליך ההגברה מבוסס qPCR. כדורי תא חנות ב -20 ° C עד עיבוד נוסף.
    2. מ2.5מיליליטר של התאים מנותקים לשחרר חלקיקים נגיפיים על ידי הקפאה (ב -80 ° C או בחנקן נוזלי) ומפשיר (ב RT או באמבט מים 37 מעלות צלזיוס) התאים שresupended בשלוש עד ארבעה פעמים בינוניות שלהם. חלק זה הוא מ lysate נקרא של P0.
  7. ודא שמנות בתרבית רקמה עם תאים 116 שגדלות לconfluency 90- 95% באמצעות ממ-בינוני בתוספת FBS (10%) וhygromycin B (100 מיקרוגרם / מיליליטר) וHV זמינים לצעדים הבאים passaging.
  8. מערבבים 1 מיליליטר של תקשורת הטרי (ממ, 5% FBS) עם 2.5 מיליליטר של lysate מהמעבר הקודם (שלב 2.6.2) לנפח סופי של 3.5 מיליליטר, להוסיף HV החלת 2 TU לכל תא (מאז רקמת 60 מ"מ מנה התרבות בconfluency של 90- 95% מכילה ~ 3.2x 10 6 תאים, להוסיף ~ 10 6.4x 6 TU של HV). (איור 3). מוציא בזהירות את המדיום מצלחת 60 מ"מ של 116 תאים ולהוסיף את התערובת הנגיפית לתאים. חזור על שלב 2.6) - 2.8) פעמיים כדי לקבל lysates לעבורגילאי P1 ו- P2.
  9. מערבבים 17.5 מיליליטר תקשורת טרי (ממ, 5% FBS) עם 2.5 מיליליטר של lysate מP2 ולהוסיף HV החלת 2 TU לכל תא (מאז צלחת תרבית רקמת 150 מ"מ בconfluency של 80 100% מכיל ~ 2x 10 7 תאים, להוסיף ~ 4x 10 7 TU של HV). הסר את המדיום מצלחת 150 מ"מ של 116 תאים ולהדביק תאים עם תערובת ויראלי. לטפח תאים נגועים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  10. תאי 48h לאחר זיהום קציר כמתואר בשלב 2.6) כדי לקבל P3 מעבר (איור 3).
    1. חזור על שלב 2.6) 1.
    2. מ19.5 מיליליטר הנותר של חלקיקים נגיפיים שחרור P3 מתאי resupended על ידי הקפאה והפשרה שלוש עד ארבעה פעמים. חלק זה הוא מ lysate נקרא P3.
      הערה: וקטורי חלק סופו של דבר עשויים לדרוש קטעים נוספים ב150 מנות מ"מ עד שהם מוגברים במידה מספקת. לכן לייעל את התהליך מראש ההגברה צריכה להיות במעקב במהלך לעבור סידוריהְזדַקְנוּת. ניתוח מבוסס qPCR של תהליך ההגברה יכול להתבצע כאמור בסעיף 3 (ראה גם איור 4 א). טרום הגברה של HCAdV ביצוע קלטת ביטוי לחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בקלות יכולה להיות מוערכת על ידי התבוננות אות flourecscent GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 4).

3. ניטור של תהליך הגברה שימוש כמותי-Real Time PCR (qPCR) (ראה גם איור 4 א).

  1. לבודד gDNA מכדורי תא מכל קטע של preamplifaction (שלבים 2.6) - 2.10) באמצעות כל ערכת בידוד DNA מסחרית לבידוד של gDNA מהתאים בתרבית או בשיטה אחרת של בחירה. לקבלת תוצאות אופטימליות PCR להשתמש gDNA טרי ככל האפשר. אחרת ניתן לאחסן gDNA ב -20 ° C עד לשימוש נוסף.
  2. כדי לקבוע את מספר הגנום HCAdV הנוכחי בתאים של מעבר בהתאמה על ידי ניתוח qPCR ליצור עקומה סטנדרטית באמצעות 10 1 </ Sup> - 10 9 עותקים של פלסמיד שנשא את ממשלת ישראל הכלולה בגנום HCAdV.
  3. לנתח את אותה הכמות של gDNA מP0- P3 (שלב 2.6- 2.10) החלת qPCR באמצעות 400 ננומטר של פריימרים ספציפיים לממשלת ישראל הכלולה בגנום HCAdV. לביצוע הוראות יצרן מעקב qPCR של כימיקלים qPCR בהתאמה. הגדר את תכנית qPCR כדלקמן: מראש דגירה על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, הגברה ב -40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 55 60 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו 72 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות. על הבסיס העקום הסטנדרטי מספר הגנום HCAdV בתגובה ניתן אינטרפולציה.

4. הגברה בקנה מידה גדולה של וקטורי HCAdV בתאי גידול ב116 השעיה

  1. להוסיף 900 מיליליטר של ממ הטרי (37 מעלות צלזיוס) prewarmed בתוספת 10% FBS וhygromycin B (100 מיקרוגרם / מיליליטר) לתוך בקבוק תרבות טווה 3 ליטר (איור 3).
  2. הסר בינוני מלפחות 10 מנות בתרבית רקמה בודדות 150 מ"מ עם 116 תאים שגודל בconfluency של 90- 100% ולשטוף את תאים עם 10 מיליליטר של טרי מראש התחמם (37 ° C) ממ בתוספת FBS (10%) וhygromycin B (100 מיקרוגרם / מיליליטר) בעזרת פיפטה סרולוגיות. פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי לקבל השעיה תא הומוגנית. העבר את התאים ישירות לתוך הבקבוק טווה כבר מכיל 900 מיליליטר מהשלב 4.1).
    הערה: אל תשתמש בטריפסין / EDTA כזה עלול להשפיע לרעה על צמיחה של תאי השעיה. לאחר הסרת בינונית להעביר מייד תאים לתוך בקבוק ספינר. לא להתמודד עם יותר משתי מנות בתרבית רקמה בכל פעם. כבר זמן ההמתנה לאחר הוספת תקשורת טריות קשה יותר יהיה למנותקים תאים מצלחת תרבית רקמה.
  3. כדי להבטיח בקבוק טווה דגירה צמיחת תאים אופטימלי על בוחש מגנטי בתרבית רקמת חממה למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. התאם את הבוחש המגנטי עד 70 סל"ד, כדי למנוע עיקול של תאים למשטחי הזכוכית. צג צמיחת תאים בבקבוק התרבות טווה לבחון אם תאים שגודלו בבקבוק התרבות טווה הם קיימא ואם הם גדלים לכמויות מספיקות. בכל פעם לפני הוספת העברה בינונית טרי 2 מיליליטר מbioreactor לצלחת תרבית רקמת 60 מ"מ. שים לב מורפולוגיה תא תחת מיקרוסקופ.
    הערה: תאים יוצרים גושים צפים במדיום התרבות מצביעים על צמיחה וכדאיות (ראה גם איור 4C) אופטימליות. לאחר 24 שעות הם יוצרים מושבות על פני השטח של המנה בתרבית הרקמה. 30 50% מצביע על צפיפות מפגש אופטימלית.
  4. 24 שעות לאחר הגדרת בקבוק התרבות טווה להוסיף 500 מיליליטר של תקשורת הטרי (ממ, 10% FBS) בתוספת hygromycin B (100 מיקרוגרם / מיליליטר). 24 שעות מאוחר יותר לחזור על פעולה זו.
  5. 72 שעות לאחר הגדרת תרבות ספינר, להוסיף 1,000 מיליליטר של תקשורת טרי ממ (10% FBS) עם hygromycin B (100 מיקרוגרם / מיליליטר) וכתוצאה מכך בהיקף כולל של 3 ליטר של השעיה תא.
  6. 24 שעות לאחר שהגיע avolume של שלושה ליטרים, קציר 116 תאי השעיה על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 500 XG ב RT. בטל supernatant. שמור את בקבוק התרבות טווה רוק מתחת למכסת המנוע בתרבית הרקמה.
  7. כדורי תא גלולים בממ הטרי בתוספת 5% FBS ידי pipetting למעלה ולמטה על 8 10 פעמים כדי לקבל השעיה תא הומוגנית. נפח בינוני תלוי אם lysate משלב 2.10) 2. (19.5 מיליליטר, ראה שלב 4.8) 1. אפשרות) או מניות ויראלי מטוהרת של HCAdV מצעד 5.9) 2. (כמה μl depanding בכייל נגיף, ראה שלב 4.8) 2., אפשרות ב) משמש לזיהום של התאים. השתמש בנפח כולל של 150 מיליליטר.
    1. אפשרות: לזיהום של 116 תאי השעיה עם lysate מP3 (הגברה ראשונית) תאי העברה מצעד 4.8) לבקבוק 250 מיליליטר אחסון מצויד בבר סטרילי מגנטי ומערבבים או בקבוק טווה בקנה מידה קטנה 250 מ"ל ושיתוף להדביק תאים עם וירוס בתוך lysate מP3 (שלב 2.10.2) ו -2 TU של HV לכל תא. בהנחת צפיפות של 3x10 5 תאים לכל מיליליטר, הכולל את המספר הסלולרי הוא 9x 10 8 תאים. כך להוסיף 1.8x 10 9 TU של HV.
    2. אפשרות ב ': לזיהום של 116 תאי השעיה עם המניה ויראלי מטוהרת, תאי העברה מצעד 4.8) לבקבוק 250 מיליליטר אחסון מצויד בבר סטרילי מגנטי ומערבבים או בקבוק טווה בקנה מידה קטנה 250 מ"ל ושיתוף להדביק תאים עם 100 חלקיקים נגיפיים לכל תא של HCAdV לשעבר מטוהר (משלב 5.9) 2.). כך להוסיף 9x 10 10 סמנכ"ל לפי כייל פיזי (שנמדד על ידי הספיגה ב 260nm; שלב 6) של HCAdV המטוהר ו1.8x 10 9 TU של HV.
  8. מערבבים את תערובת תא-וירוס מספטמבר 4.8.1) או 4.8.2) בבוחש מגנטי בתרבית רקמת החממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לשעה 2 ב 60 סל"ד. ודא שבקבוק האחסון אינו סגור לחלוטין, כדי לאפשר זרימת אוויר.
  9. לאחר זיהום 2 שעות להעביר את הנפח הכולל של תערובת תא-וירוס בחזרה לכת טווה 3 ליטרבקבוק יור ולהוסיף 1,850 מיליליטר של (37 מעלות צלזיוס) ממ תקשורת מראש חימם הטרי בתוספת 5% FBS בהיקף כולל של 2 ליטר ו דגירה בתרבית רקמת החממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 במשך 48 שעות ב 70 סל"ד.
  10. קציר תאים על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב g 890x ב RT ב500 מיליליטר צינורות צנטריפוגה. הסר את המדיום וresuspend תאי pelleted בהיקף כולל של 28 מיליליטר של DPBS. פיפטה למעלה ולמטה כדי לקבל השעיה תא הומוגנית. להקפיא את ההשעיה תא-וירוס בחנקן נוזלי או ב -80 מעלות צלזיוס ולוודא כי ההשעיה היא קפוא לחלוטין. אחסן את ההשעיה תא-הווירוס ב -80 ° C עד שמתחיל טיהור הווירוס.

5. טיהור ודיאליזה של HCAdV

  1. כדי להכין lysate הנגיפי למילויי צזיום כלוריד (CsCl), להקפיא השעיה תא-וירוס מצעד 4.11) בחנקן נוזלי והפשרה באמבט מים ב 37 ° C פעמים ארבע.
  2. צנטריפוגה lysate הנגיפי ב XG 500 עבור 8 דקות בRT ולאסוף את supernatant המכיל את HCAdV.
  3. לultracentrifugation להכין פתרונות CsCl כfollows.Weigh 37.5 גר '(1.5 גר' / סנטימטר 3), g 33.5 (ל1.35 גר '/ סנטימטר 3), ו31,25 גרם (1.25 גר' לסנטימטר 3 /) של אבקת CsCl בהתאמה ולמלא עם 2 O ל -25 מיליליטר DH.
    1. Stirr עד פתרון הופך מסנן ברור וסטרילית הפתרונות. לבסוף להסיר 1 מיליליטר של כל פתרון ולשקול את זה בקנה מידת קנס לבדוק האם הצפיפות היא נכונה. 1ml צריך לשקלל 1.5 גר ', 1.35 ו -1.25 בהתאמה ז.
    2. אם הצפיפות היא גבוהה מדי לשנות את זה על ידי תוספת בשלבים של נפחים קטנים (μl) של DH סטרילי 2 O. לאחר תוספת של DH 2 O למדוד densitiy שוב. אם יש צורך להוסיף עוד DH 2 א '
    3. חזור על התהליך עד שהצפיפות היא נכונה. אם הצפיפות היא נמוכה מדי לשנות את זה על ידי הוספת כמות קטנה של אבקת CsCl. סינון סטרילי את זה שוב ולבדוק את הצפיפות. אם הצפיפות היא גבוהה מדי לשנות את זה על ידי Addinז DH 2 O כפי שתואר קודם לכן. אם הצפיפות היא עדיין נמוכה מדי להוסיף מור CsCl, מסנן סטרילי את זה שוב ולבדוק את הצפיפות. חזור על התהליך עד שהצפיפות היא נכונה.
  4. הכן הדרגתיים צעד CsCl בשישה צינורות ultracentrifuge ברורים. בזהירות ולאט פיפטה פתרונות CsCl לצינורות באמצעות הסדר הבא: 0.5 מיליליטר של 1.5 גר '/ סנטימטר 3 פתרון CsCl, 3 מיליליטר של 1.35 גר' / סנטימטר 3 פתרון CsCl ו -3.5 מיליליטר של 1.25 גר '/ סנטימטר 3 פתרון CsCl (איור 2 ג) .
  5. כיסוי ~ 4.5 מיליליטר של supernatant הווקטור פינה מצעד 5.2) על גבי גרם / סנטימטר 3 שכבת CsCl 1.25. צנטריפוגה הדרגתיים בultracentrifuge באמצעות תנופה את הרוטור (SW-41) בגיל 12 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה 2 ב 226.000 XG (35,000 סל"ד) עם ההאצה איטית והאטה לHCAdV-הגנום נפרד המכיל חלקיקים נגיפיים מחלקיקים ותאים ריקים מַפּוֹלֶת.
    הערה: בתנאים אופטימליים להקה מפוזרת של formes פסולת תא על גביהצינורות. להלן שני ניתן לצפות להקות הלבנות. הלהקה העליונה מכילה חלקיקים ריקים ואילו הלהקה הנמוכה שווה HCAdV (2C דמויות ו5A).
  6. מוציא בזהירות את השכבות של פסולת תא וחלקיקים ריקים ולאסוף 1 מיליליטר של הלהקות הנמוכות מצינור אחד ווירוס העברה עם קצה פיפטה נקי לתוך צינור 50 מיליליטר סטרילי. להוסיף עד 24 מיליליטר של 1.35 גר '/ סנטימטר 3 פתרון CsCl לחלקיקי נגיף נאספו ומערבבים בזהירות.
  7. מלא צינורות צנטריפוגה עם 1.35 גר '/ סנטימטר 3 פתרון CsCl-וירוס לO העליון ו צנטריפוגות / N (18 20 שעות) ב226.000 XG (35,000 סל"ד) בשעת 12 ° C בultracentrifuge באמצעות את תנופת הרוטור (SW-41 ) עם ההאצה והאטה איטיות.
  8. לאסוף את HCAdV הנוכחי ברצועה התחתונה הבולטת. כלהקה עליונה פוטנציאל מכילה חלקיקים ריקים להסיר שכבות העליונות מלמעלה בעזרת פיפטה (ראה 2C דמויות ו5B) ואז לקחת את USI הלהקה התחתוןng פיפטה.
  9. Dialyze חלקיקי נגיף נאספו לחילופי חיץ.
    1. חותך את רצועה של צינורות דיאליזה (MWCO: 50,000) של כ 8 ס"מ אורך, לשטוף אותו עם סטרילי DH 2 O לשלוש פעמים. ואז לסגור צד אחד של צינור הדיאליזה עם מהדק פלסטיק ולהעביר את הווירוס שנאסף מהשלב 5.8) לתוך צינורות בעזרת פיפטה 1 מ"ל. למנוע בועות אוויר בתוך צינורות ולסגור אותו בצד השני עם סגרים דיאליזה מהדק פלסטיק.
    2. Dialyze בl 1 של חיץ דיאליזה (10 מ"מ טריס-HCl (pH 7.5), גליצרול 10% ו 1 מ"מ MgCl 2 בH 2 O deionized) עבור 2 שעות על 4 מעלות ערבוב איטי Cwith. חיץ הדיאליזה Exchange עם 2 ליטר של חיץ דיאליזה ודיאליזת O / N ב 4 ° C עם ערבוב איטי. לחלופין להשתמש sucrosebuffer (140 מ"מ NaCl, 5 מ"מ Na 2 HPO 4 x2H 2 O, 1.5 2 PO 4 וסוכרוז 730 מ"מ KH מ"מ, pH 7.8).
    3. לאסוף חלקיקי נגיף דיאליזה מצעד 5.9) 2. באמצעות עמ '1 מיליליטרipette. הכן aliquots מרובה כרכים רצויים קטנים (25 100 μl) ולאחסן את הווירוס מטוהר ב -80 ° C.

6. מדידת כייל הפיזי של תכשירי HCAdV סופי לפי צפיפות אופטית (OD)

  1. לדלל 25 μl של הכנת הווקטור הסופית מצעד 5.9) 2 עם 475 μl של חיץ תמוגה (10 מ"מ טריס-HCl (pH 7.5), 10 מ"מ EDTA (pH 8.0), 0.5% SDS)), בעדינות לנער במשך 20 דקות ב RT ולבסוף צנטריפוגות במשך 2 דקות ב RT ב15,000 x ז.
  2. מאז ערכי הספיגה ב 260 ננומטר (A260) הם בדרך כלל נמוכים, למדוד ספיגת ארבע פעמים באמצעות של supernatant 100 μl ולחשב ערך ממוצע של ארבע מדידות. לחשב את מספר החלקיקים נגיפיים לכל מיליליטר (סמנכ"ל / מיליליטר -1) באמצעות הנוסחא הבאה: סמנכ"ל / מיליליטר -1 = (אומר A260) x (20) x (1.1 x 10 12) x (גודל / HCAdV 36 KB בkb ).
    הערה: תוצאות של תשואה אופיינית של חלקיקים נגיפיים מוחלטים (כייל OD) מוצגות באיור 7 א

7. מדידה סה"כ חלקיקים, יחידות זיהומיות של HCAdV ורמות HV זיהום בגמר וקטור ההכנה על ידי qPCR. תכנית של נוהל כותרות מוצגת באיור 6

  1. תאי זרע בHEK293 6 או 12 צלחות תרבית רקמה כל כך טובות שתאים מגיעים 90% confluency ביום שלמחרת. כדי לקבוע את מספר החלקיקים נגיפיים מדבקים (כייל מדבק), להדביק תאים של אחד גם בצלחת רב גם עם μl 1 וגם שני עם 10 μl של וירוס מטוהר מצעד 5.9) 3.
  2. קציר תאים לאחר זיהום 3 שעות. הסר בינוני ולהוסיף טריפסין כדי לכסות את כל היטב דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 5 דקות. לשטוף את התאים עם טריפסין בעזרת פיפטה ולסובב את התאים ב890 XG במשך 3 דקות ב RT.
  3. Resuspend תאי pelleted ב200 μl של DPBS ולשטוף אותם ביסודיות כדי להסיר חלקיקים חופשיים (שאינם מזהמים) וקטור. צנטריפוגה 3 דקות ב 890 XG ב RT. מחק את כדורי תא supernatant וגלולים ב200 μl של DPBS הטרי.
    הערה: קביעה מדויקת של כייל זיהומיות, חשוב להסיר את כל חלקיקים הנגיפיים שאינם מזהמים ממשטחי התא על ידי טריפסין טיפול ושטיפה יסודית.
  4. כדי לקבוע את המספר הכולל של חלקיקים נגיפיים (חלקיקים מזהמים וחלקיקים מזהמים שאינם = כייל פיזי), קציר אינו נגוע HEK293 תאים משתי בארות ללא טריפסין על ידי שטיפה את התאים עם מדיום התרבות שלהם בעזרת פיפטה.
  5. ספין למטה התאים 3 דקות ב 890 XG ב RT. מחק את המדיום וresuspend תאי טבליות ב200 μl של DPBS. סוbsequently להוסיף μl 1 ו -10 μl הכנת HCAdV מטוהר ישירות לתאים, בהתאמה. להשתמש בתאים נגועים שאינו כרקע, על מנת להבטיח את אותם תנאים לבידוד gDNA וQ-PCR שלאחר מכן.
  6. לבודד gDNA מתאי HEK293 נגזרים מצעדים 7.3) ו -7.5)
    1. תאי מערבולת resuspended ב200 μl של DPBS (שלב 7.3 ו -7.4) במשך 3 שניות, להוסיף 200 μl של פתרון SDS. (10 מ"מ טריס-HCl (pH 7.5), 10 מ"מ EDTA (pH 8.0), 0.5% SDS) ו -20 μl proteinase K (20 מ"ג / מיליליטר) והשעיה מערבולת במשך 3 שניות. דגירה 12 16 שעות על 55 מעלות צלזיוס ולנער לאט. לאחר מכן להוסיף 2 μl של RNAse (20 מ"ג / מיליליטר) ודגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
    2. להוסיף 350 μl של פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl צנטריפוגות 2 דקות ב15,000 x ז. מעבירים את supernatant לצינור חדש וחזור על שלב זה פעם אחת
    3. מעבירים את supernatant לצינור חדש, להוסיף 50 μl של נתרן אצטט (pH 5, 3 מ ') ו1 מיליליטר של קרח EtOH (99.8%) קרים ומערבבים השעיה. Centriדגימות fuge במשך 10 דקות ב 15,000 XG כדי גלולה DNA הגנומי.
    4. לאחר מכן להסיר את supernatant, להוסיף 500 μl של 70% EtOH ו צנטריפוגות 2 דקות ב15,000 x ז. הסר את supernatant, להוסיף 500 μl של 70% EtOH ולנער במשך 30 דקות ב RT. אז צנטריפוגות 2 דקות ב15,000 x ז.
    5. הסר את supernatant וגלולת DNA אוויר יבש. האם כדורי ה- DNA לא יבשים במשך זמן רב, כפי שזה יהיה קשה יותר לקבל gDNA בפתרון. Resuspend גלולה DNA ב120 μl של DH 2 O ו דגירה ~ השעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס בזמן רועד. אם פתרון ה- DNA מופיע צמיג, לנער אותו במשך כמה שעות על 37 מעלות צלזיוס, או לדגור על 55 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ~.
  7. כדי לקבוע HCAdV-חלקיקים מזהמים וHCAdV-חלקיקים מוחלטים, ליצור עקומה סטנדרטית של ינואר 10 - אוגוסט 10 עותקים של פלסמיד שנשא את ממשלת ישראל הכלולה בגנום HCAdV.
  8. לקבוע חלקיקים כולל וחלקיקים מזהמים על ידי ניתוח באותו סכומי gDNA של ג HEK293 הנגועאמות מצעד 7.3) ו -7.4) תחולנה qPCR באמצעות 400 ננומטר של פריימרים ספציפיים לממשלת ישראל הכלולה בגנום HCAdV.
  9. הגדר את תכנית ה- PCR כדלקמן: מראש דגירה על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, הגברה ב -40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות ו 72 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות. על הבסיס העקום הסטנדרטי (שלב 7.7), לשרבב את המספר הכולל של הגנום adenoviral בתגובה.
  10. לחשב את מספר הגנום adenoviral בהכנת הווקטור הסופי באמצעות הנוסחות הבאות: (מספר HCAdV / המשקל בng של gDNA בתגובה) x (משקל בng של DNA של כל התאים בצלחת נגועה / וירוס נפח בμl) .
    הערה: הטווח האופייני לתשואות חלקיקים נגיפיים מוחלטים ומזהמים הוא סביב 1x10 7 -1x10 8 חלקיקים / μl ויראלי. Titers כי הם פי עשר גבוהים או נמוכים יותר הראו כאן יכול להיחשב כנורמליים. titers גבוה יותר יהיה שיפור. עם כל כבוד ליחס של לגבי השתתפות HCAdV המוחלטתles לחלקיקי HCAdV זיהומיות, ניסיון מראה כי כ 5 10% מחלקיקי HCAdV מוחלטים הם (איור 7 א) זיהומיות.
  11. כדי לקבוע את רמות הזיהום עם HV, לבצע qPCR על ידי הגברת חלק של גן adenoviral מאוחר 3 (L3) קיים בגנום HV. השתמש בפלסמיד הנושא את הגן באיחור adenoviral 3 (L3) כדי ליצור עקומה סטנדרטית (שלב 7.7).
  12. בתגובה זו יחול 400 ננומטר של L3 פריימרים קדימה 5'-AGA AGC TTA GCA TCC GTT ACT CGA GTT GG-3 'וL3 הפוך 5'-ATA AGC TTG CAT GTT GGT ATG CAG GAT GG-3 "יחד עם 300 ננומטר של חללית L3 ספציפי 5'-Fam-המרכז לאמנות עכשווית CCC GTG TGT ACC TGG TGG ACA-טמרה-3 ".
  13. הגדר את תכנית ה- PCR כדלקמן: טרום דגירה / הפעלה על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, הגברה במהלך 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות. השתמש בכל בדיקה PCR אוניברסלית mastermix לתגובת qPCR. על הבסיס העקום הסטנדרטי (שלב 7.7), לחשב את מספר בחלקיקי HV מידבקים בהכנת הווקטור הסופית. ראה (איור 7 א) לתשואות אופייניות לחלקיקי HV.
  14. לבסוף לחשב את היחס של חלקיקים מזהמים מוחלטים של HCAdV לרמות זיהום HV להעריך את איכות הכנת הווקטור.
    הערה: עד עכשיו חלק קטן של HV שנותר לא ניתן לשלול. בדרך כלל את אחוז זיהום HV הוא ~ 5% של חלקיקים מזהמים או פחות, וזה מקובל (איור 7). כמובן שפחות HV ככל האפשר רצוי, במיוחד אם הכנת הווקטור הולכת לשמש לניסויים בבעלי חיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

דוגמאות כאן נציג לשיבוט, הגברה וטיהור של הכנות HCAdV מוצגות. סקירה של אסטרטגית השיבוט (איור 1) ודוגמאות מייצגות לשכפול ולשחרורו של הגנום HCAdV על ידי הגבלת אנזים עיכול מסופקים (איור 2). דפוס אופייני הגבלה לאחר שחרורו של קלטת ממשלת ישראל-הביטוי מpHM5 ידי PI- SCE אני ואני- Céu אני לעכל וחילוץ פנול, כלורופורם שלאחר מכן ומשקעים EtOH (ראה גם צעדים 1.2 1.5) מוצגים (איור 2 א). בדרך כלל ניתן לראות להקת KB ~ 3 המקבילות לשדרת פלסמיד pHM5 ולהקה שנייה המקבילה לקלטת הביטוי של ממשלת ישראל. הלהקה המכילה את קלטת ממשלת ישראל-הביטוי לאחר מכן מטוהרת מagarose ג'ל. קלטת ממשלת ישראל-הביטוי המטוהרת מנותחת על agarose ג'ל יחד עם pAdVFTC המטוהר, dephosphorylated שwכמתעכל עם PI- SCE אני ואני- Céu אני בהתאמה (שלב 1.7) כדי לאמת את הגודל הנכון וכדי להעריך את הכמות היחסית של מולקולות לקשירה הבאה (איור 2). לאחר קשירה (ראה שלב 1.8) ואחרי חילוץ פנול, כלורופורם ומשקעים EtOH וSwa אני לעכל לחסל pAdFTC חתוך וחילוץ פנול, כלורופורם שלאחר מכן ומשקעים EtOH (שלב 1.9), מוצרי קשירה הופכים לחיידקים ושיבוטים נבחרו על אמפיצילין המכיל צלחות אגר LB-. בדרך כלל עשרות עד מאות שיבוטים מתקבלים, שממנו 5 10 שיבוטים מוכנים למיני הכנות פלסמיד דנ"א. דפוס הגבלה לעכל Hinc השני אנליטי של שיבוטים חיוביים ושליליים יחד עם pAdFTC ריק כביקורת שלילית (ראה גם צעד 1.10) מוצג (איור 2 ג). כאן שיבוטים חיוביים לא מראים להקת 5 קילו, שנמצאת בpAdFTC הריק ושיבוטים שליליים ושבר 1.7 kb מופיעשאינו קיים בpAdFTC הריק ושיבוטים שליליים. לממשלה ישראל בהתאמה זה זה מצביע על שיבוט tha היה מוצלח. שיבוט חיובי שכבר מטוהר באמצעות midiprep אז מתעכל עם לא TI לשחרר HCAdV-הגנום נושא את ממשלת ישראל מpAdVFTC-ממשלת ישראל (שלב 2.2). לבסוף לא TI מתעכל DNA ist מטוהר פעמיים באמצעות מיצוי פנול, כלורופורם ומשקעים EtOH כדי להבטיח טוהר גבוה של ה- DNA לtransfection לאחר מכן לתאים 116. ניתוח של חלק קטן מלא TI מתעכל pAdVFTC-ממשלת ישראל על ג'ל agarose מציג להקת KB ~ 9 המקבילות לשדרת פלסמיד pAdFTC ולהקה גדולה של עד ~ 36 KB (תלוי בגודל של קלטת ביטוי ממשלת ישראל) מתאים לגנום HCAdV (איור 2 ד). סקירה של ההגברה וטיהור הצינור היא סכמטי מוצגת (איור 3). דוגמאות מייצגות של הניטור של תהליך הווקטור מראש ההגברה מסופקות ( (איור 4 א). שים לב שהמספר של הגנום וקטור בדרך כלל descreases במהלך הקטעים הראשונים ומגביר משמעותי במעברים מאוחר יותר. מספר עותק וקטור של יוני 10 - יולי 10 ל- 15,000 תאים מספיק כדי להדביק 116 תאים לייצור בקנה מידה גדול בבקבוק טווה 3 ליטר. אם ממשלת ישראל בתוך הגנום וקטור HCAdV מכילה קלטת ביטוי GFP, התהליך מראש ההגברה (סעיף 2) יכול גם להיות במעקב על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תמונות מייצגות של כל קטע מוצגים (איור 4). שים לב כי מספר תאי GFP החיוביים בדרך כלל יורד בקטעים הראשונים ומגביר משמעותי בקטעים מאוחרים. אם מספר תאי GFP החיוביים מגיע ~ 100%, הווקטור היה מוגבר sufficiently להדביק 116 תאים לייצור בקנה מידה גדול בבקבוק טווה 3 ליטר. תהליך ההגברה בקנה מידה הגדול של קלטת ביטוי GFP HCAdV מכיל היה פיקוח על ידי ניתוח המיקרוסקופי של מדיום התרבות ותאים שהועבר מהבקבוק טווה לצלחת בתרבית רקמה. תמונות מיקרוסקופיות של תאים מייצרים HCAdV בתרבות השעיה (ראה שלב 4.4 ו4.11) מסופקים (איור 4C). שים לב שהתאים גדלים בגושים מצביעים על כך שצמיחת התאים שקדמו הייתה מספיק ותאים בריאים. בעת השימוש במיקרוסקופ ~ 100% של תאים אלה ניאון היו GFP חיובי, המצביע על התמרה יעילה של תאי השעיה בייצור bioreactor ווקטור יעיל. חלקיקי וקטור היו מטוהרים מבינוני ותאים של תרבות ההשעיה 3 ליטר על ידי ultracentrifugation CsCl. תמונות מייצגות של טיהור וקטור HCAdV באמצעות ultracentrifugation שיפוע צפיפות CsCl מוצגות (איור 5). אחריn צנטריפוגה הראשונית באמצעות שיפוע צעד CsCl בדרך כלל שתי להקות הם נצפו. הלהקה העליונה מכילה ריקה של capsids החלקי ואילו הרצועה התחתונה מורכבת מחלקיקי DNA המכיל וקטור (שלב 5.4- 5.5) (איור 5 א). ה- DNA המכיל חלקיקי וקטור לאחר מכן נקטף (שלב 5.6) ונקווה לצעד ultracentrifugation שני להתרכז חלקיקי הווקטור. צעד זה גורם בדרך כלל ללהקה אחת של חלקיקי וקטור DNA המכיל שסופו של דבר שנקטפו לדיאליזה שלאחר מכן (שלב 5.7- 5.8) (איור 5). הכנות וקטור dialyzed אופיינו על ידי מדידת מספר החלקיקים מוחלטים, חלקיקים מזהמים וזיהום HV. מתווה סכמטי של הליך טיטרציה (סעיף 6 ו -7) מסופקת (איור 6). תוצאות נציג לאפיון של הכנת הווקטור הסופית מוצגות (איור 7). התרשים בר מציג מספרי חלקיקי וקטור טיפוסיים שמתקבל על ידי ההליך המתואר בפרוטוקול זה. מספרים מוחלטים חלקיקים של חלקיקי וקטור נקבעו על ידי צפיפות אופטית (סעיף 6), חלקיקי וקטור זיהומיות וזיהום HV נמדדו על ידי qPCR (סעיף 7) (איור 7 א). ניסיון מראה, שכייל OD מגזים בהערכה מספר חלקיקי נגיף. חלקיקים נגיפיים מוחלטים נמדדו על ידי OD יכולים להיות 20 גבוהים פי 500 מאשר חלקיקים נגיפיים מדבקים הנמדדים על ידי Q-PCR. חלקיקי וקטור זיהומיות בד"כ נעים בין 5 10% מחלקיקים מוחלטים כאשר שניהם נמדדים על ידי Q-PCR (סעיף 7). אם הכנת הווקטור יש איכות טובה מאוד, יותר מ -20% מחלקיקים מוחלטים הם מדבקים. היחס הטיפוסי בין HV וחלקיקים מזהמים HCAdV (שלב 7.14) בדרך כלל נע בין 1-5% מחלקיקים מזהמים (איור 7). זה מקובל כHV הוא חסר שכפול. עם זאת כזיהום HV פחות ככל האפשר (<1% מחלקיקים מזהמים) הייתלהיות מועדף.

איור 1
תרשים זרימה באיור 1. של שיבוט ממשלת ישראל לpAdFTC. ממשלת ישראל משובטת לתוך MCS של פלסמיד הסעות pHM5. פלסמידים pAdFTC וpHM5-ממשלת ישראל מתעכלים עם אני- Céu אני וPI- SCE אני ומטוהר על ידי מיצוי פנול, כלורופורם ומשקעים EtOH. PHM5 מתעכל נטען על ג'ל agarose preparative לטהר את הגן של עניין (ראה גם צעד 1.5), ואילו פלסמיד pAdFTC מתעכל הוא dephosphorylated. בהמשך תגובת קשירה עם pAdFTC טופל CIP ואת קלטת ביטוי transgene מוגדרת (ראה שלב 1.8) ולאחר ההשלמה מטוהרים על ידי מיצוי פנול, כלורופורם ומשקעים EtOH. לאחר מכן Swa אני התקציר של מוצר קשירה ואחרי חילוץ פנול, כלורופורם ומשקעים EtOH מונע צמיחה של שיבוטים ביצוע pAdFTC ללא הוספה. תלת שחורזוויות מצביעות אתרי הכרת אנזים הגבלה; תיבות אפורות מציינות AdV5 הפוכה חוזר מסוף, קופסות הלבנות מסומנות באות Ψ מצביעות אריזת AdV5, חץ אדום מציין (ITR) אמרגן, קופסות ירוקות מצביעות transgene (גן של עניין, ממשלת ישראל) לבוא לידי ביטוי, קופסות כחולות מצביעות על אות polyadenylation, כתומות או כחול חצים מצביעים גני עמידות לאנטיביוטיקה של עמוד השדרה פלסמיד, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. תוצאות עבור נציג הליך השיבוט ושחרורו של הגנום HCAdV מpAdVFTC. שחרור () של קלטת ממשלת ישראל-ביטוי מpHM5 ידי PI- SCE אני ואני- Céu אני לעכל (ראה גם צעדים 1.2 1.5). (ב) SCE אני ואני- Céu אני בהתאמה (שלב 1.7). (ג) אנליטית Hinc השני תקציר של שיבוטים pAdVFTC עם ובלי ממשלת ישראל (ראה גם צעד 1.10). שחרור (D) של HCAdV-הגנום נושא את ממשלת ישראל מpAdVFTC-ממשלת ישראל על ידי לא TI לעכל (שלב 2.2) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
זיהום איור 3. תרשים סכמטי להגברת קיבולת גבוהה adenoviral וקטור וטיהור () transfection DNA HCAdV ווירוס עוזר (HV):. Transfection של הגנום HCAdV ינארית נושא את ממשלת ישראל לשורת תאי מפיק HCAdV (116 תאים [4]) וsuזיהום bsequent עם HV AdNG163R-2 [4].   הגברה של HCAdV (ב '): לאחר שלבים טרום-ידי הגברה סדרתי העברת lysate תא לצלחת תרבית רקמה חדשה ושיתוף מדביק עם HV, ייצור בקנה מידה גדולה מתבצע בתרבות השעיה 3 L (ג) לטיהור HCAdV:. ל טיהור, נגיף מבודד על ידי ultracentrifugation באמצעות הדרגתיים צזיום כלוריד דיאליזה (ד '):. חלקיקי HCAdV מטוהרים dialyzed נגד מאגר אחסון 2 ליטר. HCAdV, קיבולת גבוהה וקטור adenoviral; ITR, סרוטיפ אדנווירוס 5 הפוך חוזר מסוף; Ψ, אות אריזה; HV, וירוס עוזר; משרד הפנים, ריבוי של זיהום. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4 <br /> 4. תוצאות איור נציג של תהליך ההגברה ניטור (א) לתהליך טרום ההגברה על ידי הגברה של הגנום נגיפי באמצעות qPCR (ראה גם סעיף 3);. (ב) אם ממשלת ישראל מכילה GFP כtransgene, התהליך טרום ההגברה יכול להיות במעקב על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. (ג) נציג תוצאות של תהליך ההגברה בקנה מידה הגדול בבקבוק טווה examplified לGFP קידוד HCAdV. הלוח השמאלי מציג תמונה מיקרוסקופית של 116 תאים נגועים מהבקבוק ספינר. מדגם של מדיום התרבות ותאים הועבר לצלחת תרבית רקמת 60 מ"מ. שים לב שהגושים של תאים מוגברים גלויים. הפנל הימני מראה את אותה תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כמעט 100% מתאים transduced עם HCAdV ביצוע GFP. אנא לחץ כאן ללצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. נציגי תוצאות לאחר צנטריפוגה שיפוע CsCl () לאחר ביצוע שיפוע צעד (ראה גם צעד 5.5);.. (ב) לאחר שיפוע רציף (ראה גם צעד 5.7) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6. מתאר סכמטי של הליך טיטרציה. מדידה () של חלקיקים מזהמים: תאים בצלחת רב גם נגועים בכרכים שונים של וירוס מטוהר ונאספו ככדורי תא o (ב) מדידה.ו חלקיקים מוחלטים: תאי Unifected יוצרים רב גם נאספים על ידי trypsinization ו צנטריפוגה. לאחר וירוס מטוהר resuspension הוא הוסיף והדנ"א הגנומי הוא מבודד. בידוד (C) של ה- DNA הגנומי. (ד) כדי לכמת מספרי עותק נגיפיים הגנום PCR כמו (Q-PCR) מתבצע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דְמוּת.

איור 7
איור 7. נציגי תוצאות לאפיון של הכנת הווקטור הסופית. (א) מספרים מוחלטים של חלקיקים של הכנת וקטור על פי הפרוטוקול שהוצג נקבע בשיטות שונות:. כייל OD נמדד על ידי צפיפות אופטית (סעיף 6), כייל זיהומיות וזיהום HV שנמדד על ידי qPCR (סעיף 7) (ב)יחס בין החלקיקים כולל זיהומיות HCAdV ורמות זיהום HV שנמדדו על ידי qPCRs (סעיף 7). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול שהוצג כאן מאפשר טיהור של וקטורי HCAdV מבוססים על סוג אדנווירוס אדם 5 מבוססים על נהלים שתוארו קודם לכן 4,12. הגנום HCAdV בתוך פלסמיד pAdFTC הוא נטול כל הגנים אדנווירוס ורק נושא את 5'- ו3'- ITRS ואות האריזה. באסטרטגיה זו HV AdNG163R-2 4 מספק את כל הגנים הנחוצים לייצור וירוס יעיל בטראנס. זה מציע קיבולת אריזה של עד 35 קילו, אשר בבירור outcompetes עו"ד דור הראשון והשני או lentivirus בשימוש נרחב (LV) - או וירוס adeno קשור (AAV) וקטורים מבוססים. יתרון שני של HCAdV במיוחד עבור in vivo יישומים הוא העובדה כי בניגוד לראשון או עו"ד דור שני הם מציגים רמות מופחתות של ציטוטוקסיות ותופעות לוואי חיסוניות הנגרמות על ידי הביטוי של חלבונים נגיפיים 5-8.

עם זאת הפרוטוקול המתואר כאן הוא יותר זמן ועבודה אינטנסיבית מאשר לוקטורים אחרים נגיפיים כגון LV- או AAV-וקטורים, כמו גם ראשון או שני עו"ד דור. מכשול עיקרי הוא השיבוט של transgenes הגדול וההעברה לאחר פלסמיד ייצור וירוס pAdV-FTC. השימוש בendonucleases ביות PI- SCE אני ואני- Céu אני מציע החדרה מדויקת ומכוונת של transgene מהמעבורת פלסמיד pHM5, אבל יש לי החסרון של דבק חזק DNA ביקע. מהסיבה שצעדים ניקוי פנול, כלורופורם רב נחוצים בעת הכנת plasmid- והכנס-DNA במהלך תהליך השכפול. לכן, בקפדנות הבאה פרוטוקול השיבוט סיפק מומלץ בהחלט. לאחר שיבוט הגנום HCAdV הוא שוחרר מpAdFTC פלסמיד על ידי לא אני הגבלת אנזים העיכול וtransfected בהמשך לשורת תאי יצרן. שים לב שיעיל transfection הראשונית הם קריטיים להשגת הגברה וירוס מספקת. חשוב לציין, הפרוטוקול מציע מספר צעדים שמההליך יכול להיות מחדש במקרה השלבים הבאים להיכשל. במהלך מראש הגברה שליש מlysates ניתן לאחסן כגיבוי כדי להתחיל את ההליך מנקודה ששוב או לקצר חזרה במקרה יותר וירוס צריך להיות מיוצר.

HCAdV ביצוע transgenes גדול, מורכב או כמה או מסוים stuffer DNA יכול להיות הגברה איטית מהצפוי. לכן, חשוב לעקוב בזהירות את התהליך מראש ההגברה לפני תרבות ההשעיה הוא גדלה בבקבוק ספינר. אם מראש הגברה היא לא מוצלחת, ההליך צריך להיות עצר והתחיל מההתחלה שוב. אם מראש הגברה היא לא יעילה, passaging נוסף עשוי להיות נחוץ עד הסכום של וירוס הוא גבוה מספיק כדי להדביק את התאים שגודלו בבקבוק טווה 3 L. כחלופה לתרבות השעיה בבקבוק ספינר, 20 עד 30 150 מנות בתרבית רקמת מ"מ יכולות לשמש למעבר הסופי. עם זאת, זה עשוי להיות יותר זמן והעבודה אינטנסיבי.

class = "jove_content"> בצנטריפוגה שיפוע CsCl זה יהיה מועיל לפצל את lysate מהבקבוק טווה לשני שברים ולסובב אותם בנפרד כזה לא להפחית באופן דרמטי titers הווירוס. ברגע שהתולעת HCAdV מיוצר בהצלחה זה קל יחסית מחדש להגביר את המניה הנגיפית על ידי תרבות השעיה מבקבוק טווה עם חלקיקים נגיפיים מטוהרים וHV הדבקה משותף.

למדידות qPCR gDNA יכול גם להיות מטוהר באמצעות הפרוטוקול שהוזכר כאן או כל ערכה זמינה מסחרית לבידוד של gDNA מהתאים בתרבית. באמצעות ערכה זמינה מסחרי הפרוטוקול יכול להתקצר יום אחד אבל חלק משתנה של עותקי הגנום HCAdV שנמצאים בתאים נגועים עלול ללכת לאיבוד במהלך טיהור, בהתאם לערכת שימוש. לכן הגנום HCAdV יהיה ייצוג הולם למעט במדידות הבאות Q-PCR בהשוואה לשיטה שהוצגה בשלב 7.4).

Obtaititers זיהומיות הכולל נד בהכנת וקטור סופי אחד נגזר ממגוון בקבוק טווה אחד מ1 x 10-05 אוקטובר x 10 11 חלקיקים מזהמים. סכום זה מספיק לביצוע מספר רב של ניסויים במבחנה. תלויים בתאי המטרה, גם כמה ניסויים בvivo יכול להתנהל. לדוגמא, להשגת התמרה כבד מספיק לאחר מתן מערכתי 1 x 10 9 חלקיקים מזהמים נדרשים.

לסיכום, כמיהות התא רחבות והאפשרות לייצר אדנווירוס-שונה קפסיד יחד עם פרופיל הבטיחות המשופר של HCAdV הווקטורים נטול כל הגנים הנגיפיים להבהיר מערכת וקטור HCAdV אלה כלי חשוב ביותר עבור יישומים טיפוליים גן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
I-CeuI New England Biolabs R0699S restriction digest
PI-SceI New England Biolabs R0696S restriction digest
T4 Ligase New Engand Biolabs M0202S ligation
SwaI New England Biolabs R0604S restriction digest
NotI New England Biolabs R0189S restriction digest
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP) New England Biolabs M0290S dephosphorylation of digested plasmids
Hygromycin B PAN Biotech P02-015 selection of CRE expressing 116 cells
DMEM PAN Biotech P04-03590    Hek293T cell culture medium
Minimal Essential Medium (MEM) Eagle PAN Biotech P04-08500 116 cell culture medium  
Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS) PAN Biotech P04-36500 washing of cells, resuspension of cells
250-ml storage bottle Sigma CLS430281-24EA infection of 116 cells grown in suspension
500-ml PP CentrifugeTubes Sigma CLS431123-36EA sedimentation of cells from suspension culture
Spinner flask Bellco 1965-61030 growth of 116 cells in suspension
Ultra Clear Ultracentrifuge tubes Beckmann Coulter 344059 density gradient centrifugation
Ultracentrifuge Beckmann Coulter density gradient centrifugation
SW-41 rotor Beckmann Coulter density gradient centrifugation
Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane VWR 132129 dialysis tubing
ready-to-use dialysis cassettes  Thermo 66383 dialysis
one shot DH10B electrocompetent E. coli invitrogen C4040-52 transformation of ligation reactions
PureYield Plasmid Midiprep System Promega A2495 midiprep
peqGOLD Tissue DNA Mini Kit  Peqlab 12-3396-02 isolation of genomic DNA
SuperFect Transfection Reagent Qiagen 301305 tranfection of 116 cells
opti MEM (10% FBS) Gibco 31985-062 transfection of 116 cells
iQ SYBR Green Supermix BioRad  170-8882 q-PCR
CFX 96 C1000 touch  Biorad qPCR machine
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol  Carl Roth A156.1 purification of DNA
Cesium chloride Carl Roth 8627.1 density gradient centrifugation
sodium acetate 99% Carl Roth 6773.2 DNA precipitation
LB medium  Carl Roth X968.3 bacterial growth medium
ethanol  99.8% pure Carl Roth 9065.5  DNA precipitation and washing
SDS 99.5% Carl Roth 2326.2 lysis  buffer
EDTA Carl Roth 8043.2 lysis  buffer
Tris-HCl 99% Carl Roth 9090.3 dialysis buffer/ lysis  buffer
glycerol 99.5% Carl Roth 3783.1 dialysis buffer
MgCl2 98.5% Carl Roth KK36.2 dialysis buffer
NaCl Carl Roth 3957.1 optional dialysis buffer
KH2PO4 Carl Roth 3904.2 optional dialysis buffer
sucrose Carl Roth 9286.1 optional dialysis buffer
Na2HPO4x2H2O Carl Roth 4984.2 optional dialysis buffer
1.5-ml tubes sarstedt 72,730,005 storage of virus preparations at -80 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benihoud, K., Yeh, P., Perricaudet, M. Adenovirus vectors for gene delivery. Curr Opin Biotechnol. 10, (5), 440-447 (1999).
  2. Crystal, R. G. Adenovirus: the first effective in vivo gene delivery vector. Hum Gene Ther. 25, (1), 3-11 (2014).
  3. Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, (24), 13565-13570 (1996).
  4. Palmer, D., Ng, P. Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Mol Ther. 8, (5), 846-852 (2003).
  5. Morral, N., et al. High doses of a helper-dependent adenoviral vector yield supraphysiological levels of alpha1-antitrypsin with negligible toxicity. Hum Gene Ther. 9, (18), 2709-2716 (1998).
  6. Muruve, D. A., et al. Helper-dependent adenovirus vectors elicit intact innate but attenuated adaptive host immune responses in vivo. J Virol. 78, (11), 5966-5972 (2004).
  7. Ehrhardt, A., et al. A gene-deleted adenoviral vector results in phenotypic correction of canine hemophilia B without liver toxicity or thrombocytopenia. Blood. 102, (7), 2403-2411 (2003).
  8. Cots, D., Bosch, A., Chillon, M. Helper dependent adenovirus vectors: progress and future prospects. Curr Gene Ther. 13, (5), 370-381 (2013).
  9. Mizuguchi, H., Kay, M. A. Efficient construction of a recombinant adenovirus vector by an improved in vitro ligation method. Hum Gene Ther. 9, (17), 2577-2583 (1998).
  10. Mizuguchi, H., Kay, M. A. A simple method for constructing E1- and E1/E4-deleted recombinant adenoviral vectors. Hum Gene Ther. 10, (12), 2013-2017 (1999).
  11. Ehrhardt, A., Kay, M. A. A new adenoviral helper-dependent vector results in long-term therapeutic levels of human coagulation factor IX at low doses in vivo. Blood. 99, (11), 3923-3930 (2002).
  12. Jager, L., et al. A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors. Nat Protoc. 4, (4), 547-564 (2009).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics