Kloning och storskalig produktion av hög kapacitet Adenovirusvektorer Baserat på den mänskliga adenovirus typ 5

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ehrke-Schulz, E., Zhang, W., Schiwon, M., Bergmann, T., Solanki, M., Liu, J., Boehme, P., Leitner, T., Ehrhardt, A. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (107), e52894, doi:10.3791/52894 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

För genterapeutiska tillämpningar är det av stor betydelse att undvika cytotoxiska och immunogena biverkningar som orsakas av uttryck av virala proteiner, transgenen själv eller av inkommande virala proteiner. Adenovirusvektorer (ADV) används ofta för att introducera främmande DNA i ett stort antal olika celler för att undersöka effekterna av transgen expression 1,2. Den mest avancerade versionen av AdV representeras av hög kapacitet adenovirusvektorer (HCAdV) saknar alla virala kodande sekvenserna 3,4 och därigenom erbjuda en förpackningskapacitet på upp till 35 kb i kombination med låg immunogenicitet och låg toxicitet 5-8. På grund av deras höga förpackningskapacitet de tillåter leverans av stora eller multipla transgener med användning av en enda vektor dos. Därför utgör de ett värdefullt verktyg för forskarsamhället.

I motsats till första eller andra generationens AdV saknar de tidiga generna E1 och / eller E3 som lätt kan produceras med hjälp av kommersiella kit, vector genom konstruktion och virusproduktionen av HCAdV är mer komplex. Systemet för konstruktion av HCAdV genomen baseras på plasmiden pAdFTC uppbär en HCAdV genomet saknar alla virala kodande sekvenser och skyttelplasmid pHM5 9-12. Varje gen av intresse med upp till 14 kilobaser (kb) kan klonas in i skyttelvektorn pHM5 där det multipla kloningsstället är flankerad av igenkännings / klyva ställena i de målsökande endonukleaser PI- Sce I och I-Ceu I. Därför kan en klonad gen av intresse frigöras genom konsekutiv PI- Sce I och I-Ceu I digererar för efterföljande riktad insättning i samma restriktionsställen som finns närvarande i HCAdV genomet finns i plasmiden pAdFTC. I pAdFTC transgenen införingsstället ligger mellan PI- Sce I och I- Ceu I klyvningsställen flankeras av stuffer DNA och de icke-kodande adenovirala sekvenser som krävs för genom förpackningar sådana som 5 "och 3 'inverterade terminala upprepningar (ITR)vid båda ändarna och förpackningssignalen nedströms om 5'ITR. Den extra stuffer DNA ger optimala storleken på den slutliga HCAdV genomet som sträcker sig från 27 till 36 kb att säkerställa en effektiv förpackning under virusproduktion. Eftersom pAdFTC är en stor plasmid med upp till 45 kb (beroende på storleken av den insatta transgenen) och användningen av målsökande endonukleaser med jämförelsevis långa DNA igenkänningsställen uppvisar stark DNA-bindning, flera rengöringssteg är nödvändiga under överföring av transgenen från pHM5 till pAdFTC. Noggrann hantering undvika skjuvkrafter rekommenderas.

ITR i HCAdV genomet flankeras av Notl-restriktionsenzymigenkänningsställen belägna direkt uppströms om 5'ITR och nedströms från 3'ITR 12. Därför kan HCAdV frigöras genom Notl smälta för efterföljande transfektion av det virala genomet in i HCAdV producerande cellinjen. Notera att användningen av restriktionsenzymet NotI för rellätthet av det virala genomet från plasmiden pAdFTC innebär att den infogade transgenen saknar NotI DNA igenkänningsställen. HEK293-cell baserade producentceller (116-celler) stabilt uttrycker Cre-rekombinas. För virusamplifiering 116 celler co-infekterade med ett hjälpvirus (HV) ge alla Adv gener som behövs för replikering och förpackning trans 3,4. HV är en första generationens AdV med en floxed packningssignal som avlägsnas under virus amplifiering genom Cre-rekombinas som uttrycks i 116-celler 4. Detta säkerställer att övervägande HCAdV genomen innehåller en intakt förpackningssignal inkapslade.

Pre-amplifiering av HCAdV utföres genom att utföra seriepassage steg i 116-celler odlade på ytor i vävnadsodlingsskålar. Efter varje passage viruspartiklar frigörs från infekterade celler genom att utföra tre på varandra följande frysning-upptiningssteg. Med varje passage allt fler celler är infekterade med1/3 av cellysat från den föregående passagen. Slutligen lysat från den sista för-amplifieringssteg användes för att infektera producerande celler odlade i suspension i ett spinnerkolv för storskalig amplifiering. Virioner renas från upphängningscellerna genom att utföra ultracentrifugering i en cesiumkloriddensitetsgradient 4,12. Med detta förfarande tomma partiklar och färdigmonterade partiklar separeras i två distinkta band. För att ytterligare koncentrera HCAdV partiklarna en andra icke-gradultracentrifugesteget utförs. Därefter den resulterande bandet innehåller HCAdV uppsamlas och dialyseras mot en fysiologisk buffert. Slutliga vektorn beredningar karakteriseras med avseende på antalet absoluta virala partiklar, infektiösa partiklar och HV föroreningsnivåer. Absoluta virala partiklar kan bestämmas genom att lysera viruspartiklar och mätning av absorbansen vid 260 nm eller genom att utföra kvantitativ realtids-PCR (qPCR) 12. Smittsamhet av purified viruspartiklar kan bestämmas genom qPCR mätnings HCAdV genomen närvarande inuti infekterade celler 3 h efter infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Konstruktion av rekombinant HCAdV Genomes baserad på plasmiden pAdFTC

Obs! Alla plasmider har beskrivits tidigare 11,12 och finns tillgängliga på begäran. Kloningsförfarandet visas schematiskt i fig 1.

  1. Klona en gen av intresse (GOI) inkluderande promotor och polyadenyleringssignal (pA) i skyttelplasmid pHM5, användning av en kloningsstrategi av val, för att generera pHM5-GOI.
    OBS: Eftersom pAdFTC är en relativt stor plasmid, är klassiska plasmidberedning protokoll rekommenderas för att undvika sheering av plasmid-DNA genom användning av kommersiella plasmiden-reningssatser som är baserade på kiselmembran. I- Ceu I och PI -Sce Jag binder starkt till DNA och ändra elektro rörlighet spjälkat DNA. Därför är ett fenol-kloroform-extraktion och EtOH utfällning (steg 1,3) krävs innan agarosgelelektrofores.
  2. Digest 20 ^ g av PHM5-GOI och 10 ^ g av pAdFTC av I-CeuI (10 U) under 3 h vid 37 ° C i en total volym av 100 | j, l för att linearisera plasmiderna (~ 2,8 kb + GOI ORF-sekvensen och ~ 31kb, respektive).
  3. Rena linjäriserade plasmider med användning fenol-kloroformextraktion följt av etanol (EtOH) utfällning 13.
    1. Tillsätt 100 ni fenol: kloroform: isoamylalkohol och blanda försiktigt genom att vända röret flera gånger. Centrifugera i 2 min vid 15 tusen x g.
    2. Överför supernatanten till ett nytt rör, tillsätt 20 | il natriumacetat (pH 5, 3 M) och 400 | il iskall EtOH (99,8%) och blanda suspensionen kraftigt. Centrifugera i 10 minuter vid 15 tusen x g.
    3. Avlägsna supernatanten, tillsätt 300 pl 70% EtOH och centrifugera i 2 min vid 15 tusen x g. Ta sedan bort supernatanten och lufttorka DNA-pelleten. Upplös pelleten i 10- 20 ^ il dH2O Torka inte DNA-tabletten för länge, eftersom det blir svårare att få DNA i lösning.
  4. Digest I-Ceu Jag -digested pHM5-GOI och pAdFTC plasmiden från steg 1,3) under minst 3 h eller O / N med restriktionsenzymet PI -Sce I (10 U) vid 37 ° C i en total volym av 50 | il och därefter rena jag -CeuI och PI -Sce kluven plasmider med användning fenol-kloroformextraktion följt av EtOH utfällning (se steg 1,3). Upplös DNA i 20 pl nukleasfritt dH2O
  5. Separat pHM5 plasmidryggrad (2,8 kb) och de indiska myndigheterna (från steg 1,4) på ​​en preparativ agarosgel och gel-rening de indiska myndigheterna med hjälp av en kommersiell gel- och PCR- sanering kit. Ett representativt agarosgel av uppslutnings visas i fig 2A.
  6. Defosforylera I- Ceu I och PI -Sce I-digererad pAdFTC (från steg 1,4) med kalv intestinalt alkaliskt fosfatas från CIP (10 U) under 1 h vid 37 ° C i en total volym av 25 | il och rena defosforylerad plasmid pAdFTC genom fenol-kloroform-extraktion och efterföljande EtOH precipitation (steg 1,3). Eluera DNA i 20 pl nukleasfritt dH2O
  7. Utför analytisk gelelektrofores från en alikvot av det defosforylerade pAdFTC plasmiden (från steg 1,6) och renades GOI-fragmentet (från steg 1,5) att analysera om digere är kompletta och storlekarna på de förväntade fragmenten är korrekta (~ 31 kb till linjäriserad pAdFTC ).
    Obs: Storleken på de indiska myndigheterna varierar beroende på storleken på den transgena expressionskassetten. Uppskatta de relativa koncentrationerna av respektive fragment för efterföljande ligering. Ett representativt agarosgel av renade fragment visas i figur 2B.
  8. Konfigurera ligeringsreaktionen i en total volym av 20 | j, l med användning av 400 U av T4-DNA-ligas och ett molförhållande av vektor för att infoga av 1: 3.
    OBS: I överensstämmelse med agarosgelen visas i figur 2B vi vanligtvis ligera i en total volym av 20 | j, l med 2- till 6-il vektor, 8- till 12 | j, linfoga och 400 U av T4 DNA-ligas. Eftersom DNA-koncentrationen är vanligtvis låg efter flera phenolization steg, använda så mycket DNA som möjligt, så att inget ytterligare H2O måste tillsättas för att nå den slutliga volymen av 20 | il. Ligera vid 16 ° CO / N och därefter utföra fenol-kloroformextraktion följt av EtOH utfällning (steg 1,3).
    1. Eluera DNA i 15 fil nukleasfritt dH 2 O och smälta den renade ligeringsreaktionen med restriktionsenzymet Swal (10 U) under 2 h vid 25 ° C i en total volym av 20 | il. Sedan koncentrera och rena DNA, genom att utföra fenol-kloroform-extraktion följt av EtOH utfällning (steg 1,3). Eluera DNA i 10 pl nukleasfritt dH2O
  9. Förvandla 2 pl av det renade Swa I diger ligeringsprodukt genom elektroporering i DH10B eller DH5a elektro E. coli och väljer kloner för 16 till 24 timmar vid 37 ° C på ampicillin-innehållande LBplattor (50 mg / ml ampicillin). Välj 5- 10 kloner och framställning av plasmid DNA mini-preparat med hjälp av alkalisk lys, följt av fenol-kloroform-extraktion och efterföljande EtOH nederbörd (steg 1,3) 13.
  10. Utför en analytisk spjälkning av plasmid miniberedningar följt av agarosgelelektrofores för att kontrollera storleken av DNA-fragment. Föreslagna restriktionsenzymer är till exempel I- Ceu I och PI-Sce jag släppa insatsen, Spe I eller Hinc II (figur 2C).
  11. Amplifiera en korrekt klon i ampicillin-innehållande LB-medium (50 mg / ml ampicillin) och gör ett Midi eller maxi plasmidberedning med användning av någon kommersiellt tillgänglig plasmid reningskit.

2. Utsläpp av HCAdV-genomen från pAdFTC Plasmid och Preamplification av HCAdV vektorer i producent cellinje 116

  1. Smälta 20 pg av pAdFTC baserade adenovirala produktion plasmid innehållande det klonade indiska myndigheterna från steg 1,11) ien total volym av 100 | j, l med användning av NotI (20 U) vid 37 ° C under> 2 h och utför fenol-kloroform-extraktion två gånger, följt av EtOH-utfällning. Lös i 20- 30 l sterilt dH 2 O.
  2. Kontrollera en alikvot av 1:10 utspätt digere pAdFTC-GOI-DNA genom gelelektrofores. En 9 kb fragment för plasmidstommen och beroende på storleken på de indiska myndigheterna, en andra DNA-fragment för HCAdV genomet (storlek: 28- 36 kb) kan upptäckas.
    OBS: Ett representativt exempel på den Notl-digere visas i figur 2D. Linjäriserat DNA kan lagras under flera dagar vid 4 ° C eller vid -20 ° C under flera veckor.
  3. Innan protokollet, se till att hjälparviruset AdNG163R-2 har förstärkt 4.
    Obs: Celler transfekterade med pAdFTC härrör HCAdV vektorer är genetiskt modifierade organismer som klassificeras som biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2), kan du använda rätt inneslutning och avfallshanteringåtgärder, bland annat personlig skyddsutrustning, och arbeta under BSL-2 laminarflowhuvar.
  4. Kultur 116 celler i MEM Eagle-medium kompletterat med 10% FBS och hygromycin B (100 | ig / ml). Seed genomgått passage (under passagen 10) 116-celler (~ 0.4X 10 6 celler) i en 60 mm vävnadsodlingsskål ett dygn före transfektion så att de når 50- 80% konfluens nästa dag.
  5. Transfektera linjäriserad HCAdV genomet från steg (2,1) in i 116-celler genom användning av metoder, såsom kalciumfosfat-transfektion eller andra kommersiellt tillgängliga transfektionsreagens (figur 3a). 16- 18 timmar efter transfektion, försiktigt bort mediet, tillsätt 3 ml färskt medium (MEM, 5% FBS) och infektera celler med HV AdNG163R-2 4 tillämpning av 5 omvandlingsenheter (TU) per cell (eftersom ett sammanflytande 60 mm vävnadsodlingsskål innehåller ~ 3,2 x 10 6 celler, tillsätt ~ 1,6x 10 7 TU i HV).
    1. Rör försiktigt skålen var 20 minuter under den första timmen efter infektiongarantera lika HV distribution. Odla infekterade celler vid 37 ° C och 5% CO2. Vid effektiv virusamplifiering cytopatisk effekt (CPE) som orsakas av virusreplikation (celler avrundas uppåt och löst kopplas på eller från vävnadsodlingsskål) är observerbar 48 timmar efter infection.If CPE observeras tidigare mängden HV har att minskas. Om CPE börjar senare, har mer hjälparvirus som skall användas.
  6. Harvest celler inkluderande supernatanten 48 h efter infektion genom spolning av cellerna från odlingsskålen med användning av odlingsmediet. Celler som är upphängda i deras odlingsmedium kallas passage 0 (P0). Split P0 i två fraktioner.
    1. Från 0,5 ml av de lösgjorda cellerna centrifugera ner cellerna under 3 min vid 2000 x g och avlägsna mediet från cellpelleten är som senare används för att isolera genomiskt DNA (gDNA) för qPCR baserad analys av amplifieringsprocessen. Butiks cellpelletar vid -20 ° C tills vidare bearbetning.
    2. Från 2,5ml av de lösgjorda celler frisätta virala partiklar genom frysning (vid -80 ° C eller i flytande kväve) och upptining (vid RT eller i ett 37 ° C vattenbad) cellerna som resupended i sina mediet tre till fyra gånger. Denna fraktion är än kallas lysat av P0.
  7. Se till att vävnadsodlingsskålar med 116 celler som odlas till 90- 95% konfluens med användning av MEM-medium kompletterat med FBS (10%) och hygromycin B (100 mikrogram / ml) och HV är tillgängliga för följande passage steg.
  8. Blanda 1 ml färskt medium (MEM, 5% FBS) med 2,5 ml av lysatet från det föregående passagen (steg 2.6.2) till en slutlig volym av 3,5 ml, tillsätt HV applicera två TU per cell (eftersom en 60 mm vävnads odlingsskål på en confluency av 90- 95% innehåller ~ 3,2 x 10 6 celler, tillsätt ~ 6.4x 10 6 TU i HV). (Figur 3B). Ta försiktigt bort mediet från en 60 mm skål av 116 celler och tillsätt den virala blandningen till cellerna. Upprepa steg 2,6) - 2,8) två gånger för att få lysat av passåldrar P1 och P2.
  9. Blanda 17,5 ml färskt medium (MEM, 5% FBS) med 2,5 ml av lysatet från P2 och lägg HV applicera två TU per cell (eftersom en 150 mm vävnadsodlingsskål vid en konfluens av 80- 100% innehåller ~ 2x 10 7 celler, tillsätt ~ 4x 10 7 TU i HV). Ta ut mediet från en 150 mm skål med 116 celler och infektera celler med virusblandningen. Odla infekterade celler vid 37 ° C och 5% CO2.
  10. 48h efter infektion skörd celler såsom beskrivits i steg 2,6) för erhållande av kanalen P3 (figur 3B).
    1. Upprepa steg 2.6) 1.
    2. Från de återstående 19,5 ml P3 frisättning virala partiklar från de resupended celler genom frysning och upptining tre till fyra gånger. Denna fraktion är än kallas lysat av P3.
      Obs! Vissa vektorer småningom kan kräva ytterligare passager i 150 mm skålar tills de förstärks tillräckligt. Därför effektivitet av pre-förstärkningsprocessen måste övervakas under serie passåldrande. qPCR baserad analys av amplifieringsprocessen kan utföras som beskrivits i avsnitt 3 (se även figur 4A). Pre-amplifiering av HCAdV bär en expressionskassett för grönt fluorescerande protein (GFP) kan lätt utvärderas genom att observera GFP flourecscent signalen med användning av ett fluorescensmikroskop (figur 4B).

3. Övervakning av amplifieringsprocessen med hjälp av kvantitativa-Real Time PCR (qPCR) (se även figur 4A).

  1. Isolera gDNA från cellpelletar från varje passage av preamplifaction (steg 2,6) - 2,10) med användning av någon kommersiell DNA-isoleringskit för isolering av gDNA från odlade celler eller någon annan metod. För bästa PCR-resultat använder gDNA så färsk som möjligt. Annars gDNA kan lagras vid -20 ° C tills vidare användning.
  2. För att bestämma antalet HCAdV genomen närvarande i cellerna hos respektive passage från qPCR analys generera en standardkurva med användning av 10 en </ sup> - 10 9 kopior av en plasmid som bär Indiens myndigheter som ingår i HCAdV genomet.
  3. Analysera samma mängd gDNA från P0- P3 (steg 2.6- 2.10) tillämpa qPCR med hjälp av 400 nM av primers specifika för Indiens myndigheter som ingår i HCAdV genomet. För att utföra qPCR följa tillverkarens anvisningar för respektive qPCR kemikalier. Ställ qPCR programmet enligt följande: för-inkubation vid 95 ° C under 10 minuter, amplifiering i 40 cykler av 95 ° C under 10 s, 55- 60 ° C under 15 s och 72 ° C under 20 s. På grundval av standardkurvan antalet HCAdV genomen i reaktions kan interpoleras.

4. Storskalig Förstärkning av HCAdV vektorer 116 celler som växer i suspension

  1. Lägg 900 ml förvärmd (37 ° C) färskt MEM kompletterat med 10% FBS och hygromycin B (100 | ig / ml) i en 3 liter spinnerodlingskolv (figur 3B).
  2. Avlägsna mediet från minst 10 enskilda 150 mm vävnadsodlingsskålar med en16-celler odlas vid en konfluens av 90- 100% och spola bort celler med 10 ml färsk förvärmd (37 ° C) MEM med tillsats av FBS (10%) och hygromycin B (100 | ig / ml) med användning av en serologisk pipett. Pipettera upp och ned flera gånger för att få en homogen cellsuspension. Överför celler direkt i spinnerkolven redan innehåller 900 ml från steg 4,1).
    Obs: Använd inte Trypsin / EDTA eftersom det kan påverka tillväxten av suspensionsceller negativt. Efter avlägsnande av medium omedelbart överföra celler i spinnerkolven. Inte hantera mer än två vävnadskulturskålar i taget. Ju längre väntetiden efter tillsats nytt medium desto svårare blir det att fristående cellerna från vävnadsodlingsskål.
  3. För att säkerställa optimal celltillväxt inkubatet spinnkolv på en magnetisk omrörare i en vävnadsodlingsinkubator under 24 h vid 37 ° C och 5% CO2. Justera magnetomrörare till 70 varv per minut för att undvika vidhäftning av celler till glasytorna. Övervakning av celltillväxt i spinnerkultur kolv att undersöka om celler odlade i spinnerkultur kolv är viabla och huruvida de växer till tillräckliga mängder. Varje gång före tillsats färskt medium överföra 2 ml från bioreaktorn till en 60 mm vävnadsodlingsskål. Observera cellmorfologin under ett mikroskop.
    Obs: Celler som bildar klumpar som flyter i odlingsmediet indikerar optimal tillväxt och viabilitet (se även figur 4C). Efter 24 h de bildar kolonier på ytan av vävnadsodlingsskålen. 30- 50% konfluens indikerar optimal densitet.
  4. 24 timmar efter att du installerat spinnerkultur kolv 500 ml färskt medium (MEM, 10% FBS) kompletterat med hygromycin B (100 mikrogram / ml). 24 timmar senare upprepa detta steg.
  5. 72 h efter inrättandet av spinnerkultur, tillsätt 1000 ml färskt MEM-medium (10% FBS) med hygromycin B (100 | ig / ml) vilket resulterade i en total volym av 3 L cellsuspension.
  6. 24 timmar efter att ha nått AVolym av tre liter, skörd 116 suspensionsceller genom centrifugering under 10 min vid 500 x g vid RT. Kasta bort supernatanten. Håll den tömda spinnerkultur kolv under vävnadsodling huven.
  7. Resuspendera cellpellets i färskt MEM kompletterat med 5% FBS genom att pipettera upp och ned cirka 8- 10 gånger för att få en homogen cellsuspension. Volymen medium beror på om lysat från steg 2,10) 2. (19,5 ml, se steg 4.8) 1. alternativ a) eller en renad viral lager av HCAdV från steg 5,9) 2. (flera il depanding på viral titer, se steg 4.8) 2., alternativ b) används för infektion av cellerna. Använd en total volym av 150 ml.
    1. Alternativ A: För infektion av 116 suspensionsceller med lysat från P3 (primär amplifiering) överföra celler från steg 4,8) till en 250 ml förrådsflaskan utrustad med en steril magnetisk omrörarstav eller en 250ml småskalig spinnerflaska och co-infektera celler med den viruset inom lysatet från P3 (steg 2.10.2) och 2 TU av HV per cell. Under antagande av en densitet av 3 x10 5 celler per ml är det totala cellantalet 9x 10 8 celler. Således till 1,8 x 10 9 TU i HV.
    2. Alternativ B: För infektion av 116 suspensionsceller med renat viralt lager, överföra celler från steg 4,8) och en 250 ml förrådsflaskan utrustad med en steril magnetisk omrörarstav eller en 250ml småskalig spinnerflaska och co-infektera celler med de 100 viruspartiklar per cell av tidigare renat HCAdV (från steg 5,9) 2.). Sålunda till 9x 10 10 VP enligt fysiska titer (mätt genom absorbans vid 260 nm; steg 6) av den renade HCAdV och 1,8 x 10 9 TU av HV.
  8. Rör om cellvirusblandningen från september 4.8.1) eller 4.8.2) i på en magnetisk omrörare i vävnadsodlingsinkubator vid 37 ° C och 5% CO2 under 2 h vid 60 rpm. Kontrollera att förrådsflaskan inte är helt stängd för att tillåta luftcirkulation.
  9. 2 h efter infektion överföra den totala volymen av cellvirusblandningen tillbaka in i 3 liter spinnerkulture-kolv och till 1,850 ml färsk förvärmd (37 ° C) MEM-medium kompletterat med 5% FBS till en total volym av 2 L och inkubera i vävnadsodlingsinkubator vid 37 ° C och 5% CO2 under 48 h vid 70 varv per minut.
  10. Harvest celler genom centrifugering under 10 min vid 890x g vid RT i 500 ml centrifugrör. Avlägsna mediet och återsuspendera pelleterade cellerna i en total volym av 28 ml DPBS. Pipettera upp och ned för att erhålla en homogen cellsuspension. Frys det cellvirussuspension i flytande kväve eller vid -80 ° C och se till att suspensionen är helt frusen. Förvara cellvirussuspension vid -80 ° C tills utgångsvirusrening.

5. Rening och Dialys av HCAdV

  1. För att framställa viralt lysat för cesiumklorid (CsCl) gradienter, fryscellvirussuspension från steg 4,11) i flytande kväve och tining i ett vattenbad vid 37 ° C fyra gånger.
  2. Centrifugera det virala lysatet vid 500 xg under 8 minuter vid RT och samla supernatanten innehåller HCAdV.
  3. För Ultracentrifugering förbereda CsCl-lösningar som follows.Weigh 37,5 g (till 1,5 g / cm '3), 33,5 g (till 1,35 g / cm' 3), och 31,25 g (till 1,25 g / cm '3) CsCl pulver respektive och fylla med dH 2 O till 25 ml.
    1. Omröras tills lösningen blir klar och sterilfilter lösningarna. Slutligen avlägsna 1 ml av varje lösning och väga den på en fin skala att kontrollera vädret densiteten är korrekt. 1 ml bör väga 1,5 g, 1,35 och 1,25 g respektive.
    2. Om densiteten är alltför hög justera den genom stegvis tillsats av små volymer (l) av steril dH2O Efter tillsats av dH 2 O mäta densitiy igen. Om det behövs lägga till mer dH 2 O.
    3. Upprepa proceduren tills densiteten är korrekt. Om densiteten är alltför låg justera den genom att tillsätta liten mängd CsCl pulver. Sterilfiltrera igen och kontrollera tätheten. Om densiteten är alltför hög justera den genom Adding dH 2 O som beskrivits tidigare. Om densiteten fortfarande är för låg lägga mor CsCl, sterilfilter det igen och kontrollera tätheten. Upprepa proceduren tills densiteten är korrekt.
  4. Förbered CsCl steggradienter i sex klara ultracentrifugrör. Långsamt och försiktigt pipet CsCl lösningar i rören med hjälp av följande ordning: 0,5 ml 1,5 g / cm '3 CsCl-lösning, 3 ml 1,35 g / cm' 3 CsCl-lösning och 3,5 ml 1,25 g / cm '3 CsCl-lösning (Figur 2C) .
  5. Overlay ~ 4,5 ml av rensas vektor supernatant från steg 5,2) på toppen av 1,25 g / cm 3 CsCl skikt. Centrifugera gradienter i en ultracentrifug med användning av en swing-out rötor (SW-41) vid 12 ° C under minst 2 h vid 226 tusen xg (35 tusen rpm) med långsam acceleration och retardation till separat HCAdV-genomet innehållande virala partiklar från tomma partiklar och cell skräp.
    OBS: Under optimala förhållanden ett diffust band av cell skräp formar ovanpårören. Nedan två kan observeras vita band. Den övre bandet innehåller tomma partiklar medan den nedre bandet är lika med HCAdV (figurerna 2C och 5A).
  6. Ta försiktigt bort lager av celldebris och tomma partiklar och samla 1 ml av de lägre banden från varje rör och överför viruset med en ren pipettspetsen i ett sterilt 50 ml rör. Lägg till upp till 24 ml av 1,35 g / cm 3 CsCl-lösning till de uppsamlade viruspartiklar och blanda försiktigt.
  7. Fyll centrifugrör med 1,35 g / cm '3 CsCI-viruslösning till toppen och centrifugera O / N (18- 20 h) vid 226 tusen xg (35 tusen varv per minut) vid 12 ° C i en ultracentrifug med användning av en swing-out rötor (SW-41 ) med långsam acceleration och retardation.
  8. Samla upp HCAdV närvarande i den framträdande lägre bandet. Som potentiell övre bandet innehåller tomma partiklar bort övre skikten från toppen med hjälp av en pipett (se figur 2C och 5B) Ta sedan bort det undre bandet using en pipett.
  9. Dialysera de uppsamlade viruspartiklar för buffertbyte.
    1. Klipp av en remsa av dialysrör (MWCO: 50.000) på ca 8 cm i längd, tvätta den med sterilt dH 2 O tre gånger. Stäng sedan den ena sidan av dialysrör med en plastklämma och överföra den insamlade viruset från steg 5,8) till röret med hjälp av en 1-ml pipett. Undvik luftbubblor i slangen och stänga den på andra sidan med en plastförslutningar kläm dialys.
    2. Dialysera i 1 liter av dialysbuffert (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10% glycerol och 1 mM MgCl2 i avjoniserat H2O) under 2 h vid 4 ° Cwith långsam omröring. Utbyte dialysbuffert med 2 liter av dialysbuffert och dialysera O / N vid 4 ° C med långsam omröring. Alternativt kan du använda en sucrosebuffer (140 mM NaCl, 5 mM Na 2 HPO 4 X2h 2 O, 1,5 mM KH 2 PO 4 och 730 mM sackaros, pH 7,8).
    3. Samla dialyserade viruspartiklar från steg 5,9) 2. med användning av en 1 ml pipette. Förbereda flera alikvoter av önskade små volymer (25- 100 | il) och lagra renat virus vid -80 ° C.

6. Att mäta den fysiska titer av slutgiltiga HCAdV förberedelser optisk densitet (OD)

  1. Späd 25 | il av den slutliga vektorn beredningen från steg 5,9) 2 med 475 | il av lysbuffert (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,5% SDS)), skaka försiktigt under 20 min vid RT och centrifugera slutligen för 2 min vid RT vid 15 tusen X g.
  2. Eftersom absorbansvärdena vid 260 nm (A260) är vanligtvis låg, mäta absorbans fyra gånger med användning av 100 pl av supernatanten och beräkna medelvärdet för de fyra mätningarna. Beräkna antalet viruspartiklar per ml (vp / ml -1) med hjälp av följande formel: VP / ml -1 = (medelvärde A260) x (20) x (1,1 x 10 12) x (36 kb / HCAdV storlek i kb ).
    OBS: Resultaten av en typiskt utbyte av absoluta virala partiklar (OD titer) visas i Figur 7A

7. Mätning Total Partiklar, infektiösa enheter av HCAdV och HV föroreningshalter i slut Vector Framställning av qPCR. En ordning för titreringen förfarandet visas i figur 6

  1. Seed HEK293-celler i 6 eller 12 brunnars vävnadskulturplattor så att cellerna når 90% konfluens nästa dag. För att bestämma antalet infektiösa viruspartiklar (smittsam titer), infektera celler i en brunn i en platta med flera brunnar med 1 pl och en andra brunn med 10 pl renat virus från steg 5,9) 3.
  2. Harvest celler 3 h efter infektion. Ta bort medium och lägg trypsin för att täcka hela väl och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 under 5 min. Spola av cellerna med trypsin med användning av en pipett och spinn ner cellerna vid 890 xg under 3 min vid RT.
  3. Resuspendera pelleterade cellerna i 200 pl DPBS och tvätta dem noggrant för att avlägsna fria (icke-infektiva) vektorpartiklar. Centrifugera under 3 min vid 890 x g vid RT. Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelletar i 200 pl färsk DPBS.
    Anmärkning: För noggrann bestämning av den infektiösa titern är det avgörande att avlägsna alla icke-infektiösa viruspartiklar från cellytorna genom trypsinbehandling och noggrann tvättning.
  4. För att bestämma den totala viruspartikelantal (infekterande partiklar och icke smittsamma partiklar = fysisk titer), skörd icke-infekterade HEK293-celler från två brunnar utan trypsin genom att spola av cellerna med deras odlingsmedium med hjälp av en pipett.
  5. Centrifugera ner cellerna under 3 min vid 890 x g vid RT. Kassera mediet och återsuspendera pelleterade celler i 200 pl DPBS. Subsequently lägga ett pl och 10 pl renat HCAdV preparat direkt till cellerna, respektive. Använda icke infekterade celler som bakgrund, för att säkerställa samma villkor för gDNA isolering och efterföljande q-PCR.
  6. Isolera gDNA från HEK293-celler som härrör från steg 7,3) och 7,5)
    1. Vortex cellerna resuspenderades i 200 | il DPBS (steg 7,3 och 7,4) för 3 sek, tillsätt 200 | il av SDS-lösning. (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,5% SDS) och 20 | il proteinas K (20 mg / ml) och virvel suspension för 3 sek. Inkubera 12- 16 h vid 55 ° C och skaka långsamt. Sedan till 2 | il av RNAs A (20 mg / ml) och inkubera under 30 minuter vid 37 ° C.
    2. Lägg 350 | il fenol: kloroform: isoamylalkohol och centrifugera under 2 minuter vid 15 tusen x g. Överför supernatanten till ett nytt rör och upprepa detta steg en gång
    3. Överför supernatanten till ett nytt rör, tillsätt 50 | il natriumacetat (pH 5, 3 M) och 1 ml iskall EtOH (99,8%) och blanda suspensionen. CentriFuge prover för 10 min vid 15 tusen xg för att pelletera genom-DNA.
    4. Avlägsna supernatanten, tillsätt 500 | il av 70% EtOH och centrifugera i 2 min vid 15 tusen x g. Avlägsna supernatanten, tillsätt 500 | il av 70% EtOH och skaka i 30 min vid RT. Centrifugera sedan i 2 min vid 15 tusen x g.
    5. Avlägsna supernatanten och lufttorka DNA-pelleten. Torka inte DNA-pellets under en lång tid, eftersom det blir svårare att få gDNA i lösning. Resuspendera DNA-pelleten i 120 | il dH 2 O och inkubera i ~ 1 timme vid 37 ° C under skakning. Om DNA-lösning verkar viskös, skaka den under flera timmar vid 37 ° C, eller inkubera vid 55 ° C under ~ 1 timme.
  7. För att bestämma infektiösa HCAdV partiklar och absoluta HCAdV partiklar, generera en standardkurva för 10 ett - 10 åtta kopior av en plasmid som bär GOl som finns i HCAdV genomet.
  8. Bestämning av de totala partiklar och infektiösa partiklar genom att analysera samma mängder av gDNA av infekterade HEK293 calnar från steg 7,3) och 7,4) gäller qPCR med hjälp av 400 nM av primers specifika för Indiens myndigheter som ingår i HCAdV genomet.
  9. Ställ in PCR-programmet enligt följande: för-inkubation vid 95 ° C under 10 minuter, amplifiering i 40 cykler av 95 ° C under 10 sek, 55 ° C under 10 sek och 72 ° C under 20 sek. På grundval av standardkurvan (steg 7,7), interpolera det totala antalet adenovirala genomen i reaktionen.
  10. Beräkna antalet adenovirala genomen i den slutliga vektorn preparatet med användning av följande Formular: (Antal HCAdV / vikt i ng gDNA i reaktions) x (vikt i ng DNA av alla celler i den infekterade skålen / volym virus i il) .
    OBS: Det typiska intervallet för absoluta och infektiösa viruspartiklar avkastningen är cirka 1x10 7 -1x10 8 virala partiklar / l. Titrar som är tio gånger högre eller lägre än visade här kan betraktas som normalt. Högre titrar skulle vara en förbättring. Med avseende på förhållandet av absoluta HCAdV particles infektions HCAdV partiklar, visar erfarenheten att cirka 5- 10% av absoluta HCAdV partiklar är smittsam (Figur 7A).
  11. För att bestämma föroreningsnivåerna med HV, utföra qPCR genom att förstärka en del av den adenovirala sent gen 3 (L3) förekommer i HV-genomet. Använd en plasmid som bär den adenovirala sena gen 3 (L3) för att generera en standardkurva (steg 7,7).
  12. I denna reaktion tillämpas 400 nM av primrama L3 framåt 5'-AGA AGG TTA GCA TCC GTT ACT CGA GTT GG-3 'och L3 omvänd 5'-ATA AGC TTG CAT GTT GGT ATG CAG GAT GG-3' tillsammans med 300 nM av L3-specifika proben 5'-Fam-CCA CCC GTG TGT ACC TGG TGG ACA-Tamra-3 '.
  13. Ställ in PCR-programmet som följer: förinkubation / aktivering vid 95 ° C under 10 minuter, amplifiering under 40 cykler av 95 ° C under 15 sek och 60 ° C under 1 minut. Använd någon universell prob PCR Mastermix för qPCR reaktion. På grundval av standardkurvan (steg 7,7), beräkna antalet ifectious HV partiklar i den slutliga vektorn preparatet. Se (Figur 7A) för typiska avkastningen för HV partiklar.
  14. Slutligen beräknar förhållandet mellan absoluta infektiösa partiklar av HCAdV till HV föroreningsnivåer för att utvärdera kvaliteten på vektor preparatet.
    OBS: Fram till nu inte kan uteslutas en liten del av de återstående HV. Vanligtvis andelen HV kontamination är ~ 5% av infektiösa partiklar eller mindre, vilket är acceptabelt (Figur 7B). Naturligtvis som mindre HV som möjligt är önskvärd, speciellt om vektorn preparatet kommer att användas för djurförsök.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Här representativa exempel för kloning, förstärkning och rening av HCAdV beredningar visas. En översikt av kloningsstrategin (Figur 1) och representativa exempel för kloning och frisättning av HCAdV genomet genom restriktionsenzym smälta tillhandahålls (Figur 2). Ett typiskt restriktionsmönstret efter frisläppandet av de indiska myndigheterna-expressionskassetten från pHM5 från PI- Sce I och I- Ceu jag smälta och efterföljande fenol-kloroformextraktion och EtOH nederbörd (se steg även 1,2- 1,5) visas (Figur 2A). Typiskt kan man observera ett ~ 3 kb band motsvarande pHM5 plasmidryggraden och ett andra band motsvarande expressionskassetten av GOl. Bandet innehållande den GOI-expressionskassetten renas därefter från agarosgel. Det renade GOI-expressionskassetten analyseras på en agarosgel tillsammans med det renade, defosforylerade pAdVFTC att wsom kluvits med PI- Sce I och I- Ceu I respektive (steg 1,7) för att kontrollera rätt storlek och att uppskatta den relativa mängden av molekyler för efterföljande ligering (Figur 2B). Efter ligering (se steg 1,8), följt av fenol-kloroformextraktion och EtOH nederbörd och Swa jag smälta att eliminera oklippt pAdFTC och efterföljande fenol-kloroformextraktion och EtOH nederbörd (steg 1,9), ligeringsprodukter omvandlas till bakterier och kloner väljs ut på ampicillin innehållande LB- agarplattor. Vanligtvis tiotals till hundratals kloner erhålls, från vilken 5- 10 kloner är förberedda för plasmid-DNA-miniberedningar. En begränsning mönster av en analytisk Hinc II uppslutning av positiva och negativa kloner tillsammans med en tom pAdFTC som negativ kontroll (se även steg 1,10) visas (figur 2C). Här positiva kloner inte visar en 5 kb band, som finns i tom pAdFTC och negativa kloner och en 1,7 kb fragment visassom inte är närvarande i den tomma pAdFTC och negativa kloner. För detta respektive indiska myndigheterna indikerar tha kloning var framgångsrik. En positiv klon som har renats genom Midiprep digererades sedan med nr tI att frigöra HCAdV-genomet bär GOl från pAdVFTC-GOI (steg 2,2). Slutligen nr tI spjälkat DNA ist renades två gånger med användning av fenol-kloroform-extraktion och EtOH utfällning för att säkerställa hög renhet av DNA för efterföljande transfektion in i 116-celler. Analys av en liten del av den nr tI digere pAdVFTC-GOI på en agarosgel visar en ~ 9 kb-bandet som motsvarar den pAdFTC plasmidryggraden och ett stort band av upp till ~ 36 kb (beroende på storleken av den GOl expressionskassetten) motsvarande den HCAdV genomet (figur 2D). En översikt av amplifiering och rening rörledning visas schematiskt (figur 3). Representativa exempel på övervakning av vektorn före amplifieringsprocessen tillhandahålls ( (Figur 4A). Notera att antalet vektorgenom descreases vanligtvis under de första passagerna och starkt ökar i senare passager. En vektor kopietal av tio 6 - tio syv per 15 tusen celler är tillräcklig för att infektera 116-celler för storskalig produktion i en 3 liter spinnerkolv. Om de indiska myndigheterna i HCAdV vektorgenomet innehåller en GFP-expressionskassett, kan pre-förstärkningsprocessen (avsnitt 2) också övervakas genom fluorescerande mikroskopi. Representativa bilder av varje passage visas (Figur 4B). Observera att antalet GFP positiva celler minskar vanligen under första passager och starkt ökar i slutet av passager. Om antalet GFP-positiva celler når ~ 100%, var vektorn amplifierades sufficiently att infektera 116-celler för storskalig produktion i en 3 liter spinnerkolv. Den storskaliga förstärkningsprocess av en HCAdV innehållande GFP uttryck kassett övervakades genom mikroskopisk analys av odlingsmedium och celler som överfördes från spinnaren kolven till en vävnadsodlingsskål. Mikroskopiska bilder av celler som producerar HCAdV i suspensionskultur (se steg 4.4 och 4.11) tillhandahålls (Figur 4C). Observera att cellerna växer i klumpar indikerar att den föregående celltillväxten var tillräcklig och celler är friska. Vid användning av fluorescensmikroskopi ~ 100% av dessa celler var GFP positiv, vilket indikerar effektiv transduktion av suspensionsceller i bioreaktorn och effektiv vektorproduktion. Vektorpartiklar renades från mediet och cellerna i 3 liter suspensionsodling av CsCl-ultracentrifugering. Representativa bilder av HCAdV vektor rening med användning av CsCl densitetsgradient ultracentrifugering visas (Figur 5). Efter enn initial centrifugering med hjälp av en CsCl steggradient vanligen två band observeras. Det övre bandet innehåller tom partiella kapsider medan det lägre bandet består av DNA-innehållande vektorpartiklar (steg 5.4- 5,5) (figur 5A). DNA innehållande vektorpartiklar därefter skördas (steg 5,6) och slogs samman för en andra ultracentrifugering steg för att koncentrera vektorpartiklar. Detta steg resulterar vanligen i ett enda band av DNA-innehållande vektorpartiklar som slutligen skördas för efterföljande dialys (steg 5.7- 5,8) (figur 5B). Dialysevektor preparat karaktäriserades genom mätning av antalet absoluta partiklar, infektiösa partiklar och HV föroreningar. En schematisk skiss av titreringen förfarandet (avsnitt 6 och 7) är anordnad (fig 6). Representativa resultat för karaktärisering av den slutliga vektorn framställningen visas (Figur 7). Stapeldiagrammet visar typiska siffror vektor partiklar som ärsom erhållits genom det förfarande som beskrivs i detta protokoll. Absoluta partiklar antal vektorpartiklar bestämdes genom optisk densitet (avsnitt 6), infektiösa vektorpartiklar och HV föroreningar mättes genom qPCR (avsnitt 7) (Figur 7A). Erfarenheten visar, att OD titer överskattar antalet viruspartiklar. Absoluta viruspartiklar mätt med OD kan vara 20- 500 gånger högre än smittsamma viruspartiklar mätt med q-PCR. Infektiösa vektorpartiklar varierar usally mellan 5- 10% av absoluta partiklar när båda mättes med q-PCR (avsnitt 7). Om vektorn beredningen har en mycket god kvalitet, mer än 20% av absoluta partiklar är smittsam. Den typiska förhållandet mellan HV och infektions HCAdV partiklar (steg 7.14) varierar vanligen mellan 1-5% av infektiösa partiklar (Figur 7B). Detta är godtagbart eftersom HV är replikerande. Men eftersom mindre förorening HV som möjligt (<1% av infektiösa partiklar) skullevara att föredra.

Figur 1
Figur 1. Flödesschema för kloning av GOl in pAdFTC. Den GOI klonas in i MCS i pHM5 skyttelplasmid. Plasmider pAdFTC och pHM5-GOI spjälkas med I- Ceu I och PI-Sce I och renades genom fenol-kloroform-extraktion och EtOH-utfällning. Det digere pHM5 laddas på en preparativ agarosgel för att rena den intressanta genen (se även steg 1,5), medan den digere pAdFTC plasmiden defosforylerades. Därefter ligeringsreaktionen med CIP behandlad pAdFTC och transgenen expressionskassetten är inställd (se steg 1,8) och efter fullbordan renades genom fenol-kloroform-extraktion och EtOH-utfällning. Den efterföljande Swa I sammandrag av ligeringsprodukten följt av fenol-kloroformextraktion och EtOH nederbörd hindrar tillväxten av kloner som bär pAdFTC utan insats. Svart trivinklar indikerar restriktionsenzymigenkännings; grå rutor visar AdV5 inverterade terminala upprepningar (ITR), vita lådor märkta med Ψ indikerar AdV5 paketeringssignalen, röd pil indikerar promotor, gröna rutor indikerar transgen (gen av intresse, GOI) som ska uttryckas, blå lådor indikerar polyadenyleringssignalen, orange eller blå pilar anger antibiotikaresistensgener i plasmidryggraden respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Representativa resultat för kloningsförfarandet och frisättning av HCAdV genomet från pAdVFTC. (A) Utsläpp av Indiens-expressionskassetten från pHM5 från PI- Sce I och I- Ceu I sammandrag (se också steg 1,2- 1,5). (B) Sce I och I- Ceu I respektive (steg 1,7). (C) Analytisk Hinc II uppslutning av pAdVFTC kloner med och utan GOI (se även steg 1,10). (D) Frigörande av HCAdV-genomet som bär de indiska myndigheterna från pAdVFTC-indiska myndigheterna efter Nej tI digest (steg 2,2) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
. Figur 3. Skiss för hög kapacitet adenovirusvektor förstärkning och rening (A) HCAdV DNA-transfektion och hjälparviruset (HV) infektion: Transfektion av arise HCAdV genomet som bär de indiska myndigheterna i HCAdV producerande cellinjen (116 celler [4]) och SUbsequent infektion med HV AdNG163R-2 [4].   (B) Amplifiering av HCAdV: Efter för-förstärkningssteg genom seriell överföring av cell-lysat i ett annat vävnadsodlingsplatta och co-infecting med HV, storskalig produktion utförs i en 3 L suspensionsodling (C) HCAdV rening:. För rening, virus isoleras genom ultracentrifugering med hjälp cesiumkloridgradienter (D) Dialys. Renat HCAdV partiklarna dialyseras mot 2 L minnesbuffert. HCAdV, hög kapacitet adenovirusvektor; ITR, adenovirusserotyp 5 inverterad terminal upprepning; Ψ, packningssignal; HV, hjälpar-virus; MOI, infektions. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4 <br /> Figur 4. Representativa resultat av amplifieringsprocessen (A) Övervakning av pre-förstärkningsprocessen genom förstärkning av virala genom användning av qPCR (se även avsnitt 3),. (B) Om de indiska myndigheterna innehåller GFP som en transgen, pre-amplifieringsprocessen kan övervakas genom fluorescensmikroskopi. (C) Representativa resultat av den storskaliga amplifieringsprocessen i en spinnerflaska exemplifieras för HCAdV kodar för GFP. Den vänstra panelen visar en mikroskopisk bild av infekterade 116 celler från spinnerkolven. Ett prov av odlingsmedium och cellerna överfördes till en 60 mm vävnadsodlingsskål. Observera att klumpar av förstärkta celler är synliga. Den högra panelen visar samma bild med fluorescerande mikroskopi. Nästan 100% av cellerna transduceras med HCAdV bär GFP. Klicka här för attse en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5. Representativa resultat efter CsCl gradient centrifugering (A) Efter att ha utfört en steggradient (se även steg 5,5),.. (B) Efter kontinuerlig gradient (se även steg 5,7) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6
Figur 6. Schematisk skiss av titreringen förfarandet. (A) Mätning av infektiösa partiklar: Celler i en flerbrunnsplatta infekteras med olika volymer av renat virus och uppsamlas som cellpelletar (B) Mätning o.f absoluta partiklar: Unifected celler bildar en flerbrunns uppsamlas genom trypsinering och centrifugering. Efter resuspension renat virus tillsätts och genomiskt DNA isoleras. (C) Isolering av genomiskt DNA. (D) För att kvantifiera virusgenom antalet kopior en kvantitativ PCR (q-PCR) utförs. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 7
Figur 7. Representativa resultat för karakterisering av den slutliga vektorn beredningen. (A) Absoluta antal partiklar av en vektor preparat enligt den presenterade protokollet fastställas med olika metoder. OD titer mätt genom optisk densitet (avsnitt 6), infektiös titer och HV föroreningar mäts med qPCR (avsnitt 7) (B)Förhållandet mellan den totala smitt HCAdV partiklar och HV föroreningsnivåer som uppmätts av qPCRs (avsnitt 7). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet presenteras här möjliggör rening av HCAdV vektorer baserade på humant adenovirus typ 5 baserat på tidigare beskrivna förfaranden 4,12. Den HCAdV genomet inom pAdFTC plasmiden saknar alla adenovirusgener och endast bär 5'- och 3'- ITR och packningssignalen. I denna strategi HV AdNG163R-2 4 ger alla nödvändiga gener för effektiv virusproduktionen i trans. Detta ger en förpackningskapacitet på upp till 35 kb, som tydligt konkurrerar ut första och andra generationens AdVs eller utbredda lentivirus (LV) - eller adenoassocierat virus (AAV) baserade vektorer. En annan fördel med HCAdV särskilt för in vivo-applikationer är det faktum att i motsats till första eller andra generationens AdVs de visar minskade nivåer av cytotoxiska och immunogena biverkningar som orsakas av uttrycket av virala proteiner 5-8.

Ändå protokollet som beskrivs här är mer tid ocharbetar intensivt än för andra virala vektorer såsom LV- eller AAV-vektorer samt första eller andra generationens AdVs. Ett stort hinder är kloning av stora transgener och den efterföljande överföring till virusproduktionen plasmiden pAdV-FTC. Användningen av målsökande endonukleaser PI- Sce I och I-Ceu jag erbjuder exakt och riktad infogning av transgenen från skyttelplasmid pHM5, men har nackdelen att kraftigt klibba för det kluvna DNA: t. Av denna anledning många fenol-kloroform sanering steg är nödvändiga när de förbereder plasmid- och insert-DNA under kloningsförfarandet. Därför noggrant följa den medföljande klonings protokollet strikt rekommenderas. Efter kloning av HCAdV genomet frisätts från plasmiden pAdFTC genom Not I-restriktionsenzym smälta och transfekterades därefter in i producerande cellinjen. Observera att första transfektion effektivitet är avgörande för att uppnå tillräcklig virusamplifiering. Viktigt erbjuder protokollet flera stegfrån vilken förfarandet kan återstartas om efterföljande steg misslyckas. Under pre-förstärkning en tredjedel av lysaten kan lagras som backup för att starta proceduren från den punkten igen eller att förkorta en upprepning i fall mer virus behöver produceras.

HCAdV bära stora, komplexa eller flera transgener eller vissa stuffer DNA kan vara att förstärka långsammare än väntat. Därför är det viktigt att noggrant följa den för-förstärkningsprocessen innan suspensionsodling odlas i en rotationskolv. Om pre-förstärkning inte lyckas, bör förfarandet avbrytas och startas från början igen. Om pre-amplifiering är ineffektiv kan ytterligare passage vara nödvändigt till dess mängden virus är tillräckligt hög för att infektera celler odlade i en 3 L spinnkolv. Som ett alternativ till suspensionsodling i en spinnkolv, kan 20 till 30 150 mm vävnadsodlingsskålar användas för den slutliga passagen. Detta kan emellertid vara mer tid och arbetskrävande.

För qPCR mätningar gDNA antingen kan renas via protokollet nämns här eller något annat kommersiellt tillgängligt kit för isolering av gDNA från odlade celler. Genom att använda kommersiellt tillgängligt kit protokollet kan kortas en dag men en varierande del av de HCAdV genomkopior som är närvarande i infekterade celler kan gå förlorade under rening, beroende på satsen används. Därför HCAdV genomen blir något underrepresenterade i följande Q-PCR mätningar i jämförelse med den metod som presenteras i steg 7,4).

ObtaiNed totala infektions titrar i en slutlig vektor preparat som härrör från en spinnkolv sträcker sig från 1 x 10 10 till 5 x 10 11 infektiösa partiklar. Denna mängd är tillräcklig för att utföra talrika experiment in vitro. Beroende på målcellerna, också flera in vivo-experiment kan utföras. Till exempel för att uppnå tillräcklig lever transduktion efter systemisk administration 1 x 10 9 infektiösa partiklar krävs.

Sammanfattningsvis, den breda cell tropism och möjligheten att producera kapsid-modifierat adenovirus tillsammans med den förbättrade säkerhetsprofilen för HCAdV vektorer saknar alla virala gener gör dessa HCAdV vektorsystem ett mycket värdefullt verktyg för genterapeutiska applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
I-CeuI New England Biolabs R0699S restriction digest
PI-SceI New England Biolabs R0696S restriction digest
T4 Ligase New Engand Biolabs M0202S ligation
SwaI New England Biolabs R0604S restriction digest
NotI New England Biolabs R0189S restriction digest
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP) New England Biolabs M0290S dephosphorylation of digested plasmids
Hygromycin B PAN Biotech P02-015 selection of CRE expressing 116 cells
DMEM PAN Biotech P04-03590    Hek293T cell culture medium
Minimal Essential Medium (MEM) Eagle PAN Biotech P04-08500 116 cell culture medium  
Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS) PAN Biotech P04-36500 washing of cells, resuspension of cells
250-ml storage bottle Sigma CLS430281-24EA infection of 116 cells grown in suspension
500-ml PP CentrifugeTubes Sigma CLS431123-36EA sedimentation of cells from suspension culture
Spinner flask Bellco 1965-61030 growth of 116 cells in suspension
Ultra Clear Ultracentrifuge tubes Beckmann Coulter 344059 density gradient centrifugation
Ultracentrifuge Beckmann Coulter density gradient centrifugation
SW-41 rotor Beckmann Coulter density gradient centrifugation
Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane VWR 132129 dialysis tubing
ready-to-use dialysis cassettes  Thermo 66383 dialysis
one shot DH10B electrocompetent E. coli invitrogen C4040-52 transformation of ligation reactions
PureYield Plasmid Midiprep System Promega A2495 midiprep
peqGOLD Tissue DNA Mini Kit  Peqlab 12-3396-02 isolation of genomic DNA
SuperFect Transfection Reagent Qiagen 301305 tranfection of 116 cells
opti MEM (10% FBS) Gibco 31985-062 transfection of 116 cells
iQ SYBR Green Supermix BioRad  170-8882 q-PCR
CFX 96 C1000 touch  Biorad qPCR machine
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol  Carl Roth A156.1 purification of DNA
Cesium chloride Carl Roth 8627.1 density gradient centrifugation
sodium acetate 99% Carl Roth 6773.2 DNA precipitation
LB medium  Carl Roth X968.3 bacterial growth medium
ethanol  99.8% pure Carl Roth 9065.5  DNA precipitation and washing
SDS 99.5% Carl Roth 2326.2 lysis  buffer
EDTA Carl Roth 8043.2 lysis  buffer
Tris-HCl 99% Carl Roth 9090.3 dialysis buffer/ lysis  buffer
glycerol 99.5% Carl Roth 3783.1 dialysis buffer
MgCl2 98.5% Carl Roth KK36.2 dialysis buffer
NaCl Carl Roth 3957.1 optional dialysis buffer
KH2PO4 Carl Roth 3904.2 optional dialysis buffer
sucrose Carl Roth 9286.1 optional dialysis buffer
Na2HPO4x2H2O Carl Roth 4984.2 optional dialysis buffer
1.5-ml tubes sarstedt 72,730,005 storage of virus preparations at -80 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benihoud, K., Yeh, P., Perricaudet, M. Adenovirus vectors for gene delivery. Curr Opin Biotechnol. 10, (5), 440-447 (1999).
  2. Crystal, R. G. Adenovirus: the first effective in vivo gene delivery vector. Hum Gene Ther. 25, (1), 3-11 (2014).
  3. Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, (24), 13565-13570 (1996).
  4. Palmer, D., Ng, P. Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Mol Ther. 8, (5), 846-852 (2003).
  5. Morral, N., et al. High doses of a helper-dependent adenoviral vector yield supraphysiological levels of alpha1-antitrypsin with negligible toxicity. Hum Gene Ther. 9, (18), 2709-2716 (1998).
  6. Muruve, D. A., et al. Helper-dependent adenovirus vectors elicit intact innate but attenuated adaptive host immune responses in vivo. J Virol. 78, (11), 5966-5972 (2004).
  7. Ehrhardt, A., et al. A gene-deleted adenoviral vector results in phenotypic correction of canine hemophilia B without liver toxicity or thrombocytopenia. Blood. 102, (7), 2403-2411 (2003).
  8. Cots, D., Bosch, A., Chillon, M. Helper dependent adenovirus vectors: progress and future prospects. Curr Gene Ther. 13, (5), 370-381 (2013).
  9. Mizuguchi, H., Kay, M. A. Efficient construction of a recombinant adenovirus vector by an improved in vitro ligation method. Hum Gene Ther. 9, (17), 2577-2583 (1998).
  10. Mizuguchi, H., Kay, M. A. A simple method for constructing E1- and E1/E4-deleted recombinant adenoviral vectors. Hum Gene Ther. 10, (12), 2013-2017 (1999).
  11. Ehrhardt, A., Kay, M. A. A new adenoviral helper-dependent vector results in long-term therapeutic levels of human coagulation factor IX at low doses in vivo. Blood. 99, (11), 3923-3930 (2002).
  12. Jager, L., et al. A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors. Nat Protoc. 4, (4), 547-564 (2009).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics