Kloning og storstilet produktion af høj kapacitet adenovirusvektorer Baseret på menneskelige adenovirus type 5

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ehrke-Schulz, E., Zhang, W., Schiwon, M., Bergmann, T., Solanki, M., Liu, J., Boehme, P., Leitner, T., Ehrhardt, A. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (107), e52894, doi:10.3791/52894 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

For genterapeutiske anvendelser er det af stor betydning at undgå cytotoksiske og immunogene bivirkninger forårsaget af ekspression af virale proteiner, transgenet selv eller af indkommende virale proteiner. Adenovirusvektorer (ADV) er almindeligt anvendt til at indføre fremmed DNA i en lang række celler for at undersøge virkningen af transgenekspression 1,2. Den mest avancerede version af AdV er repræsenteret ved høj kapacitet adenovirusvektorer (HCAdV) mangler alle virale kodende sekvenser 3,4 og derved tilbyder en emballage kapacitet op til 35 kb kombineret med lav immunogenicitet og lav toksicitet 5-8. På grund af deres høje emballeringskapacitet de tillader levering af store eller flere transgener ved hjælp af en enkelt vektor dosis. Derfor udgør de et værdifuldt værktøj for forskningsverdenen.

I modsætning til første eller anden generation AdV mangler de tidlige gener E1 og / eller E3, der let kan fremstilles ved anvendelse af kommercielle kits, vector genom konstruktion og produktion af virus HCAdV er mere kompleks. Systemet til opførelse af HCAdV genomer er baseret på plasmidet pAdFTC bærer en HCAdV genom blottet for alle virale kodende sekvenser og shuttle-plasmidet pHM5 9-12. Helst gen af interesse på op til 14 kilobaser (kb) kan klones ind i shuttle-vektor pHM5 hvori det multiple kloningssted er flankeret af genkendelses / spaltning sites af målsøgende endonukleaser PI- Sce I og I- Ceu I. Derfor kan et klonet gen af interesse frigives af træk PI- Sce I og I- Ceu I fordøjer til efterfølgende rettet indføring i de samme restriktionssteder til stede i HCAdV genomet indeholdt i plasmidet pAdFTC. I pAdFTC transgenet insertionssted placeret mellem PI- Sce I og I- Ceu I spaltningssteder flankeres af stuffer DNA og de ​​ikke-kodende adenovirussekvenser, der er nødvendige for genom emballage som den 5 'og 3' inverterede terminale gentagelser (ITR'er)i begge ender og pakkesignalet nedstrøms for 5'ITR. Den ekstra stuffer DNA giver optimal størrelse af den endelige HCAdV genomet der spænder fra 27 til 36 kb at sikre en effektiv emballage under virus-produktion. Da pAdFTC er et stort plasmid med op til 45 kb (afhængig af størrelsen af ​​det indsatte transgen) og brugen af ​​målsøgende endonukleaser med sammenligneligt lange DNA genkendelsessteder udviser stærk DNA-binding, flere oprensningstrin er nødvendige under overførsel af transgenet fra pHM5 til pAdFTC. Omhyggelig håndtering undgå forskydningskræfter anbefales.

ITR'erne af HCAdV genomet flankeres af Not I restriktionsenzym-genkendelsessites er placeret direkte opstrøms for 5'ITR og nedstrøms for 3'ITR 12. Derfor kan HCAdV frigøres ved Not I fordøje til efterfølgende transfektion af det virale genom i HCAdV producent cellelinie. Bemærk, at brugen af restriktionsenzym Not I for rellethed af virusgenomet fra plasmidet pAdFTC indebærer, at den indsatte transgen er blottet for Not I-DNA-genkendelsessteder. HEK293 cellebaserede producentceller (116 celler) stabilt udtrykker Cre-rekombinase. For virusamplifikation 116 celler co-inficeret med en hjælper virus (HV) giver alle AdV gener der er nødvendige for replikation og pakning i trans 3,4. HV er et første generations AdV med en floxed pakning signal, som fjernes under virusamplifikation af Cre-rekombinase udtrykt i 116 celler 4. Dette sikrer, at overvejende HCAdV genomer indeholdende en intakt emballage signal indkapsles.

Pre-amplifikation af HCAdV udføres ved at gennemføre seriepassage trin i 116 celler dyrket på overflader i vævskulturskåle. Efter hver passage viruspartikler frigøres fra inficerede celler ved at udføre tre på hinanden følgende fryse-tø-trin. Med hver passage stigende antal celler er inficeret med1/3 af cellelysat fra den foregående passage. Endelig lysat fra den sidste præ-amplifikation trin anvendes til at inficere producent- celler dyrket i suspension i en rystekolbe til amplifikation stor skala. Virioner oprenses fra suspensionsceller ved at udføre ultracentrifugering i en cæsiumchlorid densitetsgradient 4,12. Med denne procedure tomme partikler og færdigsamlede partikler separeres i to distinkte bånd. For yderligere at koncentrere HCAdV partikler et andet ikke-gradvise ultracentrifugeringstrin udføres. Efterfølgende den resulterende bånd indeholdende HCAdV opsamles og dialyseres mod en fysiologisk buffer. Endelige vektor præparater er karakteriseret med hensyn til antallet af absolutte viruspartikler, infektiøse partikler og HV forureningsniveauer. Absolutte viruspartikler kan bestemmes ved lysering viruspartikler og måling af absorbansen ved 260 nm eller ved at udføre kvantitativ real-time PCR (qPCR) 12. Infektivitet af PURficeret viruspartikler kan bestemmes ved qPCR måle- HCAdV genomer til stede i inficerede celler 3 timer efter infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Konstruktion af rekombinant HCAdV genomer baseret på plasmid pAdFTC

Bemærk: Alle plasmider er blevet beskrevet tidligere 11,12 og er tilgængelige efter anmodning. Kloningen er skematisk vist i figur 1.

  1. Klone et gen af ​​interesse (GOI), herunder promotor og polyadenyleringssignal (pA) i shuttle plasmid pHM5, under anvendelse af en kloningsstrategi af valg, til at generere pHM5-GOI.
    BEMÆRK: Da pAdFTC er en forholdsvis stor plasmid, er klassiske plasmidpræparat protokoller anbefales for at undgå sheering af plasmid-DNA ved anvendelse af kommercielle plasmid oprensningskit der er baseret på silica membraner. I- Ceu I og PI -Sce jeg kraftigt binde til DNA og ændre den elektroforetiske mobilitet fordøjet DNA. Derfor er en phenol-chloroform-ekstraktion og EtOH udfældning (trin 1.3), før agarosegelelektroforese.
  2. Digest 20 ug PHM5-GOI og 10 ug pAdFTC af I-CeuI (10 U) i 3 timer ved 37 ° C i et samlet volumen på 100 pi for at linearisere plasmider (~ 2,8 kb + GOI ORF sekvens og ~ 31KB henholdsvis).
  3. Renses lineariserede plasmider under anvendelse phenol-chloroform-ekstraktion efterfulgt af ethanol (EtOH) udfældning 13.
    1. Tilsættes 100 pi phenol: chloroform: isoamylalkohol og bland forsigtigt ved at vende røret flere gange. Centrifuger i 2 minutter ved 15.000 x g.
    2. Supernatanten overføres til et nyt rør, tilsættes 20 pi natriumacetat (pH 5, 3 M) og 400 pi iskold EtOH (99,8%) og blandes suspensionen kraftigt. Centrifuger i 10 minutter ved 15.000 x g.
    3. Fjern supernatanten, tilsættes 300 pi 70% EtOH og centrifugeres i 2 minutter ved 15.000 x g. Derefter fjerne supernatant og lufttørre DNA pillen. Pillen opløses i 10- 20 ul dH 2 O. Må ikke tør DNA pillen for længe, ​​da det vil være sværere at få DNA i opløsning.
  4. Digest I-Ceu I -digested pHM5-GOI og pAdFTC plasmid fra trin 1.3) i mindst 3 timer eller O / N med restriktionsenzymet PI -Sce I (10 U) ved 37 ° C i et samlet volumen på 50 pi og efterfølgende oprense I -CeuI og PI -Sce fordøjet plasmider ved anvendelse phenol-chloroform-ekstraktion efterfulgt af EtOH udfældning (se trin 1.3). Opløs DNA i 20 ul nucleasefrit dH 2 O.
  5. Separat pHM5 plasmidskelet (2,8 kb), og den indiske regering (fra trin 1.4) på ​​en præparativ agarosegel og gel-rense den indiske regering ved hjælp af en kommerciel gel-og PCR- oprydning kit. Et repræsentativt agarosegel af fordøjelsen er vist i figur 2A.
  6. Dephosphorylere I- Ceu I og PI -Sce I-spaltet pAdFTC (fra trin 1.4) med kalve intestinal alkalisk phosphatase CIP (10 U) i 1 time ved 37 ° C i et samlet volumen på 25 pi og oprense dephosphoryleret plasmid pAdFTC ved phenol-chloroform-ekstraktion og efterfølgende EtOH PRecipitation (trin 1.3). Eluere DNA i 20 ul nucleasefrit dH 2 O.
  7. Udfør analytisk gelelektroforese fra en portion af dephosphorylerede pAdFTC plasmidet (fra trin 1.6), og det rensede GOI-fragment (fra trin 1.5) at analysere, om fordøjer er komplette og størrelserne af de forventede fragmenter er korrekte (~ 31 kb til lineariseret pAdFTC ).
    Bemærk: Størrelsen af GOI er variabel afhængigt af størrelsen af transgenet ekspressionskassetten. Estimere de relative koncentrationer af de respektive fragmenter til efterfølgende ligering. Et repræsentativt agarosegel af oprensede fragmenter er vist i figur 2B.
  8. Opsætning af ligeringsreaktionen i et totalt volumen på 20 pi ved anvendelse af 400 E T4-DNA-ligase og et molforhold mellem vektor indsætte på 1: 3.
    BEMÆRK: I konkordans med agarosegel vist i figur 2B vi normalt ligere i et samlet volumen på 20 pi med 2- til 6-pi vektor, 8- til 12 piindsætte og 400 E T4 DNA-ligase. Som DNA-koncentrationen er normalt lav efter flere phenolization trin, bruge så meget DNA som muligt, således at ingen yderligere H2O skal tilsættes for at nå det endelige volumen på 20 pi. Ligere ved 16 ° CO / N og udfører derefter phenol-chloroform-ekstraktion efterfulgt af EtOH udfældning (trin 1.3).
    1. Eluere DNA i 15 pi nucleasefrit dH2O og fordøje det oprensede ligeringsreaktionen med restriktionsenzymet Swal (10 U) i 2 timer ved 25 ° C i et samlet volumen på 20 pi. Derefter koncentreres og oprensning af DNA, ved at udføre phenol-chloroform-ekstraktion efterfulgt af EtOH udfældning (trin 1.3). Eluere DNA i 10 pi nucleasefrit dH 2 O.
  9. Transform 2 pi af det oprensede Swal-fordøjet ligeringsprodukt ved elektroporering ind DH10B eller DH5a elektrokompetente E. coli og vælg kloner for 16 til 24 timer ved 37 ° C på ampicillin indeholdende LB-plader (50 mg / ml ampicillin). Vælg 5- 10 kloner og forberede plasmid DNA mini-præparater ved hjælp alkalisk lyse efterfulgt af phenol-chloroform ekstraktion og efterfølgende EtOH nedbør (trin 1.3) 13.
  10. Udfør en analytisk fordøjelse af plasmid mini-præparater efterfulgt af agarosegelelektroforese for at kontrollere størrelsen af ​​DNA-fragmenter. Foreslåede restriktionsenzymer er for eksempel I- Ceu I og PI- Sce I frigive insertet, Spe I eller HincII (figur 2C).
  11. Opformere et korrekt klon i ampicillin-holdige LB-medium (50 mg / ml ampicillin) og udføre en Midi eller maxi-plasmidpræparat anvendelse af enhver kommercielt tilgængelige plasmid oprensningskit.

2. Frigivelse af HCAdV-genomer fra pAdFTC Plasmid og Preamplification af HCAdV Vektorer i Producer Cell Linie 116

  1. Fordøje 20 ug af pAdFTC-baserede adenovirale produktion plasmid indeholdende det klonede GOI fra trin 1.11) iet samlet volumen på 100 pi under anvendelse af Not I (20 U) ved 37 ° C i> 2 timer og udfører phenol-chloroform-ekstraktion to gange efterfulgt af EtOH udfældning. Opløses i 20- 30 pi sterilt dH 2 O.
  2. Check en alikvot på 1:10 fortyndet fordøjet pAdFTC-GOI-DNA ved gelelektroforese. En 9 kb fragment for plasmid backbone og, afhængigt af størrelsen af ​​GOI, et andet DNA fragment for HCAdV genom (størrelse: 28- 36 kb) er detekterbar.
    BEMÆRK: Et repræsentativt eksempel på Notl-spaltning er vist i figur 2D. Lineariseret DNA kan opbevares i adskillige dage ved 4 ° C eller ved -20 ° C i flere uger.
  3. Før du fortsætter med protokollen, skal du sørge for, at hjælpeviruset AdNG163R-2 er blevet forstærket 4.
    Bemærk: Celler transficeret med pAdFTC afledt HCAdV vektorer er genetisk modificerede organismer, der er klassificeret som biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2), skal du bruge en ordentlig inddæmning og affaldshåndteringforanstaltninger, herunder personlige værnemidler, og arbejder under BSL-2 laminar flow emhætter.
  4. Kultur 116 celler i MEM Eagle-medium suppleret med 10% FBS og hygromycin B (100 ug / ml). Seed lavpassage (under passagen 10) 116 celler (~ 0,4x 10 6 celler) i en 60 mm vævskulturskål én dag før transfektion så de når 50- 80% konfluens næste dag.
  5. Transficere lineariseret HCAdV genom fra trin (2.1) i 116 celler ved anvendelse af fremgangsmåder, såsom calciumphosphat-transfektion eller andre kommercielt tilgængelige transfektionsreagenser (figur 3A). 16- 18 timer efter transfektion, forsigtigt fjerne mediet, tilsættes 3 ​​ml frisk medium (MEM, 5% FBS) og inficere celler med HV AdNG163R-2 4 anvendelse 5 transducerende enheder (TU) per celle (da en sammenflydende 60 mm vævskulturskål indeholder ~ 3,2x 10 6 celler, tilføje ~ 1,6x 10 7 TU af HV).
    1. Forsigtigt bevæge skålen hver 20 min i den første time efter infektion tilsikre lige HV distribution. Dyrk inficerede celler ved 37 ° C og 5% CO2. I tilfælde af effektiv virusamplifikation cytopatisk effekt (CPE) forårsaget af virusreplikation (celler rundes op og løst fastgjort eller frigjort fra vævskulturskål) er observerbare 48 timer efter infection.If CPE tidligere mængden af ​​HV skal reduceres. Hvis CPE starter senere, mere hjælpevirus skal anvendes.
  6. Harvest celler, herunder supernatant 48 timer efter infektion ved at skylle af cellerne fra dyrkningsskålen ved anvendelse af dyrkningsmediet. Celler, der er ophængt i deres dyrkningsmedium kaldes passage 0 (P0). Split P0 i to fraktioner.
    1. Fra 0,5 ml af løsnede celler spin ned cellerne i 3 minutter ved 2.000 xg og fjern medium fra cellepelleten, er der senere anvendes til isolering af genomisk DNA (gDNA) for qPCR analyse af amplifikationsprocessen. Store cellepellets ved -20 ° C indtil yderligere forarbejdning.
    2. Fra 2,5ml af de løsrevne celler frigiver virale partikler ved nedfrysning (ved -80 ° C eller i flydende nitrogen) og optøning (ved stuetemperatur eller i et 37 ° C vandbad) de celler, der resupended i deres medium tre til fire gange. Denne fraktion er end kaldes lysat af P0.
  7. Sikre, at vævskulturskåle med 116 celler, der er dyrket til 90- 95% konfluens ved hjælp af MEM-medium suppleret med FBS (10%) og hygromycin B (100 ug / ml) og HV er til rådighed for følgende overførselsteknikker trin.
  8. Bland 1 ml frisk medium (MEM, 5% FBS) med 2,5 ml af lysatet fra det foregående passage (trin 2.6.2) til et slutvolumen på 3,5 ml, tilsættes HV anvende 2 TU per celle (da en 60 mm væv dyrkningsskålen ved en konfluens på 90- 95% indeholder ~ 3,2x 10 6 celler, tilsættes ~ 6,4x 10 6 TU af HV). (Figur 3B). Fjern forsigtigt mediet fra en 60 mm skål af 116 celler og tilsæt viral blandingen til cellerne. Gentag trin 2.6) - 2,8) to gange til opnåelse af lysater af passaldre P1 og P2.
  9. Bland 17,5 ml frisk medium (MEM, 5% FBS) med 2,5 ml af lysatet fra P2 og tilføj HV anvende 2 TU per celle (da en 150 mm vævskulturskål ved en konfluens på 80- 100% indeholder ~ 2x 10 7 celler, tilsættes ~ 4x 10 7 TU af HV). Fjern mediet fra en 150 mm skål af 116 celler og inficere celler med virus blanding. Dyrk inficerede celler ved 37 ° C og 5% CO2.
  10. 48T efter infektion høst celler som beskrevet i trin 2.6) for at opnå passage P3 (figur 3B).
    1. Gentag trin 2.6) 1.
    2. Fra de resterende 19,5 ml P3 frigivelse viruspartikler fra de resupended celler ved frysning og optøning tre til fire gange. Denne fraktion er end kaldes lysat af P3.
      Bemærk: Nogle vektorer i sidste ende kan kræve yderligere passager i 150 mm skåle indtil de forstærkes tilstrækkeligt. Derfor effektiviteten af ​​præ-forstærkning proces skal overvåges under seriel passaldring. qPCR baseret analyse af forstærkning proces kan udføres som beskrevet i afsnit 3 (se også figur 4A). Pre-amplifikation af HCAdV bærer en ekspressionskassette for grønt fluorescerende protein (GFP) kan let vurderes ved at observere GFP flourecscent signal ved hjælp af et fluorescensmikroskop (figur 4B).

3. Overvågning af Amplification Proces hjælp Quantitative-Real Time PCR (qPCR) (se også figur 4A).

  1. Isoler gDNA fra cellepellets fra hver passage af preamplifaction (trin 2.6) - 2,10) ved anvendelse af et kommercielt DNA-isolering kit til isolering af gDNA fra dyrkede celler eller en anden metode. For at opnå optimale PCR-resultater bruger gDNA så frisk som muligt. Ellers gDNA kan opbevares ved -20 ° C indtil yderligere anvendelse.
  2. For at bestemme antallet af HCAdV genomer til stede i cellerne i de respektive passage af qPCR analyse danne en standardkurve under anvendelse af 10 1 </ sup> - 10 9 kopier af et plasmid, der bærer den indiske regering, der er indeholdt i HCAdV genom.
  3. Analyser den samme mængde gDNA fra P0- P3 (trin 2.6- 2.10) om anvendelse af qPCR hjælp 400 nM af primere specifikke for den indiske regering, der er indeholdt i HCAdV genom. Til udførelse af qPCR følg producentens anvisninger respektive qPCR kemikalier. Indstil qPCR programmet som følger: præinkubation ved 95 ° C i 10 minutter, amplifikation i 40 cykler ved 95 ° C i 10 s, 55- 60 ° C i 15 s og 72 ° C i 20 s. På grundlag af standardkurven kan interpoleres antallet af HCAdV genomer i reaktionen.

4. Large Scale Amplifikation af HCAdV vektorer i 116 celler, der vokser i suspension

  1. Tilføj 900 ml forvarmet (37 ° C) frisk MEM suppleret med 10% FBS og hygromycin B (100 ug / ml) i en 3 l spinner dyrkningskolbe (figur 3B).
  2. Fjern mediet fra mindst 10 individuelle 150 mm vævskulturskåle med 116 celler dyrket på et konfluens på 90- 100% og skyl off celler med 10 ml frisk foropvarmet (37 ° C) MEM suppleret med FBS (10%) og hygromycin B (100 ug / ml) under anvendelse af en serologisk pipette. Pipette op og ned flere gange for at få en homogen cellesuspension. Overfør celler direkte i spinnerkolben allerede indeholder 900 ml fra trin 4.1).
    Bemærk: Brug ikke trypsin / EDTA som det negativt kan påvirke væksten af suspension celler. Efter fjernelse af medium umiddelbart overføre celler i spinnerkolben. Ikke håndtere mere end to vævskulturskåle ad gangen. Jo længere ventetid efter tilsætning frisk medium jo sværere bliver det at fritliggende celler fra vævskulturskål.
  3. For at sikre optimal cellevækst inkuberes spinnerkolben på en magnetomrører i en vævskultur-inkubator i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2. Juster magnetomrører til 70 rpm for at undgå binding af celler til glasoverflader. Overvåge cellevækst i spinner dyrkningskolbe at undersøge, om celler dyrket i spinner dyrkningskolben er levedygtige, og om de vokser til tilstrækkelige mængder. Hver gang forud for tilsætning af frisk medium transfer 2 ml fra bioreaktoren til en 60 mm vævskulturskål. Observere cellemorfologi under et mikroskop.
    Bemærk: Celler danner klumper flyder i dyrkningsmediet angiver optimal vækst og levedygtighed (se også figur 4C). Efter 24 timer de danner kolonier på overfladen af ​​vævskulturskål. 30- 50% konfluens indikerer optimal tæthed.
  4. 24 timer efter opsætning af spinner kultur kolben tilsættes 500 ml frisk medier (MEM, 10% FBS) suppleret med hygromycin B (100 pg / ml). 24 timer senere gentage dette trin.
  5. 72 timer efter oprettelse spinnerkulturen, tilsættes 1000 ml frisk MEM medium (10% FBS) med hygromycin B (100 ug / ml) resulterer i et totalt volumen på 3 liter cellesuspension.
  6. 24 timer efter at nå avlydstyrken af ​​tre liter, høst 116 suspensionsceller ved centrifugering i 10 minutter ved 500 xg ved stuetemperatur. Kassér supernatanten. Den tømte spinnerkulturen kolbe under vævskultur hætte holde.
  7. Resuspender cellepellets i frisk MEM suppleret med 5% FBS ved pipettering op og ned omkring 8- 10 gange for at få en homogen cellesuspension. Mængden af ​​mediet afhænger af, om lysat fra trin 2.10) 2. (19,5 ml, se trin 4.8) 1. option a) eller en renset viral bestand af HCAdV fra trin 5.9) 2. (flere pi depanding på viral titer, se trin 4.8) 2., mulighed b) anvendes til infektion af cellerne. Brug et samlet volumen på 150 ml.
    1. Mulighed A: Til infektion af 116 suspensionsceller med lysatet fra P3 (primær amplificering) overføre celler fra trin 4.8) til en 250 ml opbevaringsflaske udstyret med en steril magnetisk omrører eller et 250ml lille målestok spinnerkolbe og co-inficere celler med virus i lysatet fra P3 (trin 2.10.2) og 2 TU af HV per celle. Under forudsætning af en densitet på 3 x10 5 celler pr ml, det samlede celleantal er 9x 10 8 celler. Således tilsættes 1,8 x 10 9 TU af HV.
    2. Alternativ B: infektion af 116 suspensionsceller med oprenset viral stock, overføre celler fra trin 4.8) til en 250 ml opbevaringsflaske udstyret med en steril magnetisk omrører eller et 250ml lille målestok spinnerkolbe og co-inficere celler med 100 viruspartikler per celle af tidligere oprenset HCAdV (fra trin 5.9) 2.). Således tilføjer 9x 10 10 VP ifølge fysiske titer (målt ved absorbans ved 260 nm; trin 6) af det oprensede HCAdV og 1,8x 10 9 TU af HV.
  8. Omrør celle-virus blandingen fra september 4.8.1) eller 4.8.2) ind på en magnetomrører i vævskultur inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i 2 timer ved 60 rpm. Sørg for, at opbevaring flasken ikke er helt lukket for at tillade luftcirkulation.
  9. 2 timer efter infektion overføre det totale volumen af ​​cellen-virus blandingen tilbage i 3 l spinner culture kolbe og tilsættes 1,850 ml frisk foropvarmet (37 ° C) MEM medium suppleret med 5% FBS til et samlet volumen på 2 L og inkuberes i vævskultur inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i 48 timer ved 70 rpm.
  10. Harvest cellerne ved centrifugering i 10 minutter ved 890x g ved stuetemperatur i 500 ml centrifugerør. Fjern mediet og resuspender celler i pelleterede et samlet volumen på 28 ml DPBS. Pipettere op og ned for at opnå en homogen cellesuspension. Frys celle-virussuspension i flydende nitrogen eller ved -80 ° C at sikre, at suspensionen helt frosne. Opbevar celle-virus suspension ved -80 ° C indtil start af virus oprensning.

5. Rensning og dialyse af HCAdV

  1. For at forberede viruslysat for cæsiumchlorid (CsCI) gradienter, fryse celle-virussuspension fra trin 4.11) i flydende nitrogen og optøning i et vandbad ved 37 ° C fire gange.
  2. Centrifuger viruslysatet ved 500 xg i 8 minutter ved RT og indsamle supernatanten indeholdende HCAdV.
  3. For Ultracentifugering forberede CsCI opløsninger som follows.Weigh 37,5 g (1,5 g / cm3), 33,5 g (1,35 til g / cm3), og 31,25 g (i 1,25 g / cm 3) af CsCI pulver henholdsvis og fyld op med dH2O til 25 ml.
    1. Omrøre, indtil opløsningen bliver klar og sterilfilter løsningerne. Endelig fjernes 1 ml af hver opløsning og vejer det på en fin skala for at tjekke vejr tætheden er korrekt. 1ml bør vægt 1,5 g, 1,35 og 1,25 g henholdsvis.
    2. Hvis massefylden er for høj justere den ved trinvis tilsætning af små mængder (pi) sterilt dH 2 O. Efter tilsætning af dH2O måle densitiy igen. Hvis det er nødvendigt at tilføje mere dH 2 O.
    3. Gentag proceduren, indtil tæthed er korrekt. Hvis massefylden er for lav tilpasse det ved at tilføje lille mængde CsCI pulver. Sterilfilter det igen og kontrollere tætheden. Hvis massefylden er for høj justere den ved adding dH2O som beskrevet ovenfor. Hvis tætheden er stadig for lav tilføje mor CsCI, sterilfilter den igen og kontrollere tætheden. Gentag proceduren, indtil tætheden er korrekt.
  4. Forbered CsCI trinvise gradienter i seks klare ultracentrifugerør. Forsigtigt og langsomt pipetteres CsCI løsninger ind i rørene ved hjælp af følgende rækkefølge: 0,5 ml 1,5 g / cm3 CsCl-opløsning, 3 ml 1,35 g / cm3 CsCl-opløsning og 3,5 ml 1,25 g / cm3 CsCl-opløsning (figur 2C) .
  5. Overlay ~ 4,5 ml blokerede vektor supernatant fra trin 5.2) oven på 1,25 g / cm3 CsCl lag. Centrifuger gradienter i en ultracentrifuge ved hjælp af en swing ud rotor (SW-41) ved 12 ° C i mindst 2 timer ved 226.000 xg (35.000 rpm) med langsom acceleration og deceleration til separat HCAdV-genomet indeholder viruspartikler fra tomme partikler og celler debris.
    BEMÆRK: Under optimale betingelser et diffust bånd af celle vragrester trykforme på toppen afrørene. Nedenfor to hvide bånd kan observeres. Den øvre bånd indeholder tomme partikler mens det nederste bånd er lig med HCAdV (figur 2C og 5A).
  6. Fjern forsigtigt lag af cellerester og tomme partikler og indsamle 1 ml af de nedre bånd fra hvert rør og overførsel virus med en ren pipettespids i et sterilt 50 ml rør. Tilføj op til 24 ml 1,35 g / cm3 CsCl løsning på de indsamlede viruspartikler og blandes omhyggeligt.
  7. Fyld centrifugerør med 1,35 g / cm3 CsCl-virusopløsning til toppen og centrifuger O / N (18- 20 timer) ved 226.000 xg (35.000 rpm) ved 12 ° C i en ultracentrifuge under anvendelse af en udsvingsrotor (SW-41 ) med langsom acceleration og deceleration.
  8. Opsaml HCAdV stede i den fremtrædende lavere bånd. Som en potentiel øvre bånd indeholder tomme partikler fjernelse af de øverste lag fra toppen ved hjælp af en pipette (se figur 2C og 5B) Derefter tage væk det nedre bånd USIng en pipette.
  9. Dialyse de indsamlede viruspartikler til bufferudskiftning.
    1. Skær en strimmel dialyseslange (MWCO: 50.000) på ca. 8 cm i længden, vaske det med sterilt dH2O tre gange. Derefter lukke den ene side af dialyserøret med en plastik klemme og overfører de indsamlede virus fra trin 5.8) i rør under anvendelse af en 1-ml pipette. Undgå luftbobler i slangen og lukke den på den anden side med en plastik klemme dialyse lukninger.
    2. Dialyse i 1 liter dialysebuffer (10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 10% glycerol og 1 mM MgCl2 i deioniseret H2O) i 2 timer ved 4 ° Cwith langsom omrøring. Exchange dialyse buffer med 2 liter dialysepuffer og dialyseres O / N ved 4 ° C med langsom omrøring. Alternativt kan en sucrosebuffer (140 mM NaCl, 5 mM Na 2 HPO 4 x2H 2 O, 1,5 mM KH 2 PO 4 og 730 mM sucrose, pH 7,8).
    3. Saml dialyserede viruspartikler fra trin 5.9) 2. anvendelse af en 1 ml pipette. Forbered flere portioner af de ønskede små mængder (25- 100 pi) og gemme oprenset virus ved -80 ° C.

6. Måling af fysiske titeren af ​​Final HCAdV forberedelser optiske densitet (OD)

  1. Fortynd 25 pi den endelige vektor fremstilling fra trin 5.9) 2 med 475 pi lysisbuffer (10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,5% SDS)), ryst forsigtigt i 20 minutter ved RT og endelig centrifugeres i 2 minutter ved stuetemperatur ved 15.000 x g.
  2. Da de absorbansværdier ved 260 nm (A260) er som regel lav, måle absorbansen fire gange ved anvendelse af 100 pi af supernatanten og beregne middelværdien af ​​fire målinger. Beregn antallet af viruspartikler per ml (vp / ml -1) ved hjælp af følgende formel: VP / ml -1 = (gennemsnitlig A260) x (20) x (1,1 x 10 12) x (36 kb / HCAdV størrelse i kb ).
    BEMÆRK: Resultaterne af et typisk udbytte på absolutte viruspartikler (OD titer) er vist i figur 7A

7. Måling alt Partikler, infektiøse enheder af HCAdV og HV kontaminationsgraden i Final Vector Forberedelse af qPCR. En ordning af Titrering Procedure er vist i figur 6

  1. Seed HEK293-celler i 6 eller 12 brønds vævskulturplader, så cellerne når 90% konfluens på den næste dag. For at bestemme antallet af infektiøse viruspartikler (smitsom titer), inficere celler i en brønd i en multi-brønds plade med 1 pi og en anden brønd med 10 pi oprenset virus fra trin 5.9) 3.
  2. Harvest celler 3 timer efter infektion. Fjern mediet og tilsæt trypsin til at dække hele godt og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i 5 minutter. Skyl off cellerne med trypsin under anvendelse af en pipette og spin ned cellerne ved 890 x g i 3 minutter ved stuetemperatur.
  3. Resuspendere pelleterede celler i 200 pi DPBS og vask dem grundigt for at fjerne frie (ikke-infektiøse) vektor partikler. Centrifugeres i 3 minutter ved 890 xg ved stuetemperatur. Kassér supernatanten og resuspender cellepellets i 200 pi frisk DPBS.
    Bemærk: nøjagtig bestemmelse af den infektiøse titer, er det afgørende at fjerne alle ikke-infektiøse viruspartikler fra cellen overflader ved trypsinbehandling og grundig vask.
  4. At bestemme det samlede viruspartikel nummer (infektiøse partikler og ikke infektiøse partikler = fysisk titer), høst ikke-inficerede celler fra HEK293 to brønde uden trypsin ved at skylle cellerne med deres dyrkningsmedium under anvendelse af en pipette.
  5. Spin ned cellerne i 3 minutter ved 890 xg ved stuetemperatur. Kassér mellemlang og resuspender pelleterede celler i 200 pi DPBS. Subsequently tilsættes 1 ul og 10 ul renset HCAdV præparat direkte til cellerne hhv. Bruge ikke inficerede celler som baggrund, for at sikre de samme betingelser for gDNA isolation og efterfølgende q-PCR.
  6. Isoler gDNA fra HEK293-celler afledt fra trin 7.3) og 7,5)
    1. Vortex celler resuspenderet i 200 pi DPBS (trin 7.3 og 7.4) i 3 sek, tilsættes 200 pi SDS-opløsning. (10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,5% SDS) og 20 pi proteinase K (20 mg / ml) og vortex suspension i 3 sek. Inkuber 12- 16 timer ved 55 ° C og omrystes langsomt. Derefter tilsættes 2 pi RNAse A (20 mg / ml) og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C.
    2. Tilføj 350 pi phenol: chloroform: isoamylalkohol og centrifugeres i 2 minutter ved 15.000 x g. Overfør supernatanten til et nyt rør og gentage dette trin én gang
    3. Supernatanten overføres til et nyt rør, tilsættes 50 pi natriumacetat (pH 5, 3 M) og 1 ml iskold EtOH (99,8%) og blandes suspension. CentriFuge prøver i 10 minutter ved 15.000 xg for at pelletere genomisk DNA.
    4. Så fjern supernatanten, tilsættes 500 pi 70% EtOH og centrifugeres i 2 minutter ved 15.000 x g. Fjern supernatanten, tilsættes 500 pi 70% EtOH og omrystes i 30 minutter ved stuetemperatur. Derefter centrifugeres i 2 minutter ved 15.000 x g.
    5. Fjern supernatanten og lufttørre DNA pellet. Må ikke tørre DNA pellets i lang tid, da det vil være sværere at få gDNA i opløsning. Resuspender DNA pellet i 120 pi dH2O og inkuberes i ~ 1 time ved 37 ° C under omrystning. Hvis DNA-opløsning forekommer viskøs, rystes i adskillige timer ved 37 ° C eller inkuberes ved 55 ° C i ~ 1 time.
  7. For at bestemme infektiøse HCAdV-partikler og absolutte HCAdV-partikler, generere en standardkurve for 10 1 - 10 8 kopier af et plasmid, der bærer GOI indeholdt i HCAdV genomet.
  8. Bestem samlede partikler og infektiøse partikler ved at analysere de samme mængder af gDNA af inficerede HEK293 calen fra trin 7.3) og 7,4) anvender qPCR hjælp 400 nM af primere specifikke for den indiske regering, der er indeholdt i HCAdV genom.
  9. Indstil PCR-programmet som følger: præinkubation ved 95 ° C i 10 minutter, amplifikation i 40 cykler ved 95 ° C i 10 sek, 55 ° C i 10 sek og 72 ° C i 20 sek. På grundlag af standardkurven (trin 7.7), interpolere det samlede antal af adenovirale genomer i reaktionen.
  10. Beregne antallet af adenovirale genomer i den endelige vektor præparat under anvendelse af følgende formular: (Antal HCAdV / vægt i ng gDNA i reaktionen) x (vægt i ng DNA af alle celler i inficerede skålen / volumen virus i pi) .
    BEMÆRK: Den typiske område for absolutte og infektiøse virale partikler udbytter er omkring 1x10 7 -1x10 8 virale partikler / pl. Titere der er ti gange højere eller lavere end vist her kan betragtes som normale. Højere titere ville være en forbedring. Med hensyn til forholdet mellem absolutte HCAdV partikles til infektiøse HCAdV partikler, viser erfaringen, at cirka 5- 10% af absolutte HCAdV partikler er smitsom (figur 7A).
  11. At bestemme niveauerne forurening med HV, udføre qPCR ved amplificering af et del af det adenovirale sene gen 3 (L3) til stede i HV-genomet. Brug af et plasmid med den adenovirale sene gen 3 (L3) til at generere en standardkurve (trin 7.7).
  12. I denne reaktion anvendes 400 nM af primerne L3 fremadrettet 5'-AGA AGC TTA GCA TCC GTT ACT CGA GTT GG-3 'og L3 reverse 5'-ATA AGC TTG CAT GTT GGT ATG CAG GAT GG-3' sammen med 300 nM af L3-specifikke probe 5'-Fam-CCA CCC GTG TGT ACC TGG TGG ACA-Tamra-3 '.
  13. Indstil PCR-programmet som følger: præinkubation / aktivering ved 95 ° C i 10 minutter, amplifikation under 40 cykler af 95 ° C i 15 sek og 60 ° C i 1 min. Brug en universel sonde PCR Mastermix for qPCR reaktion. På grundlag af standardkurven (trin 7.7), beregne antallet af ismitsomme HV partikler i den endelige vektor forberedelse. Se (figur 7A) for typiske udbytter for HV-partikler.
  14. Endelig beregne forholdet mellem absolutte infektiøse partikler af HCAdV til HV kontamineringsniveauer at evaluere kvaliteten af ​​præparatet vektor.
    BEMÆRK: Indtil nu er en lille del af de resterende HV kan ikke udelukkes. Normalt procentdelen af HV forurening er ~ 5% af infektiøse partikler eller derunder, hvilket er acceptabelt (figur 7B). Naturligvis som mindre HV som muligt er ønskelig, især hvis præparatet vektor skal bruges til dyreforsøg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her repræsentative eksempler til kloning, amplifikation og oprensning af HCAdV præparater er vist. En oversigt over kloningsstrategien (figur 1) og repræsentative eksempler på kloning og frigivelse af HCAdV genomet ved restriktionsenzymspaltning er tilvejebragt (figur 2). En typisk restriktion mønster efter frigivelsen af den indiske regering-ekspressionskassetten fra pHM5 af PI- Sce I og I- Ceu jeg fordøje og efterfølgende phenol-chloroform ekstraktion og EtOH nedbør (se også trin 1,2 1.5) vises (figur 2A). Typisk en ~ 3 kb bånd svarende til pHM5 plasmidskelet og et andet bånd svarende til ekspressionskassetten af ​​GOI kan observeres. Båndet indeholdende GOI-ekspressionskassetten oprenses derefter fra agarosegelen. Det oprensede GOI-ekspressionskassetten analyseres på en agarosegel sammen med det oprensede, dephosphoryleret pAdVFTC at wsom fordøjet med PI- Sce I og I- Ceu jeg henholdsvis (trin 1.7) for at kontrollere den korrekte størrelse og til at estimere den relative mængde af molekyler til efterfølgende ligering (figur 2B). Efter ligering (se trin 1.8) efterfulgt af phenol-chloroform-ekstraktion og EtOH udfældning og Swal fordøje at fjerne uncut pAdFTC og efterfølgende phenol-chloroformekstraktion og EtOH udfældning (trin 1.9), er ligeringsprodukter transformeres ind i bakterier og kloner selekteres på ampicillin indeholdende LB agarplader. Normalt snesevis til hundredvis af kloner opnået, hvorfra 5- 10 kloner er forberedt til plasmid-DNA-mini-præparater. En begrænsning mønster af en analytisk HincII-spaltning af positive og negative kloner sammen med en tom pAdFTC som negativ kontrol (se også trin 1.10) vises (figur 2C). Her positive kloner viser ikke en 5 kb bånd, der er til stede i det tomme pAdFTC og negative kloner og en 1,7 kb fragment visessom ikke er til stede i det tomme pAdFTC og negative kloner. Til dette respektive GOI dette indikerer tha kloning var vellykket. En positiv klon, som er blevet oprenset via midiprep blev derefter fordøjet med nr tI at frigive HCAdV-genomet bærer GOI fra pAdVFTC-GOI (trin 2.2). Endelig nr tI fordøjet DNA ist oprenset to gange under anvendelse phenol-chloroformekstraktion og udfældning EtOH for at sikre høj renhed af DNA til efterfølgende transfektion i 116-celler. Analyse af en lille brøkdel af nr tI fordøjet pAdVFTC-GOI på en agarosegel viser en ~ 9 kb bånd svarende til pAdFTC plasmid backbone og et stort bånd på op til ~ 36 kb (afhængigt af størrelsen af GOI ekspressionskassetten) svarende til HCAdV genom (figur 2D). En oversigt over amplifikation og rensning rørledningen er vist skematisk (figur 3). Repræsentative eksempler på overvågningen af ​​vektoren pre-amplifikationsprocessen leveres ( (figur 4A). Bemærk, at antallet af vektor-genomer normalt descreases løbet af de første passager og øges betydeligt i de senere passager. En vektor kopitallet af 10 6 - 10 7 pr 15000 celler er tilstrækkeligt til at inficere 116-celler til produktion i stor målestok i en 3 l rystekolbe. Hvis den indiske regering i HCAdV vektorgenomet indeholder en GFP ekspressionskassette, kan præ-forstærkning proces (afsnit 2) også overvåges af fluorescerende mikroskopi. Repræsentative billeder af hver passage er vist (figur 4B). Bemærk, at antallet af GFP-positive celler normalt falder i løbet af første passager og øges betydeligt i slutningen af ​​passager. Hvis antallet af GFP-positive celler når ~ 100% blev vektoren amplificeret sufficiently at inficere 116-celler til produktion i stor målestok i en 3 l rystekolbe. I stor skala amplifikationsprocessen af ​​et HCAdV indeholdende GFP ekspressionskassetten blev overvåget ved mikroskopisk analyse af dyrkningsmedium og celler, der blev overført fra spinnerkolben til en vævskulturskål. Mikroskopiske billeder af celler, der producerer HCAdV i suspension kultur (se trin 4.4 og 4.11) leveres (figur 4C). Bemærk, at celler vokser i klumper indikerer, at væksten det foregående cellen var tilstrækkeligt og celler er sunde. Ved brug af fluorescensmikroskopi ~ 100% af disse celler var GFP positive, hvilket indikerer effektiv transduktion af suspensionsceller i bioreaktoren og effektiv vektor produktion. Vektorpartikler blev oprenset fra mediet og cellerne i 3 l suspensionskultur af CsCI ultracentrifugering. Repræsentative billeder af HCAdV vektor oprensning under anvendelse af CsCl densitetsgradientultracentrifugering er vist (figur 5). Efter enn indledende centrifugering ved hjælp af en CsCl tringradient normalt to bands overholdes. Det øvre bånd indeholder tomme af partielle capsider mens det nederste bånd består af DNA indeholdende vektorpartikler (trin 5.4- 5.5) (figur 5A). DNA indeholdende vektorpartikler efterfølgende høstes (trin 5.6) og samles til en anden ultracentrifugeringstrin at koncentrere vektorpartikler. Dette trin resulterer sædvanligvis i et enkelt bånd af DNA indeholdende vektorpartikler der endelig høstet til efterfølgende dialyse (trin 5.7- 5.8) (figur 5B). Dialyserede vektor-præparationer blev karakteriseret ved at måle antallet af partikler, absolutte infektiøse partikler og HV forurening. En skematisk oversigt over titreringen procedure (afsnit 6 og 7) er tilvejebragt (figur 6). Repræsentative resultater for karakterisering af den endelige vektor fremstilling er vist (figur 7). Søjlediagrammet viser typiske vektor partikelantal, der eropnået ved proceduren, der er beskrevet i denne protokol. Absolutte partikler antal vektor-partikler blev bestemt ved optisk densitet (afsnit 6), infektiøse vektor partikler og HV forurening blev målt ved qPCR (afsnit 7) (Figur 7A). Erfaringen viser, at OD-titeren overvurderer antallet af viruspartikler. Absolutte viruspartikler målt ved OD kan være 20- 500 gange højere end infektiøse viruspartikler målt ved q-PCR. Smitsomme vektor partikler usally ligge mellem 5- 10% af absolutte partikler når begge blev målt ved q-PCR (afsnit 7). Hvis præparatet vektor har en meget god kvalitet, mere end 20% af absolutte partikler er infektiøse. Den typiske forhold mellem HV og infektionssygdomme HCAdV partikler (trin 7.14) normalt svinger mellem 1-5% af infektiøse partikler (figur 7B). Dette er acceptabelt, da HV er replikering mangelfuld. Ikke desto mindre som mindre HV forurening som muligt (<1% af infektiøse partikler) villeforetrækkes.

Figur 1
Figur 1. Flowchart af kloning den indiske regering i pAdFTC. Den indiske regering er klonet ind i MCS af pHM5 shuttle plasmidet. Plasmider pAdFTC og pHM5-GOI fordøjes med I- Ceu I og PI- Sce I og oprenset ved phenol-chloroform-ekstraktion og EtOH udfældning. Den fordøjede pHM5 er indlæst på en præparativ agarosegel at rense genet af interesse (se også trin 1.5), mens den fordøjede pAdFTC plasmidet dephosphoryleres. Efterfølgende ligeringsreaktionen med CIP-behandlet pAdFTC og transgenekspression kassetten er sat op (se trin 1.8) og efter afslutningen oprenset ved phenol-chloroform-ekstraktion og EtOH udfældning. Den efterfølgende Swal fordøjelse af ligeringsproduktet efterfulgt af phenol-chloroform-ekstraktion og EtOH udfældning forhindrer væksten af kloner, der bærer pAdFTC uden indsats. Sort trivinkler angiver restriktionsenzymgenkendelsessekvenser sites; grå bokse angiver AdV5 inverterede terminale gentagelser (ITR), hvide kasser mærket med Ψ indikerer AdV5 pakkesignal røde pil viser promotor, grønne bokse angiver transgen (genet af interesse, GOI), der skal udtrykkes, blå felter angiver polyadenyleringssignal, orange eller blå Pilene angiver antibiotikaresistensgener af plasmidet rygrad, henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Repræsentative resultater for kloningen proceduren og frigivelsen af HCAdV genomet fra pAdVFTC. (A) Frigivelse af GOI-ekspressionskassetten fra pHM5 af PI- Sce I og I- Ceu I Digest (se også trin 1,2 1.5). (B) Sce I og I- Ceu jeg henholdsvis (trin 1.7). (C) Analytisk HincII fordøjelse af pAdVFTC kloner med og uden Indiens regering (se også trin 1.10). (D) Frigivelse af HCAdV-genomet bærer den indiske regering fra pAdVFTC-GOI af No tI Digest (trin 2.2) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
. Figur 3. Skematisk diagram for høj kapacitet adenovirusvektor amplifikation og oprensning (A) HCAdV DNA-transfektion og hjælpervirus (HV) infektion: Transfektion lineariseret HCAdV genom bærer GOI i HCAdV producent-cellelinie (116 celler [4]) og subsequent infektion med HV AdNG163R-2 [4].   (B) Opformering af HCAdV: Efter præ-amplifikationstrinnene ved seriel overførsel cellelysat i et nyt vævskulturskål og co-inficere med HV, storproduktion udføres i en 3 L suspensionskultur (C) HCAdV oprensning:. For rensning, virus isoleres ved ultracentrifugering under anvendelse cæsiumchloridgradienter (D) Dialyse:. Oprensede HCAdV partikler dialyseres mod 2 L opbevaringsbuffer. HCAdV, høj kapacitet adenovirusvektor; ITR, adenovirus serotype 5 inverteret terminal repeat; Ψ, emballering signal; HV, hjælpevirus; MOI, mangfoldighed af infektion. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4 <br /> Figur 4. Repræsentative resultater af amplificeringsprocessen (A) Overvågning af præ-forstærkning proces ved forstærkning af virale genomer hjælp qPCR (se også afsnit 3.);. (B) Hvis den indiske regering indeholder GFP som et transgen, præforøgelsesfasen proces kan overvåges ved fluorescensmikroskopi. (C) Repræsentative resultater af stor målestok amplifikationsprocessen i et rystekolbe eksemplificeret for HCAdV der koder for GFP. Den venstre panel viser et mikroskopisk billede af inficerede 116 celler fra spinnerkolben. En prøve af dyrkningsmedium og celler blev overført til en 60 mm vævskulturskål. Bemærk, at klumper af amplificerede celler er synlige. Højre panel viser det samme billede med fluorescerende mikroskopi. Næsten 100% af cellerne transduceres med HCAdV bærer GFP. Klik her for atse en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Repræsentative resultater efter CsCI gradient centrifugering (A) efter at have udført et skridt gradient (se også trin 5.5).. (B) Efter kontinuerlig gradient (se også trin 5.7) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. Skematisk oversigt over titreringen procedure. (A) Måling af infektiøse partikler: Celler i en multi-brønds plade er smittet med forskellige mængder af oprenset virus og opsamles som cellepellets (B) Måling o.f absolutte partikler: Unifected celler danner en multi-brønds opsamles ved trypsinisering og centrifugering. Efter tilsættes resuspension renset virus og genomisk DNA er isoleret. (C) Isolering af genomisk DNA. (D) at kvantificere virale genom kopiantal en kvantitativ PCR (Q-PCR) udføres. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 7
Figur 7. Repræsentative resultater til karakterisering af den endelige vektor forberedelse. (A) det absolutte antal partikler af en vektor præparat ifølge den præsenterede protokol bestemmes med forskellige metoder:. OD titer målt ved optisk tæthed (afsnit 6), infektiøs titer og HV forurening målt ved qPCR (afsnit 7) (B)Forholdet mellem de samlede infektiøse HCAdV partikler og HV kontamineringsniveauer målt ved qPCRs (afsnit 7). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen præsenteres her tillader rensning af HCAdV vektorer baseret på human adenovirus type 5 baseret på tidligere beskrevne procedurer 4,12. Den HCAdV genomet i pAdFTC plasmidet er blottet for alle adenovirusgener og kun bærer 5'- og 3'- ITR'er og emballagen signalet. I denne strategi HV AdNG163R-2 4 indeholder alle nødvendige gener for effektiv virus produktion i trans. Dette giver en emballage på op til 35 kb, hvilket klart outcompetes første og anden generation ADVS eller udbredte lentivirus (LV) - eller adenoassocieret virus (AAV) baserede vektorer. En anden fordel ved HCAdV især til in vivo anvendelser er det faktum, at i modsætning til første og anden generation ADVS de viser reducerede niveauer af cytotoksiske og immunogene bivirkninger forårsaget af ekspressionen af virale proteiner 5-8.

Alligevel protokollen beskrevet her er mere tid ogarbejde intensivt end for andre virale vektorer såsom LV- eller AAV-vektorer samt første- eller anden generation ADVS. En væsentlig hindring er kloning af store transgener og den efterfølgende overførsel til virusproduktion plasmidet pAdV-FTC. Anvendelsen af målsøgende endonukleaser PI- Sce I og I- Ceu I tilbyder præcis og rettet indføring af transgenet fra shuttle plasmid pHM5, men har den ulempe stærkt klæber til det spaltede DNA. Derfor er det nødvendigt mange phenol-chloroform oprydning trin, når forbereder plasmid- og indsæt-DNA under kloningen proceduren. Derfor strengt efter billede kloningsprotokollen er strengt anbefales. Efter kloning af genomet HCAdV frigives fra plasmidet pAdFTC ved Not I restriktionsenzymspaltning og efterfølgende transficeret ind producenten cellelinie. Bemærk, at de første transfektionseffektiviteter er afgørende for at opnå tilstrækkelig virus forstærkning. Vigtigt er det, protokollen giver flere trinhvorfra proceduren kan genstartes i tilfælde efterfølgende trin mislykkes. Under præ-amplifikation kan lagres en tredjedel af lysaterne som backup for at starte proceduren fra dette punkt igen eller at forkorte en gentagelse i tilfælde mere virus skal produceres.

HCAdV transporterer store, komplekse eller flere transgener eller visse stuffer DNA kan være forstærke langsommere end forventet. Derfor er det afgørende at omhyggeligt følge præforøgelsesfasen proces, før suspensionskultur dyrkes i et rystekolbe. Hvis pre-forstærkning ikke lykkes, bør proceduren stoppes og startes forfra igen. Hvis præ-amplifikation er ineffektiv, kan yderligere passage være nødvendigt indtil mængden af ​​virus er høj nok til at inficere celler dyrket i en 3 L rystekolbe. Som et alternativ til suspensionskultur i en rystekolbe, kan 20 til 30 150 mm vævskulturskåle anvendes ved den endelige passage. Imidlertid kan det være mere tid og arbejde intensivt.

For qPCR målinger gDNA enten kan renses via nævnt her protokol eller en hvilken som helst kommercielt tilgængeligt kit til isolering af gDNA fra dyrkede celler. Ved anvendelse af kommercielt tilgængeligt kit protokollen kan afkortes én dag, men en varierende del af HCAdV genom kopier, der er til stede i inficerede celler kan gå tabt under oprensning, afhængigt af kittet anvendes. Derfor vil HCAdV genomer være lidt underrepræsenteret i følgende Q-PCR-målinger sammenlignet med fremgangsmåden fremlagt i trin 7.4).

Obtaidefinerede samlede infektiøse titere i en sidste vektor præparat afledt af en spinnerkolben området fra 1 x 10 10 til 5 x 10 11 infektiøse partikler. Denne mængde er tilstrækkelig til at udføre en lang række in vitro forsøg. Afhængig af målcellerne, også flere in vivo forsøg kan udføres. For eksempel, for at opnå tilstrækkelig leveren transduktion efter systemisk administration ønskes 1 x 10 9 infektiøse partikler.

Sammenfattende den brede celle tropisme og muligheden for at fremstille capsid-modificeret adenovirus sammen med den forbedrede sikkerhedsprofil for HCAdV vektorer blottet for alle virusgener gøre disse HCAdV vektorsystem et meget værdifuldt værktøj til genterapeutiske anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
I-CeuI New England Biolabs R0699S restriction digest
PI-SceI New England Biolabs R0696S restriction digest
T4 Ligase New Engand Biolabs M0202S ligation
SwaI New England Biolabs R0604S restriction digest
NotI New England Biolabs R0189S restriction digest
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP) New England Biolabs M0290S dephosphorylation of digested plasmids
Hygromycin B PAN Biotech P02-015 selection of CRE expressing 116 cells
DMEM PAN Biotech P04-03590    Hek293T cell culture medium
Minimal Essential Medium (MEM) Eagle PAN Biotech P04-08500 116 cell culture medium  
Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS) PAN Biotech P04-36500 washing of cells, resuspension of cells
250-ml storage bottle Sigma CLS430281-24EA infection of 116 cells grown in suspension
500-ml PP CentrifugeTubes Sigma CLS431123-36EA sedimentation of cells from suspension culture
Spinner flask Bellco 1965-61030 growth of 116 cells in suspension
Ultra Clear Ultracentrifuge tubes Beckmann Coulter 344059 density gradient centrifugation
Ultracentrifuge Beckmann Coulter density gradient centrifugation
SW-41 rotor Beckmann Coulter density gradient centrifugation
Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane VWR 132129 dialysis tubing
ready-to-use dialysis cassettes  Thermo 66383 dialysis
one shot DH10B electrocompetent E. coli invitrogen C4040-52 transformation of ligation reactions
PureYield Plasmid Midiprep System Promega A2495 midiprep
peqGOLD Tissue DNA Mini Kit  Peqlab 12-3396-02 isolation of genomic DNA
SuperFect Transfection Reagent Qiagen 301305 tranfection of 116 cells
opti MEM (10% FBS) Gibco 31985-062 transfection of 116 cells
iQ SYBR Green Supermix BioRad  170-8882 q-PCR
CFX 96 C1000 touch  Biorad qPCR machine
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol  Carl Roth A156.1 purification of DNA
Cesium chloride Carl Roth 8627.1 density gradient centrifugation
sodium acetate 99% Carl Roth 6773.2 DNA precipitation
LB medium  Carl Roth X968.3 bacterial growth medium
ethanol  99.8% pure Carl Roth 9065.5  DNA precipitation and washing
SDS 99.5% Carl Roth 2326.2 lysis  buffer
EDTA Carl Roth 8043.2 lysis  buffer
Tris-HCl 99% Carl Roth 9090.3 dialysis buffer/ lysis  buffer
glycerol 99.5% Carl Roth 3783.1 dialysis buffer
MgCl2 98.5% Carl Roth KK36.2 dialysis buffer
NaCl Carl Roth 3957.1 optional dialysis buffer
KH2PO4 Carl Roth 3904.2 optional dialysis buffer
sucrose Carl Roth 9286.1 optional dialysis buffer
Na2HPO4x2H2O Carl Roth 4984.2 optional dialysis buffer
1.5-ml tubes sarstedt 72,730,005 storage of virus preparations at -80 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benihoud, K., Yeh, P., Perricaudet, M. Adenovirus vectors for gene delivery. Curr Opin Biotechnol. 10, (5), 440-447 (1999).
  2. Crystal, R. G. Adenovirus: the first effective in vivo gene delivery vector. Hum Gene Ther. 25, (1), 3-11 (2014).
  3. Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, (24), 13565-13570 (1996).
  4. Palmer, D., Ng, P. Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Mol Ther. 8, (5), 846-852 (2003).
  5. Morral, N., et al. High doses of a helper-dependent adenoviral vector yield supraphysiological levels of alpha1-antitrypsin with negligible toxicity. Hum Gene Ther. 9, (18), 2709-2716 (1998).
  6. Muruve, D. A., et al. Helper-dependent adenovirus vectors elicit intact innate but attenuated adaptive host immune responses in vivo. J Virol. 78, (11), 5966-5972 (2004).
  7. Ehrhardt, A., et al. A gene-deleted adenoviral vector results in phenotypic correction of canine hemophilia B without liver toxicity or thrombocytopenia. Blood. 102, (7), 2403-2411 (2003).
  8. Cots, D., Bosch, A., Chillon, M. Helper dependent adenovirus vectors: progress and future prospects. Curr Gene Ther. 13, (5), 370-381 (2013).
  9. Mizuguchi, H., Kay, M. A. Efficient construction of a recombinant adenovirus vector by an improved in vitro ligation method. Hum Gene Ther. 9, (17), 2577-2583 (1998).
  10. Mizuguchi, H., Kay, M. A. A simple method for constructing E1- and E1/E4-deleted recombinant adenoviral vectors. Hum Gene Ther. 10, (12), 2013-2017 (1999).
  11. Ehrhardt, A., Kay, M. A. A new adenoviral helper-dependent vector results in long-term therapeutic levels of human coagulation factor IX at low doses in vivo. Blood. 99, (11), 3923-3930 (2002).
  12. Jager, L., et al. A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors. Nat Protoc. 4, (4), 547-564 (2009).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics