İnsan Adenovirüs Tip 5 dayanarak Yüksek Kapasiteli Adenoviral Vektörler klonlanması ve Büyük Ölçekli Üretim

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ehrke-Schulz, E., Zhang, W., Schiwon, M., Bergmann, T., Solanki, M., Liu, J., Boehme, P., Leitner, T., Ehrhardt, A. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (107), e52894, doi:10.3791/52894 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Gen terapötik uygulamalar için, viral proteinlerin tanımlanması, transgen tarafından ya gelen viral proteinler kaynaklanan sitotoksik ve immünojenik yan etkileri önlemek için büyük bir önem taşımaktadır. Adenovirüs vektörleri (AdV), yaygın olarak transgen ekspresyonu 1,2 etkisini araştırmak için hücreler, çok çeşitli yabancı DNA'nın için kullanılır. AdV en gelişmiş versiyonu tüm viral kodlama dizilerinin 3,4 ve böylece düşük immünojenikliğe ve düşük toksisite 5-8 ile birlikte 35 kb bir ambalajlama kapasitesi sunan yoksun yüksek kapasiteli adenovirüs vektörleri (HCAdV) ile temsil edilir. Sahip oldukları yüksek paketleme kapasitesi tek bir vektör doz kullanılarak büyük veya çok sayıda transgenlerin dağıtılmasına izin. Bu nedenle, araştırma toplum için değerli bir araç temsil etmektedir.

Bunun aksine, VEC birinci veya ikinci kuşak AdV kolayca ticari kitler kullanılarak üretilebilir erken gende, E1 ve / veya E3 yoksun içintor HCAdV genomu yapımı ve virüs üretimi daha karmaşıktır. HCAdV genomlarının yapımı için sistem, bütün viral kodlayıcı sekansların ve mekik plazmidinin pHM5 9-12 yoksun bir HCAdV genomu taşıyan plazmid pAdFTC dayanmaktadır. Kadar 14 kilo bazların (kb) ilgi duyulan herhangi bir gen çoklu klonlama bölgesini tanıma ile takviye edildiği mekik vektörü pHM5 klonlanabilir / homing endonükleazlar siteleri yaran Sce I ve I-Ceu I. PI Bu nedenle, ilgi konusu bir klonlanmış genin üst üste PI Sce I ve I-I Ceu plazmid pAdFTC içinde ihtiva HCAdV genomunda bulunan, aynı restriksiyon sitlerine sonra yönlendirilmiş sokulması için digests serbest bırakılabilir. PAdFTC olarak PI Sce I ve I-CEU I sitesi yarığa arasında bulunan transgen yerleştirme sahası stuffer DNA ve 5 've 3' ters terminal tekrarları genom paketleme için gerekli kodlama yapmayan adenoviral sekansından (ITR) tarafından kuşatılırbiter ve 5'ITR bölgesinin paketleme sinyaline akım aşağı hem de. Ek stuffer DNA virüs üretimi sırasında etkin bir paketleme sağlamak için 27 ile 36 kb arasında değişen nihai HCAdV genomunun en uygun boyutu sağlar. PAdFTC (sokulan transgenin boyutuna bağlı olarak) 45 kb olan büyük bir plasmid ve nispeten uzun DNA tanıma mevkileri ile homing endonükleazlar kullanım olduğu bağlanması güçlü bir DNA, çok sayıda temizlik adım pHM5 gelen transgenin transferi sırasında gerekli olan sergileyen pAdFTC için. Kesme kuvvetleri kaçınarak dikkatli kullanım tavsiye edilir.

HCAdV genomunun ITRler 5'ITR yukarı doğru doğrudan doğruya bulunur ve 3'ITR 12 alt baş Not I sınır enzimi tanıma bölgeleri tarafından takviye edilir. Bu nedenle, HCAdV Not I HCAdV üretici hücre hattı viral genomun daha sonra transfeksiyonu için sindirimi ile serbest bırakılabilir. Not sınırlama enzimi kullanımı değil ben rel içinplazmid pAdFTC viral genomun kolaylığı eklenen transgen Not I DNA tanıma sitelerinin yoksun olduğunu gösterir. HEK293 hücre bazlı üretici hücreler (116 hücreleri) kararlı bir şekilde Cre rekombinaz ifade eder. Virüs amplifikasyonu için 116 hücre trans-3,4 replikasyon ve paketleme için gerekli olan tüm AdV genlerin temin Bir yardımcı virüs (HV) ile birlikte enfekte edilir. HV 116 hücrelerinde 4 olarak ifade edilmiştir Cre rekombinaz virüs amplifikasyonu sırasında uzaklaştırılır floxed paketleme sinyali ile bir birinci kuşak AdV olup. Bu, sağlam bir ambalaj sinyalini içeren, ağırlıklı olarak HCAdV genomları kapsül içine alınır sağlar.

HCAdV Ön amplifikasyon doku kültürü çanakları içinde yüzeyler üzerinde büyümüş 116 hücreleri seri pasajlama aşamaların uygulanması ile gerçekleştirilir. Her geçiş sonrasında viral partiküller üç ardışık dondurma-eritme aşamaların uygulanması ile enfekte olmuş hücrelerden salınırlar. Hücrelerin sayısını artan her geçiş ile enfekte olanÖnceki geçit hücre lizatı 1/3. Son ön amplifikasyon aşaması, büyük ölçekli amplifikasyonu için, dönen bir şişede süspansiyon içinde yetiştirilmiş üretici hücrelerin enfeksiyonu için kullanılır son olarak lizata. Viryonlar 4,12 gradyan sezyum klorür yoğunluğunda ultrasantrifüj gerçekleştirerek süspansiyon hücrelerinden saflaştırılır. Bu prosedür ile, boş parçacıklar ve tam olarak monte parçacıkları iki farklı bantlar ayrılır. Ayrıca HCAdV konsantre ikinci bir sigara kademeli ultrasantrifügasyon adımı gerçekleştirilir parçacıklar. Daha sonra elde edilen bant HCAdV içeren toplandı ve fizyolojik tampon karşı diyaliz edilir. Nihai vektör hazırlıkları mutlak viral parçacıkların, enfeksiyöz partiküller ve HV kirlilik seviyeleri numaralarına göre karakterize edilir. Mutlak viral parçaları viral partikülleri parçalama ve 260 nm'de absorbans ölçülerek ve kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) 12 gerçekleştirilerek belirlenebilir. Pur enfektivitesiified virüs parçacıkları enfekte olmuş hücrelerde 3 saat enfeksiyon sonrası içinde mevcut qPCR ölçüm HCAdV genomlarının belirlenebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Plazmid pAdFTC dayalı Rekombinant HCAdV Genomlarının 1. İnşaat

Not: Tüm plazmidler önce 11,12 açıklandığı ve istek üzerine temin edilir oylandı. Klonlama prosedürü şematik olarak Şekil 1 'de gösterilmiştir.

  1. PHM5-GOI oluşturmak için, seçilen bir klonlama stratejisi kullanılarak, transfer plazmidi pHM5 içine promotör ve poliadenilasyon sinyali (pA) da dahil olmak üzere ilgili bir geni (GOI) klonlama.
    Not: pAdFTC nispeten büyük bir plazmid olduğu için, klasik bir plazmid hazırlama protokolleri silika membranlanna dayalı ticari plazmid saflaştırma kitleri kullanılarak plazmid DNA Sheering önlemek için önerilir. I- Ceu I ve PI -Sce şiddetle DNA'ya bağlanmasını ve sindirilmiş DNA'nın elektroforetik hareketliliği değiştirin. Bu nedenle, bir fenol-kloroform ekstraksiyonu ve EtOH çöktürme (1.3 adım a), agaroz jel elektroforezi gerekli olacaktır.
  2. HSH özetini 20 ug100 ul toplam hacim içinde 37 ° C sıcaklıkta 3 st için I-CeuI (10 U) 5-GOI ve pAdFTC 10 ug (~ 2.8 kb + GOI ORF sekansı ve • 31kb sırasıyla) plazmidler doğrusallaştırılması için.
  3. Etanol (EtOH) çökeltme 13, ardından fenol-kloroform ekstraksiyonu kullanılarak doğrusallaştırılmış plazmidler arındırın.
    1. Kloroform: 100 fenol ul ekle izoamil alkol ve tüpü birkaç kez ters yüz edilerek yavaşça karıştırın. 15.000 x g'de 2 dakika süre ile santrifüje.
    2. , Yeni bir tüpe transfer süpernatantı sodyum asetat, 20 ul (pH 5, 3 M) ve buz 400 ul soğuk EtOH (% 99.8) ekleyin ve kuvvetli bir şekilde süspansiyon karıştırın. 15.000 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj.
    3. Süpernatantı, 15.000 x g'de 2 dakika süre ile 300,% 70 EtOH ul ve santrifüj ekleyin. Ardından süpernatant ve hava-kuru DNA pelet çıkarın. DH 2 O. 10- 20 ul pelet çözülür O çözeltide DNA elde etmek zor olacak gibi, çok uzun değil kuru DNA pelet yapın.
  4. Digest I-Ceu I pHM5-GOI ve adım 1.3 pAdFTC plazmidi) -digested 50 ul toplam hacim içinde 37 ° C'de sınırlama enzimi PI -Sce I (10 U) en az 3 saat ya da O / N ve daha sonra I saflaştırmak -CeuI ve PI -Sce I (adım 1.3) EtOH çökeltme izlenmiş ve fenol-kloroform ekstraksiyonu kullanılarak plazmidler ile sindirilmiş. Nükleaz ücretsiz dH 2 O 20 ul DNA çözülür
  5. Ayrı pHM5 plazmid omurgası (2,8 kb) ile bir preparatif agaroz jeli üzerinde (adım 1.4) GOI ticari bir jel-ile GOI jel saflaştırılması ve temizleme kiti ise PCR. Özetle temsili bir agaroz jel Şekil 2A'da gösterilmiştir.
  6. Fosforilatı I- Ceu I ve PI -Sce pAdFTC I ile sindirilmiş 25 ul toplam hacim içinde 37 ° C sıcaklıkta 1 st için dana bağırsağı alkalin fosfatazı CİP (10 U) ve fenol-kloroform ekstraksiyonu ve daha sonra EtOH ile fosforik asitten arındırılan plazmid pAdFTC saflaştırılması (Aşama 1.4) precipitation (adım 1.3). Nükleaz ücretsiz dH 2 O 20 ul DNA Zehir
  7. Dijestleri eksiksiz ve beklenen parçalarının boyutları (doğru olup olmadığını ~ doğrusallaştırılmış pAdFTC 31 kb analiz etmek için (adım 1.6) defosforile pAdFTC plazmid ve (1.5 adım) saf GOI parçasının bir böleni ile analitik jel elektroforezi gerçekleştirme ).
    Not: Goa boyutu transgen ekspresyon kasetinin büyüklüğüne bağlı olarak değişkendir. Daha sonra ligasyon için ilgili parçalarının görece konsantrasyonlarının tahmin edilmesi. Saflaştınldı parçalarının temsili bir agaroz jel Şekil 2B'de de gösterilmiştir.
  8. 400 U T4 DNA ligazı ve 1 eklemek için vektörün bir mol oranı kullanılarak 20 ul bir toplam hacim içinde Bağlanma tepkimesinin ayarları: 3.
    NOT: Şekil 2B'de gösterildiği agaroz jeli ile uyumlu olarak genellikle, 6-il vektörüne 2- 20 ul bir toplam hacim içinde 8- ila 12 ul ligateyerleştirin ve 400 U T4 DNA ligaz. DNA konsantrasyonu çok sayıda fenolizasyon aşamalarından sonra genellikle düşük olduğu için 20 ul nihai hacme ulaşmak için ek bir H2O ilave edilmesi gerekir, böylece mümkün olduğunca fazla DNA kullanılır. EtOH çökeltme (adım 1.3), ardından fenol-kloroform ekstraksiyonu yerine, daha sonra 16 ° de CO / N oranında bağlanır ve.
    1. Nükleaz serbest dH 2 O 15 ul DNA Zehir ve 20 ul bir toplam hacim içinde 25 ° C 'de 2 saat süre ile sınırlama enzimi SwaI (10 U) ile saflaştırılmıştır ligasyon reaksiyonu sindiremez. Daha sonra konsantre ve EtOH çökeltme (adım 1.3), ardından fenol-kloroform ekstraksiyonu gerçekleştirerek, DNA arındırmak. Nükleaz ücretsiz dH 2 O 10 ul DNA Zehir
  9. Saflaştırılmış SWA 2 ul Transform Ben DH10B içine elektroporasyon ile ligasyon ürünü sindirilmiş ya da DH5α E. elektrouyumlu E. coli ve amfisilin içeren LB 37 ° C'de 16 ila 24 saat için seçim klonlarPlakalar (50 mg / ml ampisilin). 5- 10 klonları seçip fenol-kloroform ekstraksiyonu ve daha sonra EtOH çökeltme (adım 1.3) de 13 ve ardından alkalin liziz kullanılarak plazmid DNA mini preparatları.
  10. DNA fragmanlarının boyutunu kontrol etmek için agaroz jel elektroforezi ile ve ardından plazmid mini preparatlar analitik özetini gerçekleştirin. Önerilen sınırlama enzimleri, örneğin I Ceu I ve PI Sce I ekleme, Spe I ve Hinc II (Şekil 2C) serbest bırakmak için bulunmaktadır.
  11. Amfisilin içeren LB ortam maddesi doğru bir klon yükseltin (50 mg / ml ampisilin) ​​ve herhangi bir ticari olarak mevcut plazmid saflaştırma kiti kullanılarak bir midibüsleri veya maksi plazmid hazırlama gerçekleştirin.

Yapımcı Hücre Hattı 116 pAdFTC Plazmid ve HCAdV Vektörleri Preamplification gelen HCAdV-genom 2. Yayın

  1. Aşama 1,11 klonlanan GOI içeren pAdFTC tabanlı adenoviral üretimi plazmid) içinde 20 ug Digesttoplam> 2 saat süre ile 37 ° C 'de Not I (20 U) kullanılarak 100 ul hacim ve yerine fenol-kloroform ekstraksiyonu iki kez EtOH çökeltme izlenmiş. 20- 30 ul steril dH 2 O çözülür
  2. Jel elektroforezi ile 1:10 seyreltilmiş sindirilmiş pAdFTC-GOI-DNA'nın bir kısım edin. Goa, HCAdV genomuna (boyut: 28- 36 kb) bir ikinci DNA fragmanının boyutuna bağlı olarak bir 9 kb plazmid omurgası için fragmanı ve, tespit edilebilir.
    Not: Ben değil sindirmek temsili bir örneği Şekil 2D görüntülenir. Doğrusal hale getirilen DNA birkaç hafta boyunca 4 ° C'de veya -20 ° C'de birkaç gün muhafaza edilebilir.
  3. Protokol ile devam etmeden önce, yardımcı virüsü AdNG163R-2 4 amplifiye edilmiş olduğundan emin olun.
    Not: pAdFTC türetilmiş HCAdV vektörleri ile transfekte hücreler Biyogüvenlik Seviyesi 2 (BSL-2), uygun çevreleme ve atık işleme kullanın lütfen olarak sınıflandırılan genetiği değiştirilmiş organizmalarBSL-2 laminer akış davlumbaz altında kişisel koruyucu donanım ve çalışmaları dahil olmak üzere önlemler.
  4. MEM Kartal ortamı içinde kültür 116 hücreleri,% 10 FBS ve higromisin B (ug / ml 100 ug) ile takviye edilmiştir. (Geçit 10 altında) Tohum düşük geçiş da 50-% 80 konfluent ertesi gün ulaşacak şekilde transfeksiyondan önce 60 mm doku kültürü çanağı bir günde 116 hücreleri (0.4x 10 6 hücre).
  5. Örneğin kalsiyum fosfat transfeksiyonu veya diğer ticari olarak temin edilebilen transfeksiyon reaktifleri (Şekil 3A) ve yöntemleri kullanarak 116 hücrelerine aşama (2,1) için linearize HCAdV genomu transfekte. 16- 18 saat post-transfeksiyon, dikkatli bir şekilde hücre başına (konfluent yana HV AdNG163R-2 4 5 nakleden birimleri uygulanması (TU) ile hücrelerin 3 ml ekleyin, taze ortam (MEM,% 5 FBS) orta kaldırmak ve enfekte 60 mm doku kültürü çanak ~ 3.2x 10 6 hücre içeren) HV ~ 1.6x 10 7 TU ekleyin.
    1. Yavaşça için enfeksiyon sonrası ilk bir saat içinde çanak her 20 dakikada hareketEşit HV dağılımını sağlamak. 37 ° C 'de, enfekte olmuş hücrelere yetiştirmek ve% 5 CO2. Virüs replikasyonu neden etkili bir virüs amplifikasyon sitopatik etki (CPE) durumunda gözlemlenebilir olan (hücreler yuvarlanır ve gevşek bağlı veya doku kültürü çanak ayrılır) post-infection.If CPE görülmektedir 48 saat önce HV miktarı vardır azaltılabilir. CPE sonra başlar, daha fazla yardımcı virüs kullanılmalıdır.
  6. Kültür ortamı kullanılarak kültür kaplarına hücreler kapalı kızarma ile süpernatant 48 saat sonrası enfeksiyon dahil Hasat hücreleri. Kendi kültür ortamı içinde süspansiyon haline hücreler, pasajı 0 (P0) olarak adlandırılır. Iki fraksiyon Böl P0.
    1. Ayrılan hücreler, 0.5 ml 2.000 x g'de 3 dakika boyunca hücrelerin aşağı spin ve hücre topağından orta kaldırmak kaynaktan, daha sonra büyütme işlemi qPCR göre analiz için genomik DNA (gDNA) izole etmek için kullanılmıştır. Daha sonra işlenene kadar -20 ° C'de saklayın hücre topakları.
    2. 2.5 Gönderenmüstakil hücrelerin mi kendi orta üç ila dört kez resupended hücreler (sıvı azot -80 ° C'de ya da) dondurulması ve (37 ° C su banyosunda oda sıcaklığında ya da) eritilmesi ile viral partikülleri serbest bırakın. Bu fraksiyon P0 denilen lizat fazladır.
  7. FBS (% 10) ve higromisin B (100 ug / ml) ve HV ile takviye edilmiş MEM-ortamı kullanılarak 90-% 95 konfluansa kadar büyütülür 116 hücreleri ile doku kültür kaplarına sağlanması, aşağıdaki adımları pasajlama için kullanılabilir.
  8. 60 mm doku yana hücre (başına 2 TU uygulanması HV ekleyin 3,5 ml'lik bir nihai hacme, önceki geçiş (aşama 2.6.2) için lizat, 2.5 ml taze ortam (MEM,% 5 FBS) içinde 1 ml karıştırın 90-% 95 konfluansa kültür çanağı ~ 3.2 x 10 6 hücre içeren) HV ~ 6.4x 10 6 TU ekleyin. (Şekil 3B). Dikkatle 116 hücre 60 mm çanak orta kaldırmak ve hücrelere virüs karışımı ekleyin. Adımı yineleyin 2.6) - 2.8) iki kez pas lizatları elde etmek içinyaşları P1 ve P2.
  9. ~ Içeren P2 lizat 2.5 ml 17,5 ml yeni, ortam (MEM,% 5 FBS) karıştırın ve 80-% 100 konfluansa bir 150 mm doku kültürü çanağı yana hücre (başına 2 TU uygulanması HV ekleme 2x 10 7 Hücreler,) + HV 4x 10 7 TU ekleyin. 116 hücre, 150 mm'lik çanak Ortamı çıkarın ve viral karışımı ile hücreleri enfekte etmektedir. 37 ° C 'de, enfekte olmuş hücrelere yetiştirmek ve% 5 CO2.
  10. Gibi adım 2.6'da açıklanana 48 saat enfeksiyon sonrası hasat hücreleri) geçişi P3 (Şekil 3B) elde edildi.
    1. Adımı yineleyin 2.6) 1.
    2. Resupended hücrelerden P3 bırakma viral parçacıkların kalan 19.5 ml den üç dört kez dondurma ve çözme ile. Bu fraksiyon P3 denilen lizat fazladır.
      Not: yeterince güçlendirilmiş kadar bazı vektörler sonunda 150 mm yemekleri ek pasajlar gerekebilir. Bu nedenle preamplıfikasyon sürecinin etkinliği seri geçiş sırasında izlenmesi gerekenyaşlanma. Bölüm 3 (ayrıca bkz, Şekil 4A) 'de tarif edildiği gibi büyütme işlemi qPCR dayalı analiz gerçekleştirilebilir. Yeşil floresan proteini (GFP) için bir ekspresyon kasetini taşıyan HCAdV Ön amplifikasyon kolayca floresan mikroskop (Şekil 4B) ile GFP flourecscent sinyalin gözlemlenmesi ile değerlendirilebilir.

Kantitatif-Real Time PCR (qPCR) ile Amplifikasyon Sürecinin 3. İzleme (aynı zamanda Şekil 4A).

  1. 2.10) kültür hücrelerinden gDNA izolasyonu veya seçtiğiniz başka bir yöntem için herhangi bir ticari DNA izolasyon kiti kullanılarak - preamplifaction (2.6 adımlar) her geçit hücre pelet gelen gDNA'sından izole edin. Optimal PCR sonuçları için mümkün olduğunca taze olarak gDNA'sından kullanın. Aksi takdirde gDNA sonraki kullanıma kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
  2. Standart bir eğri 10 1 kullanılarak oluşturulabilir qPCR analizi ile ilgili geçiş hücrelerinde mevcut HCAdV genomlarının sayısını belirlemek için, </ sup> - 10 HCAdV genomu içinde ihtiva GOI taşıyan bir plazmidin 9 kopya.
  3. HCAdV genomunda ihtiva Goa için özel primerler 400 nM kullanılarak qPCR uygulanması P0- P3 (aşama 2.6- 2.10) için gDNA aynı miktarda analiz eder. İlgili qPCR kimyasalların qPCR takip üreticinin talimatlarına yürütülmesi için. Şöyle qPCR Set programı: Ön inkübasyon 95 ° C de 10 dakika, 10 sn için 95 ° C 40 döngü amplifikasyon, 15 sn için 60 ° C 55- ve 20 sn için 72 ° C. Standart eğrinin temelinde reaksiyonda HCAdV genomlarının sayısı interpolasyon edilebilir.

Askıya büyüyen 116 hücrelerinde HCAdV Vektörler 4. Büyük Ölçekli Büyütme

  1. 3 l spinner kültürü şişesi (Şekil 3B) içerisine% 10 FBS ve higromisin B (100 ug / ml) ile desteklenmiş önceden ısıtılmış (37 ° C), taze MEM 900 ml ilave edilir.
  2. 1 ile en az 10 ayrı ayrı 150 mm doku kültürü kaplarından orta çıkarın16 hücreleri 90-% 100 konfluansa büyütüldü ve 10 ml hücrelerini yıkamak, taze, önceden ısıtılmış (37 ° C) MEM FBS (% 10) ve serolojik bir pipet kullanarak higromisin B (100 ug / ml) ile takviye edilmiştir. Yukarı Pipet ve aşağı birkaç kez homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek. Zaten) aşama 4.1 900 ml içeren dönen şişeden doğrudan hücreleri aktarın.
    Not: olumsuz süspansiyon hücrelerinin büyümesini etkileyebilir olarak tripsin / EDTA kullanmayın. Ortamının alınmasından sonra, hemen spinner flask içine hücreleri aktarın. Bir seferde en fazla iki doku kültürü yemekleri dokunmayın. Uzun bekleme süresi daha zor taze medya ekledikten sonra doku kültürü çanak hücreleri kopuk olacaktır.
  3. 37 ° C'de 24 saat boyunca bir doku kültür inkübatörü içinde bir manyetik karıştırıcı ile ilgili en uygun hücre büyümesi inkübe spinner flask sağlanması ve% 5 CO2 için. Cam yüzeylere hücrelerin yapışmasını önlemek için 70 rpm'ye manyetik karıştırıcı ayarlayın. Spinner kültürü şişesine yetiştirilen hücreler canlı olup olmadığını ve yeterli miktarda büyümeye olup olmadığını incelemek için spinner kültürü şişesi hücre büyümesini izleyin. 60 mm doku kültürü tabağına biyoreaktör taze bir sıvı transfer 2 ml ilave edilmeden önce her zaman. Mikroskop altında hücre morfolojisi uyun.
    Not: kültür ortamı yüzer topaklar hücreler uygun büyüme ve canlılığı (ayrıca bkz Şekil 4C) işaret etmektedir. 24 saat sonra onlar doku kültürü çanak yüzeyinde koloniler oluştururlar. 30-% 50 izdiham optimum yoğunluğunu gösterir.
  4. 24 saat spinner kültürü şişesi kurduktan sonra higromisin B (100 ug / ml) ile desteklenmiş taze ortam 500 ml (MEM,% 10 FBS) ilave edin. 24 saat sonra bu adımı tekrarlayın.
  5. 72 saat santrifüj kültürünün kurduktan sonra, hücre süspansiyonu, 3 L'lik bir toplam hacim içinde elde edilen higromisin B (100 ug / ml) ile, taze MEM ortamında (% 10 FBS) 1,000 ml ilave edin.
  6. 24 saat sonra, av ulaşanoda sıcaklığında 500 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleme ile üç litre, hasat 116 Süspansiyon hücreleri olume. Süpernatantı atın. Doku kültürü kaputun altında boşaltılmış spinner kültür şişesi bulundurun.
  7. Taze MEM'de süspanse hücre topakları homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için aşağı yaklaşık 8- 10 kez yukarı pipetleme ve% 5 FBS ile desteklenmiş. Ortamının hacmi Aşama 2,10) 2 olup lizat bağlıdır. 1 (19.5 ml, adım 4.8). seçeneği a) 'ya aşama 5,9 den HCAdV saflaştırılmış viral stoğu) 2. (viral titresi bağlı olarak süresi birkaç ul, adım 4.8) 2., isteğe bağlı b) hücrelerin enfeksiyonu için kullanılır. 150 ml 'lik bir toplam hacim kullanın.
    1. Seçenek a: steril manyetik karıştırma çubuğu ile veya 250 ml'lik bir küçük ölçekli, dönen bir şişede ile donatılmış 250 ml'lik bir saklama şişesine P3 (birincil amplifikasyonu) aşama 4,8 transfer hücreleri) lisatı ile 116 süspansiyon hücrelerinin enfeksiyonu için olan hücreleri co-enfekte P3 (adım 2.10.2) ve hücre başına HV 2 TU lizat içindeki virüs. 3x bir yoğunluğa varsayarsak10 5 hücre ml başına toplam hücre sayısı 9x 10 8 hücreleri. Böylece HV 1.8x 10 9 TU ekleyin.
    2. Seçenek b: saflaştınlmış viral stok ile 116 süspansiyon hücrelerinin enfeksiyonu için, steril manyetik karıştırma çubuğu ve 250 ml küçük ölçekli dönen şişeden ile donatılmış 250 ml'lik bir şişeye aşama depolama 4,8 transfer hücreleri) 100 viral partikül hücreleri co-enfekte (adım 5.9 dan itibaren) eskiden saflaştırılmış HCAdV 2 hücre başına.). Saflaştırılmış HCAdV ve HV 1.8x 10 9 TU, (aşama 6 260nm'de absorbans ile ölçüldü) Bu nedenle, fiziksel titreye uygun olarak 9 x 10 10 VP ekleyin.
  8. 60 rpm'de 2 saat boyunca CO2 37 ° C'de doku kültürü inkübatörü içinde, bir manyetik karıştırıcı üzerinde sep 4.8.1) ya da 4.8.2) hücre-virüs Karışımı karıştırınız ve% 5. Depolama şişesi tamamen hava dolaşımına izin kapalı olmadığından emin olun.
  9. 2 saat sonrası enfeksiyon 3 l spinner kült haline geri hücre-virüs karışımın toplam hacmi aktarınure şişe ve 48 saat sonra 37 ° C'de ve% 5 CO2 doku kültürü kuluçka makinesi içinde 2 L 'lik bir toplam hacme kadar% 5 FBS ile desteklenmiş taze önceden ısıtılmış (37 ° C) MEM ortam 1850 ml ekleyin ve inkübe 70 rpm.
  10. 500 ml santrifüj tüplerine oda sıcaklığında 890x g'da 10 dakika boyunca santrifüj ile hasat hücreleri. Ortamı çıkarın ve DPBS 28 ml 'lik bir toplam hacim içinde tekrar süspansiyon pelet hücreleri. Homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek aşağı yukarı pipet ve. Süspansiyon, donmuş emin sıvı azot ya da -80 ° C'de hücre virüs süspansiyonu dondurun. Virüs arıtma başlangıç ​​kadar -80 ° C 'de hücre virüs süspansiyonu saklayın.

5. Arıtma ve HCAdV Diyaliz

  1. , Sezyum klorür (CsCl) geçişlerini viral lizat hazırlanması 37 ° C dört kez bir su banyosu içinde, sıvı azot ve çözülme adım 4,11 hücreden virüs süspansiyonu) dondurmak için.
  2. R 8 dakika boyunca 500 xg'de viral lizat santrifüjT ve HCAdV ihtiva eden süpernatan toplamak.
  3. Ultrasantrifüj ve 31,25 g (1,35 g / cm 3), 33.5 g (1.5 g / cm3 için) CsCl çözeltiler gibi follows.Weigh 37,5 g hazırlamak için (1.25 g / cm3) CsCl tozu sırasıyla ve dolgu dH 2 O 25 ml kadar.
    1. Çözelti kadar karışması sağlandı açık ve steril filtreyi çözümleri olur. Nihayet her çözeltinin 1 ml kaldırmak ve yoğunluğu doğru Hava kontrol etmek için ince bir ölçekte tartın. 1ml sırasıyla 1.5 g, 1.35 ve 1.25 gr ağırlık gerekir.
    2. Yoğunluğu çok yüksekse, steril dH 2 O küçük hacimleri (ul) adım adım ilavesiyle ayarlamak DH 2 O eklendikten sonra tekrar Yoğunluklu ölçün. Gerekirse daha fazla dH 2 O ekleyin
    3. Yoğunluk doğru kadar işlemi tekrarlayın. Yoğunluğu çok düşükse, CsCl tozu az miktarda eklenmesi ile ayarlayın. Steril filtre tekrar ve yoğunluğunu kontrol edin. Yoğunluğu çok yüksekse, eklenti ile ayarlamakg dH önce açıklandığı gibi 2 O. Yoğunluk hala çok düşük eklemek mor CsCI, steril filtre onu tekrar yoğunluğunu kontrol edilirse. Yoğunluk doğru kadar işlemi tekrarlayın.
  4. Altı açık ultrasantrifüjdeki tüplerde CsCI adım geçişlerini hazırlayın. Dikkatle yavaş yavaş, aşağıdaki düzen ile tüplerin içine CsCl çözümler pipetle: 1.5 0.5 ml g / cm3 CsCI çözeltisi, 1.35 ml 3 g / cm3 CsCl çözeltisi ve 1.25 ml 3,5 g / cm 3 CsCl çözeltisi (Şekil 2C) .
  5. Kaplama ~ 1,25 g / cm3 CsCl tabakanın üzerine adım 5.2 temizlenir vektörü süpernatan 4.5 mi). Santrifüj boş parçacıklar ve hücreden virüs partikülleri içeren ayrı HCAdV-genom yavaş hızlanma ve yavaşlama ile 226.000 xg (35,000 rpm) en az 2 saat 12 ° C'de rotor (SW-41) bir salıncak dışarı kullanarak bir ultrasantrifüjdeki geçişlerini enkaz.
    NOT: üstündeki hücre enkaz kalıpları optimal koşullar altında bir yaygın banttüpler. İki Aşağıda beyaz şeritler görülebilir. Alt bant HCAdV (Şekil 2C ve 5A) eşittir oysa üst bant boş parçacıklar içerir.
  6. Dikkatle Hücre kalıntılarının boş parçacıkların tabakaları kaldırmak ve steril bir 50 ml tüp içine temiz bir pipet ucu ile her bir tüpe transfer virüsü, alt bantların 1 ml toplar. G Toplanan virüs parçacıklarına / cm 3 CsCl çözümü ve iyice karıştırın 1,35 24 ml ekleyin.
  7. 1.35 g / cm bir ultrasantrifüjdeki 12 ° C'de 226.000 xg (35,000 rpm) ve üst santrifüj O / N (18- 20 saat) 3 CsCl-virüs çözümü rotor bir salıncak dışarı kullanarak (SW-41 ile santrifüj tüpleri doldurmak ) Yavaş hızlanma ve yavaşlama ile.
  8. Belirgin alt bandında bulunan HCAdV toplayın. Potansiyel bir üst bant boş parçacıklar pipet kullanarak üst üst katmanlarını kaldırmak içerdiğinden Sonra alt bant usi take away (Şekil 2C ve 5B bakınız)bir pipet ng.
  9. Tampon değişimi için toplandı virüs partikülleri Dialyze.
    1. Uzunluğu yaklaşık 8 cm, üç kez steril dH 2 O ile yıkayın: diyaliz tübü (50.000 MWCO) bir şerit kes. Daha sonra plastik bir kelepçe ile diyaliz tübü bir tarafına yakın ve 1 ml pipet kullanılarak tüp içinde) aşama 5,8 toplanan virüs aktarın. Boru içindeki hava kabarcıklarını önlemek ve plastik kelepçe diyaliz kapaklar ile diğer tarafta kapatın.
    2. 4 ° Cwith yavaş karıştırma 2 saat süreyle diyaliz tamponuna (10 mM Tris-HCl (pH 7,5),% 10 gliserol ve deiyonize H 2 O, 1 mM MgCl2) içinde 1 l Dialyze. 2 diyaliz tamponu l ve yavaş karıştırılarak 4 ° C'de O / N diyaliz Exchange diyaliz tamponu. Alternatif olarak, bir sucrosebuffer (140 mM NaCI, 5 mM Na 2 HPO 4 x2H 2, O, 1,5 mM KH 2 PO 4 ve 730 mM sakaroz, pH 7.8) kullanın.
    3. Adım 5.9) 2 diyaliz virüs parçacıkları toplayın. 1 ml p kullanarakipette. İstenen küçük hacimli (25- 100 ul) birden fazla alikotları hazırlayın ve -80 ° C'de saflaştırılmış virüs saklayın.

6. Ölçme Optik Yoğunluk Final HCAdV Hazırlıklar Fiziksel Titre (OD)

  1. Liziz tamponu (10 mM Tris-HCI (pH 7.5) 475 ul ile adım 5.9) 2 nihai vektörü hazırlama 25 ul seyreltilmiş, 10 mM EDTA (pH 8.0),% 0.5 SDS)), yavaşça 20 dakikada çalkalanır RT ve son olarak 15.000 x g'de oda sıcaklığında 2 dakika süreyle santrifüjlenir.
  2. 260 nm'de (A260) absorbans değerleri, genellikle düşük olduğundan, süpernatan 100 ul kullanılarak Emilim dört kez ölçülmesi ve dört ölçümün ortalama değeri hesaplanmıştır. Aşağıdaki formülü kullanarak ml başına viral parçacıkların sayısını (vp / ml -1) hesaplayın: kb içinde vp / ml -1 = (A260 ortalama) x (20) x (1.1 x 10 12) x (36 kb / HCAdV boyutu ).
    Not: Mutlak viral parçacıkların (OD titresi) tipik bir verim sonuçları, Şekil 7A'da gösterilmektedir

7. Toplam Parçacıklar, qPCR Final Vektör Hazırlama HCAdV ve YG Kirlilik Düzeylerinin Bulaşıcı Birimleri ölçülmesi. Titrasyon Prosedür A Şema Şekil 6'da gösterilen bir

  1. 6 ya da 12 gözlü doku kültür plakaları içinde Tohum HEK293 hücreleri, böylece hücreler, bir sonraki gün% 90 birleşik duruma ulaştılar. Bulaşıcı viral parçacıkların sayısını (bulaşıcı titre) belirlemek için, 1 | il ve adım 5,9 saflaştırılmış virüs 10 ul, ikinci oyuk) ile bir çok-çukurlu plakanın üzerindeki çukurların birinin hücreleri enfekte 3.
  2. Hasat hücreleri 3 saat sonrası enfeksiyon. Orta çıkarın ve tüm kuyu kapsayacak şekilde tripsin eklemek ve 3 inkübe7 ° C ve% 5 5 dakika boyunca CO2. Bir pipet kullanarak tripsin ile hücrelerini yıkayın ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 890 xg'de hücreleri aşağı doğru döndürün.
  3. DPBS 200 ul pelet hücreleri tekrar süspansiyon ve ücretsiz (non-enfektif) vektör parçacıkları çıkarmak için iyice yıkayın. Oda sıcaklığında 890 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj. Taze DPBS 200 ul supernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelletleri atın.
    Not: Bulaşıcı titreye doğru belirlenmesi için, tedavi ve kapsamlı yıkama tripsin hücre yüzeyleri olmayan tüm enfektif viral partikülleri temizlemek için çok önemlidir.
  4. Toplam viral partikül sayısı (enfektif parçacıklar olmayan enfeksiyon parçacıklar = Fiziksel titresi) belirlemek için, hasat kendi kültür ortamı, bir pipet kullanılarak ile hücrelerden yıkama Tripsinin vermeden iki kuyu HEK293 hücrelerinin enfekte olmayan.
  5. RT'de 890 x g'de 3 dakika boyunca hücreleri aşağı Spin. Orta atın ve DPBS 200 ul pelet hücreleri tekrar süspansiyon. Subsequently sırasıyla şirketinden hücrelere 1 ul ve n-bütanol HCAdV hazırlama 10 ul ekle. GDNA izolasyon ve sonraki q-PCR için aynı koşulları sağlamak için, arka plan olarak sigara enfekte hücreleri kullanın.
  6. HEK293 adımlar 7.3 türetilen hücrelerin) ve 7.5 gDNA'sından Yalıtmak)
    1. DPBS 3 sn için (aşama 7,3 ve 7,4), 200 ul içinde yeniden süspansiyon haline Vorteks Hücreler, SDS çözeltisi 200 ul ilave edin. (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM EDTA (pH 8.0),% 0.5 SDS) içinde 20 ul Proteinaz K (20 mg / ml) ve vorteks süspansiyonu 3 sn. 55 ° C'de 12- 16 saat inkübe ve yavaş yavaş sallayın. Daha sonra RNAse A 2 ul (20 mg / ml) ekleyin ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
    2. 15.000 x g'de 2 dakika süre ile izoamil alkol ve santrifüj: kloroform: fenol 350 ul ekle. Yeni bir tüpe süpernatant aktarın ve bir kez bu adımı tekrarlayın
    3. , Yeni bir tüpe transfer süpernatantı sodyum asetat, 50 ul (pH 5, 3 M) ve buz 1 ml soğuk EtOH (% 99.8) ekleyin ve süspansiyon karıştırılır. Centri15.000 x g'de 10 dakika boyunca fuge örnekleri genomik DNA: pelet.
    4. Daha sonra, süpernatant kaldırmak 15.000 x g'de 2 dakika süre ile 500,% 70 EtOH ul ve santrifüj ekleyin. Süpernatantı,% 70 EtOH 500 ul ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca sallayın. Daha sonra 15.000 x g'de 2 dakika süre ile santrifüjlenir.
    5. Süpernatantı ve hava-kuru DNA pelet çıkarın. O çözeltide gDNA'sından almak zor olacak gibi uzun bir süre değil kuru DNA pelet yapın. DH 2 O 120 ul DNA pelletini ve çalkalayarak 37 ° C sıcaklıkta yaklaşık 1 saat süreyle inkübe edin. DNA solüsyonu viskoz görünürse, 37 ° C'de birkaç saat boyunca sallayın veya ~ 1 saat boyunca 55 ° C'de inkübe edin.
  7. HCAdV genomu içinde ihtiva GOI taşıyan bir plazmidin 10 8 kopya - enfeksiyöz HCAdV parçacıklar ve mutlak HCAdV parçacıkları saptamak için, 10 1, standart bir eğri oluşturmak.
  8. Enfekte HEK293 c gDNA aynı miktarda analiz ederek toplam parçacıkları ve bulaşıcı parçacıklar belirlemeAşama 7.3) ve 7.4) için arşın qPCR HCAdV genomu içinde ihtiva Goa için özel primerler 400 nM kullanılarak uygulanır.
  9. Aşağıda belirtilen PCR programı ayarlayın: Ön inkübasyon 95 ° C de 10 dakika, amplifikasyon için 10 saniye boyunca 95 ° C 40 döngü, 10 saniye 55 ° C ve 20 sn için 72 ° C'dir. Standart eğri (aşama 7,7) temelinde, reaksiyonda adenoviral genom sayısı enterpolasyon.
  10. Aşağıdaki Formular kullanarak nihai vektör hazırlanmasında adenoviral genom sayısını hesaplayın: (HCAdV / ağırlık sayısı reaksiyonu gDNA arasında ng) x (ul ağırlığı tüm hücrelerin DNA ng enfekte çanak / hacim virüsü) .
    NOT: Mutlak ve enfektif viral parçacıkların verim için tipik aralık 1x10 7 -1x10 8 viral partiküller / ul çevresinde bulunmaktadır. Burada gösterdi on kat daha yüksek ya da daha düşük titreler, normal olarak kabul edilebilir. Yüksek titreler bir gelişme olacaktır. Mutlak HCAdV katılımı ile oranı ile ilgili olarakles enfeksiyöz HCAdV parçacıklarına deneyim mutlak HCAdV partiküllerinin yaklaşık 5 ila 10%, bulaşıcı (Şekil 7A) olduğunu göstermektedir.
  11. HV ile kirlilik seviyesini belirlemek için, HV genomunda bulunan adenoviral geç gen 3 (L3) bir kısmını yükselterek qPCR gerçekleştirmek. Standart bir eğri (aşama 7,7) oluşturmak üzere adenoviral geç gen 3 (L3) taşıyan bir plazmit kullanın.
  12. Bu reaksiyonda primerler L3 400 nM geçerli ileri 5'-AGC AGA TTA TCC GCA GTT CGA ACT GTT GG-3 've 5'-L3 ters ATA AGC TTG CAT GGT ATG GTT CAG GAT GG-3' birlikte nM 300 ile L3-spesifik probun 5'-FAM-CCA CCC TGT GTG ACC TGG TGG ACA-TAMRA 3 '.
  13. Aşağıda belirtilen PCR programı ayarlayın: Ön inkübasyon / aktivasyon 95 ° C de 10 dakika, amplifikasyon 15 saniye ve 1 dakika boyunca 60 ° C, 95 ° C 40 döngü süresince. PCR qPCR reaksiyon için master herhangi evrensel prob kullanın. Standart eğri (aşama 7,7) temelinde bölgesi sayısını hesaplamakNihai vektör hazırlanmasında bulaşıcılık HV parçacıklar. HV partiküller için tipik verimler için (Şekil 7A) bakınız.
  14. Nihayet vektör hazırlık kalitesini değerlendirmek için HV kirlilik seviyelerine HCAdV mutlak bulaşıcı parçacıkların oranı hesaplanır.
    NOT: Şimdi kalan HV küçük bir kısmı göz ardı edilemez kadar. Genellikle HV kirlilik oranının kabul edilebilir bulaşıcı parçacıklar ya da daha az ~% 5 (Şekil 7B) 'dir. Mümkün olduğunca az HV arzu edilir Tabii olarak, vektör hazırlama hayvan deneyleri için kullanılan olacak özellikle eğer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Klonlama, amplifikasyon ve HCAdV preparasyonlar saflaştırılması için Burada temsili örnekleri gösterilir. Enzim restriksiyon dijest ile bir klonlama stratejisi genel (Şekil 1) ve klonlama için temsili örnekler ve HCAdV genomunun salma (Şekil 2) temin edilmiştir. Sindirimi I PI Sce I ve I-CEU tarafından pHM5 gelen GOI-sentezleme kaseti ve daha sonra fenol-kloroform ekstraksiyonu ve EtOH çökeltme serbest bırakılmasından sonra tipik bir sınırlama modelinin (Şekil 2A) olarak gösterilmiştir (ayrıca bakınız 1.2- 1.5 adım). Tipik haliyle pHM5 plazmid omurgası ve Goa ait ekspresyon kaseti tekabül eden bir ikinci bandın karşılık gelen bir ~ 3 kb bandı görülmektedir. GOI-sentezleme kasetini ihtiva eden bandı daha sonra agaroz jelden arıtılır. Saflaştırılmış GOI-sentezleme kaseti saflaştırılmış, defosforile pAdVFTC ile birlikte bir agaroz jeli üzerinde analiz edilmiştir wDoğru boyutu doğrulamak ve daha sonra ligasyon (Şekil 2B) moleküllerin nispi miktarını tahmin etmek için PI Sce I ve I-CEU, sırasıyla I (aşama 1,7) ile parçalanmıştır olarak. Ligasyondan sonra ampisilin üzerinde seçilen I kesilmemiş pAdFTC ve daha sonra fenol-kloroform ekstraksiyonu ve EtOH çökelmesini (1.9 adım a), ligasyon ürünleri, bakteri ve klonlar dönüşen ortadan kaldırmak için özet fenol-kloroform ekstraksiyonu ve EtOH çökeltme ve Swa ve ardından (adım 1.8 bakınız) LB- agar ihtiva etmektedir. Genellikle klonlann yüzlerce onlarca 5- 10 klon plazmid DNA mini preparatlar için hazırlandığı elde edilir. Birlikte negatif kontrol (aynı zamanda 1.10 adım bakınız) olarak boş bir pAdFTC ile pozitif ve negatif klonların bir analitik Hinc II parçalamadan bir kısıtlama deseni (Şekil 2C) gösterilmektedir. Burada Pozitif klonlar, boş pAdFTC ve negatif klonlar ve 1,7 kb fragmanı görünür içinde mevcut olan bir 5 kb bant göstermeo boş pAdFTC ve negatif klonunda mevcut değildir. Bu, ilgili Goa için, bu tha klonlama başarılı olduğunu gösterir. Midiprep ile saf hale edilmiş Pozitif bir klon daha sonra pAdVFTC-Goa (aşama 2.2) GOI taşıyan HCAdV-genomu serbest bırakmak için hiç Ti ile sindirildi. Son olarak, Resim tI ist iki kez 116 hücrelerine daha sonra transfeksiyon için DNA'nın yüksek saflığın temin edilmesi amacıyla, fenol-kloroform ekstraksiyonu ve EtOH çökeltme ile arıtılmış, DNA ile sindirilmiş. Resim Ti küçük bir parçasının analizi, bir agaroz jeli üzerinde pAdVFTC-GOI sindirilmiş pAdFTC plazmid omurgası ve (GOI sentezleme kasetinin büyüklüğüne bağlı olarak) ~ kadar 36 kb büyük bir bandına karşılık gelen bir p 9 kb bant gösterir HCAdV genomuna (Şekil 2D) karşılık gelir. Amplifikasyon ve arıtma boru hattının bir bakış şematik (Şekil 3) gösterilir. Vektör ön büyütme işlemi izleme temsili örnekleri verilmiştir ( (Şekil 4A) gösterilmiştir. Vektör genomları sayısı genellikle ilk geçişleri sırasında descreases ve güçlü sonraki pasajlarda artar unutmayın. 10 6 arasında bir vektör kopya sayısı, - 10 7 15.000 başına hücre, bir 3 L spinner flask içinde, büyük ölçekli üretim için 116 hücreleri enfekte etmek için yeterlidir. HCAdV vektör genom içinde GOI bir GFP ekspresyon kaseti içeriyorsa, ön amplifikasyon işlemi (bölüm 2) aynı zamanda flüoresan mikroskobu ile izlenebilir. Her bir geçiş yolunun Örnek resimler (Şekil 4B) gösterilmiştir. GFP pozitif hücrelerin sayısı, genellikle ilk geçişleri sırasında azalır ve güçlü bir geç geçişleri artar unutmayın. GFP pozitif hücrelerin sayısı ~ 100% ulaştığında, vektör suff büyütülmüştüriciently 3 l spinner flask içinde, büyük ölçekli üretim için 116 hücreleri enfekte etmek için. Bir HCAdV içeren GFP ekspresyon kasetinin büyük ölçekli amplifikasyon işlemi, bir doku kültür tabağına dönen şişeden transfer Kültür ortamında ve hücrelerin mikroskopik analizi ile izlenmiştir. Süspansiyon kültüründe HCAdV üreten hücrelerin mikroskobik resimler (4.4 ve 4.11 aşama) (bkz Şekil 4C) sağlanmıştır. Hücreler ödemeler dengesi istatistiklerinde hücre büyümesi yeterli ve hücreleri sağlıklı olduklarını gösteren yığınlarda büyüyor unutmayın. Bu hücrelerin flüoresan mikroskopi ~% 100 kullanırken biyoreaktör ve verimli vektör üretiminde süspansiyon hücrelerinin etkili bir iletimini gösteren GFP pozitif bulunmuştur. Vektörü tanecikleri CsCI ultra-santrifüj ile orta ve 3 l süspansiyon kültürünün hücrelerinden saflaştırılmıştır. CsCl yoğunluk gradyan ultrasantrifüj kullanılarak HCAdV vektörü saflaştırma Örnek resimler (Şekil 5) gösterilmiştir. Bir sonran CsCI basamaklı bir derece kullanılarak, ilk santrifüj genellikle iki bant gözlenir. Alt bant, DNA ihtiva eden vektör parçacıklarının (aşama 5.4- 5.5) (Şekil 5A) oluşur, oysa üst bant kısmı kapsidleri boş içermektedir. Vektörü tanecikleri içeren DNA daha sonra (adım 5.6) toplandı ve vektörü tanecikleri konsantre ile ikinci bir ultrasantrifüj adımı için bir araya getirilmiştir. Bu adım genellikle son olarak sonuç diyaliz (aşama 5.7- 5.8) (Şekil 5B) için hasat edilen DNA ihtiva eden vektör partiküllerinin tek bir bant ile sonuçlanır. Dializ ürünü vektör hazırlıkları mutlak parçacıklar, enfeksiyöz partiküller ve HV kirlenme sayısının ölçülmesi ile belirlenmiştir. Titrasyon prosedürü (bölüm 6 ve 7) şematik bir planı (Şekil 6) sağlanır. Nihai vektör hazırlama karakterizasyonu için Örnek sonuçlar (Şekil 7) gösterilmiştir. Çubuk grafik olan tipik vektör parçacık numaralarını gösterirBu protokol açıklanan prosedür ile elde edilen. Vektör parçacıklarının mutlak parçacıkları numaraları optik yoğunluğa (bölüm 6), bir enfeksiyon vektörü parçacıkları ve HV kirlenme ile belirlenmiştir qPCR (bölüm 7) (Şekil 7A) ile ölçüldü. Deneyim OD titresi virüs partiküllerinin sayısını olduğundan fazla olduğunu gösterir. OD Mutlak viral partiküller q-PCR ile ölçülen enfeksiyöz viral parçacıkların 500 kat daha yüksek 20- olabilir. Her iki q-PCR (bölüm 7) ile ölçülen zaman enfeksiyon vektörü tanecikleri usally mutlak parçacıkların 10 5- ila% arasında değişir. Vektör hazırlanması için çok iyi bir kaliteye sahip ise, mutlak parçacıkların% 20'den fazla bulaşıcıdır. HV ve bulaşıcı HCAdV parçacıkları (aşama 7,14) arasındaki tipik oranı genellikle enfeksiyöz partiküller 1-5% (Şekil 7B) arasında değişmektedir. HV çoğaltma eksik olduğu gibi bu kabul edilebilir. Yine de mümkün olduğunca az YG kirlenme olarak (<bulaşıcı parçacıkların% 1) olurtercih edilebilir.

figür 1
PAdFTC içine GOI klonlanması Şekil 1. Akış Şeması. GOI pHM5 mekik plazmidinin MCS klonlanır. Plazmidler pAdFTC ve pHM5-GOI I- Ceu I ve PI Sce I ile sindirilmiş ve fenol-kloroform ekstraksiyonu ve EtOH çökeltilerek saflaştırılır. Dijeste pAdFTC plazmid defosforile oysa sindirilmiş pHM5, ilgi konusu geni (aynı zamanda 1,5 aşama bakınız) saflaştırmak için bir preparatif agaroz jel üzerine yüklenir. Daha sonra CIP ile muamele pAdFTC ile ligasyon reaksiyonu ve transgen sentezleme kaseti ayarlamak (adım 1.8) ve tamamlandıktan sonra fenol-kloroform ekstraksiyonu ve EtOH çökeltme yoluyla saflaştırılır. Fenol-kloroform ekstraksiyonu ve EtOH çökeltme izlenmiş ve ligasyon ürünün sonraki Swa I sindirimi insert olmadan pAdFTC taşıyan klonların büyümesini engeller. Siyah triaçılar sınırlama enzimi tanıma bölgelerini belirtir; gri kutular AdV5 terminalli tekrarları ters göstermektedir (ITR) Ψ işaretli beyaz kutular AdV5 paketleme sinyali göstermektedir, kırmızı bir ok promotörü gösterir yeşil kutuları (ilgi konusu genin, GOI) ifade edilecek transgen göstermektedir mavi kutular poliadenilasyon sinyali, portakal ya da mavi işaret Oklar plazmid omurgasının antibiyotik direnç genleri işaret sırasıyla. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil pAdVFTC gelen HCAdV genomun klonlama prosedürü ve serbest bırakılması için 2. Temsilcisi sonuçlar. PI Sce I ve I-I ile sindirilmiş Ceu (aynı zamanda 1.2- 1.5 adım bakınız) pHM5 den GOI-sentezleme kasetinin (A) serbest bırakılması. (B) Sce I ve I-CEU, sırasıyla I (aşama 1,7) ile sindirilmiş GOI-sentezleme kaseti ve saflaştırılmış, defosforile edilmiş pAdVFTC arıtıldı. (C) ve Goa (ayrıca 1.10 aşama bakınız) olmadan pAdVFTC klonlarının Analitik Hinc II sindirimi. Hiçbir tI sindirimi tarafından pAdVFTC-Goa dan GOI taşıyan HCAdV-genom (adım 2.2) (D) Yayın bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
. Yüksek kapasiteli adenoviral vektör amplifikasyonu ve saflaştırma Şekil 3. Şematik (A) HCAdV DNA transfeksiyonu ve yardımcı virüsü (HV) enfeksiyonu: HCAdV üretici hücre hattına GOI taşıyan Lineerleştirilmiş HCAdV genomunun transfeksiyonu (116 hücreleri [4]) ve suHV AdNG163R-2 ile enfeksiyon bsequent [4].   (B) HCAdV amplifikasyonu: ön amplifikasyon aşamasından sonra seri yeni bir doku kültür tabağına hücre lizatının aktarılması ve HV ile birlikte enfekte edilmesi suretiyle büyük ölçekli üretim, bir 3 L süspansiyon kültürü içinde gerçekleştirilir (C) HCAdV saflaştırma:. Için arıtma, virüs sezyum klorür gradyanları kullanılarak ultra santrifüj yoluyla izole edilir (D) Diyaliz. Arıtılmış HCAdV parçacıkları 2 L depolama tampon maddesine karşı diyaliz edilmiştir. HCAdV, yüksek kapasiteli adenoviral vektör; ITR, adenovirüs serotip 5 terminal tekrar ters; Ψ, paketleme sinyali; HV, yardımcı virüsü; İçişleri Bakanlığı, enfeksiyon çokluğu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4, <Br /> büyütme işlemi qPCR kullanılarak viral genomların amplifikasyonu ile ön amplifikasyon işleminin (A) Kontrol Şekil 4. Örnek sonuçlar (bakınız bölüm 3'e bakınız). (B) GOI, bir transgen olarak GFP içeriyorsa, Ön amplifikasyon işlemi fluoresan mikroskobu ile kontrol edilebilir. (C), dönen bir şişede büyük ölçekli amplifikasyon işleminin Örnek sonuçlar HCAdV kodlayan GFP için örneklendirilmiş. Sol panel dönen şişeden enfekte 116 hücre mikroskobik görüntüsünü gösterir. Kültür ortamı ve hücreler bir örneği 60 mm doku kültürü çanağı aktarılmıştır. Çoğaltılan hücrelerin yığınları görebilir olduğuna dikkat edin. Sağ panel floresan mikroskopi kullanılarak aynı resmi gösterir. Hücrelerin hemen hemen% 100 HCAdV GFP taşıyan iletilir. Için tıklayınızBu rakamın büyük bir sürümünü görüntüleyin.

Şekil 5,
CSCL degrade santrifüj sonra Şekil 5. Temsilcisi sonuçları (A) basamaklı bir derece (aynı zamanda 5.5 adım bakınız) gerçekleştirdikten sonra;.. Sürekli gradyan (ayrıca 5.7 ​​adım bakınız) sonra (B) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Titrasyon prosedürünün 6. şematik anahat rakam. Enfeksiyöz partiküller (A) Ölçüm: Çok-oyuklu bir plaka içerisinde hücreler saflaştırılmış virüs farklı hacimlerde ile enfekte ve hücre peletleri gibi toplanır (B) Ölçümü o.f mutlak parçacıklar: enfekte edilmemiş hücreler, tripsinizasyon ve santifrüjleme ile toplanır, bir çok-iyi oluşturur. Tabanda saflaştırılmış virüs ilave edilir ve genomik DNA izole sonra. Genomik DNA (C) İzolasyon. (D) kantitatif PCR (q-PCR) gerçekleştirilir viral genom kopya numaralarını ölçmek için. Bu büyük halini görmek için tıklayınız rakam.

Şekil 7,
Nihai vektör hazırlık karakterizasyonu için 7. Temsilcisi sonuçları Şekil. (A), farklı yöntemleri ile sunulan protokole göre bir vektör hazırlanması partiküllerinin mutlak sayıları. OD titre qPCR (bölüm 7) ile ölçülen optik yoğunluk (bölüm 6), enfeksiyöz titresi ve HV kirlenme ile ölçülmüştür (B)QPCRs (bölüm 7) ile ölçülen toplam bulaşıcı HCAdV parçacıklar ve YG kirlilik seviyeleri arasındaki oran. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada sunulan protokol daha önce tarif edilen prosedürlere göre 4,12 insan adenovirüs tip 5 göre HCAdV vektörlerinin saflaştırılmasına olanak tanımaktadır. PAdFTC plasmidinin içinde HCAdV genom Tüm adenovirüs genlerin yoksun olan ve 5'- ve 3'- ITR'ler ve paketleme sinyalini taşır. Bu stratejide HV AdNG163R-2 4 trans etkili bir virüs üretimi için gerekli tüm genleri içerir. Veya adeno bağlantılı virüs (AAV) vektörleri tabanlı - Bu, açık bir şekilde, birinci ve ikinci nesil ADVS veya yaygın olarak kullanılan lentivirüs (LV) outcompetes kadar 35 kb'lik ambalaj kapasiteleri sağlar. Özellikle in vivo uygulamalar için HCAdV ikinci bir avantajı birinci aksine veya ikinci kuşak ADVS bunlar sitotoksik azaltılmış seviyede ve viral proteinlerin 5-8 sentezlenmesinin neden imünojenik yan etkiler gösteriyorlar gerçektir.

Yine de burada açıklanan protokol daha fazla zaman vediğer viral gibi LV- olarak vektörlerin veya AAV-vektörlerin yanı sıra birinci ya da ikinci nesil ADVS için daha yoğun çalışıyoruz. Bir büyük engel büyük transgenlerin klonlanması ve virüs üretimi plazmid PADV-FTC sonraki transferidir. Homing endonükleazları kullanımı Sce I ve I-Ceu Mekik plazmid pHM5 gelen transgenin hassas ve yönlendirilmiş sokulmasını teklif PI, fakat güçlü yarılmış DNA yapışma bir dezavantaja sahiptir. Klonlama işlemi sırasında plasmid- ve insert-DNA hazırlarken bu nedenle bir çok fenol-kloroform temizleme adımları gereklidir. Bu nedenle, titizlikle sağlanan klonlama protokolü takip kesinlikle tavsiye edilir. HCAdV genomu klonlama Not I kısıtlama plazmid pAdFTC salınır sonra enzimi sindirimi ve daha sonra üretici hücre hattı transfekte edildi. İlk transfeksiyon verimliliği yeterli virüs amplifikasyon ulaşmak için çok önemli olduğunu unutmayın. Önemlisi, protokol birkaç adım sunarhangi prosedür takip eden adımlar başarısız durumunda yeniden başlatılabilir. Ön amplifikasyon sırasında lizatlarının üçte biri tekrar noktadan prosedürünü başlatmak için ya da daha fazla virüs üretilir gereken durumda bir tekrarı kısaltmak için yedek olarak saklanabilir.

HCAdV, büyük bir kompleks ya da birkaç transgenleri veya belirli stuffer DNA taşıyan beklenenden daha yavaş yükselterek olabilir. Bu nedenle, süspansiyon kültürü, dönen bir şişede yetiştirilir önce dikkatlice ön amplifikasyon süreci takip için çok önemlidir. Ön amplifikasyon başarılı değilse, işlem durdurulur ve yeniden baştan başlanmalıdır. Ön amplifikasyon verimsiz ise virüs miktarı, 3 L, dönen bir şişede yetiştirilen hücreler enfekte için yeterince yüksek olduğu zamana kadar, ek pasajlama gerekli olabilir. Spinner flask içinde süspansiyon kültürünün bir alternatif olarak, 20 150 ila 30 mm doku kültür tabakları son geçiş için kullanılabilir. Ancak, bu daha çok zaman ve yoğun çalışabilir.

QPCR ölçümleri için gDNA da burada belirtilen protokol veya kültürlenmiş hücrelerden gDNA izolasyonu için herhangi bir ticari olarak temin edilebilir kit ile saflaştırılabilir. Ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanılarak protokolü, bir gün kısaltılabilir, ancak enfekte olmuş hücreler içinde mevcut olan HCAdV genom kopyalarının değişen bir bölümü kullanılır kiti bağlı olarak, saflaştırma sırasında kaybolabilir. Bu nedenle HCAdV genomları adımda 7.4 sunulan yönteme göre) q-PCR ölçümleri aşağıdaki biraz yeterince temsil olacaktır.

ObtaiSon bir vektör hazırlanmasında ned toplam bulaşıcı titreleri 1 x 10 10 5 x 10 11 bulaşıcı parçacıklara bir değer değişimi şişeyi aralığında elde. Bu miktar in vitro deneylerde sayıda gerçekleştirmek için yeterlidir. In vivo deneyler, aynı zamanda, hedef hücreler üzerinde bağımlı birçok şekilde gerçekleştirilebilir. Örneğin, sistemik uygulamadan sonra yeterli bir karaciğer naklini gerçekleştirmek için 1 x 10 9 infeksiyöz gerekmektedir.

Özetle, geniş hücre tropizm ve HCAdV geliştirilmiş güvenlik profili ile birlikte kapsid modifiye adenovirüs üretmek için olasılığı tüm viral genlerin yoksun bu HCAdV vektör sistemini gen terapötik uygulamalar için son derece değerli bir araç kılmak vektörleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var olduğunu beyan ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
I-CeuI New England Biolabs R0699S restriction digest
PI-SceI New England Biolabs R0696S restriction digest
T4 Ligase New Engand Biolabs M0202S ligation
SwaI New England Biolabs R0604S restriction digest
NotI New England Biolabs R0189S restriction digest
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP) New England Biolabs M0290S dephosphorylation of digested plasmids
Hygromycin B PAN Biotech P02-015 selection of CRE expressing 116 cells
DMEM PAN Biotech P04-03590    Hek293T cell culture medium
Minimal Essential Medium (MEM) Eagle PAN Biotech P04-08500 116 cell culture medium  
Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS) PAN Biotech P04-36500 washing of cells, resuspension of cells
250-ml storage bottle Sigma CLS430281-24EA infection of 116 cells grown in suspension
500-ml PP CentrifugeTubes Sigma CLS431123-36EA sedimentation of cells from suspension culture
Spinner flask Bellco 1965-61030 growth of 116 cells in suspension
Ultra Clear Ultracentrifuge tubes Beckmann Coulter 344059 density gradient centrifugation
Ultracentrifuge Beckmann Coulter density gradient centrifugation
SW-41 rotor Beckmann Coulter density gradient centrifugation
Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane VWR 132129 dialysis tubing
ready-to-use dialysis cassettes  Thermo 66383 dialysis
one shot DH10B electrocompetent E. coli invitrogen C4040-52 transformation of ligation reactions
PureYield Plasmid Midiprep System Promega A2495 midiprep
peqGOLD Tissue DNA Mini Kit  Peqlab 12-3396-02 isolation of genomic DNA
SuperFect Transfection Reagent Qiagen 301305 tranfection of 116 cells
opti MEM (10% FBS) Gibco 31985-062 transfection of 116 cells
iQ SYBR Green Supermix BioRad  170-8882 q-PCR
CFX 96 C1000 touch  Biorad qPCR machine
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol  Carl Roth A156.1 purification of DNA
Cesium chloride Carl Roth 8627.1 density gradient centrifugation
sodium acetate 99% Carl Roth 6773.2 DNA precipitation
LB medium  Carl Roth X968.3 bacterial growth medium
ethanol  99.8% pure Carl Roth 9065.5  DNA precipitation and washing
SDS 99.5% Carl Roth 2326.2 lysis  buffer
EDTA Carl Roth 8043.2 lysis  buffer
Tris-HCl 99% Carl Roth 9090.3 dialysis buffer/ lysis  buffer
glycerol 99.5% Carl Roth 3783.1 dialysis buffer
MgCl2 98.5% Carl Roth KK36.2 dialysis buffer
NaCl Carl Roth 3957.1 optional dialysis buffer
KH2PO4 Carl Roth 3904.2 optional dialysis buffer
sucrose Carl Roth 9286.1 optional dialysis buffer
Na2HPO4x2H2O Carl Roth 4984.2 optional dialysis buffer
1.5-ml tubes sarstedt 72,730,005 storage of virus preparations at -80 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benihoud, K., Yeh, P., Perricaudet, M. Adenovirus vectors for gene delivery. Curr Opin Biotechnol. 10, (5), 440-447 (1999).
  2. Crystal, R. G. Adenovirus: the first effective in vivo gene delivery vector. Hum Gene Ther. 25, (1), 3-11 (2014).
  3. Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, (24), 13565-13570 (1996).
  4. Palmer, D., Ng, P. Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Mol Ther. 8, (5), 846-852 (2003).
  5. Morral, N., et al. High doses of a helper-dependent adenoviral vector yield supraphysiological levels of alpha1-antitrypsin with negligible toxicity. Hum Gene Ther. 9, (18), 2709-2716 (1998).
  6. Muruve, D. A., et al. Helper-dependent adenovirus vectors elicit intact innate but attenuated adaptive host immune responses in vivo. J Virol. 78, (11), 5966-5972 (2004).
  7. Ehrhardt, A., et al. A gene-deleted adenoviral vector results in phenotypic correction of canine hemophilia B without liver toxicity or thrombocytopenia. Blood. 102, (7), 2403-2411 (2003).
  8. Cots, D., Bosch, A., Chillon, M. Helper dependent adenovirus vectors: progress and future prospects. Curr Gene Ther. 13, (5), 370-381 (2013).
  9. Mizuguchi, H., Kay, M. A. Efficient construction of a recombinant adenovirus vector by an improved in vitro ligation method. Hum Gene Ther. 9, (17), 2577-2583 (1998).
  10. Mizuguchi, H., Kay, M. A. A simple method for constructing E1- and E1/E4-deleted recombinant adenoviral vectors. Hum Gene Ther. 10, (12), 2013-2017 (1999).
  11. Ehrhardt, A., Kay, M. A. A new adenoviral helper-dependent vector results in long-term therapeutic levels of human coagulation factor IX at low doses in vivo. Blood. 99, (11), 3923-3930 (2002).
  12. Jager, L., et al. A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors. Nat Protoc. 4, (4), 547-564 (2009).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics