إعداد سطحي والفعال للGlycopolymers نيون ثلاثي مكون عبر تسيطر عليها RAFT البلمرة

1Department of Biochemistry, University of Missouri, 2Department of Biological Sciences, University of Missouri, 3Department of Molecular Microbiology & Immunology, University of Missouri, 4Department of Child Health, University of Missouri
Chemistry
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, W., Lester, J. M., Amorosa, A. E., Chance, D. L., Mossine, V. V., Mawhinney, T. P. Facile and Efficient Preparation of Tri-component Fluorescent Glycopolymers via RAFT-controlled Polymerization. J. Vis. Exp. (100), e52922, doi:10.3791/52922 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

glycopolymers الاصطناعية هي أدوات مفيدة وتنوعا المستخدمة في مختلف المجالات البحثية الحيوية والطبية الحيوية. مثال على تركيب سطحي وكفاءة glycopolymers الإحصائية الفلورسنت تسيطر عليها بشكل جيد باستخدام عكسها بالإضافة إلى ذلك، تجزئة سلسلة نقل ويتجلى (الطوافة) البلمرة المستندة. يبدأ تجميع مع إعداد المحتوية على β الجالاكتوز-glycomonomer 2-lactobionamidoethyl methacrylamide التي تم الحصول عليها عن طريق تفاعل lactobionolactone وN - (2-aminoethyl) methacrylamide (AEMA). يستخدم 2-Gluconamidoethyl methacrylamide (GAEMA) كما التناظرية الهيكلية التي تفتقر إلى محطة β-غالاكتوزيد. ينطوي على تفاعل البلمرة بوساطة RAFT الثلاثة التالية أحادية مختلفة: N - (2-هيدروكسي إيثيل) مادة الأكريلاميد كما الفاصل، AEMA هدفا لمزيد من العلامات مضان، وglycomonomers. تسامحا من النظم المائية، وكيل الطوافة المستخدمة في رد فعل هو (حمض 4-cyanopentanoic) -4-dithiobenzoate.وقد لوحظت dispersities منخفضة (≤1.32)، والتراكيب البوليمرات يمكن التنبؤ بها، واستنساخ عالية من polymerizations بين المنتجات. ويتم الحصول على البوليمرات الفلورية عن طريق تعديل glycopolymers مع استر carboxyfluorescein succinimidyl استهداف المجموعات الوظيفية أمين أساسي على AEMA. يتم التحقق من خصوصيات-كتين ملزمة للglycopolymers الناتجة عن طريق اختبار مع حبات الاغاروز المقابلة المغلفة مع glycoepitope الاعتراف يكتينس محددة. بسبب سهولة من التوليف، ورقابة مشددة من المؤلفات المنتج واستنساخ جيدة للتفاعل، وهذا البروتوكول يمكن ترجمتها نحو إعداد البعض glycopolymers القائم على الطوافة مع الهياكل والتراكيب محددة، كما تريد.

Introduction

في العقدين الماضيين، التحقيقات مع glycopolymers الاصطناعية شهدت نموا بطيئا ولكن مستمرة، مما يدل على إمكانيات كبيرة في دراسة آليات المعدية التي تشمل البحوث التي تركز على كتين الاعتراف بمعالجة 1-3. منذ glycopolymers الاصطناعية التي تمتلك الأنصاف السكر متعددي يحمل أعلى بكثير كفاءات-كتين ملزم، بالمقارنة مع الكربوهيدرات الأحادية التكافؤ، فهي من الطلب الكبير في مجال غليكوبيولوغي 3. ذات أهمية خاصة في الأبحاث السريرية هو استخدام glycopolymers الفلورسنت لتوصيف بكتيريا بوساطة كتين ملزمة مع الكربوهيدرات المتاحة على سطوح الخلايا في الجهاز التنفسي الإنسان وبروتين سكري المخاطية. في وقت مبكر من الدراسات المختبرية المستخدمة glycopolymers القائم بولي أكريلاميد متاحة تجاريا في الاختبارات ملزمة البكتيرية. أظهرت العديد من هذه التحقيقات نتائج واعدة، لكنه أثار مخاوف بشأن، obtainability، والكثير إلى الكثير الفروق في كل من بولymer الوزن الجزيئي والمحتوى glycoepitope. تم وضع بروتوكول اقتصادا في المختبر الذي من شأنه أن يوفر لعنصر تحكم مرضية من المحتويات هيكل وحجم ونقاء glycopolymers الاصطناعية التي تستهدف يكتينس البكتيرية.

بحثا عن نهج الاصطناعية مناسبة لglycopolymers، تم اختبار تقنية البلمرة جديدة نسبيا باستخدام نوع من البلمرة الجذرية للرقابة التي يعملون عكسها بالإضافة إلى ذلك، تجزئة سلسلة نقل (الطوافة) وكلاء 4. وقد تم مؤخرا استخدام هذه الكواشف RAFT في عدد قليل من الاستعدادات glycopolymer 5-7. مقارنة مع بروتوكولات إعداد glycopolymer أخرى، polymerizations بوساطة RAFT تظهر العديد من المزايا، بما في ذلك التسامح لمجموعة متنوعة من هياكل مونومر وظروف التفاعل والتوافق المحتملة مع المحاليل المائية، وانخفاض حجم التبعثر من المنتجات البوليمرية المطلوب 8،9. من بين الأماكن البارزة هي بروتوكولات لإعداد RAFT-BAglycopolymers ثلاثي مكون الحوار الاقتصادي الاستراتيجي، مما يتيح السيطرة على تركيبة أحادية مختلفة، كل منها قد يكون لها وظائف متميزة 10-13. ومع ذلك، فإن معظم الجهود البحثية السابقة إما تفتقر المصاوغ الكربونيلي الكربوهيدرات قلادة 10، أو يعملون صعدت polymerizations مما أدى إلى بوليمرات ثلاثية كتلة، التي تتكون من homopolymers مرتبطة تساهميا، والتي غالبا ما تخدم أغراضا مختلفة من البوليمرات الإحصائية التي هي بوليمرات التي تتابع مونومر بقايا تتبع قاعدة إحصائية 13/09.

في الآونة الأخيرة، ويعمل المجمع RAFT thiocarbonylthio (حمض 4-cyanopentanoic) -4-dithiobenzoate في بيئة مائية، وإعداد مجموعة من glycopolymers الإحصائية ثلاثي مكون الخطية التي تحتوي على السكريات قلادة محددة وتطبيقها في RAFT تستند للبكتيريا ملزمة بوساطة كتين وذكرت الاختبارات 14. الهدف العام من هذا الأسلوب، قدم بطريقة بصرية، هو إعداد ثلاثي مكونglycopolymers الفلورسنت الإحصائية عن طريق البلمرة تسيطر الطوافة. بسبب سهولة من بروتوكول البلمرة خطوة واحدة، ودفع غرامة السيطرة على طول البوليمر والتراكيب، واستنساخ عالية من رد الفعل، هذا البروتوكول يمكن تطبيقها بسهولة مع غيرها من التوليفات القائمة على مجموعة من glycopolymers مع الهياكل المطلوبة.

Protocol

1. توليف Glycomonomer 2-Lactobionamidoethyl Methacrylamide

  1. حل 2 غرام من حمض lactobionic في 3.0 مل من الميثانول اللامائية وإضافة ببطء الايثانول المطلق في قطرة الأزياء الحكمة حتى حل عادل يتحول غائما، ثم إزالة المذيبات عبر rotoevaporation.
  2. حل هذه البقايا، من الخطوة 1.1 في 3.0 الميثانول اللامائية مل، ومرة ​​أخرى، إضافة ببطء الايثانول المطلق حتى مجرد غائم، ثم تتبخر المذيبات عبر rotoevaporation. كرر هذه الخطوة 3 مرات للحصول lactobiono-1،5-اكتون (1،94 ز، 98٪ العائد). هذا المنتج هو من نقاء كافية لاستخدامها في التفاعلات التالية.
  3. إضافة 1.0 غرام من lactobionolactone في 3.0 مل من الميثانول إلى N - (2-aminoethyl) methacrylamide (AEMA، 0.58 غ) والهيدروكينون الأثير monomethyl (MEHQ، 1.0 ملغ)، المانع من البلمرة الذاتي، في 2.0 مل من الميثانول، تليها بنسبة 1.0 مل من ثلاثي الإيثيلامين. إثارة في RT لمدة 48 ساعة.
  4. إضافة 20 مل من H 2 O منزوع الأيونات (2 درهم
  5. لإزالة أي حمض lactobionic المتبقية، إضافة 20 مل من درهم 2 O، ثم تمرير محلول مائي من خلال عمود الصرف أنيون (OH - النموذج، 10 ملم × 20 ملم) في دورق الاستقبال تحتوي على 1.0 ملغ من MEHQ.
  6. إزالة ثلاثي الإيثيلامين، التي تنتج في الخطوة 1.5، عن طريق تبخير للجفاف عن طريق rotoevaporation.
  7. إضافة 20 مل من درهم 2 O وإزالة غير المتفاعل AEMA بإضافة ببطء 1 قسامات ملغ من الراتنج تبادل الأيونات الموجبة (H + النموذج) حتى لا النينهيدرين المواد المتفاعلة يمكن اكتشافها. مراقبة إزالة من خلال اتخاذ 1 مكل من الحل بعد كل إضافة الراتنج، وتطبيقه على لوحة اللوني طبقة رقيقة، ثم رش لوحة مع النينهيدرين 2٪ في محلول الإيثانول. عندما يتم احترام أي اللون الأزرق العميق لتطوير عندما يتم تسخين لوحة إلى 90 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، تم الوصول إلى نقطة النهاية.
  8. إزالة MEHQ من العينة عن طريق إذابة المواد المجففة بالتجميد في الحد الأدنى من الميثانول (~ 0.5 مل)، ثم إضافة الأسيتون مائي بارد (-20 ° C، 15 مل) لترسيب المنتج. جمع يعجل عن طريق الترشيح باستخدام القمع الزجاج fritted، ثم تجفيف راسب في مجفف تحت فراغ للحصول على methacrylamide 2-lactobionamidoethyl (LAEMA) باعتبارها مسحوق البيض (0.94 ز، 68٪ العائد). هذا المنتج هو من نقاء كافية لاستخدامها في التفاعلات التالية.

2. تجميع مونومر 2-Gluconamidoethyl Methacrylamide

ملاحظة: إعداد 2-gluconamidoethyl methacrylamide (GAEMA)، والتي لا تمتلك السكر قلادة، وتكييفها من أسلوب نشر 15.

  1. إضافة 2.0 غرام من AEMA الذائبة في 10 مل من الميثانول إلى الحلمن D-جلوكونولاكتون (1.6 غرام) في 30 مل من الميثانول و، مع التحريك، إضافة ببطء 1.6 مل من ثلاثي الإيثيلامين.
  2. اثارة رد فعل على RT لمدة 24 ساعة.
  3. تصفية الناتج الراسب باستخدام القمع الزجاج fritted وشطف راسب ثلاث مرات مع 10 مل كل من الأيزوبروبانول، ثم تغسل مع 10 مل من الأسيتون الجاف. تجفيف الناتج الراسب في مجفف تحت فراغ.

3. RAFT Glycopolymer التجميعي

  1. لإزالة MEHQ المانع موجودة في N التجاري - (2-هيدروكسي إيثيل) مادة الأكريلاميد (HEAA)، إضافة 1 مل من HEAA إلى أنبوب 2 مل microcentrifuge ل، تليها إضافة 0.5 غرام من جزيئات أكسيد الألومنيوم. أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 300 x ج لمدة 30 ثانية، واستخدام أفضل HEAA طبقة في التفاعل التالي.
  2. إضافة بعناية 32.8 ملغ من LAEMA (70.0 ميكرومول)، و 1.7 ملغ من AEMA (10.5 ميكرومول) و 27.5 ميكرولتر من HEAA (270 ميكرومول)، وجميع يذوب في 0.4 مل من درهم 2 O، لتنظيفها جيدا أنبوب 1 مل Schlenk، وبالتالي وجود monomنسبة إيه المولي من 20: 3: 77.
  3. في رد فعل مواز، من أجل إنتاج البوليمرات السيطرة التي لا تمتلك أي السكر قلادة، بدلا من استخدام LAEMA في الخطوة 3.2، استبدل 21.4 ملغ من GAEMA (70.0 ميكرومول) في رد الفعل.
  4. إلى Schlenk أنبوب منها (أي 3.2 أو 3.3)، بالتتابع إضافة 50 ميكرولتر من DMF تحتوي على 0.53 ملغ من (حمض 4-cyanopentanoic) -4-dithiobenzoate (1.9 ميكرومول، وكيل RAFT)، و 50 ميكرولتر من DMF تحتوي على 250 ميكروغرام من 4،4'-azobis- (حمض 4-cyanovaleric) (0.9 ميكرومول، البادئ). المزيج بلطف بواسطة الإصبع التنصت.
  5. تجميد محتويات الواردة في أنبوب Schlenk توظيف الثلج الجاف: حمام الإيثانول (75 غ الثلج الجاف في 100 مل ايثانول)، وتطبيق فراغ في حدود 10-50 mTorr، ثم إغلاق صمام Schlenk والسماح الحل لذوبان الجليد ببطء إلى RT . كرر هذه الدورة تجميد الجلاء ذوبان الجليد مرتين أكثر من ذلك. التأكد من أن جميع الكواشف حل بعد ذوبان الجليد الماضي.
  6. وضع أنبوب Schlenk إلى با البلاستيك قابل للغلقز، إخلاء الهواء الحقيبة، ثم ختم ذلك. نقل حقيبة تحتوي على أنبوب Schlenk إلى حمام الماء مسخن في 70 ° C واحتضان لمدة 24 ساعة.
  7. نقل بعناية الحل في أنبوب Schlenk إلى كيس غسيل الكلى مستعدة (MWCO = 3500)، وdialyze ضد درهم 2 O (10 × 2 L) لمدة 24 ساعة، وتغيير درهم 2 O كل ساعة لساعة 8 الأولى. بعد غسيل الكلى، ونقل عينة من أنابيب غسيل الكلى في أنبوب اختبار، وتجميد العينة في -80 ° C، ثم يجفد ذلك.

ملاحظة: الناتج الإحصائي بولي methacrylamide / الأكريلاميد (PMA) بوليمرات تحتوي على قلادة 4- O -β-D-galactopyranosyl-D-gluconamide (lactobionamide) (من الخطوة 3.2) أو D-gluconamide (من الخطوة 3.3)، على التوالي، التي تم الحصول عليها. للراحة من المناقشة، ويختصر هذه glycopolymers هما PMA-LAEMA وPMA-GAEMA، على التوالي.

4. بعد تعديل Glycopolymers مع Fluorophores

  • حل 5.0 ملغ من glycopolymer PMA-LAEMA أو PMA-GAEMA تحتوي على ~ 0.9 μmole من المجموعات الوظيفية أمين الأساسي في 0.9 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، 0.1 M فوسفات الصوديوم، كلوريد الصوديوم 0.15 M، ودرجة الحموضة 7.5)، على التوالي.
  • إضافة ببطء 0.6 ملغ من carboxyfluorescein succinimidyl استر في 100 ميكرولتر من DMF إلى حلول مع التحريك السريع. يحرك برفق لمدة 16 ساعة ردود الفعل في الظلام في RT.
  • في حين محمية من الضوء، تحميل العينة إلى أنابيب غسيل الكلى استعداد (MWCO = 3500) وdialyze ضد درهم 2 O (2 L) لمدة 16 ساعة، وتغيير الحل غسيل الكلى في كل ساعة لساعة 8 الأولى. بعد غسيل الكلى، ونقل عينة من أنابيب غسيل الكلى في أنبوب اختبار، وتجميد العينة في -80 ° C، ثم يجفد ذلك.
  • ملاحظة: بعد تجفيد، glycopolymers الفلورسنت PMA-LAEMA-فلوريسئين وPMA-GAEMA-فلوريسئين، على التوالي، ويتم الحصول على.

    5. توصيف الغليسينبوليمرات

    1. تحديد عدد متوسط ​​الوزن الجزيئي (M ن)، وزن متوسط ​​الوزن الجزيئي (M ث) والتبعثر (M ث / M ن) من glycopolymers على نظام HPLC التجاري مجهزة الههلامي (GPC) والبرمجيات، والمؤتمر الشعبي العام العمود مناسبة للوزن الجزيئي للاهتمام، وكاشف معامل الانكسار، وذلك باستخدام 0.1 M تريس / 0.1 M العازلة كلوريد الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7) كما شاطف بمعدل تدفق 0.6 مل / دقيقة 14. استخدام المعايير البولي ايثيلين جلايكول عن معايير الوزن الجزيئي (MW: 200-1،200،000 ز / مول).
    2. قياس تركيزات الفعلية من المجموعات الوظيفية أمين أولي داخل glycopolymers 16. تحليل محتوى الكربوهيدرات الكلي للglycopolymers تصنيعه وفقا لطريقة نشر 17.
    3. إجراء اختبارات التكوين الهيكلي ونقاء LAEMA glycomonomers، GAEMA وglycopolymers PMA-LAEMA، PMA-GAEMA في D 2 O التي كتبها NMR الطيفي 14.

    6. الاختبارات ملزمة للGlycopolymers الاصطناعية مع كتين المغلفة الخرز الاغاروز

    1. إضافة 1.5 مل من برنامج تلفزيوني ل50 ميكرولتر من تعليق الحمرية-عرف الديك كتين (ECL) حبات الاغاروز المغلفة، الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 1 دقيقة، وإزالة بعناية والتخلص من طاف. كرر هذه الخطوة مرتين، ثم resuspend والخرز في 0.5 مل من برنامج تلفزيوني.
    2. إضافة 3 ميكروغرام من PMA-LAEMA-فلوريسئين أو PMA-GAEMA-فلوريسئين (المراقبة السلبية) في 6 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لحبات التعليق، واحتضان خليط، في الظلام، في RT لمدة 1 ساعة.
    3. غسل مخاليط مع 1.5 مل من PBS ثلاث مرات، والخرز resuspend في 0.2 مل من برنامج تلفزيوني. تحميل قسامة (4 ميكرولتر) في بئر على شريحة المجهر المناعي (تفلون المغلفة)، وتغطي مع انزلاق الغطاء، ومراقبة بواسطة المجهر مضان باستخدام فلتر FITC (الطول الموجي الإثارة: 467-498 نانومتر، والطول الموجي الانبعاثات: 513- 566 نانومتر) وهدف 10X لدراسة الربط رانه فلوري glycopolymers مع حبات 14.

    Representative Results

    توليف glycomonomer

    وقد استخدم حمض Lactobionic هنا كمثال لإعداد glycomonomers. باستخدام الأساليب في التقرير الأولي عن تركيب LAEMA 11، لوحظت عوائد متنوعة في إعداد مع نقاء غير مرضية. طريقة تنقية تعديلها باستخدام الموجبة وتبادل أنيون راتنجات لإزالة المواد غير المتفاعل انطلاق عرضت مستقر المحصول المنتج ونقاء عالية، وهو ما يؤكده 1 H و 13 C NMR الطيفي (الشكل 1).

    RAFT التوليف glycopolymer وبعد التعديل من glycopolymers مع fluorophores

    في المقابل إلى glycopolymers كتلة إعدادها من خلال polymerizations RAFT صعدت، ويوفر هذا البروتوكول البلمرة خطوة واحدة لتوزيع glycomonomer موحدة في جميع أنحاء العمود الفقري البوليمر. وglycopolymers هو موضح هنا يحتوي على 20٪ من مول GLycomonomer، وأكدت 77٪ من مول HEAA كفاصل، و 3 مول٪ من AEMA كهدف لمرحلة ما بعد التعديلات (انظر الشكل 2). 1 H- و 13 C-NMR الطيفي هياكل PMA-LAEMA وPMA-GAEMA (أرقام 3 و 4). كما هو مبين في الشكل (5)، عندما تآمر ضد التشكيلات شطف المؤتمر الشعبي العام من glycopolymer توليفها دون RAFT، سواء PMA-LAEMA وPMA-GAEMA ديك dispersities منخفضة، تثبت نجاعة نهج الطوافة. كما هو متوقع، PMA-GAEMA لديه M ن أصغر من PMA-LAEMA بسبب نقص PMA-GAEMA من السكر قلادة. وكشف تحليل الكربوهيدرات وأمين أولي المجموعات الوظيفية محتوى glycopolymers RAFT أن نسبة أحادية في glycopolymers المنتج تتفق مع نسبة متكافئة من بدء أحادية العاملين في البلمرة رد فعل بوساطة RAFT (الجدول 1). هذا يدل على رقابة مشددة من تكوين. مونومرنانوثانية في glycopolymers توليفها، كما تم تصميمها.

    رد فعل من المجموعات الوظيفية أمين أولي مع fluorophores تفعيلها هو أسلوب يستخدم على نطاق واسع في وضع العلامات البروتين. كان يعمل هذا الأسلوب هنا لتسمية glycopolymers تنقيته مع carboxyfluorescein. التالية بعد التعديل، تم الحصول على البوليمرات الفلورية (الشكل 6). تم الكشف عن أي تدهور للبوليمرات المسمى فلوريسئين في رد الفعل من خلال تحليل GPC (لا تظهر البيانات).

    ملزمة اختبارات glycopolymers الاصطناعية مع حبات الاغاروز المغلفة كتين

    لتقييم خصوصية ملزم كتين من glycopolymers توليفها، والخرز الاغاروز-كتين المغلفة مع الكربوهيدرات المعروفة خصوصية ملزم تم استخدامها.-عرف الديك الحمرية كتين (ECL)، واستخدمت في التجارب، لديه خصوصية ملزمة نحو β-D-غالاكتوزيد. الرقم 7A يدل بوضوح على أن PMA-LAEMA-FLuorescein، والذي يحتوي β-D-غالاكتوزيد كما الكربوهيدرات قلادة، عرضت قوية ملزمة مع كتين ECL. في المقابل، فإن سلبية ملزمة لECL من glycopolymer PMA-GAEMA-فلوريسئين، الذي لا يملك والسكر قلادة، هو مبين في الشكل 7B. هذه النتيجة تجسد فعالية الربط والتقارب من glycopolymer الفلورسنت توليفها.

    الشكل 1
    الشكل 1. تعيين 1 H- (أ) و 13 C-NMR (ب) أطياف (D 2 O) لLAEMA. (تم تعديل هذا الرقم من وانغ وآخرون. 14) اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الشكل.

    <ص الطبقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> الرقم 2
    الشكل 2. توضيح تخطيطي لتركيب glycopolymer الفلورسنت PMA-LAEMA تحتوي على β غالاكتوزيد كما السكر قلادة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل (3)
    الشكل 3. المخصصة 1 H- (A) و 13 C-NMR (B) أطياف (D 2 O) لPMA-LAEMA glycopolymer. (تم تعديل هذا الرقم من وانغ وآخرون. 14) نداءحد ذاته انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الرقم 4
    الرقم 4. المخصصة 1 H- (A) و 13 C-NMR (B) أطياف (D 2 O) لPMA-GAEMA. (تم تعديل هذا الرقم من وانغ وآخرون. 14) اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الرقم 5
    الرقم 5. جل آثار تخلل اللوني ومقرها RAFT-PMA-GAEMA وPMA-LAEMA أعدت مع وبدون استخدام وكيل RAFT. وعلى النقيض من PMA-LAEMA أعدت دون RAFT وكيل (الأزرق)، RAFT- استنادا PMA-LAEMA (الأخضر) لديه التبعثر أقل بكثير (M ث / M ن). استنادا RAFT-PMA-GAEMA (الحمراء)، وPMA-LAEMA ديك ملامح GPC مماثلة، ولكن من السابق لديها أصغر M ن نظرا لعدم وجود أي السكريات قلادة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل (6)
    الرقم 6. PMA-LAEMA قبل وبعد بعد التعديل مع fluorophore. (A) مقارنة مع الأبيض غير المسمى glycopolymer (أنبوب الأيسر)، وصفت فلوريسئين PMA-LAEMA يظهر اللون الأصفر القوي (أنبوب الأيمن). (B) تحت الأشعة فوق البنفسجية، غير المسمى PMA-LAEMA (أنبوب الأيسر، 1 ملغ / مل في PBS) مظلمة، ويقدم مع عدم وجود مضان، في حين فلوريسئين المسمى PMA-LAEMA (أنبوب الصحيح، 1 ملغ / مل في PBS) يبين مضان أخضر قوي.: //www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الرقم 7
    الرقم 7. الحمرية-عرف الديك كتين (ECL) حبات الاغاروز المغلفة ربط β-D-غالاكتوزيد تحتوي على glycopolymers، وليس تلك التي لا تمتلك السكر قلادة. (A) PMA-LAEMA-فلوريسئين (3 ميكروغرام) أظهرت ملزمة قوية مع ECL ، في حين أن (B) PMA-GAEMA-فلوريسئين، التي لا تمتلك أي بقايا قلادة β-D-غالاكتوزيد، لم تظهر أي ملزمة مع حبات المغلفة كتين. على نطاق وبار = 100 ميكرون.

    الجدول 1. القيم الاستهداف والمعلمات الاصطناعية والتراكيب الفعلية للglycopolymers. أ) استهداف القيم، القيم التيوالمطلوب من المنتجات؛ ب) DP، درجة البلمرة. ج) NA، غير متوفرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    موانئ دبي ب التبعثر المحتوى الفعلي للglycomonomers
    مول٪
    المحتوى الفعلي للأمين الأساسي
    مول٪
    استهداف القيم 100 <1.3 20 3
    PMA-LAEMA 99 1.26 19 3.2
    سلطة النقد الفلسطينية-GAEMA 89 1.32 NA ج 2.7

    Discussion

    بروتوكول سطحي وفعالة لglycopolymers ثلاثي مكون أساس RAFT-فلوري، مع وبدون الكربوهيدرات قلادة، واستخدامها في اختبار ملزم كتين، ويتجلى في هذا التقرير. يبدأ بروتوكول مع إعداد glycomonomers LAEMA وGAEMA. من خلال خطوة واحدة تسيطر عليها RAFT البلمرة، glycopolymers مع العائد استنساخه، وتكوين مونومر يمكن التنبؤ به وانخفاض التبعثر، ويتم الحصول على. التالية بعد التعديل من glycopolymers مع carboxyfluorescein succinimidyl استر، الربط من glycopolymer فلوري المسمى respective الناتجة غير قابلة للاختبار بسهولة لخصوصية ملزم كتين لها.

    في الخطوات التحضيرية الأولية للglycomonomers التي هي لاستخدامها في توليفات glycopolymer اللاحقة، تم استخدام حمض lactobionic متاحة بسهولة وجلوكونولاكتون. من الناحية النظرية، أي الكربوهيدرات المصالح، من السكريات الأحادية إلى يغوساكاريدس معقدة، يمكن أن يكون المحولد لglycomonomers التي كتبها التصريف السكر الهدف على مجموعة الهيدروكسيل الأولية على C6 من الجلوكوز. بعد أكسدة الجلوكوز بقايا الحد، والجفاف لاحقا لاكتون، يمكن للمنتج ثم يكون رد فعل بسهولة مع أمين أساسي على AEMA لتشكيل glycomonomer المقابلة. ويمكن رؤية أمثلة أخرى من هذا الطريق في تقرير حديث 14. وتجدر الإشارة إلى أنه قبل الشروع في أي خطوة البلمرة، MEHQ، البلمرة المانع من امكانات، يجب إزالتها من كل مونومر وglycomonomer الاستعدادات فقط قبل استخدامها. ويتم إنجاز هذا بسهولة باستخدام الحد الأدنى من الميثانول إلى حل glycomonomer التي تمتلك MEHQ ثم التعامل معها على الفور مع الأسيتون في -20 ° C إلى ترسيب المنتجات خالية من المانع في ارتفاع العائد.

    أساسية في أي نظام البلمرة الراديكالية، ويجري التركيز على الاهتمام بالتفاصيل ومونومر درجات نقاء. كما هو الحال في نظام RAFT البلمرة، وتتكون منمصدر جذري، كاشف RAFT، مونومر والمذيبات. في هذا العرض تصور، يوصف نظام RAFT البلمرة خطوة واحدة تركز على إنتاج بوليمرات الإحصائية الناتجة عن خليط التفاعل تمتلك ثلاثة مونومرات مختلفة في محلول مائي. وتعرض اثنين من ردود الفعل بوساطة RAFT منفصلة في أي واحد يستخدم لglycomonomer التي تمتلك قلادة، غير الحد محطة الكربوهيدرات (أي، β-D-سكر اللبن)، والآخر، وحيازة البوليول مع أي بقايا الكربوهيدرات منضم. مشتركة في كل من ردود الفعل بوساطة RAFT كانت أحادية تمتلك مجموعة الهيدروكسيل المفرد التي هي بمثابة جزيء الفاصل، وحيازة أخرى لأمين حرة لمرحلة ما بعد التعديل، مع fluorophore الأمينية رد الفعل.

    منذ وجود الأكسجين في خليط التفاعل والبيئة تضر البلمرة RAFT بوساطة، ويتم إنجاز زواله لتتبع مستويات بسهولة عبر العديد من تجميد إيفادورات cuate ذوبان الجليد مع الحفاظ على Schlenk عاء التفاعل أنبوب تحت فراغ عالية.

    تجدر الإشارة إلى أن نسبة المولي مونومرات مختلفة في رد فعل يمكن تعديلها حسب الحاجة. أيضا، من خلال تغيير كمية العامل RAFT المستخدمة، وطول البوليمرات الناتجة يمكن السيطرة عليها (18). ومع ذلك، ينبغي أن نسبة المولي من وكيل RAFT إلى البادئ يكون دائما أكبر من اثنين لضمان التبعثر منخفض للمنتج. في ظل هذه الظروف، تطور البلمرة هو ثابت، واستنساخ رد فعل مرتفع جدا. ومع ذلك، فإنه من غير المحتمل أن أحد يحصل على توزيع موحد تماما من كل أحادية المشاركة ضمن البوليمرات الإحصائية، وذلك بسبب سرعة البلمرة المختلفة. تميز توزيع مونومرات مختلفة داخل البوليمر لا تزال صعبة للغاية.

    طريقة بعد التعديل، المعروضة هنا، على حد سواء amenabl أبسط وأكثره إلى استخدام مجموعة واسعة من العلامات الفلورية، بالمقارنة مع غيرها من البروتوكولات المطبقة على glycopolymers التسمية 2،11. وتشمل هذه الكثير للأمين رد الفعل fluorophores للذوبان في الماء، النقاط الكمومية، biotins، وغيرها. خصوصيات الملزمة لتصنيعه، glycopolymers المسمى يتم التحقق منها بسهولة باستخدام يكتينس مع الانتماءات الملزمة المعروفة. PMA-GAEMA لا تملك السكر قلادة هو السيطرة السلبية المناسبة. Glycopolymers مع مختلف العلامات الفلورية إعداد عبر هذا الطريق وقد استخدمت بنجاح في التحقيقات بوساطة كتين بكتيريا ملزما 14. كما وردت، ينبغي إعداد هذا سطحي وكفاءة glycopolymers الفلورسنت إحصائية توفر إمكانات كبيرة لمجموعة واسعة من البحوث glycobiological.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagent
    Lactobionic acid Sigma-Aldrich 153516
    D-Gluconolactone  Sigma-Aldrich G2164
    N-(2-hydroxyethyl) acrylamide (HEAA) Sigma-Aldrich 697931
    Orange II sodium salt Sigma-Aldrich O8126
    Hydroquinone monomethyl ether (MEHQ) Sigma-Aldrich 54050 Polymerization inhibitor
    N-(2-aminoethyl) methacrylamide hydrochloride (AEMA) Polysciences, Inc 24833-5
    Triethylamine Fisher Scientific BP-616
    Anion-exchange resin IRN-78 hydroxide-form, 80 mesh Sigma-Aldrich 10343-U
    Cation-exchange resin 50Wx8, 200 mesh Sigma-Aldrich 217514
    Aluminum oxide, ~150 mesh  Sigma-Aldrich A1522 Type WN-6, Neutral, Activity Grade Super I
    Ninhydrin Sigma-Aldrich N4876 An ethanol solution of 0.2% ninhydrin was used in the test
    4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic acid Sigma-Aldrich 722995 RAFT agent
    4,4′-Azobis(4-cyanovaleric acid) Sigma-Aldrich 11588 Polymerization initiator
    Carboxyfluorescein succinimidyl ester  Life Technologies C1157
    Erythrina Cristagalli lectin coated agarose bead Vector Laboratories AL-1143 
    Solvent
    dH2O Produced by Barnstead water purification system, 18 megOhm-cm
    Isopropanol Fisher Scientific A461-4 ACS grade or better
    Methanol Fisher Scientific A454-4 ACS grade or better
    Absolute ethanol Fisher Scientific BP2818-100 ACS grade or better
    Dimethylformamide Sigma-Aldrich 22705 ACS grade or better
    Acetone Fisher Scientific A929-4 ACS grade or better
    Equipment
    Dialysis membrane (MWCO: 3,500) Spectrum Labs 132720
    Polyethylene glycol analytical standard standard Sigma-Aldrich O2393
    Schlenk tube, 1 ml Quark Glass Customized
    TSK-GEL G4000 PWxl  Tosoh Bioscience  8022 Used for GPC analysis of the glycopolymers
    Empower 3 with GPC/SEC package Waters Corporation
    Waters Alliance HPLC system  Waters Corporation Equipped with refractive index detector (Waters 2414) and fluorescence detector (Waters 2475)
    Avance III 800 MHz NMR Spectrometer Bruker Corporation
    BX43 fluorescence microscope Olympus Corporation Used with FITC filter in the glycopolymer binding test
    Rotavap / Rotoevaporator Heidolph
    Fritted disc funnel Fisher Scientific 10-310-109
    Lyophilizer Labconco
    Immunofluorescence microscope slide Polysciences 18357-1
    Revco Ultima Plus -80 °C Freezer Thermo Scientific
    Plastic Vacuum Bag and Hand Pump Ziploc
    Vacuum Pump, Direct Drive, Maxima C Plus Fisher Scientific
    Vacuum Gauge Sargent-Welch

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Scharfman, A., et al. Pseudomonas aeruginosa binds to neoglycoconjugates bearing mucin carbohydrate determinants and predominantly to sialyl-Lewis x conjugates. Glycobiology. 9, (8), 757-764 (1999).
    2. Song, E. H., et al. In vivo targeting of alveolar macrophages via RAFT-based glycopolymers. Biomaterials. 33, (28), 6889-6897 (2012).
    3. Wolfenden, M. L., Cloninger, M. J. Chapter 14. Multivalency in carbohydrate binding. Carbohydrate Recognition: Biological Problems, Methods, and Applications. Wang, B., Boons, G. .-J. John Wiley, & Sons, Inc., Chapter. 349-370 (2011).
    4. Moad, G., Rizzardo, E., Thang, S. H. Radical addition-fragmentation chemistry in polymer synthesis. Polymer. 49, (5), 1079-1131 (2007).
    5. Spain, S. G., Gibson, M. I., Cameron, N. R. Recent advances in the synthesis of well-defined glycopolymers. J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 45, (11), 2059-2072 (2007).
    6. Bernard, J., Hao, X., Davis, T. P., Barner-Kowollik, C., Stenzel, M. H. Synthesis of various glycopolymer architectures via RAFT polymerization: From block copolymers to stars. Biomacromolecules. 7, (1), 232-238 (2006).
    7. Bulmus, V. RAFT polymerization mediated bioconjugation strategies. Polym. Chem. 2, 1463-1472 (2011).
    8. Ting, S. R. S., Chen, G., Stenzel, M. H. Synthesis of glycopolymers and their multivalent recognitions with lectins. Polymer Chemistry. 1, 1392-1412 (2010).
    9. Vazquez-Dorbatt, V., Lee, J., Lin, E. W., Maynard, H. D. Synthesis of glycopolymers by controlled radical polymerization techniques and their applications. Chembiochem. 13, 2478-2487 (2012).
    10. Jiang, X., Ahmed, M., Deng, Z., Narain, R. Biotinylated glyco-functionalized quantum dots: Synthesis, characterization, and cytotoxicity studies. Bioconjugate Chem. 20, (5), 994-1001 (2009).
    11. Deng, Z., Li, S., Jiang, X., Narain, R. Well-defined galactose-containing multi-functional copolymers and glyconanoparticles for biomolecular recognition processes. Macromolecules. 42, (17), 6393-6405 (2009).
    12. Qin, Z., et al. Galactosylated N-2-hydroxypropyl methacrylamide-b-N-3-guanidinopropyl methacrylamide block copolymers as hepatocyte-targeting gene carriers. Bioconjugate Chem. 22, (8), 1503-1512 (2011).
    13. Albertin, L., Wolnik, A., Ghadban, A., Dubreuil, F. Aqueous RAFT polymerization of N-acryloylmorpholine, synthesis of an ABA triblock glycopolymer and study of its self-association behavior. Macromol. Chem. Phys. 213, (17), 1768-1782 (2012).
    14. Wang, W., Chance, D. L., Mossine, V. V., Mawhinney, T. P. RAFT-based tri-component fluorescent glycopolymers: synthesis, characterization and application in lectin-mediated bacterial binding study. Glycoconj. J. 31, (2), 133-143 (2014).
    15. Deng, Z., Ahmed, M., Narain, R. Novel well-defined glycopolymers synthesized via the reversible addition fragmentation chain transfer process in aqueous media. J. Polymer Sci. Part A: Polym. Chem. 47, (2), 614-627 (2009).
    16. Noel, S., Liberelle, B., Robitaille, L., De Crescenzo, G. Quantification of primary amine groups available for subsequent biofunctionalization of polymer surfaces. Bioconjugate Chem. 22, (8), 1690-1699 (2011).
    17. Biermann, C. J., McGinnis, G. D. Preparation of alditol acetates and their analysis by gas chromatography (GC) and mass spectrometry (MS). Analysis of Carbohydrates by GLC and MS. CRC Press. 87-170 (1989).
    18. Thomas, D. B., et al. Kinetics and molecular weight control of the polymerization of acrylamide via RAFT. Macromolecules. 37, (24), 8941-8950 (2004).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics