Preparazione Facile ed efficiente di Glycopolymers fluorescenti Tri-componenti tramite polimerizzazione RAFT controllata

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Wang, W., Lester, J. M., Amorosa, A. E., Chance, D. L., Mossine, V. V., Mawhinney, T. P. Facile and Efficient Preparation of Tri-component Fluorescent Glycopolymers via RAFT-controlled Polymerization. J. Vis. Exp. (100), e52922, doi:10.3791/52922 (2015).

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Abstract

Glycopolymers sintetici sono strumenti strumentali e versatili utilizzati in vari campi di ricerca biochimici e biomedici. Un esempio di una sintesi facile ed efficiente glycopolymers statistici fluorescenti ben controllati utilizzando reversibile addizione frammentazione chain-trasferimento (RAFT) polimerizzazione sede è dimostrata. La sintesi inizia con la preparazione di β-galattosio contenenti glycomonomer 2-lactobionamidoethyl metacrilammide ottenuto per reazione del lactobionolactone e N - (2-amminoetil) metacrilammide (Aema). 2-Gluconamidoethyl metacrilammide (GAEMA) è usato come un analogo strutturale manca un terminale β-galactoside. Il seguente reazione di copolimerizzazione RAFT-mediata coinvolge tre differenti monomeri: N - (2-idrossietil) acrilammide come distanziale, Aema come obiettivo per ulteriore etichettatura fluorescenza, e le glycomonomers. Tollerante di sistemi acquosi, l'agente RAFT utilizzato nella reazione è (acido 4-cyanopentanoic) -4-dithiobenzoate.Bassa dispersities (≤1.32), composizioni copolimero prevedibili, e l'alta riproducibilità delle polimerizzazioni sono state osservate tra i prodotti. Polimeri fluorescenti sono ottenuti modificando i glycopolymers con estere carboxyfluorescein succinimidil mira i gruppi funzionali amminici primari sulla Aema. Specificità lectina legante dei glycopolymers risultanti sono verificati da test con corrispondenti agarosio rivestite con specifici lectine glycoepitope riconoscimento. Grazie alla facilità di sintesi, il controllo stretto delle composizioni di prodotto e la buona riproducibilità della reazione, questo protocollo possono essere tradotti verso preparazione di altri glycopolymers basato RAFT-con strutture e composizioni specifiche, come desiderato.

Introduction

Negli ultimi due decenni, le indagini con glycopolymers sintetici hanno subito uno sviluppo lento ma continuo, dimostrando un notevole potenziale in esame i meccanismi infettivi che comprendono la ricerca che si concentra sul riconoscimento lectina processi 1-3. Poiché glycopolymers sintetici possiedono frazioni di zucchero polivalenti presentano efficacies lectina vincolante molto più elevati, rispetto ai carboidrati monovalenti, sono di grande richiesta nel campo glycobiology 3. Di particolare interesse per la ricerca clinica è l'uso di glycopolymers fluorescenti per caratterizzare il legame con carboidrati disponibili sulla superficie delle cellule respiratorie umane e glicoproteina mucose batterica lectina-mediata. All'inizio studi in vitro impiegato in commercio glycopolymers basato poliacrilammide-in batteriche prove vincolanti. Molte di queste sonde hanno mostrato risultati promettenti, ma ha sollevato preoccupazioni per quanto riguarda, obtainability, e da lotto a lotto variazioni sia in polpeso molecolare Ymer e contenuti glycoepitope. Un protocollo economico in laboratorio è stato sviluppato che fornirebbe un controllo soddisfacente di contenuti la struttura, le dimensioni, e la purezza di glycopolymers sintetiche destinate lectine batteriche.

Alla ricerca di un approccio sintetico atto a glycopolymers, una tecnica relativamente nuova di polimerizzazione è stata testata utilizzando un tipo di polimerizzazione radicale controllato che ha impiegato oltre reversibile-frammentazione catena di trasferimento (RAFT) agenti 4. Tali reagenti RAFT sono state recentemente utilizzate in alcune preparazioni glycopolymer 5-7. Rispetto ad altri protocolli di preparazione glycopolymer, polimerizzazioni RAFT-mediata dimostrano diversi vantaggi, tra cui la tolleranza ad una varietà di strutture monomeriche e condizioni di reazione, potenzialità compatibilità con le soluzioni acquose, e basso dispersity dimensioni dei prodotti polimerici desiderati 8,9. Di notevole interesse sono i protocolli per la preparazione di RAFT-baglycopolymers tri-componente sed che consente il controllo di composizioni di monomeri diversi, ciascuno dei quali può avere funzioni distinte 10-13. Tuttavia, la maggior parte dei precedenti sforzi di ricerca sia mancavano anomerico carboidrati pendente 10, o impiegati intensificati polimerizzazioni conseguente copolimeri tri-blocco, che consistono di omopolimeri covalentemente legate, che spesso servono scopi diversi polimeri che sono copolimeri statistici in cui la sequenza di monomero residui seguono una regola statistica 9-13.

Recentemente, impiegando il composto RAFT thiocarbonylthio (acido 4-cyanopentanoic) -4-dithiobenzoate in ambiente acquoso, la preparazione di un gruppo di RAFT-basato glycopolymers statistici tri-componente lineari contenenti specifici zuccheri sospensione e loro applicazione in lectina-mediata batterica vincolante test è stato segnalato 14. L'obiettivo generale di questo metodo, presentato in modo visivo, è quello di preparare tri-componenteglycopolymers fluorescenti statistici tramite copolimerizzazione ZATTERA controllata. A causa della facilità del protocollo polimerizzazione di uno stadio, il controllo fine della lunghezza polimero e composizioni, e l'elevata riproducibilità della reazione, questo protocollo può essere facilmente applicato ad altre sintesi basata RAFT-di glycopolymers con strutture desiderati.

Protocol

1. Sintesi di 2-Glycomonomer Lactobionamidoethyl metacrilammide

  1. Sciogliere 2 g di acido lattobionico in 3,0 ml di metanolo anidro e aggiungere lentamente etanolo assoluto in maniera saggia goccia fino a quando la soluzione diventa torbida solo, quindi rimuovere i solventi via rotoevaporation.
  2. Sciogliere il residuo, dal punto 1.1, in 3,0 ml di metanolo anidro e, ancora una volta, aggiungere lentamente etanolo assoluto fino a poco nuvoloso, poi evaporare i solventi via rotoevaporation. Ripetere questa operazione per 3 volte per ottenere lactobiono-1,5-lattone (1,94 g, il 98% di resa). Questo prodotto è di purezza sufficiente per essere utilizzato nei seguenti reazioni.
  3. Aggiungere 1,0 g di lactobionolactone in 3.0 ml di metanolo per N - (2-amminoetil) metacrilammide (Aema, 0,58 g) e idrochinone monometil etere (MEHQ, 1,0 mg), un inibitore di auto-polimerizzazione, in 2,0 ml di metanolo, seguita da 1,0 ml di trietilammina. Mescolare a temperatura ambiente per 48 ore.
  4. Aggiungere 20 ml di H 2 O deionizzata (DH 2
  5. Per rimuovere qualsiasi lattobionico rimanente, aggiungere 20 ml di dH 2 O, quindi passare la soluzione acquosa attraverso una colonna a scambio anionico (OH - modulo 10 mm x 20 mm) in un bicchiere di ricezione contenente 1,0 mg di MEHQ.
  6. Rimuovere trietilammina, prodotta nel passo 1.5, per evaporazione a secchezza tramite rotoevaporation.
  7. Aggiungere 20 ml di dH 2 O e rimuovere reagito Aema aggiungendo lentamente 1 mg aliquote di resina a scambio cationico (forma H +) fino a quando non ninidrina materiali reattivi sono rilevabili. Monitorare la rimozione prendendo 1 microlitri aliquote della soluzione dopo ogni aggiunta resina, applicandola ad una piastra cromatografia su strato sottile, quindi spruzzando la piastra con ninidrina 2% in soluzione di etanolo. Quando nessun colore blu profondo è osservato lo sviluppo quando la piastra viene riscaldata a 90 ° C per 1 min, il punto finale è stato raggiunto.
  8. Rimuovere MEHQ dal campione sciogliendo il materiale liofilizzato in una quantità minima di metanolo (~ 0,5 ml), quindi aggiungere acetone anidro freddo (-20 ° C, 15 ml) per precipitare il prodotto. Raccogliere il precipitato per filtrazione usando un imbuto di vetro sinterizzato, quindi asciugare il precipitato in un essiccatore sotto vuoto per ottenere 2-lactobionamidoethyl metacrilammide (LAEMA) come polvere bianca (0,94 g, 68% di resa). Questo prodotto è di purezza sufficiente per essere utilizzato nei seguenti reazioni.

2. Sintesi di monomero 2-Gluconamidoethyl metacrilammide

Nota: La preparazione di 2-gluconamidoethyl metacrilammide (GAEMA), che non possiede uno zucchero pendente, è stato adattato da un metodo pubblicato 15.

  1. Aggiungere 2,0 g di Aema sciolti in 10 ml di metanolo ad una soluzionedi D-gluconolattone (1,6 g) in 30 ml di metanolo e, sotto agitazione, aggiungere lentamente 1,6 ml di trietilammina.
  2. Mescolare la reazione a temperatura ambiente per 24 ore.
  3. Filtrare il prodotto precipitato utilizzando un imbuto di vetro sinterizzato e lavare il precipitato tre volte con 10 ml ciascuna di isopropanolo, poi lavare con 10 ml di acetone secca. Essiccare il prodotto precipitato in un essiccatore sotto vuoto.

3. ZATTERA Glycopolymer Sintesi

  1. Per rimuovere il MEHQ inibitore presente in N commerciale - (2-idrossietil) acrilammide (HEAA), aggiungere 1 ml di HEAA in una provetta 2 ml microcentrifuga, seguita da aggiunta di 0,5 g di nanoparticelle di ossido di alluminio. Centrifugare la provetta a 300 xg per 30 sec, e utilizzare lo strato HEAA superiore nella seguente reazione.
  2. Aggiungere con cautela 32,8 mg di LAEMA (70,0 mmol), 1.7 mg di Aema (10,5 mmol) e 27,5 ml di HEAA (270 mmol), tutti sciolti in 0,4 ml di dH 2 O, a un ben pulita tubo 1 ml Schlenk, quindi avendo un Monomer rapporto molare di 20: 3: 77.
  3. In una reazione parallela, per produrre polimeri di controllo che non possiedono lo zucchero pendente, al posto di usare LAEMA al punto 3.2, sostituire 21,4 mg di GAEMA (70,0 mmol) in reazione.
  4. Per il rispettivo tubo Schlenk (ad esempio, 3.2 o 3.3), in sequenza aggiungere 50 ml di DMF contenente 0,53 mg di (acido 4-cyanopentanoic) -4-dithiobenzoate (1.9 mmol, agente ZATTERA), e 50 ml di DMF, contenente 250 mg di 4,4-azobis- (acido 4-cyanovaleric) (0,9 mmol, iniziatore). Mescolare delicatamente con le dita toccando.
  5. Congelare i contenuti contenuti nel tubo Schlenk impiegano un ghiaccio secco: bagno di etanolo (75 g di ghiaccio secco in 100 ml di etanolo), applicare il vuoto entro 10-50 mTorr, quindi chiudere la valvola Schlenk e permettere la soluzione per scongelare lentamente per RT . Ripetere questo ciclo di gelo-disgelo evacuare-due volte. Assicurarsi che tutti i reagenti si dissolvono dopo l'ultimo disgelo.
  6. Posizionare il tubo Schlenk in un ba plastica richiudibileg, evacuare l'aria della borsa, e poi sigillarlo. Trasferire il sacchetto contenente il tubo Schlenk ad un bagno di acqua preriscaldata a 70 ° C e incubare per 24 ore.
  7. Trasferire accuratamente la soluzione nel tubo Schlenk ad un sacchetto di dialisi preparata (MWCO = 3,500), e dializza contro dH 2 O (10 x 2 L) per 24 ore, cambiando il dH 2 O ogni ora per le prime 8 ore. Dopo la dialisi, trasferire il campione dal tubo di dialisi in una provetta, congelare il campione a -80 ° C, e poi liofilizzare esso.

Nota: Il risultante statistico poli-metacrilammide / acrilammide (PMA) copolimeri contenenti ciondolo 4- O -β-D-galattopiranosil-D-gluconamide (lactobionamide) (dal punto 3.2) o D-gluconamide (dal punto 3.3), rispettivamente, sono ottenuto. Per comodità di discussione, questi due glycopolymers sono abbreviati come PMA-LAEMA e PMA-GAEMA rispettivamente.

4. Postmodifica di Glycopolymers con Fluorofori

  • Sciogliere 5.0 mg di glycopolymer PMA-LAEMA o PMA-GAEMA contenente ~ 0,9 micromol di gruppi funzionali amminici primari in 0,9 ml di tampone fosfato salino (PBS, 0,1 M fosfato di sodio, 0,15 M di NaCl, pH 7,5), rispettivamente.
  • Aggiungere lentamente 0,6 mg di estere carboxyfluorescein succinimidil in 100 ml di DMF alle soluzioni con una rapida agitazione. Mescolare delicatamente le reazioni di 16 ore al buio a temperatura ambiente.
  • Mentre riparo dalla luce, caricare il campione in un tubo di dialisi preparata (MWCO = 3.500) e dializza contro dH 2 O (2 L) per 16 ore, cambiando la soluzione di dialisi ogni ora per le prime 8 ore. Dopo la dialisi, trasferire il campione dal tubo di dialisi in una provetta, congelare il campione a -80 ° C, e poi liofilizzare esso.
  • Nota: Dopo la liofilizzazione, glycopolymers fluorescenti PMA-LAEMA-fluoresceina e PMA-GAEMA-fluoresceina, rispettivamente, si ottengono.

    5. Caratterizzazione del Glycopolimeri

    1. Determinare il peso molecolare medio numerico (M n), il peso molecolare medio ponderale (M w) e dispersità (M w / M n) delle glycopolymers su un sistema di HPLC commerciale dotato di cromatografia a permeazione di gel software (GPC), un GPC colonna adatto per il peso molecolare di interesse, e un rivelatore dell'indice di rifrazione, con 0,1 M Tris / 0,1 M tampone di cloruro di sodio (pH 7) come eluente a una portata di 0,6 ml / min 14. Utilizzare standard di polietilene glicole come standard di peso molecolare (MW: 200-1,200,000 g / mol).
    2. Quantificare le concentrazioni reali di gruppi funzionali amminici primario all'interno delle glycopolymers 16. Analizzare il contenuto totale di carboidrati dei glycopolymers sintetizzati secondo un metodo pubblicato 17.
    3. Eseguire prove di composizione strutturale e la purezza del glycomonomers LAEMA, GAEMA e glycopolymers PMA-LAEMA, PMA-GAEMA in D 2 O mediante spettroscopia NMR 14.

    6. I test vincolante delle Glycopolymers sintetiche con lectina rivestite agarosio

    1. Aggiungere 1,5 ml di PBS per 50 ml di sospensione del crista-galli Erythrina lectina (ECL) agarosio Rivestiti, centrifugare a 300 xg per 1 minuto e rimuovere con attenzione e smaltire il surnatante. Ripetere questa operazione due volte, e poi risospendere le sfere in 0,5 ml di PBS.
    2. Aggiungere 3 g di PMA-LAEMA-fluoresceina o PMA-GAEMA-fluoresceina (controllo negativo) in 6 ml di PBS alla sospensione perline, e incubare le miscele, al buio, a temperatura ambiente per 1 ora.
    3. Lavare le miscele con 1,5 ml di PBS per tre volte, e perline risospendere in 0,2 ml di PBS. Caricare un aliquota (4 ml) in un pozzo su un vetrino da microscopio immunofluorescenza (rivestiti in teflon), coprire con un vetrino, e osservare al microscopio a fluorescenza utilizzando un filtro FITC (lunghezza d 'onda di eccitazione: 467-498 nm, lunghezza d'onda di emissione: 513- 566 nm) e un obiettivo 10X per esaminare il legame di tegli fluorescente glycopolymers con le perline 14.

    Representative Results

    Sintesi di glycomonomer

    Lattobionico è stato utilizzato qui come esempio per la preparazione di glycomonomers. Utilizzando metodi nel rapporto iniziale sulla sintesi di LAEMA 11, sono stati osservati i rendimenti varie in preparazione con la purezza insoddisfacente. Il metodo di purificazione modificata con resine cationiche e scambio anionico per rimuovere il materiale di partenza non reagito offerto resa del prodotto stabile e elevata purezza, che è confermato da 1 H e 13 C spettroscopia NMR (figura 1).

    ZATTERA sintesi glycopolymer e post-modifica di glycopolymers con fluorofori

    In contrasto con i blocchi-glycopolymers preparati tramite polimerizzazione RAFT gradini, questo protocollo copolimerizzazione one-step fornisce una distribuzione uniforme glycomonomer catena polimerica. I glycopolymers indicati qui contengono il 20% in moli di glycomonomer, 77% in moli di HEAA come distanziatore, e 3% in moli di Aema come bersaglio per la post-modifiche (vedere Figura 2). 1 H- 13 e spettroscopia C-NMR confermano le strutture di PMA-LAEMA e PMA-GAEMA (figure 3 e 4). Come mostrato in figura 5, quando tracciata contro i profili di eluizione GPC del glycopolymer sintetizzato senza RAFT, sia PMA-LAEMA e PMA-GAEMA hanno bassi dispersities, dimostrando l'efficacia dell'approccio RAFT. Come previsto, PMA-GAEMA ha una M n inferiore a quella di PMA-LAEMA causa della mancanza di uno zucchero pendente del PMA-GAEMA. Analisi dei carboidrati e amminici primari gruppi funzionali contenuto delle glycopolymers RAFT rivelato che il rapporto di monomeri nelle glycopolymers prodotto è coerente con il rapporto stechiometrico di monomeri impiegati nella reazione di polimerizzazione RAFT-mediata (Tabella 1) a partire. Questo significa uno stretto controllo del compositio monomerons nelle glycopolymers sintetizzati, come progettato.

    Reazione di gruppi funzionali amminici primari con fluorofori attivate è una tecnica largamente usata in etichettatura proteine. Questa tecnica è stata impiegata qui per etichettare glycopolymers purificati con carbossifluoresceina. Dopo postmodifica, polimeri fluorescenti sono stati ottenuti (Figura 6). Nessuna degradazione dei polimeri fluoresceina nella reazione è stata rilevata mediante analisi GPC (dati non mostrati).

    Binding prove dei glycopolymers sintetici con agarosio perline lectina rivestite

    Per valutare la specificità-lectina legante dei glycopolymers sintetizzati, è stato utilizzato lectina rivestito agarosio con carboidrati nota specificità di legame. Crista-galli lectina Erythrina (ECL), impiegati negli esperimenti, ha una specificità di legame verso β-D-galactoside. Figura 7A dimostra chiaramente che PMA-LAEMA-Flfluoresceina, che contiene β-D-galattoside come carboidrato pendente, espone forte legame con la lectina ECL. Al contrario, il legame al ECL della glycopolymer PMA-GAEMA-fluoresceina, che non possiede uno zucchero pendente negativo, è mostrato in Figura 7B. Questo risultato esemplifica l'efficacia di legame e l'affinità del glycopolymer fluorescenti sintetizzato.

    Figura 1
    Figura 1. assegnato 1 H (a), e 13 C-NMR (b) gli spettri (D 2 O) per LAEMA. (Questo dato è stato modificato da Wang et al. 14) Clicca qui per vedere una versione più grande di questo figura.

    <p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Figura 2
    Figura 2. Rappresentazione schematica della sintesi di glycopolymer fluorescente PMA-LAEMA contenenti β-galattoside come lo zucchero ciondolo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 3
    Figura 3. assegnato 1 H (A) e 13 C-NMR (B) spettri (D 2 O) per PMA-LAEMA glycopolymer. (Questo dato è stato modificato da Wang et al. 14) PleaSE Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 4
    Figura 4. assegnato 1 H (A) e 13 C-NMR (B) spettri (D 2 O) per PMA-GAEMA. (Questo dato è stato modificato da Wang et al. 14) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 5
    Figura 5. gel cromatografia a permeazione di tracce di base-ZATTERA PMA-GAEMA e PMA-LAEMA preparati con e senza l'utilizzo di agenti ZATTERA. In contrasto con il PMA-LAEMA preparato senza RAFT agente (blu), il rafting basata PMA-LAEMA (verde) ha un dispersity molto inferiore (M w / M n). A base di ZATTERA PMA-GAEMA (rosso) e PMA-LAEMA hanno profili simili GPC, ma il primo ha una più piccola M n causa della mancanza di zuccheri pendenti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 6
    Figura 6. PMA-LAEMA prima e dopo la post-modifica con fluoroforo. (A) Rispetto bianco-etichettato glycopolymer (tubo a sinistra), marcato con fluoresceina PMA-LAEMA presenta con un colore giallo forte (tubo a destra). (B) Sotto UV, non marcato PMA-LAEMA (tubo sinistro, 1 mg / ml in PBS) è scuro e presenta alcuna fluorescenza, mentre fluoresceina PMA-LAEMA (tubo a destra, 1 mg / ml in PBS) spettacoli forte fluorescenza verde.: //www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg "Target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 7
    Figura 7. Erythrina crista-galli lectina (ECL) agarosio Rivestiti legano β-D-galattoside contenenti glycopolymers, e non quelli che non possiedono uno zucchero ciondolo. (A) PMA-LAEMA-fluoresceina (3 mg) ha dimostrato forte legame con ECL , mentre in (B) PMA-GAEMA-fluoresceina, che possiede nessun residuo ciondolo β-D-galattoside, non hanno mostrato associazione con le perline lectina rivestite. Barra di scala = 100 micron.

    Tabella 1. Valori rivolge ad un dei parametri sintetici e composizioni reali delle glycopolymers. A) Targeting valori, valori chesono desiderata dei prodotti; b) DP, grado di polimerizzazione; c) NA, non disponibile. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    DP b Dispersità Il contenuto effettivo di glycomonomers
    mol%
    Il contenuto effettivo di ammina primaria
    mol%
    Targeting valori 100 <1.3 20 3
    PMA-LAEMA 99 1.26 19 3.2
    PMA-GAEMA 89 1.32 NA c 2.7

    Discussion

    Un protocollo facile ed efficiente per glycopolymers fluorescenti basati ZATTERA tri-componente, con e senza un carboidrato pendente, e il loro utilizzo in un test-lectina legante, è dimostrato in questa relazione. Il protocollo inizia con la preparazione di glycomonomers LAEMA e GAEMA. Attraverso un one-step ZATTERA controllato copolimerizzazione, glycopolymers con resa riproducibile, prevedibile composizione monomero e basso dispersity, si ottengono. A seguito di post-modifica della glycopolymers con estere carboxyfluorescein succinimidil, il legame del rispettivo glycopolymer fluorescente marcato risulta è facilmente verificabile per la sua specificità-lectina legante.

    Nelle fasi preparative iniziali delle glycomonomers che devono essere impiegati nelle successive sintesi glycopolymer, prontamente disponibili lattobionico e gluconolattone stati utilizzati. In teoria, tutti i carboidrati di interesse, da monosaccaridi a oligosaccaridi complessi, può essere converted per glycomonomers coniugando zucchero destinazione sul gruppo ossidrilico primario C6 di glucosio. Dopo l'ossidazione del residuo di glucosio riduzione, e la sua successiva disidratazione per un lattone, il prodotto può quindi essere facilmente fatto reagire con l'ammina primaria Aema per formare il corrispondente glycomonomer. Ulteriori esempi di questo percorso può essere visto in un recente rapporto 14. Va notato che, prima di iniziare qualsiasi fase di polimerizzazione, MEHQ, un inibitore di polimerizzazione potenti, deve essere rimosso da tutte le preparazioni monomero e glycomonomer appena prima dell'uso. Questo viene facilmente eseguita utilizzando la minima quantità di metanolo per sciogliere il glycomonomer che possiede MEHQ poi trattare immediatamente con acetone a -20 ° C per precipitare il prodotto senza inibitore in alto rendimento.

    Indispensabile in ogni schema di polimerizzazione radicale, l'attenzione ai dettagli e monomeri purezze sono enfatizzati. Come è tipico di un sistema di polimerizzazione RAFT, si compone diuna fonte radicali, un reagente RAFT, un monomero e solvente. In questa presentazione visualizzata, un sistema di polimerizzazione RAFT passo singolo è descritto che si concentra sulla produzione di copolimeri statistici generati da una miscela di reazione che possiede tre differenti monomeri in soluzione acquosa. Due reazioni RAFT-mediata separati sono presentati in cui si utilizza un glycomonomer che possiede un pendente, non riducente terminus carboidrati (cioè, β-D-galattosio), e l'altra, in possesso di un poliolo senza residuo carboidrato legato. Comune a entrambe le reazioni RAFT mediata erano monomeri che possiedono un gruppo ossidrile singolare che serve come una molecola distanziale, e un'altra in possesso di una ammina libera per la post-modifica con un fluoroforo ammino-reattiva.

    Poiché la presenza di ossigeno nella miscela di reazione e l'ambiente è dannoso per polimerizzazione RAFT-mediata, la sua rimozione a livello di tracce viene facilmente realizzata mediante vari freeze-evacicli cuate-disgelo mantenendo il recipiente di reazione tubo Schlenk sotto vuoto spinto.

    Va notato che il rapporto molare di differenti monomeri nella reazione può essere regolato secondo necessità. Inoltre, variando la quantità di agente RAFT utilizzato, la lunghezza dei polimeri risultanti può essere controllato 18. Tuttavia, il rapporto molare dell'agente RAFT di iniziatore deve sempre essere maggiore di due per assicurare il basso dispersità del prodotto. In queste condizioni, l'evoluzione della copolimerizzazione è costante, e la riproducibilità della reazione è molto elevata. Detto questo, è improbabile che si ottiene una distribuzione del tutto uniforme di tutti monomeri partecipanti entro un copolimero statistico, a causa delle loro diverse velocità di polimerizzazione. Caratterizzare la distribuzione dei diversi monomeri all'interno del polimero è ancora molto impegnativo.

    Il metodo post-modifica, presentata qui, è al tempo stesso semplice e più amenable l'uso di una più ampia selezione di etichette fluorescenti, rispetto ad altri protocolli applicati a glycopolymers etichetta 2,11. Questi includono molti dei fluorofori ammina reattiva idrosolubili, punti quantici, biotins, e altri. Le specificità di legame dei sintetizzati glycopolymers etichettati sono facilmente verificabili utilizzando lectine con note affinità di legame. PMA-GAEMA possiede senza zucchero ciondolo è un adeguato controllo negativo. Glycopolymers con etichette fluorescenti diversi preparati per questa via sono stati utilizzati con successo in ricerche di lectina-mediata batterica vincolante 14. Come presentato, questa preparazione facile ed efficiente glycopolymers fluorescenti statistici dovrebbe fornire un grande potenziale per una vasta gamma di ricerca glycobiological.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagent
    Lactobionic acid Sigma-Aldrich 153516
    D-Gluconolactone  Sigma-Aldrich G2164
    N-(2-hydroxyethyl) acrylamide (HEAA) Sigma-Aldrich 697931
    Orange II sodium salt Sigma-Aldrich O8126
    Hydroquinone monomethyl ether (MEHQ) Sigma-Aldrich 54050 Polymerization inhibitor
    N-(2-aminoethyl) methacrylamide hydrochloride (AEMA) Polysciences, Inc 24833-5
    Triethylamine Fisher Scientific BP-616
    Anion-exchange resin IRN-78 hydroxide-form, 80 mesh Sigma-Aldrich 10343-U
    Cation-exchange resin 50Wx8, 200 mesh Sigma-Aldrich 217514
    Aluminum oxide, ~150 mesh  Sigma-Aldrich A1522 Type WN-6, Neutral, Activity Grade Super I
    Ninhydrin Sigma-Aldrich N4876 An ethanol solution of 0.2% ninhydrin was used in the test
    4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic acid Sigma-Aldrich 722995 RAFT agent
    4,4′-Azobis(4-cyanovaleric acid) Sigma-Aldrich 11588 Polymerization initiator
    Carboxyfluorescein succinimidyl ester  Life Technologies C1157
    Erythrina Cristagalli lectin coated agarose bead Vector Laboratories AL-1143 
    Solvent
    dH2O Produced by Barnstead water purification system, 18 megOhm-cm
    Isopropanol Fisher Scientific A461-4 ACS grade or better
    Methanol Fisher Scientific A454-4 ACS grade or better
    Absolute ethanol Fisher Scientific BP2818-100 ACS grade or better
    Dimethylformamide Sigma-Aldrich 22705 ACS grade or better
    Acetone Fisher Scientific A929-4 ACS grade or better
    Equipment
    Dialysis membrane (MWCO: 3,500) Spectrum Labs 132720
    Polyethylene glycol analytical standard standard Sigma-Aldrich O2393
    Schlenk tube, 1 ml Quark Glass Customized
    TSK-GEL G4000 PWxl  Tosoh Bioscience  8022 Used for GPC analysis of the glycopolymers
    Empower 3 with GPC/SEC package Waters Corporation
    Waters Alliance HPLC system  Waters Corporation Equipped with refractive index detector (Waters 2414) and fluorescence detector (Waters 2475)
    Avance III 800 MHz NMR Spectrometer Bruker Corporation
    BX43 fluorescence microscope Olympus Corporation Used with FITC filter in the glycopolymer binding test
    Rotavap / Rotoevaporator Heidolph
    Fritted disc funnel Fisher Scientific 10-310-109
    Lyophilizer Labconco
    Immunofluorescence microscope slide Polysciences 18357-1
    Revco Ultima Plus -80 °C Freezer Thermo Scientific
    Plastic Vacuum Bag and Hand Pump Ziploc
    Vacuum Pump, Direct Drive, Maxima C Plus Fisher Scientific
    Vacuum Gauge Sargent-Welch

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    References

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