디지털 핵산 정량 분석​​ 실험의 단순 대량 판독

Biology

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Morinishi, L. S., Blainey, P. Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays. J. Vis. Exp. (103), e52925, doi:10.3791/52925 (2015).

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Abstract

디지털 분석은 세포 및 희소 개별 핵산 분자의 계수의 검출을 가능하게 강력한 방법이다. 그러나 디지털 분석은 일상적으로 인한 비용과 시중에서 판매하는 방법과 관련된 특정 장비에 적용되지 여전히. 여기서 우리는 액적 기반 디지털 벌크 분석법 형광을 측정하는 종래의 실시간 PCR 기기를 사용하여 디지털 액적 분석의 판독을 위해 단순화 된 방법을 제시한다.

우리는 합성 액적 혼합물 및 액적 디지털 다중 변위 증폭 (MDA) 분석을 이용하여 벌크 분석의 판독 성능을 특성화. 디지털 반응 형식에서 양적 MDA는 특히 이점, 그러나 우리의 새로운 방법은 모든 디지털 분석에 적용됩니다. 디지털 PCR 등의 설립 디지털 분석 프로토콜의 경우,이 방법은 속도와 분석 판독을 단순화하는 역할을한다.

우리 벌크 판독 partitione 방법론의 장점을 가져온다전문 판독 장비가 필요없이 D 분석. 이 표준에 대한 요구가 종래의 실시간 실험보다 덜 까다로운 있지만 벌크 판독 방법의 주된 제한, 액적 계산 플랫폼 및 표준 시료에 대한 필요성에 비해 동적 범위가 감소된다. 정량적 전체 게놈 증폭 (WGA)는 WGA 반응에서 오염물을 테스트하는 데 제약 품질 제어 및 우주 생물학 등 다양한 응용 분야에있어서 큰 가능성을 제공 미지 서열과 함께 DNA 단편의 존재를 검출하기위한 가장 민감한 방법이다.

Introduction

핵산 정량 (디지털 PCR) 1-4 및 기본 순서 (서열)에 대한 디지털 분석은 강하게 생명 과학 및 의학에 영향을하고 있습니다. 디지털 분석은, 높은 감도를 제공하는 실험을 통해 용이 한 비교를 가능하게하고, 결정적으로, 비교 데이터 (5) (표 1)을 함유하는 큰 데이터베이스의 구성을 가능하게 절대치 스케일 (제어에 대해 생략)에 분자 계수의 정량화를 제공한다.

지난 15 년 동안, 전체 게놈 증폭 (WGA)은 핵산 증폭 용 PCR 일반 공구로 나란히 나타났다. PCR 원한다면, WGA는 용이하게 검출 또는 염기 서열 분석 등 후속 분석을 위해 사용할 수있는 레벨까지 분 샘플을 증폭 소자에 의해 분석하고 예비 애플리케이션에 유용하다. PCR 달리 WGA 오히려 미지 서열을 포함한 시료 중의 모든 서열의 증폭을 허용하는, 특정 DNA 유전자좌에 특이하지 않다.PCR 및 WGA 간의 기본적인 차이점은 서로 상보 만드는 방법 및 그 응용이 다른 과제가 발생한다.

WGA 반응 (6)의 높은 수율은 단일 분자 (7), 단일 세포 (8) 및 정량 또는 추가 분석을 위해 다른 낮은 바이오 매스 샘플 9에서 게놈 DNA의 일상적인 증폭을 할 수 있습니다. WGA 화학와 관련된 주요 문제는 오염 물질에 극단적 인 감도와 개별 템플릿 분자 (6)에 걸쳐 고르지 증폭 있습니다. 단일 셀 시퀀싱 그러나 WGA는 얻고 인기가 WGA에 의해 WGA 기술 (10), 및 템플릿 정량의 '킬러 애플리케이션'로 떠오르고있다하는 응용 프로그램 (7)의 많은 분야에서 중요하다.

디지털 핵산 정량 계측 이전 판막과 미세 유체 valveless 견적 다양한 설명되었지만액적 기반 분석법을 포함한 TS 11-14, 15, 16 (표 2). 그러나 디지털 분석을위한 상업 미세 유체 시스템은 반응 설치 및 제품 감지 (17)에 대한 전문적인 장비를 필요로한다. 사용자 정의 판막 미세 유체는 유연하지만, 정밀 미세 가공 및 공압 제어 시스템 (18)을 필요로한다. 이 에멀젼 계 디지털 분석법 19,20 용 단 분산 미세 방울을 만드는 비교적 간단하지만, 디지털 판독 대규모 와이드 필드 영상 중 하나를 요구하는 (인기있는 차세대 시퀀싱 기술과 유사) 기술적 부담이다 (21, 22) 또는 고속 액적 검출 23-25 ​​흐름 기반. 이상적으로, 디지털 분석은 복잡한 장비에 대한 필요성을 감소시키고 빨리 판독 될 샘플을 허용하는 다수의, 판독을 위해 셋업에서 간단 할 것이다. 여기에서 우리는 PCR 나는 기존의 실시간 사용하는 디지털 방울 분석의 판독을위한 간단한 방법을 설명nstrument은 액적 기반 디지털 분석의 대량 형광을 측정합니다.

새로운 방식은 디지털 PCR 분석법에 적용 할 수 있지만, (PCR 대해 우수한 결과를 수득)에 문제가있는 실시간 증폭 분석법을하는 아날로그 디지털 WGA 분석에 특히 유리하다. WGA 공통 서열, 길이 및 염기 함량 이질적 주형 분자와 시료에 적용된다. 이들 다른 템플릿 분자는 참조 ( "표준") 특성과 일치하는 샘플의 사용을 필요로, 다른 비율 6에서 증폭된다. 종종, 이러한 표준을 사용할 수 없으며, 또는 수신 된 샘플의 특성을 알 수있다. 입력 질량, 분자의 입력 번호, 둘, 또는 둘의 조합 - WGA 화학의 입력 재료 및 길이 의존 속성 이질성은 26도 정량화되는 것에 모호성을 생성하여 결과 해석을 복잡. F어떤 시퀀스의 오염 물질 분자가 방해 가능성이 있기 때문에 inally, 시퀀스 비 특이도는 정량적 PCR보다 오염 양적 다중 변위 증폭 (MDA) 더 민감 렌더링합니다. 디지털 마이크로 유체 분석은 주형 분자를 편석 적은 오염물 샘플링되도록 반응 부피를 감소시킴으로써 오염을 해결.

여기서 우리는 인기있는 등온 WGA 방법, MDA (27)를 사용합니다. 참고로, PicoPlex 및 MALBAC (28)를 포함하여 여러 가지 다른 WGA 화학은 초기 등온 가닥 변위 단계에 결정적으로 의존한다. 등온 단계 정량적 WGA 아날로그 실시간 분석을 적용하는 과제를 악화. WGA는 어느 쪽도 완전히 설치 중에 방지하지 원치 않는 변수를 미리 증폭으로 이어지는 없으며, 이종 분자의 복제가 완료 구동 및 정지 할 수있는 방식으로 ( "순환") 이산화 할 수 PCR (11) 등의 다음주기에 앞서 (그림 1). WGA위한 디지털 분석법 포맷으로 인해 분석 종말점에서 열거 각 분자의 분리에 전형적인 반응 설정 절차를 수용합니다 원래 판독 정확성은 증폭 효율의 변화는 거의 독립적 것이다 수단 (그래서 사전 증폭은 결과에 영향을 미치지 않는다).

분석 종말점에서 액적마다 신호 레벨이 액적 체적에 의존하므로 분석은, 균일 한 양으로 오일 제조 방울에 따라, 우리는 결과의 일관성 액적 크기의 분포에 걸쳐 평균에 의존하지 않는다. 단 분산 방울을 만드는 것은 이제 (약 3,500 단 분산 방울 논문 2013 년 이후 출판 된) 표준 절차이지만, 마이크로 유체 기기 (25)를 필요로한다. 사실, 여섯 개 이상의 기업들은 방울의 생산에 의존하는 독립적 인 상용 제품을 개발하고, 방울 만들기 마이크로 유체 칩은23,29은 상업적으로 사용할 수 있습니다. 이 연구를 위해, 우리는 사내 (프로토콜 참조) 생산 지정 미세 유체 장치를 사용했다. 주사기를 통해 유동 장치도 시판되고 구동 펌프, 그러나 대안으로, 비용을 줄이기 위해 30 진공 구동 흐름을위한 단일의 일회용 주사기로 치환 될 수있다.

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Protocol

주 :이 프로토콜은 기존 상업용 방울 방울 결정자 23,29 형성 할 수있는 미세 유체 소자를 제작하는 단계, 상기 분석에 대한 필요가 없다.

1. 물방울 형성​​ 미세 유체 소자를 확인

  1. SU-8 마스터 제조 프로토콜에 채널 마스터 주형을 제조 이전 31 약술하지만 방울 생성기 마스크 패턴 (32).
  2. 소프트 리소그래피 (32, 33)의 기술을 이용하여 PDMS의 장치를 제작.

2. 대량 물방울 판독에 대한 반응 믹스를 준비


주 : 프로토콜은 증폭 반응의 다양한 형태를 사용하여 핵산을 정량하는데 사용될 수있다. 예로서, 몇몇 람다 DNA 농도 MDA 필요한 시약 주어진다. 시약 세부 사항은 특정 시약의 표에 나열되어 있습니다. 액적 내의 템플릿의 분포에 의존 sufficien시료의 t 혼합.

  1. 구하거나 Purify를 Phi29 DNA 중합 효소.
    1. 이전에 공급 업체로부터 7 또는 구매 한 바와 같이 Phi29를 정화. 도시 된 실험에 사용 Phi29 정제 하였다.
  2. 65 mM의 KOH, 1.65 mM의 EDTA, 14 mM의 DTT로 구성된 변성 버퍼 10 ㎖를 준비합니다.
  3. 65 mM의 염산, 0.21 M 트리스 (CL)의 pH 7.0, 9 mM 트리스 - CL 산도 8.0 구성된 중화 버퍼 10 ㎖를 준비합니다.
  4. 이러한 뉴 클레아없는 물과 같은 두 가지 기준, 하나없이 템플릿 컨트롤 (NTC), 하나의 높은 템플릿 농도 (4 페이지 주변 / μL 람다 DNA)를 준비합니다. qPCR에 관 변성 버퍼의 3.3 μL 각 표준의 3.3 μl를 변성. 3 분 동안 실온에서 품어. 중화 버퍼의 3.3 μL 각을 끄다.
  5. qPCR에 관 변성 버퍼의 3.3 μL를 사용하여 원하는 템플릿의 3.3 μl를 변성. 3 분 동안 실온에서 품어. 3.3 μL로 담금질중화 버퍼의.
  6. 얼음에 샘플 당 마스터 혼합물의 11 μl를 준비합니다. 배 MDA 반응 마스터 혼합물이 2 배 이중 가닥의 DNA로 구성 (dsDNA) 결합 염료, 배 qPCR에 참조 염료, 50 μm의 무작위 올리고, 2 ㎎ / ㎖ BSA, 배 Phi29 DNA 중합 효소 반응 버퍼, 4.8 밀리미터의 dNTPs, 뉴 클레아없는 물 및 40 μg의 / ㎖ Phi29 DNA 폴리머 라제. 잘 7.5.Mix보다 산도 수준이 매우 높거나 낮은 발생하지 않는 중합 효소를 보장하기 위해 지난 Phi29 DNA 중합 효소를 추가합니다.
  7. 옵션 : 적은 오탐 (false positive)의 경우, 이전에 방울 (34)을 형성하는 자외선을 마스터 믹스를 노출.
    1. 얼음에 0.5 ml의 1.5 ml의 명확한 튜브 샘플 당 예비 혼합물의 10 μl를 준비합니다. 사전 혼합은 55 μm의 무작위 올리고, 2.2 ㎎ / ㎖ BSA, 1.1 Phi29 DNA 중합 효소 반응 버퍼, 5.3 밀리미터의 dNTPs, 및 뉴 클레아없는 물로 구성되어 있습니다.
    2. (34) 기술로 얼음에 물에 튜브를 삽입하고 ACCU에 자외선 (254 nm의)에 노출5.7 J의 mulated 용량 / ㎠.
    3. 사전 혼합물에 40 ㎍ / ml의 dsDNA 결합 배로 염료, 배로 참조 염료 및 Phi29를 추가합니다. 잘 섞는다.
  8. 변성 템플릿 또는 표준의 10 μL 마스터 혼합물의 10 μl를 결합합니다. 잘 섞는다.

3. 물방울 형성

참고 : 물방울 정전기 및 전단 응력에 매우 민감 할 수 있습니다. 정전기가 발생할 수 있습니다 옷을 제거하고 방울을 형성하기 전에 자신을 접지. 최대한 에멀젼에서, 튜브의 상부에서 튜브의 유제를 처리. 피펫 에멀젼 매우 느리게, 바람직하게는 넓은 구멍 피펫 팁과. 피펫 팁으로부터 송출되면, 피펫 속도를 결정하는 팁의 측면에 에멀젼 시계.

  1. 양식 방울. 실험은 도시의 경우, 마이크로 유체 장치는 오일 유입구와 방울을 생성하기위한 유동 포커싱 접합 두 수용액 유입구를 갖는다. 두 syri를 사용하여NGE 20,000 NL 1 방울을 생성하기 위해 마이크로 유체 칩을 통해 오일의 계면 활성제 및 55 μL의 반응 혼합물을 20 μL의 유량을 제어하는​​ 펌프.
  2. 이것은 계면 활성제 많은 오일 소적을 함께 제조 할 수 있지만, 조성물은 매우 높은 온도에서 및 시간에 걸쳐 방울의 안정성에 영향을주는 것 : 참고. 하나의 가능한 조합은 음이온 성 계면 활성제와 19,35 불소화 오일 HFE 7500이다.
  3. 임의의 방법 13,36 어떠한 크기로 액적들을 생성하지만, 액적 인구 크기 변동은 벌크 형광, 따라서 분석의 정확성에 영향을 미칠 것이다. 도시 된 실험에서, NL 1 방울의 양을 가진 단 분산했다.
  4. PCR 튜브에 물방울과 오일을 모두 수집합니다. 각 샘플에 대해, 나누어지는 30 광학 모자와 신선한 PCR 튜브에 오일 μL, 오일 위에 방울의 20 μl를 전송합니다. 일관된 볼륨은 분석이 교류로인지 확인가능한 보좌 신부.
  5. 닫기 튜브는 느슨한 모자는 오일이 증발 할 수로, 단단히 모자.

4. 등온 증폭

  1. PCR 용 열 순환기, qPCR에의 열 순환기, 또는 핫 플레이트를 이용하여, 7 시간 동안 30 ° C에서 샘플들을 배양하고, 75 ℃에서 1 분 동안 불 활성화. 방울의 튜브는이 시점에서 몇 시간 동안 호일로 덮여 냉장고에 남아있을 수있다.

5. 데이터 수집 및 분석

  1. 즉시 qPCR에의 열 순환기를 이용하여 모든 샘플에 대해 형광 염료 농도를 측정하고, 반응을 불활 다음. 최적의 필터 설정은 염료의 여기 및 방출 스펙트럼에 의존 할 것이다. 예를 들어, dsDNA 염료 - 결합에 대해 설정 492 내지 516 nm의 필터 및 기준 염료에 대해 설정 585 내지 610 nm의 필터를 사용한다. 다른 형광 측정 기술은 형광을 정량하는 데 사용될 수있다.
  2. 각 샘플에 대해,에 의해 결합 dsDNA 염료의 형광 강도를 분할기준 염료의 형광 강도. 모든 시료에서 배경 형광, 또는 아니 템플릿 제어 정규화 형광을 뺀다.
  3. 표준에서 수정 된 형광 측정을 사용하여 선형 표준 곡선을 작성합니다. NTC 표준은 0 % 형광 방울과 샘플에 대한 형광 ( "모든 부정")를 나타내며, 높은 템플릿 농도 형광 측정은 100 % 형광 방울과 샘플에 대한 기대 형광 ( "모든 긍정적")입니다. 대응하는 표준 곡선을 사용하여, 그들의 대량의 형광에 기초하여 양 및 음의 액적 중간 비율을 예측한다.

6. 일으키기 방울 원리 증명 측정을위한

  1. 형광 (포지티브) 방울을 0.1 ng를 람다 DNA, 1X dsDNA 결합 염료, 1X 기준 염료, 1.5 유닛의 Taq DNA 중합 효소, 10 mM의 트리스 -HCl, 50 mM의 KCl을, 1.5 m 이루어진 PCR 반응 혼합물을 제조M의 MgCl 2, 0.2 밀리미터의 dNTP, 0.5 μM 프라이머. 전술 한 바와 같이 혼합물을 30 회 (20 초, 20 초, 1 분, 72 ° C, 55 ° C, 95 ° C) 열 순환 후 액 적을 형성한다.
  2. 비 형광 (네거티브) 방울을 : 1X dsDNA 결합 염료 이루어진 PCR 반응 혼합물을 제조, 1X 기준 염료, 1.5 유닛의 Taq DNA 중합 효소, 10 mM의 트리스 -HCl, 50 mM의 KCl을 1.5 밀리미터의 MgCl 2, 0.2 mM의 dNTP를, 0.5 μm의 프라이머. 혼합물을 30 회 (20 초 동안 95 ° C, 20 초, 1 분, 72 ° C, 55 ° C)를 선택한 다음, 열 순환 액 적을 형성한다.
  3. 미리 혼합 비율 액적 형성
    1. qPCR에 튜브에 불소 오일의 20 μl를 배포, 증발을 방지 할 수있는 광학 캡 커버.
    2. 오일의 상단에 부정적인 비율 : 부드럽게 원하는 양에 잘 혼합 된 방울의 10 μl를 피펫. 의 결과에 긍정적 인 : 음 방울 비율은 1 (모든 긍정적 인), 0.8, 0.5, 0.2, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, 0 (모든 NEG했다극상).
  4. qPCR에의 열 순환기를 사용하여 모든 샘플에 대한 형광 염료 농도를 측정한다. 이 프로토콜의 경우, 결합 dsDNA 염료에 대해 설정 492 내지 516 nm의 필터 및 기준 염료에 대해 설정 585 내지 610 nm의 필터를 사용한다.
    1. dsDNA가 기준 형광 염료를 사용한 형광 염료 결합 정상화. 또한 "모든 긍정적"샘플의 형광으로 정상화.
  5. "모든 긍정적"과 "모든 부정"샘플에서 정규화 된 형광 측정을 사용하여 선형 표준 곡선을 작성합니다. 대응하는 표준 곡선을 사용하여, 그들의 대량의 형광에 기초하여 양 및 음의 액적 중간 비율을 예측한다.
  6. 각각의 비율 (N = 3) 독립 방울 형성​​하고 각 복제에 대한 믹싱에 대한 실험을 반복합니다.

7. 원리 증명 MDA 실험

  1. 사양과 람다 DNA 원액의 농도를 측정trophotometer.
    1. 물방울 당 평균 10 템​​플릿 분자에 필요한 템플릿 농도를 계산한다. 이 프로토콜의 경우, 방울 볼륨이 1 NL과 람다 DNA의 1 NG가 약 1.9 × 10 (7) 사본이 포함되어 있다고 가정. 따라서, 방울 당 10 템​​플릿은 NL 당 10 사본 또는 μL 당 526 FG 람다 DNA를 될 것입니다. 방울이 형성 될 때 주형 따라서 높은 초기 주형 농도 / μL 3.2 PG 것이다, ~ 6 배 희석한다.
  2. 직렬 변성 버퍼와 같은 부피의 중화 버퍼와 3.2 PG / μL로 람다 DNA를 희석. 0.1의 희석 배수를 들어, 변성 완충액 45 μl를 10 μl의 샘플을 조합하고 3 분 동안 RT에서 배양한다. 중화 버퍼의 45 LL은 해소에 추가.
  3. 실험 샘플의 나머지 부분을 만드는 단계 7.2에 기재된 바와 같이, 상기 샘플을 희석한다. 표시되는 반응에서 초기 템플릿 농도는 3.2 페이지, 320 FG했다160 FG, 32 FG, 16 FG, 3.2 FG 및 마이크로 리터 당 1.6 FG.
    참고 : mastermix 추가 후 최종 템플릿 농도는 526 FG했다, 52.6 FG, 26.3 FG, 5.26 FG, 마이크로 리터 당 2.63 FG, 526 AG, 263 AG. 방울 당 각각 10, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 예상 람다 사본.
  4. 생성 및 단계 2.5-5.3에 설명 된대로 각 샘플에서 방울을 분석 할 수 있습니다.
  5. 디지털 카메라를 사용하여 도시 된 형광 영상 (도 2,3) RT에서 10 배의 대물 렌즈와 에피 형광 현미경에 장착 획득. 각 샘플에 대한보기의 열두 필드를 취득. 형광 슬라이드로 얻은 배경 이미지로 수정 형광 이미지.
  6. 유화 오일이 빨리 증발로 영상 37 포함 된 실을 사용합니다.
  7. ImageJ에 매크로 (보조 기호 파일)를 사용하여 개별 방울 강도를 분석합니다.
    1. 가장 N 비 형광 액 적을 분리 임계 형광 강도를 선택높은 템플릿 농도 이미지의 형광 방울에서 TC 이미지. 각각의 미지 시료에 대하여, 임계치 이상의 형광 강도와 방울의 비율을 계산한다.

8. PCR 및 MDA 벌크 반응

  1. PCR 반응을 준비합니다.
    1. 직렬 0.1 희석 배수와 템플리트 DNA를 희석. 각각의 희석, 변성 버퍼의 45 μL와 템플릿의 10 μl를 결합하고 3 분 동안 실온에서 품어. 중화 버퍼의 45 μL로 희석을 결합합니다.
    2. 샘플 당 PCR의 mastermix 20 μl를 준비합니다. 1.1 PCR 반응 마스터 혼합물의 Taq DNA 중합 효소 μL 60 대 / 11 mM 트리스 - 염산, 55mM의 KCl, 1.65 밀리미터의 MgCl 2, 0.22 밀리미터의 dNTP 구성, 1.1 염료, 1.1 참조 염료, 550 nm의 dsDNA 결합 각각의 프라이머.
    3. 희석 템플릿의 2 μL 및 mastermix 20 μl를 결합합니다.
      참고 : 최종 템플릿 농도 T에그는 도시 반응을 PCR 50 페이지, 5 페이지, 500 FG, 마이크로 리터 당 50 FG, 5 FG, 500 AG 및 0g 람다 DNA했고, 세중의에서 수행되었다.
    4. 다음 프로그램 qPCR에 기계의 열 순환 PCR 반응. 2 분 동안 72 ℃에서 2 분 전에 30 초, 30 초, 20 초 동안 57 ° C, 72 ° C ~ 95 ° C의 40주기를 실행하고 4 ℃에서 유지.
    5. dsDNA는 참고 염료 형광 이전에 추가 분석을 이용하여 염료 형광 결합 정상화.
  2. MDA 반응을 준비합니다.
    1. 단계 8.1.1에 설명 된대로 샘플을 희석.
    2. 얼음에 샘플 당 마스터 혼합물의 11 μl를 준비합니다. 배 MDA 반응 마스터 혼합물 배 dsDNA 결합 염료, 배 기준 염료, 50 μm의 무작위 올리고, 구성 2 ㎎ / ㎖ BSA, 배 phi29 DNA 중합 효소 반응 버퍼, 4.8 밀리미터의 dNTPs, 뉴 클레아없는 물, 40 ㎍ / ㎖의 Phi29 DNA 중합 효소.
    3. 40 μg의에 Phi29 DNA 중합 효소를 추가 / 중합 효소 개발을 위해 지난 ㎖로OES 7.5 이상의 pH 값이 더 높거나 낮을 발생하지. 잘 섞는다.
    4. qPCR에 관 변성 버퍼의 3.3 μL로 희석 템플릿의 3.3 μL를 변성. 3 분 동안 실온에서 품어. 중화 버퍼의 3.3 μl를 추가합니다.
    5. 변성 템플릿의 10 μL 마스터 혼합물의 10 μl를 결합합니다. 잘 섞는다.
    6. 다음 프로그램 qPCR에 기계에서 MDA 반응을 실행합니다.
    7. 형광마다 7.5 분을 측정, 4 시간 동안 30 ° C에서 잡으십시오.
    8. 1 분 동안 75 ℃에서 비활성화.
    9. dsDNA가 기준 형광 염료를 사용한 형광 염료 결합 정상화. 또한, 각 샘플의 최대 형광 의해 정상화.

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Representative Results

종래의 벌크 / 실시간 정량적 PCR이 판독 및 WGA 정량 분석 (도 1) 모두에 사용될 수 있지만, 디지털 정량 분석은 이점이있다 (표 1)을 제공한다. 기재된 방법에서는 단순한 벌크 종료점 측정 (도 2)과 미세 액적 형태로 디지털 분석법을 판독. 이 방법은 광범위하게 적용 할 수 있지만이 방법은 기존의 실시간 분석을위한 특별한 도전을 제시하기 때문에, 우리는 양적 WGA (MDA)에 초점을 맞추고있다.

우리의 실시간 PCR 장비는 오일에 분산 형광 미세 방울의 다양한 분수를 감지 할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 우리는 형광과 비 형광 방울 (그림 2)의 합성 혼합물의 대부분 형광을 측정 하였다. 벌크 형광 양성 액적 카운트 (독립적 형광 현미경에 의해 평가)이 예상대로 (형광 방울의 입력 부분과 선형 스케일도 3a). 실험은 각각의 세트에 대해 독립적으로 액적 형성 및 혼합하여, 세번 수행 하였다.

"알 수없는"샘플에 대한 이론적 정량 성능을 평가하기 위해, 우리는 완전히 긍정적이고 완전히 음성 대조군 샘플을 사용하여 선형 표준 곡선을 설립했다. 이러한 물방울 많은 별 표준 곡선으로, 우리는 각 샘플의 벌크 형광을 기반으로 합성 양극과 음극 방울 혼합물의 비율을 계산 하였다. (도 3B R 2 = 0.984) 결과는 동적 범위의 두 로그에서 방울 비 정량에 좋은 성능을 보여줍니다. 입력 된 분석 물 농도를 용이하게 양 또는 음의 액적 (38)의 비율로부터 계산된다.

실제 양적 WGA 분석에 우리의 방법을 테스트하기 위해, 우리는 위스콘신 주에 걸쳐 형광 수준과 람다 DNA와 디지털 방울 MDA 분석의 긍정적 인 방울의 비율을 측정 농도의 드 범위 (그림 4). 도 4b에, 액적 대표적인 형광 화상이 표시된다. 방울 당 평균 템플릿 예상대로 디지털 MDA 샘플들로부터 모두 벌크 형광 양성 분획은 액적 부피 판독 충실히 디지털 분석 (= 0.927 R 2)의 결과를 캡처 할 수있는 것을 나타내는 척도. 우리는 독립적 인 방울을 형성하고 각 복제에 대한 WGA를 실시, 각 농도에 대한 실험을 반복했다.

표 1
표 1. 실시간 디지털 분석의 요약. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

able2.jpg "/>
표 핵산 정량을위한 기존의 방법 2. 요약. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 1
그림 1. 실시간 정량 PCR 및 람다 DNA. MDA의 MDA는 PCR과 같은 온도 사이클을 통해 이산화, 얼음에 신중하게 준비하지 않을 경우 프리 앰프하는 경향이되지 않습니다. 여기에, 정량 PCR 및 MDA는 람다 DNA의 농도가 증가 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
Figur소적과 대표 화상의 판독의 아날로그 전자 도식. (A)가 양 및 음의 방울이 미세 유체 소자에 형광 및 비 형광 시약으로부터 생성 하였다. 음의 비율 : 물방울은 상이한 양에 미리 혼합 하였다. 벌크 형광 레벨은 표준 실시간 열 순환기로 측정하고, 양 액적 분획을 형광 현미경으로 측정 하였다. (B) 대표 형광 긍정적 방울 (스케일 바 = 200 μm의)의 비율을 증가시키는 이미지를 입혔다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. 대량 형광 별도로 준비 긍정적이고 부정적인 drople 조합의 형광 분수TS. (A) (양의) 형광 및 비 형광 (네거티브) 액 상이한 비율로 예비 혼합 하였다. 형광 측정 벌크 긍정적 액적 입력 분획의 양을 측정하고 비교 액적 분획 (N = 3, 바 +/- SD를 나타낸다). 점선은 선형 관계 주어진 기대 형광 분율을 나타낸다. 예상 형광 입력 분율 기준에 기초하여 예측 된 비율 (B) 비교. 라인이 선형 관계 주어진 기대 값을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
도 4 벌크 형광 액적 디지털 MDA 에세이. 디지털 MDA 형광 분획을 실시 하였다 increasing 템플릿 람다 DNA (N = 3, 오차 막대는 SD를 나타낸다)의 농도 및도 2a에 설명한 바와 같이 측정. 라인은 본 실험에서 데이터를 모델링 푸 아송 분포를 이용하여 예상 형광 분율을 나타낸다. B) 대표 형광이 방울 (NTC, 0.005, 0.05, 0.5, 10) 당 예상 람다 DNA 분자를 증가시키기위한 반응의 불 활성화 (스케일 바 = 200 μm의) 후 물방울의 이미지를 입혔다. 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다 .

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Discussion

디지털 분석법 희귀 세포의 검출 및 핵산 분자의 개인의 계산을 가능하게 강력한 방법이다. 그러나, 디지털 분석은 여전히​​ 통상적으로 시판되는 방법과 관련된 특수 장비의 비용을 부분적으로 분석 실험실에서 기인인가되지 않는다. 여기서 우리는 표준 정량 실시간 PCR 기계를 사용하여 단순화 된 아날로그 판독하여 핵산을 정량 종점 디지털 분석법을 설명한다. 이 방법은 설정 신속하고, 판독 방울 계산 방법보다 훨씬 간단하다.

우리의 분석은 표준 장비를 사용하여 한꺼번에 종점 측정 편의상 개별 액적 측정 단일 분자 (단일 액적) 감도 상실. 우리의 디지털 MDA 실험에서 우리는 형광 현미경 실제 FRA의 확인에도 불구하고, 배경에서 200 부정적인 방울 당 1 개의 긍정적 인 물방울보다 구별 할 수 없습니다긍정적 인 방울의 ction의 (그림 4) 예상대로. 대량 형광 측정 한계에 감도와 배경 낮은 양의 물방울 분수의 대량 측정 분석의 감도. 높은 감도가 필요한 경우, 디지털 판독하는 것이 좋습니다. 오일 레벨 또는 벌크 액적 부피의 차이는 크게 형광 샘플 데이터에 영향을 미칠 수있다. 기준 염료도 정상화 오일 볼륨 형광 읽기에 만드는 차이를 만들 수 없습니다. 그것은 검정 체적, 장비 획득 파라미터 마이크로 웰 형상, 또는 광학 필터를 최적화하는 것은 분석 성능을 향상시킬 수있다.

감도 및 벌크 분석법 디지털 동적 범위는 또한 파티션 크기를 최적화함으로써 개선 될 수있다. 큰 방울 도구 적 배경을 극복하고 낮은 입력 농도에 대한 감도를 향상시킬 수있는 각 템플릿 분자에서 형광 제품의 더 많은 양을 얻을 수 있습니다. 에다른 한편으로는, 더 작은 방울 분석 부피당 분자의 분리를 허용한다. 주형 농도는 샘플에 걸쳐 매우 가변적이면 크고 작은 액적 반응은 분석의 동적 범위를 확장하기 위해 39 병렬로 수행 될 수있다.

일관된 방울 볼륨은 또한 정확한 측정을 위해 필요하다. 많은 마이크로 유체 맞춤 솔루션은 직렬 및 병렬 19,40 41,42 모두 급속 샘플로부터 단 분산 액 적을 형성하기 위해 존재한다. 몇몇 병렬로 여러 개별 샘플로부터 액적 생성을 가능하게하면서, 기존 설계에 대한 간단한 수정은 임의의 수의 샘플을 동시에 액적 생성을 허용한다. 예를 들면, 바이오 - 래드 (Bio-Rad) ddPCR 시스템 (23)은 다수의 샘플들로부터의 동시 액적 형성을 가능 독립적 액적 결정자의 일련의 입구에 균일 한 압력을인가한다.

우리의 대량 판독 방법은 키에 액세스특수한 판독 계측 없이도 디지털 파티션 분석의 장점은 정량적 WGA에 적합하다. 여기, 우리는 때문에 순서 특이성 (7)의 부족을 배경 오염 물질에 매우 민감 양적 WGA에 초점을 맞추었다. 원래의 템플릿 수가 관심이고 또한 실시간 정량적 WGA 분석법에서 제품의 미지의 잠재적 넓은 분자량 분포는 어플리케이션 해석을 어렵게 만든다. 디지털 분석 서식 주소는 모두 이러한 문제. 오염 물질은 종래의 실시간 분석에서 발생할 수있는 바와 같이 고 분자량 오염물에 의해 저 분자량의 분석 지배력을 방지, 개인 반응 파티션 내에 포함된다. 방울 내 밝은 반점으로 볼도 2B 및도 4b, 가능한 오염 물질에서 분리하고 증폭 또는 전체 형광에 실질적으로 기여하지 않습니다. 또한,분석에서 생성 된 디지털 신호는 템플릿이 아닌 템플릿의 크기 또는 이들의 증폭 율의 수에 비례한다. 우리의 방법은 대량의 디지털 측정치를 보정하는 표준에 의존하지만, 요구 사항과 일치하는 샘플 및 기준 특성이 현저하게 완화 될 수있다.

정량적 WGA 일반적 WGA 반응 7,34 오염 물질을 정량화하는 데 사용하고, 가장 민감한 미지 서열의 DNA의 존재를 정량화하는 공지의 방법, 제약 등 다양한 응용 분야에있어서 큰 가능성을주고있다 품질 관리, 법의학 및 우주 생물학. 대량 디지털 판독, 가속화 병렬화 및 분석 판독을 단순화하여, 디지털 PCR과 같은 다른 디지털 분석 프로토콜을 혜택을 누릴 수 있습니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Evagreen Dye Biotium 31000
Bovine serum albumin New England Biotechnologies B9000S
Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer New England Biotechnologies B0269S Vortex periodically until aggregate dissolves
Lambda DNA New England Biotechnologies N3011S Heated to 50 oC and quenched on ice prior to dilution
Randomized MDA oligos Integrated DNA Technologies 5'-NNNNN*N-3'
PCR primers Integrated DNA Technologies 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’
UltraPure Nuclease-free water Life Technologies 10977-015 UV-treated for 30 min in Stratalinker 2400 before use (optional)
ROX reference dye Life Technologies 12223-012
PCR optical strip caps Life Technologies 4323032
PCR tubes Agilent Technologies 401428
dNTP (25 micromolar each) Agilent Technologies 200415
Thermocycler - Mx3000P qPCR system Agilent Technologies 401403
Barrier pipette tips VWR 89003-046
Bio-rad oil for evagreen Bio-rad 186-4005
JumpStart Taq ReadyMix Sigma-Aldrich P2893-100RXN

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References

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