डिजिटल न्यूक्लिक एसिड की मात्रा assays के सरल थोक पढ़ा गया

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Morinishi, L. S., Blainey, P. Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays. J. Vis. Exp. (103), e52925, doi:10.3791/52925 (2015).

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Abstract

डिजिटल assays के दुर्लभ कोशिकाओं और व्यक्तिगत न्यूक्लिक एसिड अणुओं की गिनती का पता लगाने के लिए सक्षम है कि शक्तिशाली तरीके हैं। हालांकि, डिजिटल assays के नियमित रूप से की वजह से लागत और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तरीकों के साथ जुड़े विशिष्ट उपकरणों के लिए, लागू नहीं भी कर रहे हैं। यहाँ हम छोटी बूंद-आधारित डिजिटल assays के थोक प्रतिदीप्ति को मापने के लिए एक पारंपरिक वास्तविक समय पीसीआर साधन का उपयोग कर डिजिटल छोटी बूंद assays के readout के लिए एक सरल तरीका मौजूद है।

हम सिंथेटिक छोटी बूंद मिश्रण और एक छोटी बूंद डिजिटल कई विस्थापन प्रवर्धन (एमडीए) परख का उपयोग थोक readout परख के प्रदर्शन की विशेषताएँ। एक डिजिटल प्रतिक्रिया स्वरूप से मात्रात्मक एमडीए विशेष रूप से लाभ, लेकिन हमारी नई विधि किसी भी डिजिटल परख करने के लिए लागू होता है। इस तरह के डिजिटल पीसीआर के रूप में स्थापित डिजिटल परख प्रोटोकॉल के लिए, इस विधि की गति को और परख readout के सरल करने के लिए कार्य करता है।

हमारी थोक readout कार्यप्रणाली partitione का लाभ लाता हैविशेष readout के उपकरण के लिए आवश्यकता के बिना घ assays। इस मानक के लिए आवश्यकताओं को एक पारंपरिक वास्तविक समय प्रयोग के लिए की तुलना में कम मांग कर रहे हैं, हालांकि थोक readout के कार्यप्रणाली की प्रिंसिपल सीमाओं, छोटी बूंद गिनती प्लेटफार्मों और एक मानक नमूना के लिए जरूरत के साथ तुलना में गतिशील रेंज कम कर रहे हैं। मात्रात्मक पूरे जीनोम प्रवर्धन (WGA) WGA प्रतिक्रियाओं में contaminants के लिए परीक्षण करने के लिए प्रयोग किया जाता है और दवा गुणवत्ता नियंत्रण और astrobiology सहित विभिन्न आवेदन क्षेत्रों में विधि महान वादा देने अज्ञात दृश्यों के साथ डीएनए टुकड़े की उपस्थिति का पता लगाने के लिए सबसे संवेदनशील तरीका है, है।

Introduction

न्यूक्लिक एसिड की मात्रा का ठहराव (डिजिटल पीसीआर) 1-4 और आधार आदेश (अनुक्रमण) के लिए डिजिटल assays दृढ़ता से जीवन विज्ञान और चिकित्सा प्रभावित कर रहे हैं। डिजिटल assays, उच्च संवेदनशीलता को उपलब्ध कराने के प्रयोगों भर में सतही तुलना की, सक्रिय करने और महत्वपूर्ण, तुलनीय डेटा 5 (1 टेबल) से युक्त बड़े डेटाबेस के निर्माण को सक्षम करने, एक पूर्ण पैमाने (एक नियंत्रण के सापेक्ष नहीं) पर आणविक गिनती की मात्रा का ठहराव प्रदान करते हैं।

पिछले 15 वर्षों में, पूरे जीनोम प्रवर्धन (WGA) न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन के लिए एक सामान्य उपकरण के रूप में पीसीआर के साथ उभरा। पीसीआर की तरह, WGA आसानी से पता लगाया या आधार अनुक्रमण तरह बाद के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक स्तर तक मिनट नमूना तत्वों amplifying द्वारा विश्लेषणात्मक और प्रारंभिक अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी है। पीसीआर के विपरीत, WGA बल्कि अज्ञात दृश्यों सहित नमूने में सभी दृश्यों का प्रवर्धन की अनुमति, एक विशेष डीएनए ठिकाना लिए विशिष्ट नहीं है।पीसीआर और WGA के बीच यह बुनियादी फर्क एक दूसरे के पूरक के तरीकों में आता है और अपने आवेदन में विभिन्न चुनौतियों को जन्म देता है।

WGA प्रतिक्रियाओं 6 की उच्च उपज एकल अणुओं 7, एकल कक्षों 8 और मात्रा का ठहराव या आगे के विश्लेषण के लिए अन्य कम बायोमास नमूने 9 से जीनोमिक डीएनए की दिनचर्या प्रवर्धन सक्षम बनाता है। WGA रसायन विज्ञान के साथ जुड़े प्रमुख चुनौतियों अपनी contaminants के लिए अत्यधिक संवेदनशीलता और व्यक्तिगत टेम्पलेट अणुओं 6 भर में असमान प्रवर्धन हैं। एकल कोशिका अनुक्रमण के रूप में हालांकि, WGA लोकप्रिय हो रहा है WGA द्वारा WGA प्रौद्योगिकी 10, और टेम्पलेट मात्रा का ठहराव का 'हत्यारा आवेदन "के रूप में उभरा है आवेदन 7 के कई क्षेत्रों में महत्वपूर्ण है।

डिजिटल न्यूक्लिक एसिड की मात्रा का ठहराव के लिए इंस्ट्रुमेंटेशन पहले Valved और बिना वाल्व का microfluidic प्रपत्र की एक किस्म में वर्णित किया गया हैछोटी बूंद आधारित assays सहित टीएस 11-14, 15,16 (तालिका 2)। हालांकि, डिजिटल विश्लेषण के लिए वाणिज्यिक सिस्टम microfluidic प्रतिक्रिया सेटअप और उत्पाद का पता लगाने के लिए 17 विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है। कस्टम valved microfluidics लचीला कर रहे हैं, लेकिन सटीक microfabrication और साँस का नियंत्रण प्रणालियों 18 की आवश्यकता होती है। यह पायस आधारित डिजिटल assays के 19,20 के लिए monodisperse सूक्ष्म बूंदों बनाने के लिए अपेक्षाकृत आसान है, जबकि डिजिटल readout बड़े पैमाने पर व्यापक क्षेत्र इमेजिंग या तो आवश्यकता होती है, (लोकप्रिय अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के समान) तकनीकी रूप से भारी है 21,22 या उच्च गति छोटी बूंद का पता लगाने के 23-25 ​​प्रवाह आधारित। आदर्श रूप में, एक डिजिटल परख जटिल उपकरण के लिए कम करने की जरूरत है और जल्दी से बाहर पढ़ने के लिए हो नमूनों की बड़ी संख्या के लिए अनुमति देता है, readout के लिए सेट-अप से आसान हो जाएगा। यहाँ हम पीसीआर मैं एक पारंपरिक वास्तविक समय का उपयोग करता है कि डिजिटल छोटी बूंद assays के readout के लिए एक सरल विधि का वर्णनnstrument छोटी बूंद-आधारित डिजिटल assays के थोक प्रतिदीप्ति मापने के लिए।

नया दृष्टिकोण डिजिटल पीसीआर assays के लिए लागू किया जा सकता है, यह (पीसीआर के लिए उत्कृष्ट परिणाम दे) समस्याग्रस्त हैं वास्तविक समय प्रवर्धन assays के अनुरूप है जिसके लिए डिजिटल WGA assays के लिए विशेष रूप से लाभप्रद है। WGA सामान्यतः अनुक्रम, लंबाई, और आधार सामग्री में विषम हैं कि टेम्पलेट के अणुओं के साथ नमूने के लिए लागू किया जाता है। ये अलग टेम्पलेट अणुओं एक संदर्भ ("मानक") मिलान विशेषताओं के साथ नमूना के उपयोग की जरूरत महसूस, अलग-अलग दरों 6 पर परिलक्षित कर रहे हैं। अक्सर, ऐसी कोई मानक उपलब्ध है, या भेजे गए नमूनों की विशेषताओं से अनजान हैं। इनपुट जन, अणुओं के इनपुट संख्या, दो, या न करने का एक संयोजन - WGA chemistries के इनपुट सामग्री और लंबाई पर निर्भर संपत्ति की विविधता 26 भी मात्रा निर्धारित किया जा रहा है क्या में अस्पष्टता बनाने के द्वारा परिणामों की व्याख्या मुश्किल। एफकिसी भी क्रम से दूषित पदार्थों के अणुओं हस्तक्षेप करने के लिए एक संभावित है के बाद से inally, अनुक्रम-गैर विशिष्टता मात्रात्मक पीसीआर से संदूषण के लिए मात्रात्मक कई विस्थापन प्रवर्धन (एमडीए) और अधिक संवेदनशील बना देता है। Microfluidic डिजिटल assays टेम्पलेट अणुओं को अलग और कम दूषित पदार्थों को जांचा जाता है कि इस तरह की प्रतिक्रिया की मात्रा को कम करने से प्रदूषण को संबोधित करते हैं।

यहाँ हम एक लोकप्रिय इज़ोटेर्माल WGA विधि, एमडीए 27 का उपयोग करें। ध्यान से, PicoPlex और MALBAC 28 सहित कई अन्य WGA chemistries प्रारंभिक इज़ोटेर्माल कतरा विस्थापन कदम पर महत्वपूर्ण निर्भर करते हैं। इज़ोटेर्माल कदम मात्रात्मक WGA के लिए अनुरूप वास्तविक समय assays के आवेदन करने की चुनौती बढ़ा। WGA न तो पूरी तरह, सेटअप के दौरान रोका अवांछित चर पूर्व प्रवर्धन के लिए अग्रणी है और न ही विषम अणुओं की प्रतिकृति पूरा करने के लिए प्रेरित किया है और रोका जा सकता है, जहां एक तरह से ("साइकिल") discretized किया जा सकता पीसीआर 11 की तरह अगले चक्र के लिए पूर्व (चित्रा 1)। WGA के लिए एक डिजिटल परख प्रारूप की वजह से परख समापन बिंदु पर गणना के लिए प्रत्येक अणु के अलगाव के लिए ठेठ प्रतिक्रिया सेटअप प्रक्रियाओं accomodates मूल readout सटीकता प्रवर्धन दक्षता में विभिन्नता का काफी हद तक स्वतंत्र होगा इसका मतलब है (ताकि पूर्व प्रवर्धन परिणामों को प्रभावित नहीं करता है)।

परख समापन बिंदु पर छोटी बूंद प्रति संकेत स्तर छोटी बूंद की मात्रा पर निर्भर करेगा के रूप में परख, वर्दी संस्करणों के साथ तेल में उत्पादित बूंदों पर निर्भर करता है, और हम परिणामों की स्थिरता छोटी बूंद आकार के एक वितरण भर में औसत पर निर्भर नहीं करना चाहते हैं। Monodisperse बूंदों बनाना अब (लगभग 3,500 monodisperse छोटी बूंद कागजात 2013 के बाद से प्रकाशित किया गया है) एक मानक प्रक्रिया है, लेकिन microfluidic इंस्ट्रूमेंटेशन 25 की आवश्यकता है। वास्तव में, अधिक से अधिक छह कंपनियों ने इस तरह की बूंदों के उत्पादन पर निर्भर है कि स्वतंत्र वाणिज्यिक उत्पादों का विकास किया है, और छोटी बूंद-बनाने microfluidic चिप्स हैं23,29 व्यावसायिक रूप से उपलब्ध। इस अध्ययन के लिए, हम घर में (प्रोटोकॉल देखें) उत्पादित कस्टम microfluidic उपकरणों का इस्तेमाल किया। सिरिंज उपकरणों के माध्यम से प्रवाह भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं ड्राइव करने के लिए पंप, लेकिन वैकल्पिक रूप से, लागत 30 कम करने के लिए वैक्यूम संचालित प्रवाह के लिए एक एकल डिस्पोजेबल सिरिंज के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए बूंदों मौजूदा वाणिज्यिक छोटी बूंद निर्माताओं 23,29 के साथ बनाई जा सकती है के रूप में microfluidic युक्ति fabricating, इस परख के लिए आवश्यक नहीं है।

1. छोटी बूंद-बनाने Microfluidic डिवाइस बनाने

  1. SU-8 मास्टर निर्माण प्रोटोकॉल के साथ चैनलों के लिए मास्टर ढालना तैयार करें जो पहले 31 उल्लिखित है, लेकिन एक छोटी बूंद जनरेटर मुखौटा पैटर्न 32 के साथ।
  2. मुलायम लिथोग्राफी 32,33 की तकनीक का उपयोग कर PDMS में उपकरणों बनाना।

2. थोक बूंद पढ़ा गया के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें


नोट: प्रोटोकॉल प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं के कई प्रकार के प्रयोग न्यूक्लिक एसिड यों इस्तेमाल किया जा सकता है। एक उदाहरण के रूप में, कई लैम्ब्डा डीएनए सांद्रता के एमडीए के लिए आवश्यक अभिकर्मकों दिया जाता है। अभिकर्मक विवरण विशिष्ट अभिकर्मकों की तालिका में सूचीबद्ध हैं। बूंदों के भीतर टेम्पलेट का वितरण sufficien पर निर्भर करता हैनमूने के टी मिश्रण।

  1. प्राप्त करते हैं या शुद्ध Phi29 डीएनए पोलीमरेज़।
    1. पहले से आपूर्तिकर्ता से 7, या खरीद के रूप में वर्णित Phi29 शुद्ध। दिखाया प्रयोगों के लिए इस्तेमाल Phi29 शुद्ध किया गया था।
  2. 65 मिमी कोह, 1.65 मिमी EDTA, और 14 मिमी डीटीटी से मिलकर विकृतीकरण बफर के 10 मिलीलीटर की तैयारी।
  3. 65 मिमी एचसीएल, 0.21 एम Tris सीएल पीएच 7.0, और 9 मिमी Tris सीएल पीएच 8.0 से मिलकर निराकरण बफर के 10 मिलीलीटर की तैयारी।
  4. ऐसे nuclease मुक्त पानी के रूप में दो मानकों, एक कोई टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी), और एक उच्च टेम्पलेट एकाग्रता (4 पीजी के आसपास / μl लैम्ब्डा डीएनए) तैयार करें। एक qPCR ट्यूब में विकृतीकरण बफर के 3.3 μl के साथ प्रत्येक स्तर के 3.3 μl denature। 3 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। निराकरण बफर के 3.3 μL के साथ प्रत्येक बुझाने।
  5. एक qPCR ट्यूब में विकृतीकरण बफर के 3.3 μl के साथ ब्याज की टेम्पलेट के 3.3 μl denature। 3 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। 3.3 μl साथ बुझानानिराकरण बफर की।
  6. बर्फ पर नमूना प्रति मास्टर मिश्रण के 11 μl तैयार करें। 2x एमडीए प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण 2x डबल असहाय डीएनए के होते हैं (dsDNA) बाध्यकारी डाई, 2x qPCR के संदर्भ डाई, 50 माइक्रोन बेतरतीब oligo, 2 मिलीग्राम / एमएल बीएसए, 2x Phi29 डीएनए पोलीमरेज़ प्रतिक्रिया बफर, 4.8 मिमी dNTPs, nuclease मुक्त पानी , और 40 माइक्रोग्राम / एमएल Phi29 डीएनए पोलीमरेज़। अच्छी तरह से 7.5.Mix से पीएच स्तर बहुत अधिक है या कम मुठभेड़ नहीं है पोलीमर्स सुनिश्चित करने के लिए पिछले Phi29 डीएनए पोलीमरेज़ जोड़ें।
  7. वैकल्पिक: कम झूठी सकारात्मक के लिए, पूर्व बूंदों 34 के गठन के लिए यूवी प्रकाश के साथ मास्टर मिश्रण का पर्दाफाश।
    1. बर्फ पर एक 0.5 मिलीलीटर या 1.5 मिलीलीटर स्पष्ट ट्यूब में नमूना प्रति पूर्व मिश्रण के 10 μl तैयार करें। पूर्व मिश्रण 55 माइक्रोन के बेतरतीब oligo, 2.2 मिलीग्राम / एमएल बीएसए, 1.1X Phi29 डीएनए पोलीमरेज़ प्रतिक्रिया बफर, 5.3 मिमी dNTPs, और nuclease मुक्त पानी के होते हैं।
    2. 34 के रूप में वर्णित बर्फ पर पानी में ट्यूब प्लेस और एक ACCU को पराबैंगनी प्रकाश (254 एनएम) को बेनकाब5.7 जम्मू के mulated खुराक / 2 सेमी।
    3. पूर्व मिश्रण में 40 माइक्रोग्राम / एमएल dsDNA बाध्यकारी 1x करने के लिए डाई, 1x के संदर्भ डाई, और Phi29 जोड़ें। अच्छी तरह से मलाएं।
  8. विकृत टेम्पलेट या मानक के 10 μl और मास्टर मिश्रण के 10 μl का मिश्रण। अच्छी तरह से मलाएं।

3. छोटी बूंद गठन

नोट: बूंदों स्थैतिक बिजली और कतरनी तनाव के लिए बहुत संवेदनशील हो सकता है। स्थैतिक बिजली का कारण हो सकता है कि कपड़े निकालें, और बूंदों के गठन से पहले अपने आप को जमीन। जहां तक ​​संभव हो पायस से, ट्यूब के ऊपर से पायस की ट्यूब संभाल लेना। पिपेट इमल्शन बहुत धीरे धीरे, अधिमानतः एक विस्तृत बोर pipet टिप के साथ। एक विंदुक टिप से वितरण, जब pipetting गति निर्धारित करने के लिए टिप के किनारे पर पायस देखते हैं।

  1. फार्म बूंदों। प्रयोगों से पता चला के लिए, microfluidic युक्ति एक तेल इनलेट और बूंदों पैदा करने के लिए एक प्रवाह ध्यान केंद्रित जंक्शन के साथ दो जलीय inlets है। दो syri प्रयोग करेंnge 20,000 1 nl बूंदों उत्पन्न करने के लिए microfluidic चिप के माध्यम से surfactant के साथ तेल के 55 μl और प्रतिक्रिया मिश्रण की एक 20 μl के प्रवाह की दर को नियंत्रित करने के लिए पंप।
  2. यह surfactant के साथ तेल के कई प्रकार के साथ बूंदों का उत्पादन करने के लिए संभव है, लेकिन रचना बहुत उच्च तापमान पर और समय के साथ छोटी बूंद स्थिरता को प्रभावित करेगा: ध्यान दें। एक संभव संयोजन एक anionic पृष्ठसक्रियकारक 19,35 साथ fluorinated तेल HFE 7500 है।
  3. किसी भी विधि 13,36 के साथ किसी भी आकार में बूंदों का उत्पादन है, लेकिन छोटी बूंद जनसंख्या में आकार परिवर्तनशीलता थोक प्रतिदीप्ति, और इसलिए परख की सटीकता को प्रभावित करेगा। दिखाया प्रयोगों के लिए, बूंदों 1 nl की एक मात्रा के साथ monodisperse थे।
  4. पीसीआर ट्यूबों में बूंदों और तेल के सभी ले लीजिए। प्रत्येक नमूने के लिए, विभाज्य 30 ऑप्टिकल टोपी के साथ ताजा पीसीआर ट्यूबों में तेल की μl, और तेल के शीर्ष पर बूंदों के 20 μl हस्तांतरण। लगातार संस्करणों परख एसी के रूप में है सुनिश्चितके रूप में संभव उपपादरी।
  5. बंद ट्यूब ढीला टोपियां तेल लुप्त हो जाना करने की अनुमति देगा, के रूप में कसकर टोपियां।

4. इज़ोटेर्माल प्रवर्धन

  1. एक पीसीआर thermocycler, qPCR thermocycler, या गर्म प्लेट का उपयोग करना, 7 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं, और 75 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए निष्क्रिय। बूंदों की नलियों इस बिंदु पर कुछ घंटों के लिए पन्नी के साथ कवर एक फ्रिज में छोड़ा जा सकता है।

5. डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण

  1. इसके तत्काल बाद qPCR thermocycler का उपयोग सभी नमूनों के लिए डाई प्रतिदीप्ति के स्तर को मापने, प्रतिक्रिया निष्क्रियता के बाद। इष्टतम फ़िल्टर सेटिंग्स डाई उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा पर निर्भर करेगा। इस उदाहरण के लिए, dsDNA बाध्यकारी डाई के लिए निर्धारित 492 एनएम 516 एनएम फिल्टर, और संदर्भ डाई के लिए निर्धारित 585 एनएम 610 एनएम फिल्टर का उपयोग करें। अन्य फ्लोरोसेंट माप तकनीक प्रतिदीप्ति यों इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. प्रत्येक नमूने के लिए, द्वारा dsDNA बाध्यकारी डाई की प्रतिदीप्ति तीव्रता विभाजितसंदर्भ डाई की प्रतिदीप्ति तीव्रता। सभी नमूनों से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति, या कोई टेम्पलेट नियंत्रण की सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति, घटाना।
  3. मानकों से सुधारा प्रतिदीप्ति माप का उपयोग कर एक रेखीय मानक वक्र बनाएँ। एनटीसी मानक 0% फ्लोरोसेंट बूंदों के साथ एक नमूना के लिए प्रतिदीप्ति ("सभी नकारात्मक") का प्रतिनिधित्व करता है, और उच्च टेम्पलेट एकाग्रता प्रतिदीप्ति माप 100% फ्लोरोसेंट बूंदों के साथ एक नमूना के लिए उम्मीद प्रतिदीप्ति ("सभी सकारात्मक") है। इसी मानक वक्र का उपयोग करना, उनके थोक प्रतिदीप्ति के आधार पर सकारात्मक और नकारात्मक की बूंदों के मध्यवर्ती अनुपात की भविष्यवाणी।

6. उत्पादन बूंदों सबूत के सिद्धांत माप के लिए

  1. फ्लोरोसेंट (सकारात्मक) बूंदों बनाओ: 0.1 एनजी लैम्ब्डा डीएनए, 1x dsDNA बाध्यकारी डाई, 1x संदर्भ डाई, 1.5 इकाइयों Taq डीएनए पोलीमरेज़, 10 मिमी Tris एचसीएल, 50mm KCl, 1.5 मीटर से मिलकर एक पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करेंएम 2 MgCl, 0.2 मिमी dNTP, और 0.5 माइक्रोन प्राइमरों। जैसा कि ऊपर वर्णित मिश्रण 30 बार (20 सेकंड, 20 सेकंड, 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 55 डिग्री सेल्सियस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस) Thermocycle, तो बूंदों के रूप में।
  2. गैर फ्लोरोसेंट (नकारात्मक) बूंदों बनाओ: 1x dsDNA बाध्यकारी डाई से मिलकर एक पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें, 1x संदर्भ डाई, 1.5 इकाइयों Taq डीएनए पोलीमरेज़, 10 मिमी Tris एचसीएल, 50mm KCl, 1.5 मिमी 2 MgCl, 0.2 मिमी dNTP, और 0.5 माइक्रोन प्राइमरों। मिश्रण 30 बार (20 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 20 सेकंड, 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 55 डिग्री सेल्सियस), तो बूंदों फार्म Thermocycle।
  3. पूर्व मिश्रित छोटी बूंद अनुपात गठन
    1. QPCR ट्यूबों में fluorinated तेल के 20 μl बांटो, वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक ऑप्टिकल टोपी के साथ कवर किया।
    2. तेल के शीर्ष पर नकारात्मक अनुपात: धीरे वांछित सकारात्मक में अच्छी तरह से मिश्रित बूंदों के 10 μl विंदुक। दिखाए गए परिणामों में, सकारात्मक: नकारात्मक छोटी बूंद अनुपात 1 (सभी सकारात्मक), 0.8, 0.5, 0.2, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, और 0 (सभी neg थेative)।
  4. QPCR thermocycler का उपयोग सभी नमूनों के लिए डाई प्रतिदीप्ति के स्तर को मापने। इस प्रोटोकॉल के लिए, dsDNA बाध्यकारी डाई के लिए निर्धारित 492 एनएम 516 एनएम फिल्टर, और संदर्भ डाई के लिए निर्धारित 585 एनएम 610 एनएम फिल्टर का उपयोग करें।
    1. DsDNA संदर्भ डाई प्रतिदीप्ति का उपयोग डाई प्रतिदीप्ति बाध्यकारी मानक के अनुसार। आगे कहा, "सभी सकारात्मक" नमूना के प्रतिदीप्ति द्वारा मानक के अनुसार।
  5. "सभी सकारात्मक" और "सभी नकारात्मक" नमूनों से सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति माप का उपयोग कर एक रेखीय मानक वक्र बनाएँ। इसी मानक वक्र का उपयोग करना, उनके थोक प्रतिदीप्ति के आधार पर सकारात्मक और नकारात्मक की बूंदों के मध्यवर्ती अनुपात की भविष्यवाणी।
  6. प्रत्येक अनुपात (एन = 3) स्वतंत्र छोटी बूंद गठन और प्रत्येक को दोहराने के लिए मिश्रण के साथ के लिए प्रयोग को दोहराने।

7. सबूत के सिद्धांत एमडीए प्रयोग

  1. एक कल्पना के साथ लैम्ब्डा डीएनए स्टॉक समाधान की एकाग्रता उपायtrophotometer।
    1. छोटी बूंद प्रति औसत 10 टेम्पलेट अणुओं के लिए आवश्यक टेम्पलेट एकाग्रता की गणना। इस प्रोटोकॉल के लिए, छोटी बूंद की मात्रा 1 nl और लैम्ब्डा डीएनए के एक एनजी लगभग 1.9 10 x 7 प्रतियां शामिल मान रहे हैं। इसलिए, छोटी बूंद प्रति 10 टेम्पलेट्स nl प्रति 10 प्रतियां, या μl प्रति 526 FG लैम्ब्डा डीएनए होगा। बूंदों का गठन कर रहे हैं जब टेम्पलेट इसलिए प्रारंभिक उच्चतम टेम्पलेट एकाग्रता / μl 3.2 पीजी हो जाएगा, ~ 6x पतला हो जाएगा।
  2. क्रमानुसार विकृतीकरण बफर और बराबर मात्रा निराकरण बफर के साथ 3.2 स्नातकोत्तर / μl को लैम्ब्डा डीएनए पतला। 0.1 की एक कमजोर पड़ने कारक के लिए, विकृतीकरण बफर के 45 μl के साथ 10 μl नमूना गठबंधन और 3 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। निराकरण बफर के 45 डालूँगा बुझाने के लिए जोड़ें।
  3. प्रयोग के लिए नमूने के बाकी बनाने के लिए कदम 7.2 में वर्णित के रूप में आगे नमूना पतला। दिखाया प्रतिक्रियाओं में प्रारंभिक टेम्पलेट सांद्रता, 3.2 पीजी, 320 FG थे160 FG, 32 FG, 16 FG, 3.2 FG, और microliter प्रति 1.6 FG।
    नोट: MasterMix इसके बाद अंतिम टेम्पलेट सांद्रता 526 FG थे, 52.6 FG, 26.3 FG, 5.26 FG, microliter प्रति 2.63 FG, 526 एजी, और 263 एजी। क्रमशः छोटी बूंद प्रति 10, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, और 0,005 उम्मीद लैम्ब्डा प्रतियां।
  4. पैदा करते हैं और कदम 2.5-5.3 में वर्णित के रूप में प्रत्येक नमूने से बूंदों का विश्लेषण।
  5. एक डिजिटल कैमरे का उपयोग कर दिखाया प्रतिदीप्ति छवियों (चित्रा 2,3) आरटी पर एक 10x उद्देश्य के साथ एक महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के लिए मुहिम शुरू मोल। प्रत्येक नमूना के लिए देखने के बारह क्षेत्रों के अधिग्रहण। एक फ्लोरोसेंट स्लाइड के साथ प्राप्त की एक पृष्ठभूमि छवि द्वारा सही प्रतिदीप्ति छवियों।
  6. पायस तेल तेजी से लुप्त हो जाएगा के रूप में इमेजिंग 37 के लिए एक निहित कक्ष का प्रयोग करें।
  7. एक ImageJ मैक्रो (पूरक कोड फ़ाइल) का उपयोग कर व्यक्ति छोटी बूंद तीव्रता का विश्लेषण करें।
    1. सबसे अच्छा एन में गैर फ्लोरोसेंट बूंदों को अलग करती है कि एक सीमा से प्रतिदीप्ति तीव्रता का चयनउच्च टेम्पलेट एकाग्रता छवियों में फ्लोरोसेंट बूंदों से टीसी छवियों। प्रत्येक अज्ञात नमूना के लिए, सीमा से ऊपर एक प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ बूंदों के अंश की गणना।

8. पीसीआर और एमडीए थोक प्रतिक्रियाओं

  1. पीसीआर प्रतिक्रिया तैयार करें।
    1. क्रमानुसार 0.1 की एक कमजोर पड़ने कारक के साथ टेम्पलेट डीएनए पतला। प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए, विकृतीकरण बफर के 45 μl के साथ टेम्पलेट के 10 μl गठबंधन और 3 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। निराकरण बफर के 45 μl के साथ कमजोर पड़ने का मिश्रण।
    2. नमूना प्रति पीसीआर MasterMix के 20 μl तैयार करें। 1.1X पीसीआर प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण Taq डीएनए पोलीमरेज़ μl 60 इकाइयों / 11 मिमी Tris एचसीएल, 55mm KCl, 1.65 मिमी 2 MgCl, 0.22 मिमी dNTP के होते हैं, 1.1X डाई, 1.1X संदर्भ डाई, और 550 एनएम dsDNA बाध्यकारी प्रत्येक प्राइमर।
    3. पतला टेम्पलेट के 2 μl और MasterMix के 20 μl का मिश्रण।
      नोट: अंतिम टेम्पलेट सांद्रता टी मेंउन्होंने दिखाया प्रतिक्रियाओं पीसीआर 50 स्नातकोत्तर, 5 पीजी, 500 FG, microliter प्रति 50 FG, 5 FG, 500 एजी, और 0 जी लैम्ब्डा डीएनए थे, और तीन प्रतियों में प्रदर्शन किया गया।
    4. निम्नलिखित कार्यक्रम के साथ qPCR मशीन में Thermocycle पीसीआर प्रतिक्रिया। 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट पहले 30 सेकंड, 30 सेकंड के लिए 20 सेकंड के लिए 57 डिग्री सेल्सियस, 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्रों चलाने के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़े।
    5. DsDNA संदर्भ डाई प्रतिदीप्ति से पहले आगे के विश्लेषण के लिए उपयोग कर डाई प्रतिदीप्ति बाध्यकारी मानक के अनुसार।
  2. एमडीए प्रतिक्रिया तैयार करें।
    1. कदम 8.1.1 में वर्णित के रूप में नमूने पतला।
    2. बर्फ पर नमूना प्रति मास्टर मिश्रण के 11 μl तैयार करें। 2x एमडीए प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण 2x dsDNA बाध्यकारी डाई, 2x संदर्भ डाई, 50 माइक्रोन बेतरतीब oligo के होते हैं, 2 मिलीग्राम / एमएल बीएसए, 2x phi29 डीएनए पोलीमरेज़ प्रतिक्रिया बफर, 4.8 मिमी dNTPs, nuclease मुफ्त पानी, और 40 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर Phi29 डीएनए पोलीमरेज़।
    3. 40 माइक्रोग्राम तक Phi29 डीएनए पोलीमरेज़ जोड़ें / पोलीमर्स डी सुनिश्चित करने के लिए पिछले मिलीलीटरOES 7.5 की तुलना में पीएच स्तर बहुत अधिक है या कम मुठभेड़ नहीं। अच्छी तरह से मलाएं।
    4. एक qPCR ट्यूब में विकृतीकरण बफर के 3.3 μl से पतला टेम्पलेट का 3.3 μL denature। 3 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। निराकरण बफर के 3.3 μl जोड़ें।
    5. विकृत टेम्पलेट के 10 μL और मास्टर मिश्रण के 10 μl का मिश्रण। अच्छी तरह से मलाएं।
    6. निम्नलिखित कार्यक्रम के साथ qPCR मशीन में एमडीए प्रतिक्रिया चलाएँ।
    7. प्रतिदीप्ति हर 7.5 मिनट मापने, 4 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
    8. 1 मिनट के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रिय।
    9. DsDNA संदर्भ डाई प्रतिदीप्ति का उपयोग डाई प्रतिदीप्ति बाध्यकारी मानक के अनुसार। इसके अलावा प्रत्येक नमूने के लिए अधिकतम प्रतिदीप्ति द्वारा मानक के अनुसार।

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Representative Results

पारंपरिक थोक / वास्तविक समय readouts मात्रात्मक पीसीआर और मात्रात्मक WGA assays (चित्रा 1) दोनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, डिजिटल मात्रात्मक assays के फायदे (1 टेबल) प्रदान करते हैं। वर्णित विधि में, हम एक सरल थोक समापन बिंदु माप (चित्रा 2) के साथ सूक्ष्म छोटी बूंद प्रारूप में डिजिटल assays के बाहर पढ़ने के लिए। इस विधि मोटे तौर पर लागू है, जबकि इस विधि पारंपरिक वास्तविक समय assays के लिए विशेष चुनौतियां प्रस्तुत है, क्योंकि हम मात्रात्मक WGA (एमडीए) पर ध्यान केंद्रित।

हमारी वास्तविक समय पीसीआर साधन तेल में बिखरे फ्लोरोसेंट microdroplets के अलग अंशों का पता लगा सकता है कि क्या जांच करने के लिए, हम फ्लोरोसेंट और गैर फ्लोरोसेंट बूंदों (चित्रा 2) का सिंथेटिक मिश्रण के थोक प्रतिदीप्ति मापा। थोक प्रतिदीप्ति और सकारात्मक छोटी बूंद मायने रखता है (स्वतंत्र रूप से प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन) के रूप में उम्मीद (फ्लोरोसेंट बूंदों के इनपुट अंश के साथ रैखिक पैमाने पर करचित्रा 3)। प्रयोग के प्रत्येक सेट के लिए स्वतंत्र छोटी बूंद गठन और मिश्रण के साथ तीन बार प्रदर्शन किया गया था।

"अज्ञात" के नमूने के लिए सैद्धांतिक मात्रा का ठहराव के प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए हम पूरी तरह से सकारात्मक और पूरी तरह से नकारात्मक नियंत्रण के नमूने का उपयोग रैखिक मानक घटता की स्थापना की। ऐसी छोटी बूंद-बहुत-विशिष्ट मानक घटता के साथ, हम एक नमूना के थोक प्रतिदीप्ति पर आधारित सिंथेटिक सकारात्मक और नकारात्मक छोटी बूंद मिश्रण के अंश गणना की थी। (चित्रा 3 बी आर 2 = .984) का परिणाम गतिशील रेंज के दो लॉग भर में छोटी बूंद अनुपात मात्रा का ठहराव में अच्छा प्रदर्शन दिखा। इनपुट विश्लेष्य एकाग्रता आसानी से सकारात्मक या नकारात्मक बूंदों 38 के अंश से गणना की है।

एक वास्तविक मात्रात्मक WGA परख में हमारे विधि का परीक्षण करने के लिए, हम एक वाई भर प्रतिदीप्ति स्तर और लैम्ब्डा डीएनए के साथ एक डिजिटल छोटी बूंद एमडीए परख के सकारात्मक बूंदों के अंश मापा सांद्रता के डी रेंज (चित्रा 4)। चित्रा 4 बी में, बूंदों के प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट छवियों दिखाए जाते हैं। छोटी बूंद प्रति औसत टेम्पलेट के साथ उम्मीद के रूप में डिजिटल एमडीए के नमूनों से दोनों थोक प्रतिदीप्ति और सकारात्मक छोटी बूंद अंश थोक readout ईमानदारी से एक डिजिटल परख (= 0.927 आर 2) का परिणाम कब्जा कर सकते हैं, यह दर्शाता है पैमाने। हम स्वतंत्र बूंदों के गठन और प्रत्येक को दोहराने के लिए WGA बाहर ले जाने, प्रत्येक एकाग्रता के लिए प्रयोग को दोहराया।

तालिका एक
तालिका 1. वास्तविक समय और डिजिटल assays के सारांश। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

able2.jpg "/>
टेबल न्यूक्लिक एसिड quantitating के लिए मौजूदा तरीकों की 2. सारांश। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 1
चित्रा 1. वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर और लैम्ब्डा डीएनए। एमडीए की एमडीए पीसीआर की तरह तापमान साइकिल के माध्यम से discretized, और बर्फ पर सावधानी से तैयार नहीं है, तो preamplification होने का खतरा नहीं है। इधर, मात्रात्मक पीसीआर और एमडीए लैम्ब्डा डीएनए की सांद्रता में वृद्धि के साथ प्रदर्शन किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
Figurबूंदों और प्रतिनिधि छवियों के अनुरूप readout के ई 2. योजनाबद्ध। (ए) सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों एक microfluidic युक्ति में फ्लोरोसेंट और गैर फ्लोरोसेंट अभिकर्मकों से उत्पन्न किया गया। नकारात्मक अनुपात: बूंदों अलग सकारात्मक में पूर्व मिलाया गया। थोक प्रतिदीप्ति स्तर एक मानक वास्तविक समय thermocycler साथ मापा गया है, और सकारात्मक बूंदों के अंश प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित किया गया था। (बी) के प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट सकारात्मक बूंदों (पैमाने बार = 200 माइक्रोन) के अनुपात में वृद्धि की छवियों मढ़ा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. थोक प्रतिदीप्ति और अलग से तैयार सकारात्मक और नकारात्मक drople के संयोजन के फ्लोरोसेंट अंशटीएस। (ए) (सकारात्मक) फ्लोरोसेंट और गैर फ्लोरोसेंट (नकारात्मक) बूंदों अलग अनुपात में पूर्व मिश्रित थे। मापा थोक प्रतिदीप्ति के साथ सकारात्मक बूंदों के इनपुट अंश की तुलना और मापा सकारात्मक छोटी बूंद अंश (एन = 3, सलाखों प्रतिनिधित्व +/- एसडी)। बिंदीदार रेखा एक रैखिक संबंध को देखते हुए उम्मीद फ्लोरोसेंट अंश का प्रतिनिधित्व करता है। उम्मीद फ्लोरोसेंट इनपुट अंश के मानकों के आधार पर भविष्यवाणी अनुपात (बी) तुलना। रेखा एक रैखिक संबंध को देखते हुए उम्मीद मूल्य इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. थोक प्रतिदीप्ति और एक छोटी बूंद डिजिटल एमडीए परख की। डिजिटल एमडीए फ्लोरोसेंट अंश incre के साथ प्रदर्शन किया थाasing टेम्पलेट लैम्ब्डा डीएनए (एन = 3, त्रुटि सलाखों एसडी प्रतिनिधित्व करते हैं) की सांद्रता और चित्रा 2A में वर्णित के रूप में मापा जाता है। रेखा हमारे प्रयोग से डाटा मॉडल के लिए पॉसों वितरण का उपयोग उम्मीद फ्लोरोसेंट अंश इंगित करता है। ख) प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट छोटी बूंद (एनटीसी, 0.005, 0.05, 0.5, और 10) के अनुसार उम्मीद लैम्ब्डा डीएनए अणु को बढ़ाने के लिए प्रतिक्रिया निष्क्रियता (पैमाने बार = 200 माइक्रोन) के बाद बूंदों की छवियों मढ़ा। कृपया यहाँ क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

डिजिटल assays के दुर्लभ कोशिकाओं का पता लगाने और न्यूक्लिक एसिड अणुओं के व्यक्ति की गिनती सक्षम है कि शक्तिशाली तरीके हैं। हालांकि, डिजिटल assays अभी भी नियमित रूप से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तरीकों के साथ जुड़े विशेष उपकरणों की लागत के हिस्से में, विश्लेषणात्मक प्रयोगशालाओं में लागू की वजह से नहीं कर रहे हैं। यहाँ हम एक मानक वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर मशीन का उपयोग कर एक सरलीकृत अनुरूप readout के साथ न्यूक्लिक एसिड बढ़ाता के लिए एक endpoint डिजिटल परख का वर्णन है। इस विधि सेट अप करने के लिए जल्दी है, और readout छोटी बूंद गिनती के तरीकों की तुलना में आसान है।

हमारी परख मानक उपकरण का उपयोग कर सामूहिक रूप से समापन बिंदु माप की सादगी के लिए व्यक्तिगत छोटी बूंद माप की एकल अणु (एकल छोटी बूंद) संवेदनशीलता forfeits। हमारे डिजिटल एमडीए प्रयोग में, हम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी कि वास्तविक प्रासंगिकता द्वारा पुष्टि के बावजूद, पृष्ठभूमि से 200 नकारात्मक बूंदों प्रति एक सकारात्मक छोटी बूंद से भी कम समय में भेद नहीं कर सकासकारात्मक बूंदों के ction (चित्रा 4) की उम्मीद के रूप में था। थोक प्रतिदीप्ति माप सीमा में संवेदनशीलता और पृष्ठभूमि कम सकारात्मक छोटी बूंद भागों के लिए थोक माप परख की संवेदनशीलता। उच्च संवेदनशीलता की आवश्यकता है, एक डिजिटल readout की सिफारिश की है। तेल का स्तर या थोक छोटी बूंद की मात्रा में अंतर बहुत नमूना प्रतिदीप्ति डेटा को प्रभावित कर सकते हैं। एक संदर्भ डाई के साथ भी सामान्य बनाने के तेल की मात्रा प्रतिदीप्ति पढ़ता में बनाने के मतभेद के लिए नहीं बना सकते हैं। यह परख मात्रा साधन अधिग्रहण पैरामीटर, microwell ज्यामिति, या ऑप्टिकल फिल्टर के अनुकूलन परख प्रदर्शन में सुधार हो सकता है कि संभव है।

संवेदनशीलता और थोक डिजिटल assays के गतिशील रेंज भी विभाजन आकार के अनुकूलन के द्वारा सुधार किया जा सकता है। बड़ी बूंदों भूमिका निभाई पृष्ठभूमि पर काबू पाने में मदद मिलेगी और कम इनपुट सांद्रता के लिए संवेदनशीलता में सुधार कर सकते हैं जो प्रत्येक टेम्पलेट के अणु से फ्लोरोसेंट उत्पादों का अधिक से अधिक मात्रा में निकलेगा। परदूसरी ओर, छोटे बूंदों assayed मात्रा प्रति अधिक अणुओं के अलगाव की अनुमति। टेम्पलेट एकाग्रता नमूने भर में अत्यधिक परिवर्तनशील है, तो दोनों छोटी और बड़ी छोटी बूंद प्रतिक्रियाओं परख गतिशील रेंज 39 विस्तार करने के लिए समानांतर में बाहर किया जा सकता है।

लगातार छोटी बूंद की मात्रा भी सही माप के लिए जरूरी हैं। कई कस्टम microfluidic समाधान श्रृंखला 19,40 में और समानांतर 41,42 दोनों में तेजी से एक नमूना से monodisperse बूंदों के गठन के लिए मौजूद हैं। कुछ समानांतर में कई अलग नमूनों से छोटी बूंद पीढ़ी सक्षम है, जबकि मौजूदा डिजाइन करने के लिए सरल संशोधनों के नमूने के किसी भी संख्या का एक साथ छोटी बूंद पीढ़ी के लिए अनुमति होगी। उदाहरण के लिए, जैव रेड ddPCR सिस्टम 23 कई नमूने से एक साथ छोटी बूंद गठन को सक्षम करने, स्वतंत्र छोटी बूंद निर्माताओं की एक श्रृंखला की inlets को वर्दी दबाव लागू होता है।

हमारी थोक readout कार्यप्रणाली कुंजी पहुँचताविशेष readout इंस्ट्रूमेंटेशन और बिना जरूरत के लिए विभाजित डिजिटल assays के फायदे मात्रात्मक WGA के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। यहाँ, हम कारण अनुक्रम विशिष्टता 7 की कमी करने के लिए पृष्ठभूमि contaminants के लिए अत्यधिक अतिसंवेदनशील है जो मात्रात्मक WGA, पर ध्यान केंद्रित किया। मूल टेम्पलेट्स की संख्या ब्याज की है, जहां इसके अलावा, वास्तविक समय मात्रात्मक WGA assays से उत्पादों की अज्ञात और संभावित व्यापक आणविक वजन वितरण अनुप्रयोगों में व्याख्या कठिन बनाते हैं। डिजिटल परख स्वरूपण पतों इन दोनों समस्याओं। दूषित पदार्थों को एक पारंपरिक वास्तविक समय परख में घटित होता है के रूप में उच्च आणविक वजन contaminants से कम आणविक वजन analytes के प्रभुत्व को रोकने, अलग-अलग प्रतिक्रिया विभाजनों के अंदर समाहित कर रहे हैं। बूंदों के भीतर चमकीले धब्बों के रूप में देखा आंकड़े 2 बी और 4 बी, संभव contaminants में, अलग-अलग हैं और बढ़ाना या समग्र प्रतिदीप्ति करने के लिए काफी हद तक योगदान नहीं है। इसके अलावा,डिजिटल assays में उत्पन्न संकेत टेम्पलेट्स, नहीं टेम्पलेट्स के आकार या उनके प्रवर्धन दर की संख्या के अनुपात में होती है। हमारे विधि थोक डिजिटल माप जांच करने के लिए मानकों पर निर्भर करता है, आवश्यकता नमूना मैच के लिए और मानक विशेषताओं में काफी ढील दी जा सकती है।

मात्रात्मक WGA सामान्यतः WGA प्रतिक्रियाओं 7,34 में दूषित पदार्थों को यों इस्तेमाल किया है, और सबसे संवेदनशील अज्ञात अनुक्रम के डीएनए की उपस्थिति यों के लिए जाना जाता विधि, दवा के रूप में विविध आवेदन क्षेत्रों में विधि महान वादा दे रहा है गुणवत्ता नियंत्रण, फोरेंसिक, और astrobiology। थोक डिजिटल readout, तेजी से ऊपर parallelizing, और परख readout के सरल बनाने के द्वारा, जैसे डिजिटल पीसीआर के रूप में अन्य डिजिटल परख प्रोटोकॉल लाभ उठा सकते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Evagreen Dye Biotium 31000
Bovine serum albumin New England Biotechnologies B9000S
Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer New England Biotechnologies B0269S Vortex periodically until aggregate dissolves
Lambda DNA New England Biotechnologies N3011S Heated to 50 oC and quenched on ice prior to dilution
Randomized MDA oligos Integrated DNA Technologies 5'-NNNNN*N-3'
PCR primers Integrated DNA Technologies 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’
UltraPure Nuclease-free water Life Technologies 10977-015 UV-treated for 30 min in Stratalinker 2400 before use (optional)
ROX reference dye Life Technologies 12223-012
PCR optical strip caps Life Technologies 4323032
PCR tubes Agilent Technologies 401428
dNTP (25 micromolar each) Agilent Technologies 200415
Thermocycler - Mx3000P qPCR system Agilent Technologies 401403
Barrier pipette tips VWR 89003-046
Bio-rad oil for evagreen Bio-rad 186-4005
JumpStart Taq ReadyMix Sigma-Aldrich P2893-100RXN

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References

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