Lectura granel simple de Digital ácidos nucleicos Cuantificación ensayos

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Morinishi, L. S., Blainey, P. Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays. J. Vis. Exp. (103), e52925, doi:10.3791/52925 (2015).

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Abstract

Ensayos digitales son poderosos métodos que permiten la detección de células raras y recuento de moléculas de ácido nucleico individuales. Sin embargo, los ensayos digitales son todavía no se aplican de forma rutinaria, debido al coste y equipos específicos asociados con los métodos disponibles comercialmente. Aquí presentamos un método simplificado para la lectura de las pruebas de gota digitales utilizando un instrumento convencional PCR en tiempo real para medir la fluorescencia mayor parte de los ensayos digitales basados ​​en gotas.

Caracterizamos el rendimiento del ensayo de lectura mayor usando mezclas de gotitas sintético y un digital de amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) de ensayo de gotas. Cuantitativa MDA en particular se beneficia de un formato digital de la reacción, pero nuestro nuevo método se aplica a cualquier ensayo digital. Para protocolos de ensayo digitales establecidos, tales como PCR digital, este método sirve para acelerar y simplificar la lectura del ensayo.

Nuestra metodología de lectura mayor aporta las ventajas de partitioned ensayos sin la necesidad de la instrumentación de lectura especializada. Las principales limitaciones de la metodología de lectura mayor se reducen rango dinámico en comparación con las plataformas de gotita de conteo y la necesidad de una muestra estándar, aunque los requisitos de esta norma son menos exigentes que para un experimento en tiempo real convencional. La amplificación del genoma completo cuantitativa (WGA) se utiliza para probar los contaminantes presentes en las reacciones de Ventajas de Windows Original y es la forma más sensible para detectar la presencia de fragmentos de ADN con secuencias desconocidas, dando el método de gran promesa en diversas áreas de aplicación incluyendo control de calidad farmacéutica y la astrobiología.

Introduction

Ensayos digitales para la cuantificación de ácidos nucleicos (PCR digital) 1.4 y la base de la orden (secuencia) están impactando fuertemente las ciencias de la vida y la medicina. Digitales proporcionan ensayos de cuantificación de los recuentos moleculares en una escala absoluta (no respecto a un control), proporcionando una alta sensibilidad, lo que permite comparaciones fáciles a través de experimentos, y crucial, lo que permite la construcción de grandes bases de datos que contienen datos comparables 5 (Tabla 1).

En los últimos 15 años, la amplificación del genoma (WGA) surgió junto PCR como una herramienta general para la amplificación de ácidos nucleicos. Al igual que la PCR, WGA es útil para aplicaciones analíticas y preparativas por amplificación de elementos de la muestra minuto hasta un nivel que puede ser fácilmente detectado o utilizado para los análisis posteriores, como la secuenciación de base. A diferencia de PCR, WGA no es específico de un locus particular de ADN, en lugar permitiendo la amplificación de todas las secuencias en la muestra, incluyendo secuencias desconocidas.Esta diferencia fundamental entre la PCR y WGA hace que los métodos complementarios entre sí y da lugar a diferentes desafíos en su aplicación.

El alto rendimiento de las reacciones de WGA 6 permite la amplificación rutinaria de ADN genómico a partir de moléculas individuales 7, células individuales 8 y otras muestras de baja biomasa 9 para la cuantificación o análisis adicional. Los principales desafíos relacionados con la química WGA son su extrema sensibilidad a los contaminantes y la amplificación desigual entre moléculas plantilla individuales 6. Sin embargo, WGA está ganando popularidad como la secuenciación de una sola célula se ha convertido en la "aplicación asesina" de la tecnología WGA 10, y la plantilla de la cuantificación de Ventajas de Windows Original es importante en muchos campos de aplicación 7.

Instrumentación para la cuantificación de ácido nucleico digital ha sido descrita previamente en una variedad de válvula y sin válvula forma de microfluidosts 11-14, incluyendo ensayos basados ​​en gotitas 15,16 (Tabla 2). Sin embargo, los sistemas de microfluidos comerciales para análisis digital requieren equipo especializado para la configuración de la reacción y la detección del producto 17. Microfluidos con válvula de encargo son flexibles, pero requieren de microfabricación de precisión y sistemas de control neumático 18. Si bien es relativamente sencillo de hacer monodispersas micro-gotas para los ensayos digitales basados ​​en emulsión 19,20, lectura digital es técnicamente onerosa, que requiere de formación de imágenes de campo amplio a gran escala (similar a las tecnologías de secuenciación populares de próxima generación) o 21,22 de alta velocidad de flujo basados ​​en la detección de gotas 23-25. Idealmente, un ensayo digitales sería simple a partir de la configuración de lectura de salida, reduciendo la necesidad de instrumentación compleja y permitiendo que un gran número de muestras para ser leído rápidamente. Aquí se describe un método simplificado para la lectura de los ensayos de gotitas digital que utiliza un tiempo real PCR convencional iNSTRUMENTO para medir la fluorescencia mayor parte de los ensayos digitales basados ​​en gotas.

Mientras que el nuevo enfoque puede aplicarse a los ensayos de PCR digitales, es particularmente ventajoso para los ensayos de WGA digitales para el cual analógica ensayos de amplificación en tiempo real (que dan excelentes resultados para la PCR) son problemáticos. Ventajas de Windows Original se aplica comúnmente a las muestras con las moléculas de plantilla que son heterogéneos en secuencia, longitud y contenido de la base. Estas diferentes moléculas de molde se amplifican a diferentes velocidades 6, lo que exige el uso de una referencia ("estándar") muestra con características coincidentes. A menudo, no hay tal estándar está disponible, o las características de las muestras entrantes son desconocidos. La heterogeneidad del material de entrada y la propiedad dependiente de la longitud de químicas de WGA 26 también complicar la interpretación de los resultados mediante la creación de ambigüedad en lo que se está cuantificado - la masa de entrada, el número de moléculas de entrada, una combinación de los dos, o ninguno. Finalmente, la secuencia de no especificidad de amplificación del desplazamiento hace que múltiple cuantitativa (MDA) más sensibles a la contaminación que la PCR cuantitativa ya que las moléculas contaminantes de cualquier secuencia tienen un potencial de interferir. Ensayos digitales microfluidos abordar la contaminación por segregar moléculas plantilla y la reducción de los volúmenes de reacción tales que menos contaminantes se muestrean.

Aquí se utiliza un método WGA isotérmica popular, MDA 27. Es de destacar que varias otras químicas WGA incluyendo PicoPlex y MALBAC 28 dependen crucialmente de pasos iniciales de desplazamiento de hebra isotérmica. Pasos isotérmicos exacerban el reto de aplicar ensayos en tiempo real analógicos para WGA cuantitativo. WGA no puede ser ni impidió completamente durante la instalación, lo que lleva a no deseado de pre-amplificación variables, ni discretiza ("ciclado") de una manera donde la replicación de moléculas heterogéneas puede ser conducido a la terminación y se detuvo antes de la siguiente ciclo de PCR como 11 (Figura 1). Un formato de ensayo digital para WGA acoge procedimientos de configuración reacción típica debido a la segregación de cada molécula para la enumeración en el punto final de ensayo (de modo pre-amplificación no afecta a los resultados) de lectura original significa exactitud sería en gran medida independiente de la variación en la eficiencia de amplificación.

El ensayo depende de las gotitas producidas en aceite con volúmenes uniformes, ya que el nivel de la señal por la gotita en el punto final del ensayo dependerá del volumen de gota, y no queremos que la consistencia de los resultados que dependen de un promedio a través de una distribución de tamaños de gota. Hacer gotitas monodispersas es ahora un procedimiento estándar (alrededor de 3.500 documentos de gotitas monodispersas se han publicado desde 2013), sino que requiere la instrumentación de microfluidos 25. De hecho, más de seis empresas han desarrollado productos comerciales independientes que dependen de la producción de este tipo de gotas, y los chips de microfluidos gotitas de decisiones sondisponible comercialmente 23,29. Para este estudio, se utilizaron dispositivos de microfluidos encargo de fabricación propia (véase el Protocolo). Las bombas de jeringa para conducir el flujo a través de los dispositivos también están disponibles comercialmente, pero, alternativamente, puede estar sustituido con un solo jeringa desechable para el flujo impulsado por vacío para reducir los costos 30.

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Protocol

Nota: fabricar el dispositivo de microfluidos no es necesario para este ensayo, en forma de gotas para este protocolo se pueden formar con los responsables de gotitas comerciales existentes 23,29.

1. Hacer que el dispositivo de microfluidos Gotita de formación

  1. Preparar molde maestro para los canales con el protocolo Fabrication Maestro SU-8 esbozó previamente 31, pero con un patrón de máscara generador de gotas 32.
  2. Fabricar dispositivos en PDMS utilizando las técnicas de litografía blanda 32,33.

2. Prepare la mezcla de reacción para granel Gotita Lectura


Nota: El protocolo se puede utilizar para cuantificar ácidos nucleicos utilizando muchos tipos de reacciones de amplificación. Como ejemplo, se dan los reactivos necesarios para MDA de varias concentraciones de ADN Lambda. Detalles de reactivos se enumeran en la Tabla de reactivos específicos. La distribución de plantilla dentro de las gotitas depende de suficient de mezcla de la muestra.

  1. Obtener o ADN polimerasa Phi29 Purify.
    1. Purificar Phi29 lo descrito previamente 7, o la compra de un proveedor. El Phi29 utilizado para los experimentos mostrados se purificó.
  2. Preparar 10 ml de desnaturalización tampón consistente en 65 mM de KOH, EDTA 1,65 mM, y DTT 14 mM.
  3. Preparar 10 ml de tampón de neutralización que consisten en HCl 65 mM, 0,21 M Tris-Cl pH 7,0, y 9 Tris-Cl mM, pH 8,0.
  4. Preparar dos estándares, uno no tiene control plantilla (NTC), como el agua libre de nucleasa, y una alta concentración de la plantilla (en torno a 4 pg de ADN Lambda / l). Desnaturalizar 3.3 l de cada estándar con 3,3 l de desnaturalización de búfer en un tubo de qPCR. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Saciar cada uno con 3,3 l de tampón de neutralización.
  5. Desnaturalizar 3.3 l de la plantilla de interés con 3,3 l de desnaturalización de búfer en un tubo de qPCR. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Saciar con 3,3 lde tampón de neutralización.
  6. Preparar 11 l de mezcla maestra por muestra en hielo. La mezcla maestra de reacción 2x ​​MDA consiste en ADN de doble cadena 2x (dsDNA) tinte vinculante, tinte referencia 2x qPCR, 50 M oligo aleatorizado, 2 mg / ml de BSA, ADN Phi29 2x Polimerasa tampón de reacción, 4,8 mM dNTPs, agua libre de nucleasa y 40 mg / ml de ADN polimerasa Phi29. Añadir ADN polimerasa Phi29 última para garantizar la polimerasa no encontrarse con niveles de pH mucho más alto o más bajo que 7.5.Mix bien.
  7. Opcional: Para un menor número de falsos positivos, exponer mezcla maestra con luz UV antes de formar gotitas 34.
    1. Preparar 10 l de pre-mezcla por muestra en un tubo transparente de 0,5 ml o 1,5 ml en hielo. La premezcla se compone de 55 M oligo aleatorizado, 2,2 mg / ml de BSA, ADN polimerasa Phi29 1.1x tampón de reacción, 5,3 mM dNTPs, y el agua libre de nucleasa.
    2. Se coloca el tubo en el agua en hielo como se describe 34 y exponer a la luz UV (254 nm) a un accuacu- dosis de 5,7 J / cm 2.
    3. Añadir colorante dsDNA vinculante a 1x, tinte referencia a 1X, y Phi29 a 40 mg / ml en la pre-mezcla. Mezclar bien.
  8. Combine 10 l de plantilla desnaturalizado o estándar y 10 l de mezcla maestra. Mezclar bien.

3. Gotita Formación

Nota: Las gotitas pueden ser muy sensibles a la electricidad estática y el esfuerzo cortante. Quitar las ropas que pueden causar electricidad estática, y la tierra antes de la formación de gotas. Manejar tubos de emulsión desde la parte superior del tubo, en la medida de la emulsión como sea posible. Emulsiones pipeta muy lentamente, de preferencia con una gran punta de la pipeta ánima. Cuando la dispensación de una punta de pipeta, ver la emulsión en el lado de la punta para determinar la velocidad de pipeteado.

  1. Gotas de formulario. Para los experimentos mostrados, el dispositivo de microfluidos tiene una entrada de aceite y dos entradas acuosas con un cruce de enfoque de flujo para la generación de gotitas. Utilice dos syriESN bombas para controlar las velocidades de flujo de 55 l de aceite con tensioactivo y un 20 l de mezcla de reacción a través del chip de microfluidos para generar 20.000 1 gotitas nl.
  2. Nota: Es posible producir gotitas con muchos tipos de aceite con tensioactivo, pero la composición afectará en gran medida la estabilidad de gota a altas temperaturas y el tiempo. Una combinación posible es HFE aceite fluorado 7500 con un tensioactivo aniónico 19,35.
  3. Producir gotitas en cualquier tamaño, con cualquier método de 13,36, pero la variabilidad del tamaño de la población de gotitas afectará la fluorescencia a granel, y por lo tanto la exactitud del ensayo. Para los experimentos mostrados, las gotitas eran monodispersas con un volumen de 1 nl.
  4. Recoge todas las gotas y el aceite en tubos de PCR. Para cada muestra, alícuota de 30 l de aceite en tubos de PCR frescas con tapones ópticos y transferir 20 l de gotas en la parte superior del aceite. Los volúmenes consistentes garantizan el ensayo es como accomisariar posible.
  5. Cerrar tubo de tapas con fuerza, como tapas flojas permitirán que el aceite se evapore.

4. La amplificación isotérmica

  1. El uso de un termociclador de PCR, qPCR termociclador o placa caliente, incubar las muestras a 30 ° C durante 7 horas, e inactivar durante 1 min a 75 ° C. Los tubos de las gotitas se pueden dejar en una nevera revestido con una lámina por un par de horas en este punto.

5. Adquisición de Datos y Análisis

  1. Inmediatamente después de la inactivación de reacción, medir los niveles de fluorescencia de colorante para todas las muestras utilizando el termociclador qPCR. Configuración del filtro óptima dependerá de excitación del colorante y espectros de emisión. Para este ejemplo, utilice el filtro de 516 nm-492 nm fijado para el tinte dsDNA vinculante, y el filtro 585 nm nm-610 fijado para el tinte de referencia. Otras técnicas de medición fluorescentes se pueden utilizar para cuantificar la fluorescencia.
  2. Para cada muestra, dividir la intensidad de fluorescencia del colorante dsDNA vinculante porla intensidad de fluorescencia del colorante de referencia. Restar la fluorescencia de fondo, o la fluorescencia normalizada del control sin plantilla, de todas las muestras.
  3. Crear una curva patrón lineal utilizando las medidas de fluorescencia corregidos de las normas. La norma NTC representa la fluorescencia para una muestra con 0% gotitas fluorescentes ("todos negativos"), y la medición de fluorescencia alta concentración de plantilla es la fluorescencia esperado para una muestra con 100% gotitas fluorescentes ("todo es positivo"). Utilizando la curva estándar correspondiente, predecir las proporciones intermedias de gotitas positivos y negativos sobre la base de su fluorescencia a granel.

6. producir gotas de Medidas de prueba de Principio

  1. Hacer fluorescentes gotitas (positivos): Preparar una mezcla de reacción PCR que consta de 0,1 ng de ADN Lambda, tinte 1x dsDNA vinculante, tinte de referencia 1x, 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, y 0,5 mM cebadores. Termociclo la mezcla de 30 veces (95 ° C durante 20 seg, 55 ° C durante 20 seg, 72 ° C durante 1 min), a continuación, formar gotitas como se describe anteriormente.
  2. Hacer no fluorescentes gotitas (negativos): Preparar una mezcla de reacción de PCR que consiste en colorante 1x dsDNA vinculante, tinte de referencia 1x, 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM de MgCl 2, mM dNTP 0,2, y 0,5 mM cebadores. Termociclo las mezcla de 30 veces (95 ° C durante 20 s, 55 ° C durante 20 s, 72 ° C durante 1 min), entonces se forman gotitas.
  3. La formación de relaciones de gotas premezclados
    1. Distribuir 20 l de aceite fluorado en tubos qPCR, cubrir con una tapa óptica para evitar la evaporación.
    2. Pipetear suavemente 10 l de gotitas bien mezclados en proporciones de positivos deseados: negativos en la parte superior del aceite. En los resultados mostrados, positivos: relaciones de gotitas negativos fueron 1 (todas positivas), 0,8, 0,5, 0,2, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 y 0 (todo el negativa).
  4. Medir los niveles de colorante de fluorescencia para todas las muestras utilizando el termociclador qPCR. Para este protocolo, utilice el filtro de 516 nm-492 nm fijado para el tinte dsDNA vinculante, y el filtro 585 nm nm-610 fijado para el tinte de referencia.
    1. Normalizar dsDNA vinculante tinte de fluorescencia utilizando colorante de referencia de fluorescencia. Normalizar aún más por la fluorescencia de la "todos positivos" de la muestra.
  5. Crear una curva patrón lineal utilizando las medidas de fluorescencia normalizados de los "todos positivos" y "negativos" todas las muestras. Utilizando la curva estándar correspondiente, predecir las proporciones intermedias de gotitas positivos y negativos sobre la base de su fluorescencia a granel.
  6. Repite el experimento para cada relación (n = 3) con la formación de gotas independiente y de mezcla para cada réplica.

Experimento 7. La prueba de principio MDA

  1. Medir la concentración de solución madre de ADN Lambda con una especificaciónfotómetro.
    1. Calcular la concentración de plantilla necesario medias moléculas 10 de la plantilla por las gotitas. Para este protocolo, asumen volúmenes de gota son 1 nl y 1 ng de ADN Lambda contiene aproximadamente 1,9 x 10 7 copias. Por lo tanto, 10 plantillas por gotita será de 10 copias por nl o 526 fg de ADN Lambda por l. La plantilla se diluyó ~ 6x cuando se forman las gotitas, por lo tanto, la concentración inicial más alta plantilla será 3,2 pg / l.
  2. En serie diluir el ADN Lambda de 3.2 pg / l con desnaturalización Buffer e igual volumen de tampón de neutralización. Para un factor de dilución de 0,1, combinar muestra de 10 l con 45 l de tampón de desnaturalización e incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Añadir 45 lL de tampón de neutralización para saciar.
  3. Además diluir la muestra como se describe en el paso 7.2 para hacer que el resto de las muestras para el experimento. Las concentraciones iniciales de plantilla en las reacciones que se muestran fueron 3,2 pg, 320 fg,160 fg, 32 fg, 16 fg, 3,2 fg, y 1,6 fg por microlitro.
    Nota: Las concentraciones plantilla finales después de la adición de mezcla maestra eran 526 fg, 52,6 fg, 26,3 fg, 5,26 fg, 2,63 fg, 526 ag y 263 ag por microlitro. 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, y 0,005 esperados copias Lambda por gotita, respectivamente.
  4. Generar y analizar las gotitas de cada muestra como se describe en los pasos 2.5-5.3.
  5. Adquirir las imágenes de fluorescencia se muestra (Figura 2,3) utilizando una cámara digital montado en un microscopio de epi-fluorescencia con un objetivo 10x a TA. Adquirir doce campos de visión para cada muestra. Imágenes de fluorescencia Corregir una imagen de fondo obtenido con un tobogán fluorescente por.
  6. Utilice una cámara contenida para imágenes 37 como el aceite de la emulsión se evaporará rápidamente.
  7. Analizar intensidades de gotas individuales utilizando una macro ImageJ (archivo de código suplementario).
    1. Elija una intensidad de fluorescencia umbral que mejor separa gotitas no fluorescentes en el NImágenes de TC de las gotas fluorescentes en las imágenes de alta concentración de la plantilla. Para cada muestra desconocida, calcular la fracción de gotitas con una intensidad de fluorescencia por encima del umbral.

8. reacciones de PCR a granel y MDA

  1. Preparar reacción de PCR.
    1. Diluir en serie de ADN plantilla con un factor de dilución de 0,1. Para cada dilución, se combinan 10 l de plantilla con 45 l de desnaturalización Buffer e incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Combine la dilución con 45 l de tampón de neutralización.
    2. Preparar 20 l de mezcla maestra de PCR por muestra. La mezcla maestra de reacción 1.1x PCR consta de 60 unidades / l de ADN polimerasa Taq, 11 mM Tris-HCl, KCl 55 mm, 1,65 mM MgCl2, 0,22 mM dNTP, tinte, tinte referencia 1,1x y 1,1x 550 nM dsDNA vinculante cada cebador.
    3. Combinar 2 l de plantilla diluida y 20 l de mezcla maestra.
      Nota: Las concentraciones plantilla finales en tél PCR reacciones mostradas fueron 50 pg, 5 pg, 500 fg, 50 fg, 5 fg, 500 ag, y 0 g de ADN Lambda por microlitro, y se realizaron por triplicado.
    4. Termociclo reacción PCR en la máquina qPCR con el siguiente programa. Ejecutar 40 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 57 ° C durante 20 seg, 72 ° C durante 30 seg antes de 2 min a 72 ° C durante 2 min y mantenimiento a 4 ° C.
    5. Normalizar dsDNA vinculante tinte de fluorescencia utilizando referencia colorante fluorescente antes de su posterior análisis.
  2. Preparar reacción MDA.
    1. Diluir las muestras como se describe en el paso 8.1.1.
    2. Preparar 11 l de mezcla maestra por muestra en hielo. La mezcla maestra de reacción 2x ​​MDA consiste tinte 2x dsDNA vinculante, tinte referencia 2x, 50 M oligo aleatorizado, 2 mg / ml de BSA, ADN phi29 2x Polimerasa tampón de reacción, 4,8 mM dNTPs, agua libre de nucleasa, y 40 mg / ml ADN polimerasa Phi29.
    3. Añadir la ADN polimerasa Phi29 a 40 g / ml durar para asegurar la polimerasa does no encontrarse con niveles de pH mucho mayor o menor que 7,5. Mezclar bien.
    4. Desnaturalizar 3,3 l de plantilla se diluye con 3,3 l de desnaturalización de búfer en un tubo de qPCR. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Añadir 3,3 l de tampón de neutralización.
    5. Combine 10 l de plantilla desnaturalizado y 10 l de mezcla maestra. Mezclar bien.
    6. Ejecutar reacción MDA en máquina qPCR con el siguiente programa.
    7. Mantenga a 30 ° C durante 4 horas, medir la fluorescencia cada 7,5 minutos.
    8. Inactivar a 75 ° C durante 1 min.
    9. Normalizar dsDNA vinculante tinte de fluorescencia utilizando colorante de referencia de fluorescencia. Normalizar aún más por la fluorescencia máxima para cada muestra.

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Representative Results

Mientras que las lecturas de mayor convencional / en tiempo real se pueden utilizar tanto para PCR cuantitativo y ensayos cuantitativos WGA (Figura 1), ensayos cuantitativos digitales proporcionan ventajas (Tabla 1). En el método descrito, leemos a cabo ensayos digitales en formato micro-gotita con una medición de punto final a granel sencilla (Figura 2). Si bien este método es ampliamente aplicable, nos centramos en WGA cuantitativa (MDA) ya que este método presenta desafíos especiales para los ensayos en tiempo real convencionales.

Para comprobar si nuestro instrumento PCR en tiempo real podría detectar diferentes fracciones de microgotas fluorescentes dispersos en aceite, se midió la fluorescencia mayor parte de mezclas sintéticas de fluorescente y las gotitas no fluorescentes (Figura 2). La fluorescencia mayor y cuenta gotitas positivos (evaluado de forma independiente por microscopía de fluorescencia) escalar linealmente con la fracción de entrada de gotas fluorescentes como se esperaba (Figura 3A). El experimento se realizó tres veces, con la formación de gotas y la mezcla independiente para cada conjunto.

Para evaluar el desempeño cuantificación teórica para muestras "desconocidas", establecimos las curvas de calibración lineales utilizando muestras de control del todo positivos y negativos en su totalidad. Con este tipo de curvas patrón de gotitas específicos de los lotes, se calculó la fracción de mezclas de gota positivos y negativos sintéticos basados ​​en fluorescencia mayor de cada muestra. Los resultados muestran un buen rendimiento en relación cuantificación de gotitas a través de dos registros de rango dinámico (R 2 = 0,984; Figura 3B). La concentración de analito de entrada se calcula fácilmente a partir de la fracción de gotitas positivos o negativos 38.

Para probar este método en un verdadero ensayo cuantitativo WGA, que mide los niveles de fluorescencia y fracción de gotitas positivos de un ensayo MDA gotita digital con ADN Lambda a través de una conexión wi de rango de concentraciones (Figura 4). En la Figura 4B, se muestran imágenes fluorescentes representativos de las gotitas. Tanto la fluorescencia mayor y la fracción de gotita positiva de las muestras de MDA escala digital como se esperaba con la plantilla promedio por gotita, lo que indica que la lectura a granel puede capturar fielmente el resultado de un ensayo digital (R 2 = 0,927). Repetimos el experimento para cada concentración, formando gotitas independiente y la realización de Ventajas de Windows Original para cada réplica.

Mesa 1
Tabla 1. Resumen de tiempo real y ensayos digitales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Tabla 2. Resumen de los métodos existentes para la cuantificación de ácidos nucleicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 1
Figura 1.-PCR en tiempo real cuantitativa y MDA de Lambda ADN. MDA no se discretiza mediante ciclos de temperatura como la PCR, y es propenso a preamplificación si no se preparan cuidadosamente en hielo. Aquí, la PCR cuantitativa y MDA se realizaron con concentraciones crecientes de ADN Lambda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figure 2. Esquema de lectura analógica de las gotitas y las imágenes representativas. (A) gotitas de positivos y negativos se genera a partir de los reactivos fluorescentes y no fluorescentes en un dispositivo de microfluidos. Las gotas fueron pre-mezclados en diferentes positivos: relaciones negativo. Niveles de fluorescencia a granel se midieron con un termociclador en tiempo real estándar, y la fracción de gotitas positivas se determinó por microscopía de fluorescencia. (B) fluorescente Representante superpone imágenes de aumentar ratios de gotitas positivos (barra de escala = 200 micras). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. fluorescencia a granel y la fracción fluorescente de combinaciones de drople positivo y negativo preparado por separadots. (A) fluorescente (positivo) y no fluorescente gotitas (negativos) fueron pre-mezclados en diferentes proporciones. Comparación de la fracción de entrada de gotitas positivos con la fluorescencia mayor medida y la fracción de gotita positivo medido (n = 3, las barras representan +/- SD). La línea de puntos representa la fracción fluorescente esperar dada una relación lineal. (B) Comparación de los coeficientes de predicción basado en las normas a la fracción de entrada fluorescente esperado. La línea indica el valor esperado dado una relación lineal. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. fluorescencia a granel y la fracción fluorescente de un ensayo MDA digital de las gotas. MDA Digital se realizó con increconcentraciones Asing de Lambda ADN molde (n = 3, barras de error representan SD) y medida como se describe en la figura 2A. La línea indica la fracción fluorescente espera usando la distribución de Poisson para modelar los datos de nuestro experimento. b) fluorescente Representante superpone imágenes de gotas después de la inactivación de reacción (barra de escala = 200 micras) para aumentar las moléculas de ADN Lambda previstos por cada gotita (NTC, 0,005, 0,05, 0,5, y 10). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .

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Discussion

Ensayos digitales son poderosos métodos que permiten la detección de células raras y contando de individual de moléculas de ácido nucleico. Sin embargo, los ensayos digitales aún no se aplican de forma rutinaria en los laboratorios de análisis, debido en parte al coste de equipo especializado asociados con los métodos disponibles comercialmente. Aquí se describe un ensayo digital de punto final para la cuantificación de ácidos nucleicos con una lectura analógica simplificada usando una cuantitativa en tiempo real máquina de PCR estándar. Este método es rápido de puesta en marcha, y la lectura es mucho más simple que los métodos de conteo de gotas.

Nuestro ensayo pierde el de una sola molécula (de una sola gota de) la sensibilidad de las mediciones de gotas individuales por la sencillez de masivamente punto final de medición utilizando instrumentación estándar. En nuestro experimento MDA digital, no podríamos distinguir a menos de 1 gota de positiva por cada 200 gotas negativas de fondo, a pesar de la confirmación por microscopía de fluorescencia que la fra realcción de las gotas de positivos fue el esperado (Figura 4). La sensibilidad y de fondo en el límite de la medición de fluorescencia granel, la sensibilidad del ensayo de medición a granel para fracciones de bajo gotitas positivos. Si se requiere una mayor sensibilidad, se recomienda una lectura digital. Las diferencias en los niveles de aceite o volúmenes de gota a granel pueden afectar en gran medida los datos de la muestra de fluorescencia. Incluso la normalización con un tinte de referencia no puede compensar las diferencias de volúmenes de petróleo hacen que la fluorescencia se lee. Es posible que la optimización de volumen de ensayo, los parámetros de adquisición instrumento, la geometría de micropocillos, o filtros ópticos puede mejorar el rendimiento del ensayo.

La sensibilidad y el rango dinámico de los ensayos de digitales a granel también pueden mejorarse mediante la optimización del tamaño de la partición. Gotitas más grandes producen una mayor cantidad de productos fluorescentes de cada molécula de molde, que puede ayudar a superar instrumental de fondo y mejorar la sensibilidad para concentraciones de entrada bajos. EnPor otro lado, gotitas más pequeñas permiten el aislamiento de más moléculas por volumen de ensayo. Si la concentración de plantilla es muy variable a través de muestras, ambas reacciones de gotitas pequeñas y grandes se pueden llevar a cabo en paralelo para expandir el rango dinámico de ensayo 39.

Volúmenes de gotitas consistentes también son necesarios para una medición precisa. Existen muchas soluciones de encargo de microfluidos para formar rápidamente gotitas monodispersas de una muestra, tanto en series 19,40 y 41,42 en paralelo. Aunque pocos permiten la generación de gotas de varias muestras separadas en paralelo, simples modificaciones a los diseños existentes permitirían para la generación de gotas simultánea de cualquier número de muestras. Por ejemplo, el sistema ddPCR Bio-Rad 23 se aplica una presión uniforme a las entradas de una serie de fabricantes de gotitas independientes, lo que permite la formación de gotas simultánea de múltiples muestras.

Nuestra metodología de lectura mayor accede claveventajas de ensayos digitales con particiones sin necesidad de instrumentación de lectura especializada y es muy adecuado para WGA cuantitativo. Aquí, nos centramos en WGA cuantitativa, que es altamente susceptible a los contaminantes de fondo debido a su falta de especificidad de secuencia 7. Además, la distribución del peso molecular desconocido y potencialmente amplia de productos de ensayos de WGA cuantitativos en tiempo real hacen difícil interpretación en aplicaciones donde el número de plantillas originales es de interés. Direcciones de formato de ensayo digitales ambos problemas. Los contaminantes están contenidos dentro de las particiones individuales de reacción, evitando que el dominio de analitos de bajo peso molecular por los contaminantes de alto peso molecular como ocurriría en un ensayo en tiempo real convencional. En las figuras 2B y 4B, posibles contaminantes, visto como puntos brillantes dentro de las gotitas, son segregados y no amplificar o contribuir sustancialmente a la fluorescencia total. Además, elseñal generada en ensayos digitales es proporcional al número de plantillas, no el tamaño de las plantillas o su tasa de amplificación. Aunque nuestro método se basa en estándares para calibrar la medición digital de volumen, el requisito para que coincida con la muestra y las características estándar podrá atenuarse, de forma significativa.

Quantitative WGA se utiliza comúnmente para cuantificar los contaminantes en reacciones WGA 7,34, y es el método más sensible conocida para cuantificar la presencia de ADN de secuencia desconocida, dando al método una gran promesa en áreas de aplicación tan diversas como el control de calidad farmacéutica, medicina forense, y astrobiología. Lectura digital granel puede beneficiar a otros protocolos de ensayo digitales como digital de PCR, al acelerar, paralelización, y simplificar la lectura del ensayo.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Evagreen Dye Biotium 31000
Bovine serum albumin New England Biotechnologies B9000S
Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer New England Biotechnologies B0269S Vortex periodically until aggregate dissolves
Lambda DNA New England Biotechnologies N3011S Heated to 50 oC and quenched on ice prior to dilution
Randomized MDA oligos Integrated DNA Technologies 5'-NNNNN*N-3'
PCR primers Integrated DNA Technologies 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’
UltraPure Nuclease-free water Life Technologies 10977-015 UV-treated for 30 min in Stratalinker 2400 before use (optional)
ROX reference dye Life Technologies 12223-012
PCR optical strip caps Life Technologies 4323032
PCR tubes Agilent Technologies 401428
dNTP (25 micromolar each) Agilent Technologies 200415
Thermocycler - Mx3000P qPCR system Agilent Technologies 401403
Barrier pipette tips VWR 89003-046
Bio-rad oil for evagreen Bio-rad 186-4005
JumpStart Taq ReadyMix Sigma-Aldrich P2893-100RXN

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References

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