Lecture simple de vrac numériques acide nucléique quantification dosages

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Morinishi, L. S., Blainey, P. Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays. J. Vis. Exp. (103), e52925, doi:10.3791/52925 (2015).

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Abstract

Essais numériques sont puissantes méthodes qui permettent la détection de cellules rares et de comptage individuels des molécules d'acide nucléique. Cependant, des essais numériques sont toujours pas systématiquement appliqué, en raison du coût et des équipements spécifiques associés aux méthodes disponibles dans le commerce. Nous présentons ici une méthode simplifiée pour la lecture des tests de gouttelettes numériques en utilisant un instrument conventionnel-PCR en temps réel pour mesurer la fluorescence en vrac de tests numériques de gouttelettes d'émulsion.

Nous caractérisons les performances de l'essai de lecture en vrac en utilisant des mélanges de gouttelettes de synthèse et une analyse numérique des gouttelettes amplification par déplacement multiple (MDA). Quantitative MDA particulier bénéficie d'un format numérique, mais la réaction de notre nouvelle méthode applique à toute analyse numérique. Pour les protocoles d'essai numériques établies telles que la PCR numérique, cette méthode sert à accélérer et simplifier dosage lecture.

Notre méthodologie vrac de lecture apporte les avantages de partitioneessais D, sans la nécessité d'une instrumentation spécialisée lecture. Les principales limites de la méthodologie de lecture encombrement sont réduits gamme dynamique par rapport aux plates-formes de gouttelettes de comptage et la nécessité d'un échantillon standard, bien que les exigences de cette norme sont moins exigeants que pour une expérience en temps réel classique. Quantitative toute amplification du génome (WGA) est utilisé pour tester les contaminants dans les réactions WGA et est le moyen le plus sensible pour détecter la présence de fragments d'ADN avec des séquences inconnues, donnant la méthode très prometteuse dans divers domaines d'application, y compris le contrôle de la qualité pharmaceutique et l'astrobiologie.

Introduction

Essais numériques pour la quantification de l'acide nucléique (PCR numérique) 1-4 et la base afin (séquençage) sont fortement un impact sur ​​les sciences de la vie et de la médecine. Dosages numériques offrent quantification des chiffres moléculaires sur une échelle absolue (pas par rapport à un contrôle), offrant une haute sensibilité, permettant des comparaisons faciles à travers des expériences, et, surtout, permettant la construction de grandes bases de données contenant des données comparables 5 (Tableau 1).

Au cours des 15 dernières années, toute amplification du génome (WGA) est apparu aux côtés de PCR comme un outil général pour l'amplification de l'acide nucléique. Comme PCR, WGA est utile pour les applications d'analyse et de préparation en amplifiant éléments de l'échantillon minute jusqu'à un niveau qui peut être facilement détecté ou utilisé pour des analyses ultérieures comme le séquençage de base. Contrairement à la PCR, WGA sont pas spécifiques à un locus d'ADN particulière, ce qui permet plutôt amplification de toutes les séquences de l'échantillon, y compris des séquences inconnues.Cette différence fondamentale entre PCR et WGA rend les méthodes complémentaires les uns aux autres et donnent lieu à des problèmes différents dans leur application.

Le rendement élevé de réactions WGA 6 permet l'amplification de routine de l'ADN génomique à partir de molécules simples 7, 8 cellules individuelles et d'autres échantillons à faible biomasse 9 pour la quantification ou une analyse plus approfondie. Les principaux défis associés à la chimie WGA sont son extrême sensibilité aux contaminants et l'amplification inégale entre les molécules de matrice individuelles 6. Popularité Cependant, WGA gagne que le séquençage cellule unique a émergé comme le "killer application" de la technologie de WGA 10, et le modèle quantification par WGA est important dans de nombreux domaines d'application 7.

Instrumentation pour la quantification d'acide nucléique numérique a été précédemment décrit dans une variété de valved et sans valve microfluidique forma11-14 ts, y compris les essais à base de gouttelettes 15,16 (tableau 2). Cependant, les systèmes microfluidiques commerciales pour l'analyse numérique nécessitent de l'équipement spécialisé pour la configuration de réaction et la détection de produits 17. Microfluidique valved personnalisée sont flexibles, mais nécessitent microfabrication de précision et des systèmes de contrôle pneumatiques 18. Alors qu'il est relativement simple de faire des micro-gouttelettes monodispersées pour des essais numériques à base d'émulsion 19,20, affichage numérique est techniquement lourde, nécessitant soit l'imagerie à grand champ à grande échelle (similaire aux technologies populaires de séquençage de prochaine génération) ou 21,22 haute vitesse d'écoulement à base de détection de gouttelette 23-25. Idéalement, une analyse numérique serait simple de mettre en place à la lecture, réduisant la nécessité d'une instrumentation complexe et permettant un grand nombre d'échantillons à lire rapidement. Nous décrivons ici une méthode simplifiée pour la lecture des tests de gouttelettes numériques qui utilise en temps réel classique PCR iNSTRUMENT pour mesurer la fluorescence en vrac de tests numériques de gouttelettes d'émulsion.

Alors que la nouvelle approche peut être appliquée à des tests de PCR numériques, il est particulièrement avantageux pour les dosages WGA numériques analogiques pour lesquels les tests d'amplification en temps réel (qui donnent d'excellents résultats pour la PCR) sont problématiques. WGA est généralement appliquée à des échantillons de molécules de matrice qui sont hétérogènes en séquence, la longueur et le contenu de la base. Ces différentes molécules de matrice sont amplifiés à des taux différents 6, ce qui nécessite l'utilisation d'une référence ("standard") avec des caractéristiques correspondant à l'échantillon. Souvent, de telles normes est disponible, ou les caractéristiques des échantillons entrants sont inconnus. L'hétérogénéité de la matière d'entrée et des biens dépendant de la longueur des chimies WGA 26 compliquent également l'interprétation des résultats par la création d'ambiguïté dans ce qui est quantifié - la masse d'entrée, le numéro d'entrée de molécules, une combinaison des deux, ou aucun des deux. Fnfin, la séquence de non-spécificité rend quantitative amplification par déplacement multiple (MDA) plus sensibles à la contamination que la PCR quantitative puisque les molécules contaminantes de toute séquence ont un potentiel d'interférer. Dosages numériques microfluidiques lutter contre la contamination en séparant les molécules de modèle et de la réduction des volumes de réaction de telle sorte que moins de contaminants sont échantillonnés.

Ici, nous utilisons une méthode WGA isotherme populaire, MDA 27. Fait à noter, plusieurs autres chimies WGA y compris PicoPlex et malbac 28 dépendent de façon cruciale sur les mesures initiales de déplacement isotherme de brins. Étapes isothermes exacerbent le défi de l'application de tests analogiques en temps réel pour WGA quantitative. WGA ne peut ni être entièrement évitée pendant l'installation, conduisant à indésirables pré-amplification variable, ni discrétisation ("cycling") dans une voie où la réplication de molécules hétérogènes peut être conduit à son terme et a cessé avant le prochain cycle comme PCR 11 (Figure 1). Un format numérique de dosage pour WGA accueille procédures typiques de configuration de réaction due à la ségrégation de chaque molécule pour le dénombrement au point final de dosage (sorte de pré-amplification n'a pas d'incidence sur les résultats) lecture originale signifie précision serait largement indépendante de la variation de l'efficacité d'amplification.

Le dosage dépend de gouttelettes produites dans l'huile avec des volumes uniformes, que le niveau du signal par gouttelette à l'extrémité de dosage dépendra du volume de gouttelettes, et nous ne voulons pas la cohérence des résultats de dépendre d'une moyenne à travers une distribution de tailles de gouttelettes. Faire gouttelettes monodispersées est maintenant une procédure standard (environ 3.500 documents de gouttelettes monodispersées ont été publiés depuis 2013), mais nécessite une instrumentation microfluidique 25. En fait, plus de six sociétés ont développé des produits commerciaux indépendants qui comptent sur la production de ces gouttelettes, et puces microfluidiques gouttelettes de décision sont23,29 disponible dans le commerce. Pour cette étude, nous avons utilisé des dispositifs microfluidiques personnalisé produites en interne (voir Protocole). Pompes seringue pour conduire l'écoulement à travers les dispositifs sont également disponibles dans le commerce, mais encore, peut être remplacé par une seule seringue jetable pour l'écoulement entraîné sous vide pour réduire les coûts 30.

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Protocol

Remarque: Fabrication du dispositif microfluidique est pas nécessaire pour cet essai, sous forme de gouttelettes de ce protocole peuvent être formés avec des décideurs de gouttelettes commerciales existantes 23,29.

1. Faire le dispositif microfluidique gouttelettes formant

  1. Préparer moule maître pour les canaux avec le protocole SU-8 Fabrication de Maître indiqué précédemment 31, mais avec un masque motif générateur de gouttelettes 32.
  2. Fabriquer des dispositifs en PDMS utilisant les techniques de lithographie douce 32,33.

2. Préparer Reaction Mix pour Bulk Droplet Lecture


Remarque: Le protocole peut être utilisé pour quantifier des acides nucléiques à l'aide de nombreux types de réactions d'amplification. A titre d'exemple, les réactifs nécessaires pour plusieurs concentrations de MDA Lambda ADN sont donnés. Les détails de réactifs sont listés dans le Tableau des réactifs spécifiques. La distribution de modèle à l'intérieur des gouttelettes dépend de suffisant mélange de l'échantillon.

  1. Obtenir ou purifier l'ADN polymérase Phi29.
    1. Purifier Phi29 comme décrit précédemment 7, ou de l'achat du fournisseur. Le Phi29 utilisé pour les expériences a été purifié à consulter.
  2. Préparer 10 ml de dénaturation tampon constitué de 65 mM KOH, EDTA 1,65, et 14 mM de DTT.
  3. Préparer 10 ml de tampon de neutralisation consistant en HCl 65 mM, 0,21 M de Tris-Cl pH 7,0, et de Tris-Cl pH 8,0 9 mm.
  4. Préparer deux normes, on ne contrôle de modèle (CNT) comme l'eau sans nucléase, et une concentration élevée de modèle (environ 4 pg / ul ADN Lambda). Dénaturer 3,3 pi de chaque standard avec 3,3 pi de tampon de dénaturation dans un tube qPCR. Incuber à température ambiante pendant 3 min. Étancher chacun avec 3,3 pi de tampon de neutralisation.
  5. Dénaturer 3,3 ul du modèle d'intérêt avec 3,3 pi de tampon de dénaturation dans un tube qPCR. Incuber à température ambiante pendant 3 min. Eteindre avec 3,3 plde tampon de neutralisation.
  6. Préparer 11 pi de mélange maître par échantillon sur de la glace. Le mélange maître de réaction 2x MDA se compose d'ADN double-brin 2x (ADNdb) de colorant de liaison, colorant de référence 2x qPCR, 50 pm oligo randomisé, 2 mg / ml de BSA, 2x ADN Phi29 polymérase tampon, mM dNTP 4,8, l'eau sans nucléase , et 40 ug / ml d'ADN polymerase Phi29. Ajouter Phi29 l'ADN polymérase dernière pour assurer la polymérase ne pas rencontrer les niveaux de pH beaucoup plus élevé ou plus bas que 7.5.Mix bien.
  7. Facultatif: Pour moins de faux positifs, exposer mélange maître avec une lumière UV avant la formation de gouttelettes 34.
    1. Préparer 10 pi de pré-mélange par échantillon dans un tube transparent de 0,5 ml ou 1,5 ml sur la glace. Le pré-mélange se compose de 55 uM oligo randomisé, 2,2 mg / ml de BSA, 1,1x l'ADN polymérase Phi29 tampon, 5,3 mM dNTP, et de l'eau sans nucléase.
    2. Placer le tube dans l'eau sur la glace comme décrit 34 et exposer à la lumière UV (254 nm) à un accumulé dose de 5,7 J / cm 2.
    3. Ajouter le colorant de liaison à ADN double brin à 1x, colorant de référence à 1x, Phi29 et à 40 ug / ml dans le pré-mélange. Bien mélanger.
  8. Combinez 10 pi de modèle dénaturé ou de la norme et 10 pi de mélange maître. Bien mélanger.

3. formation de gouttelettes

Remarque: Les gouttelettes peuvent être très sensibles à l'électricité statique et contrainte de cisaillement. Retirer les vêtements qui peuvent causer de l'électricité statique, et mettez-vous avant de former des gouttelettes. Poignée tubes d'émulsion à partir de la partie supérieure du tube, dans la mesure de l'émulsion que possible. Émulsions de pipette très lentement, de préférence avec une pointe de pipette alésage large. Lors de la distribution d'une pointe de pipette, regarder l'émulsion sur le côté de la pointe pour déterminer la vitesse de pipetage.

  1. Gouttelettes de formulaire. Pour les expériences représentées, le dispositif microfluidique comporte une entrée d'huile et deux entrées aqueuses avec une jonction d'écoulement de focalisation pour générer des gouttelettes. Utilisez deux SyriPompes ESN pour contrôler les taux de 55 ul d'huile avec un tensioactif et 20 pi de mélange réactionnel écoulement à travers la puce microfluidique pour générer 20.000 1 gouttelettes nl.
  2. Remarque: Il est possible de produire des gouttelettes avec de nombreux types d'huile avec surfactant, mais la composition va grandement affecter la stabilité de gouttelettes à des températures élevées et dans le temps. Une combinaison possible est HFE huile fluorée 7500 avec un tensio-actif anionique 19,35.
  3. Produire des gouttelettes de taille quelconque avec n'importe quel procédé 13,36, mais la variabilité de la taille de la population de gouttelettes aura une incidence sur la fluorescence en masse, et donc la précision du dosage. Pour les expériences indiquées, les gouttelettes étaient monodispersées et d'un volume de 1 nl.
  4. Recueillir toutes les gouttelettes et de l'huile dans des tubes de PCR. Pour chaque échantillon, aliquote 30 pi de l'huile dans des tubes de PCR fraîches avec des bouchons optiques, et transférer 20 pi de gouttelettes sur le dessus de l'huile. Les volumes cohérents assurer le dosage est comme cacuré que possible.
  5. Fermer le tube caps étroitement, comme des bouchons en vrac permettra à l'huile à évaporer.

4. amplification isotherme

  1. En utilisant un thermocycleur PCR, qPCR thermocycleur, ou une plaque chauffante, incuber les échantillons à 30 ° C pendant 7 heures, et inactiver pendant 1 min à 75 ° C. Les tubes de gouttelettes peuvent être laissés dans un réfrigérateur recouvert d'une feuille pendant quelques heures à ce point.

Acquisition de données et analyse 5.

  1. Immédiatement après la réaction inactivation, mesurer les niveaux de fluorescence de colorants pour tous les échantillons en utilisant le thermocycleur qPCR. Paramètres de filtre optimal dépendra de l'excitation de colorant et des spectres d'émission. Pour cet exemple, utilisez le filtre 516 nm-492 nm fixée pour le colorant ADN double brin de liaison, et le filtre 585 nm-610 nm fixée pour le colorant de référence. D'autres techniques de mesure de fluorescence peuvent être utilisés pour quantifier la fluorescence.
  2. Pour chaque échantillon, diviser l'intensité de fluorescence du colorant de liaison à ADN double brin parl'intensité de fluorescence du colorant de référence. Soustraire la fluorescence d'arrière-plan, ou la fluorescence normalisée du contrôle non matrice, à partir de tous les échantillons.
  3. Créer une courbe standard linéaire en utilisant les mesures de fluorescence corrigées des normes. La norme NTC représente la fluorescence d'un échantillon à 0% de gouttelettes fluorescentes («tous négatifs»), et la mesure de la fluorescence de la forte concentration de modèle est la fluorescence attendu pour un échantillon de 100% gouttelettes fluorescentes («tous positifs»). Utilisation de la courbe standard correspondant, prédire les rapports intermédiaires de gouttelettes positifs et négatifs sur la base de leur fluorescence en vrac.

6. produire des gouttelettes pour les mesures Proof-of-Principe

  1. Assurez fluorescentes gouttelettes (positives): Préparer un mélange de réaction PCR constitué de 0,1 ng Lambda ADN, colorants 1x ADNds contraignant, colorant de référence 1x, 1,5 unités de Taq polymérase ADN, 10 mM Tris-HCl, KCl 50, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de dNTP, 0,5 uM des amorces et. Thermocycle le mélange 30 fois (95 ° C pendant 20 s, 55 ° C pendant 20 s, 72 ° C pendant 1 min), puis former des gouttelettes de la manière décrite ci-dessus.
  2. Assurez non fluorescents gouttelettes (négatifs): Préparation d'un mélange réactionnel de PCR consistant en colorant 1x ADN double brin liant, un colorant de référence 1x, 1,5 unité de Taq ADN polymerase, 10 mM Tris-HCl, 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de dNTP, et 0,5 uM des amorces. Thermocycle le mélange 30 fois (95 ° C pendant 20 s, 55 ° C pendant 20 s, 72 ° C pendant 1 min), puis former des gouttelettes.
  3. Formant ratios de gouttelettes pré-mélangés
    1. Distribuer 20 pi d'huile fluorée dans des tubes qPCR, couvrir avec un capuchon optique pour éviter l'évaporation.
    2. Pipette doucement 10 pi de gouttelettes bien mélangés dans positifs escomptés: rapports négatifs sur le dessus de l'huile. Dans les résultats présentés, positifs: ratios de gouttelettes étaient négatifs 1 (tous positifs), 0,8, 0,5, 0,2, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 et 0 (tous les negative).
  4. Mesurer les niveaux de fluorescence des colorants pour tous les échantillons en utilisant le thermocycleur qPCR. Pour ce protocole, utilisez le filtre 516 nm-492 nm fixée pour le colorant ADN double brin de liaison, et le filtre 585 nm-610 nm fixée pour le colorant de référence.
    1. Normaliser ADNds liaison fluorescence de colorant en utilisant la fluorescence du colorant de référence. En outre normaliser par la fluorescence du «tous positifs" échantillon.
  5. Créer une courbe standard linéaire en utilisant les mesures de fluorescence normalisés à partir des «tous positifs» et «négatifs» tous les échantillons. Utilisation de la courbe standard correspondant, prédire les rapports intermédiaires de gouttelettes positifs et négatifs sur la base de leur fluorescence en vrac.
  6. Recommencer l'expérience pour chaque rapport (n = 3) avec formation de gouttelettes de mélange et indépendant pour chaque répétition.

7. Preuve de principe MDA Expérience

  1. Mesurer la concentration de solution stock ADN lambda avec un spectrophotometer.
    1. Calculer la concentration nécessaire à la moyenne 10 molécules par gouttelette de modèle de gabarit. Pour ce protocole, supposent volumes de gouttelettes sont 1 nl et 1 ng d'ADN lambda contient environ 1,9 x 10 7 copies. Par conséquent, 10 modèles par gouttelette sera de 10 copies par nl, ou 526 fg Lambda ADN par ul. Le modèle sera diluée ~ 6x lorsque des gouttelettes se forment, donc la concentration initiale plus élevée de modèle sera de 3,2 pg / pl.
  2. Série diluer l'ADN Lambda à 3,2 pg / ul avec du tampon de dénaturation et de volume égal tampon de neutralisation. Pour un facteur de dilution de 0,1, combiner échantillon de 10 pi avec 45 pi de tampon de dénaturation et incuber à température ambiante pendant 3 min. Ajouter 45 ll de tampon de neutralisation pour étancher.
  3. Diluer l'échantillon tel que décrit dans l'étape 7.2 de faire le reste des échantillons pour l'expérience. Les concentrations de modèle initiales dans les réactions montrées étaient de 3,2 pg, 320 fg,160 fg, 32 fg, 16 fg, 3,2 fg, et 1,6 fg par microlitre.
    Remarque: Les concentrations finales de modèle après addition de Mastermix étaient 526 fg, 52,6 fg, 26,3 fg, 5,26 fg, 2,63 fg, 526 ag, et 263 ag par microlitre. 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, et 0,005 copies Lambda attendus par gouttelette, respectivement.
  4. Produire et analyser des gouttelettes de chaque échantillon comme décrit dans les étapes 2.5-5.3.
  5. Acquérir les images de fluorescence illustré (Figure 2,3) en utilisant un appareil photo numérique monté sur un microscope épi-fluorescence avec un objectif 10x à TA. Acquérir douze champs de vision pour chaque échantillon. Corriger les images de fluorescence par une image de fond obtenu avec une lame fluorescente.
  6. Utilisez une chambre contenue pour l'imagerie 37, comme l'huile d'émulsion évaporer rapidement.
  7. Analyser l'intensité des gouttelettes individuelles en utilisant une macro d'ImageJ (fichier de code supplémentaire).
    1. Choisissez une intensité de fluorescence seuil qui sépare meilleure gouttelettes non fluorescents dans le NTC images des gouttelettes fluorescentes dans les images à forte concentration de modèle. Pour chaque échantillon inconnu, calculer la fraction de gouttelettes avec une intensité de fluorescence au-dessus du seuil.

8. Les réactions de PCR en vrac et MDA

  1. Préparer réaction PCR.
    1. Diluer en série ADN de matrice avec un facteur de dilution de 0,1. Pour chaque dilution, mélanger 10 pi de modèle avec 45 pi de tampon de dénaturation et incuber à température ambiante pendant 3 min. Mélanger la dilution avec 45 pi de tampon de neutralisation.
    2. Préparer 20 pi de Mastermix PCR par échantillon. Le mélange maître de réaction 1,1x PCR se compose de 60 unités / ul ADN polymérase Taq, 11 mM Tris-HCl, 55mM KCl, 1,65 mM MgCl2, mM dNTP 0,22, colorant, colorant de référence de 1,1x, et 550 nM 1,1x ADNds contraignant chaque amorce.
    3. Combinez 2 pi de modèle diluée et 20 pi de Mastermix.
      Remarque: Les concentrations de modèle finales dans til PCR réactions montrées était de 50 pg, 5 pg, 500 fg, 50 fg, 5 fg, 500 ag, et 0 g ADN lambda par microlitre, et ont été réalisé en triple.
    4. Thermocycle réaction PCR dans la machine qPCR avec le programme suivant. Run 40 cycles de 95 ° C pendant 30 sec, 57 ° C pendant 20 s, 72 ° C pendant 30 s avant de 2 min à 72 ° C pendant 2 min et maintien à 4 ° C.
    5. Normaliser ADNds liaison fluorescence de colorant utilisant un colorant de fluorescence de référence avant de l'analyser.
  2. Préparer réaction MDA.
    1. Diluer les échantillons comme décrit à l'étape 8.1.1.
    2. Préparer 11 pi de mélange maître par échantillon sur de la glace. Le mélange maître de réaction 2x MDA se compose de colorant 2x ADNds contraignant, colorant de référence 2x, 50 pm oligo randomisé, 2 mg / ml de BSA, 2x ADN phi29 polymérase tampon, 4,8 mM dNTP, de l'eau sans nucléase, et 40 pg / ml Phi29 ADN polymérase.
    3. Ajouter la polymérase ADN Phi29 à 40 pg / ml durer pour assurer la polymérase dOES pas rencontrer les niveaux de pH beaucoup plus élevé ou plus bas que 7,5. Bien mélanger.
    4. Dénaturer 3,3 pi de modèle dilué avec 3,3 pi de tampon de dénaturation dans un tube qPCR. Incuber à température ambiante pendant 3 min. Ajouter 3,3 ul de tampon de neutralisation.
    5. Combinez 10 pi de modèle dénaturé et 10 pi de mélange maître. Bien mélanger.
    6. Exécutez réaction MDA dans la machine qPCR avec le programme suivant.
    7. Tenir à 30 ° C pendant 4 heures, mesurer la fluorescence tous les 7,5 min.
    8. Inactiver à 75 ° C pendant 1 min.
    9. Normaliser ADNds liaison fluorescence de colorant en utilisant la fluorescence du colorant de référence. En outre normaliser par la fluorescence maximale pour chaque échantillon.

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Representative Results

Alors que les lectures en vrac classique / en temps réel peuvent être utilisés à la fois pour la PCR quantitative et analyses quantitatives de WGA (Figure 1), des essais quantitatifs numériques offrent des avantages (tableau 1). Dans le procédé décrit, nous lisons des dosages numériques au format micro-gouttelettes avec une mesure de point final en vrac simple (Figure 2). Bien que cette méthode est largement applicable, nous nous concentrons sur WGA quantitative (MDA) parce que cette méthode présente des défis particuliers pour des essais en temps réel conventionnels.

Pour vérifier si notre instrument PCR en temps réel pourrait détecter les différentes fractions de microgouttelettes fluorescentes dispersées dans l'huile, nous avons mesuré la fluorescence en vrac de mélanges de synthétiques fluorescent et gouttelettes non fluorescentes (Figure 2). La fluorescence en masse et le nombre de gouttelettes positifs (évaluée indépendamment par microscopie à fluorescence) l'échelle de façon linéaire avec la fraction d'entrée de gouttelettes fluorescentes comme prévu (Figure 3A). L'expérience a été effectuée trois fois, avec formation de gouttelettes de mélange et indépendant pour chaque ensemble.

Pour évaluer la performance de quantification théorique pour les échantillons «inconnus», nous avons établi des courbes d'étalonnage linéaires en utilisant des échantillons de contrôle entièrement positifs et négatifs entièrement. Avec de telles courbes standard spécifique goutte-Lot, nous avons calculé la fraction des mélanges synthétiques de gouttelettes positives et négatives basées sur la fluorescence de chaque échantillon en vrac. Les résultats montrent une bonne performance dans le rapport gouttelettes quantification dans deux journaux de plage dynamique (R 2 = 0,984; figure 3B). La concentration d'entrée de l'analyte peut être facilement calculée à partir de la fraction de gouttelettes 38 positives ou négatives.

Pour tester notre méthode dans un vrai test quantitatif WGA, nous avons mesuré les niveaux de fluorescence et de la fraction de gouttelettes positifs d'une gouttelette numérique MDA test avec de l'ADN Lambda sur un wi de gamme de concentrations (Figure 4). Sur la figure 4B, des images fluorescentes représentatifs des gouttelettes sont visibles. Les deux fluorescence en vrac et de la fraction de gouttelettes positive des échantillons MDA échelle numérique comme prévu avec le modèle moyenne par gouttelettes, indiquant que la lecture en vrac peut capturer fidèlement le résultat d'une analyse numérique (R 2 = 0,927). Nous avons répété l'expérience pour chaque concentration, formant indépendante gouttelettes et la réalisation de WGA pour chaque réplique.

Tableau 1
Tableau 1. Résumé des en temps réel et des analyses numériques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

able2.jpg "/>
Tableau 2. Résumé des méthodes existantes pour la quantification des acides nucléiques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 1
Figure 1. PCR en temps réel quantitative et MDA d'ADN lambda. MDA ne sont pas discrétisées grâce à des cycles de température comme PCR, et est sujette à préamplification sinon soigneusement préparé sur la glace. Ici, la PCR quantitative et MDA ont été réalisées avec des concentrations d'ADN lambda croissante. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Schéma de lecture analogique de gouttelettes et des images représentatives. (A) gouttelettes positives et négatives ont été générées à partir de réactifs fluorescents et non fluorescents dans un dispositif microfluidique. Les gouttelettes ont été pré-mélangés dans différentes positifs: ratios négative. Niveaux de fluorescence en vrac ont été mesurées avec un thermocycleur en temps réel standard, et la fraction de gouttelettes positifs a été déterminée par microscopie à fluorescence. (B) représentant fluorescent recouvert d'images de l'augmentation des ratios de gouttelettes positifs (barre d'échelle = 200 um). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. vrac fluorescence et la fraction fluorescente de combinaisons de gouttelette positif et négatif préparé séparémentts. (A) fluorescente (positif) et non-fluorescent (négatives) des gouttelettes ont été pré-mélangés dans des rapports différents. La comparaison de la fraction de gouttelettes d'entrée positifs avec la fluorescence mesurée en vrac et une fraction de gouttelettes positif mesuré (n = 3, barres représentent +/- SD). La ligne pointillée représente la fraction fluorescente attendre, compte tenu d'une relation linéaire. (B) La comparaison des ratios prévus sur la base de normes à la fraction d'entrée fluorescente prévu. La ligne indique la valeur attendue donné une relation linéaire. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. vrac fluorescence et la fraction fluorescente d'un dosage de MDA numérique de gouttelettes. MDA numérique a été réalisée avec IncreAsing concentrations de matrice ADN lambda (n = 3, les barres d'erreur représentent SD) et mesurée comme décrit dans la figure 2A. La ligne indique la fraction fluorescente attendue en utilisant la distribution de Poisson pour modéliser les données de notre expérience. b) fluorescente Représentant recouvert d'images de gouttelettes après inactivation de réaction (barre d'échelle = 200 um) pour augmenter molécules Lambda ADN attendus par gouttelette (NTC, 0,005, 0,05, 0,5 et 10). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .

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Discussion

Essais numériques sont puissantes méthodes qui permettent la détection de cellules rares et de comptage individuels des molécules d'acide nucléique. Cependant, les essais numériques sont toujours pas appliquées systématiquement dans les laboratoires d'analyse, en partie à cause du coût de l'équipement spécialisé associée à des méthodes disponibles dans le commerce. Nous décrivons ici une analyse numérique pour quantifier extrémité des acides nucléiques avec un affichage analogique simplifié en utilisant une machine standard de PCR quantitative en temps réel. Cette méthode est rapide à mettre en place, et la lecture est beaucoup plus simple que les méthodes de comptage gouttelettes.

Notre test perd la sensibilité molécule unique (single-goutte) de mesures de gouttelettes individuelles pour la simplicité de en masse critère mesure en utilisant l'instrumentation standard. Dans notre expérience MDA numérique, nous ne pouvions pas distinguer moins de 1 goutte positif pour 200 gouttelettes négatifs de fond, malgré la confirmation par microscopie à fluorescence que la fra réellection de gouttelettes positifs a été comme prévu (figure 4). La sensibilité et le fond de la limite de mesure de fluorescence en vrac de la sensibilité de l'essai de mesure de faibles fractions de masse de gouttelettes positifs. Si une plus grande sensibilité est nécessaire, un affichage numérique est recommandée. Les différences dans les niveaux d'huile ou de volumes de gouttelettes en vrac peuvent grandement affecter les données de fluorescence de l'échantillon. Même la normalisation avec un colorant de référence ne peut pas compenser les différences des volumes de pétrole font de la fluorescence lit. Il est possible que l'optimisation de volume de dosage, les paramètres d'acquisition de l'instrument, la géométrie de microtitration, des filtres optiques ou peut améliorer les performances du dosage.

La sensibilité et la plage dynamique de tests numériques en vrac peuvent aussi être améliorées en optimisant la taille de la partition. Gouttelettes plus grosses donnent une plus grande quantité de produits fluorescents de chaque molécule de modèle, qui peut aider à surmonter fond instrumentale et améliorer la sensibilité pour les faibles concentrations d'entrée. SurD'autre part, des gouttelettes plus petites permettent l'isolement de plusieurs molécules par volume dosé. Si la concentration de modèle est très variable entre les échantillons, les petites et grandes réactions de gouttelettes peuvent être menées en parallèle pour étendre la gamme dynamique de dosage 39.

Volumes de gouttelettes cohérentes sont également nécessaires pour une mesure précise. De nombreuses solutions existent microfluidiques personnalisé pour former rapidement gouttelettes monodispersées partir d'un échantillon, à la fois en série et en parallèle 19,40 41,42. Alors que quelques-uns permettent la génération de gouttelettes à partir de plusieurs échantillons distincts en parallèle, de simples modifications à des conceptions existantes permettrait de créer des gouttelettes simultanée d'un nombre d'échantillons. Par exemple, le système Bio-Rad ddPCR 23 applique une pression uniforme aux entrées d'une série de gouttelettes de décideurs indépendants, ce qui permet simultanément la formation de gouttelettes à partir de plusieurs échantillons.

Notre méthodologie vrac de lecture accède cléavantages de tests numériques partitionnées sans la nécessité d'instrumentation et de lecture spécialisée est bien adapté pour WGA quantitative. Ici, nous nous sommes concentrés sur la WGA quantitative, qui est très sensible aux contaminants de fond en raison de son manque de spécificité séquence 7. En outre, la distribution de poids moléculaire inconnu et potentiellement large de produits de quantitatives en temps réel des tests de WGA rendre l'interprétation difficile dans les applications où le nombre de modèles originaux est d'intérêt. Adresses de mise en forme de dosage numérique ces deux problèmes. Les contaminants sont contenus dans des partitions de réaction individuelles, ce qui empêche la domination des analytes de faible masse moléculaire par des contaminants de haut poids moléculaire comme cela se produirait dans un essai en temps réel classique. Dans les figures 2B et 4B, les contaminants possibles, vu que des taches lumineuses dans les gouttelettes, sont séparés et ne pas amplifier ou contribuer de manière substantielle à la fluorescence globale. En outre, lesignal généré dans des analyses numériques est proportionnelle au nombre de modèles, la taille de pas de modèles ou de leur taux d'amplification. Bien que notre méthode repose sur des normes pour calibrer la mesure numérique en vrac, l'exigence pour correspondre à l'échantillon et les caractéristiques standards peut être assouplie de manière significative.

Quantitative WGA est couramment utilisé pour quantifier les contaminants dans les réactions WGA 7,34, et est la méthode la plus sensible connu pour quantifier la présence d'ADN de séquence inconnue, donnant la méthode de grandes promesses dans des domaines d'application aussi variés que pharmaceutique contrôle de la qualité, la médecine légale, et astrobiologie. Affichage numérique en vrac peut profiter à d'autres protocoles d'essai numérique tels que numérique PCR, en accélérant, parallélisation, et en simplifiant dosage lecture.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Evagreen Dye Biotium 31000
Bovine serum albumin New England Biotechnologies B9000S
Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer New England Biotechnologies B0269S Vortex periodically until aggregate dissolves
Lambda DNA New England Biotechnologies N3011S Heated to 50 oC and quenched on ice prior to dilution
Randomized MDA oligos Integrated DNA Technologies 5'-NNNNN*N-3'
PCR primers Integrated DNA Technologies 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’
UltraPure Nuclease-free water Life Technologies 10977-015 UV-treated for 30 min in Stratalinker 2400 before use (optional)
ROX reference dye Life Technologies 12223-012
PCR optical strip caps Life Technologies 4323032
PCR tubes Agilent Technologies 401428
dNTP (25 micromolar each) Agilent Technologies 200415
Thermocycler - Mx3000P qPCR system Agilent Technologies 401403
Barrier pipette tips VWR 89003-046
Bio-rad oil for evagreen Bio-rad 186-4005
JumpStart Taq ReadyMix Sigma-Aldrich P2893-100RXN

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References

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